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Trabalho Prático nº 2: Ruptura das células e purificação
da amidase da estirpe E.coli
(pKK223-3 AI3) por cromatografia
de afinidade.
Docentes: Profª Rosário Martins
Profª Ana Paula Pinto
7 de Novembro de 2012
Universidade de Évora
Departamento de Química
U.C. Tecnologia de Enzimas
Discentes:
Cátia Fernandes, nº25892
Diana Balbino, nº25920
Filipa Santos, nº26895
Rita Bicho, nº29744
Curso:
Biotecnologia
Turma B
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 2
Índice
Resumo ............................................................................................................................................................ 3
Introdução teórica...................................................................................................................................... 4
Objectivos ....................................................................................................................................................... 9
Procedimento Experimental .............................................................................................................. 10
Material Laboratorial: ....................................................................................................................... 10
Equipamentos: ..................................................................................................................................... 10
Soluções:.................................................................................................................................................. 10
Procedimento: ...................................................................................................................................... 10
Resultados e Tratamento de Resultados ...................................................................................... 18
Discussão e Conclusão .......................................................................................................................... 18
Bibliografia ................................................................................................................................................. 42
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 3
Resumo Para preparação do extracto foram utilizadas as células de E.coli
recombinantes, ao qual se adicionou tampão TMEG com benzamidina. Esta
preparação foi ao equipamento de ultra-sons, para rebentamento da parede celular
das células, e depois centrifugado e recolhido o sobrenadante.
A separação e purificação da amidase, produzida pela bactéria utilizada,
foram efectuadas pelo método de cromatografia por afinidade. Foi utilizada uma
coluna de cromatografia com Sepharose 6B epoxiactivada com acetamida
equilibrada com tampão TME. O extracto foi adicionado à coluna e foram
recolhidas as fracções de lavagem e lida a absorvância a 250nm até à diminuição
desta aproximadamente até 0.05, indicando que todos compostos que não foram
adsorvidos pela coluna foram eluídos. Após esta diminuição foram adicionados à
coluna soluções de KCl de concentrações 20, 50, 75 e 100 mM em tampão TME,
efectuando a eluição da amidase da coluna por gradiente. Estas fracções também
foram recolhidas e a absorvância também foi lida a 280nm.
Seguidamente procedeu-se ao doseamento da actividade enzimática do
extracto celular enzimático (não purificado), das fracções de lavagem e durante a
eluição da amidase nas fracções já purificadas. Foram retirados 20 µL de cada
fracção para uma microplaca de ELISA, adicionado o substrato p-nitroacetanilida e
lida a absorvância a 405 nm durante cerca de 10 minutos. Este ensaio foi efectuado
em triplicado para cada amostra. Depois com os resultados obtidos foram
determinadas graficamente as velocidades de reacção, e com estas e a adaptação
da Lei Lambert-Beer foi determinada a actividade enzimática do extracto e das
fracções purificadas com amidase.
Para o doseamento da proteína foi utilizado o método de ligação do corante
Azul de Coomassie G, para o extracto celular e para as fracções de eluição com
actividade enzimática. Foi elaborada a recta de calibração para as soluções padrões
de BSA, de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 40 µg/mL preparadas a partir de uma solução mãe de
2mg/mL de BSA. Para cada amostra foram efectuadas diluições, dependo se era ou
não purificada, e foram retirados 100µL de cada amostra e respectivas diluições
para uma microplaca de ELISA, adicionando também o mesmo volume de azul de
Comassie G., esperou-se 5 minutos para se dar a reacção e foi lida a absorvância a
630nm; este ensaio foi efectuado em triplicado para cada amostra. Seguidamente,
com os resultados obtidos, foi escolhida a melhor diluição que caía na gama dos
valores padrão da curva de calibração e foi determinada a quantidade de proteína
no extracto celular e nas fracções purificadas com amidase, a partir da equação da
recta de calibração. Também foram calculados a actividade enzimática específica
do extracto e das fracções purificadas com amidase, o rendimento e o factor de
purificação deste processo experimental, a partir da quantidade de proteína e das
actividades enzimática do extracto e das fracções purificadas com amidase obtidas.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 4
Introdução teórica
A Escherichia coli é uma bactéria bacilar Gram-negativa, é uma bactéria
simbionte descoberta em 1885 pelo alemão-austríaco Theodor Escherich.
A E. coli assume a forma de um bacilo e pertence à família das
Enterobacteriaceae. São bactérias aeróbias e anaerobias facultativas, tendo como
habitat natural o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais. Possui
ainda vários flagelos dispostos em volta da célula.
Figura 1: Escherichia coli 0157:H7
A E. coli é uma bactéria única capaz de produzir todos os componentes de
que é constituida, a partir de compostos básicos e fontes de energia suficientes,
algo que poucos seres vivos conseguem fazer, é ainda lactase positiva, uma enzima
fermentadora de açúcares.
O genoma da E. coli, possui cerca de 5 milhões de pares de bases e vários
milhares de genes que codificam mais de 4000 proteínas em contraste com o
genoma humano que possui 3 bilhões de pares de bases e cerca de 27 mil
proteínas.
Esta bactéria foi e continua a ser muito estudada enquanto modelo geral
para mecanismos biológicos das bactérias, na área da biologia molecular, tendo
também um papel muito importante em bioengenharia e microbiologia industrial.
Na vida quotidiana a E. coli tem importância na:
Avaliação da contaminação fecal em águas superficiais, de estuários
e marinas.
Monitorização de águas recreacionais como piscinas, praias e lagos.
É um indicador fundamental para avaliar as condições de
balneabilidade, de acordo com os padrões nacionais.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 5
Avaliação da qualidade bacteriológica de águas destinadas à
irrigação, descendentação de animais, criação de ostras e mariscos.
Avaliação da eficiência dos sistemas de tratamento das estações de
tratamento de águas residuais.
Monitorização da qualidade de água para consumo humano, da rede
de distribuição, de águas minerais, poços, etc.
Os reactores descontínuos são os biorreactores mais utilizados na
produção de enzimas em forma solúvel. Quando uma cultura microbiana se
desenvolve num sistema fechado, pode-se traçar uma curva de crescimento
microbiano. Esta pode ser dividida nas seguintes etapas ou fases:
Fase Lag onde ainda não há um aumento significativo da população,
sendo o período necessário para o microorganismo se adaptarem ao
meio;
Fase Log ou exponencial, nesta etapa há divisão celular máxima, as
células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes,
sintetizando os seus constituintes e multiplicando-se;
Fase estacionária que são sintetizados vários metabolitos
secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas;
Fase de declínio na qual maioria das células está em processo de
morte onde poderá ser uma morte lenta ou de uma forma
exponencial, nalguns casos ocorre a lise celular. Na curva iremos
obter as diversas fases de crescimento na qual uma fase importante é
a fase exponencial onde as células crescem a uma taxa constante e
máxima, nesta será possível determinar a taxa de crescimento
exponencial, um factor muito importante para determinação do
tempo médio de geração, comparação do desenvolvimento de
estirpes e comparação do desenvolvimento de estirpes em diferentes
condições.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 6
Figura 2: Curva de crescimento em sistemas fechados
Uma fase Lag longa poderá significar que o inóculo é insuficiente para se
multiplicar, poderemos ter uma cultura envelhecida, ou o meio e a temperatura
são desfavoráveis o que poderá levar a não existência da curva de crescimento. Na
fase estacionária, os nutrientes começam a escassear e os produtos tóxicos
tornam-se mais abundantes, nesta etapa não há um crescimento líquido da
população, o número de células que se divide é equivalente ao número de células
que morrem. Na curva iremos obter as diversas fases de crescimento na qual uma
fase importante é a fase exponencial onde as células crescem a uma taxa constante
e máxima, nesta será possível determinar a taxa de crescimento exponencial, um
fator muito importante para determinação do tempo medio de geração,
comparação do desenvolvimento de estirpes e comparação do desenvolvimento de
estirpes em diferentes condições.
A utilização de enzimas como catalisadores de reacções de síntese de vários
compostos de interesse industrial tem recebido considerável atenção devido às
conhecidas vantagens que as enzimas apresentam relativamente a catalisadores
químicos como a estereoespecificidade, a especificidade de substrato, o baixo
consumo energético, entre outras.
A amidase é um homohexâmero em que cada subunidade da amidase
apresenta um arranjo de quatro camadas, tipo “sandwich” αββα (33% hélices-α e
22% folhas-β) com duas folhas-β internas 21. No entanto, relativamente às outras
nitrilases, a amidase apresenta uma folha-β adicional na cadeia N-terminal e uma
cadeia C-terminal mais longa.
O sucesso deste enzima deve-se á variedade de reacções que pode realizar e
á diversidade de especificidade, catalizando reacções onde amidas, ácidos e esteres
podem servir de substrato, o que levará obviamente à obtenção de uma enorme
variedade de produtos de síntese alguns dos quais com aplicação industrial.
De entre os vários produtos de interesse industrial podem-se referir os
ácidos hidroxâmicos amplamente utilizados na indústria farmacêutica como
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 7
constituintes de antibióticos, factores de crescimento e inibidores de tumores.
Entre os diferentes enzimas capazes de realizar reacções de síntese destes ácidos
hidroxâmicos encontra-se a amidase de Pseudomonas aeruginosa.
A amidase é produzida por tecnologia de DNA recombinante em E.coli. As
ferramentas de DNA recombinante há muito que são utilizadas por permitirem o
controle e potenciação da síntese de enzimas e produtos que não são normalmente
produzidos pelo microorganismo.
As enzimas convertem o substrato (uma substância) no produto (noutra
substância), em que o substrato liga-se a uma zona específica da enzima (centro
activo) e forma o complexo enzima-substrato.
Enzima + Substrato ⇒ Enzima + Produto
Os enzimas são biocatalizadores porque aumentam a velocidade da reacção
diminuindo a energia de activação necessária para a conversão do substrato em
produto; não são consumidos e não alteram o equilíbrio químico da mesma
reacção e são muito específicos para a reacção que catalisam ou em relação aos
substratos que transformam.
A actividade enzimática (UI) é definida pela quantidade de enzima
necessária para converter um micromole de substrato por minuto em
determinadas condições favoráveis. Esta actividade pode depender da presença de
cofactores, em que o enzima necessita de ligação a moléculas não proteicas para
que possam exercer a sua função.
Também existem factores que influenciam a actividade enzimática,
afectando a velocidade da reacção:
concentração da enzima
concentração do substrato
pH
temperatura
presença de activadores e inibidores
A velocidade catalítica de uma reacção enzimática é condicionada pela
concentração do enzima e do substrato. Com o aumento gradual da concentração
do enzima existe formação de produto até um certo limite, podendo afirmar-se que
a velocidade de uma reacção enzimática é directamente proporcional à
concentração do enzima, desde que haja excesso de substrato durante a reacção. Se
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a concentração de substrato for aumentada, mantendo a do enzima, aumenta a
actividade enzimática, até um certo ponto em que se verifica a saturação
enzimática, pois todo o enzima encontra-se na forma do complexo enzima-
substrato.
O pH do meio onde se encontra o enzima é um factor condicionante da
actividade enzimática, pois geralmente os enzimas têm um pH óptimo de actuação
em que a sua actividade é máxima; valores acima ou abaixo provocam diminuição
de actividade enzimática ou até inactivação da mesma.
Geralmente a velocidade das reacções enzimáticas é proporcional à
temperatura a que estas decorrem e também apresentam uma temperatura óptima
para uma velocidade máxima. Os enzimas quando sujeitos a baixas temperaturas
ficam inactivos devido à falta de energia de activação para provocar o choque entre
as moléculas enzimáticas e as moléculas do substrato; e quando sujeitas a altas
temperaturas o enzima pode deixar de actuar devido à desnaturação da proteína
que a constitui, perdendo-se a configuração espacial e consequentemente o centro
activo da mesma.
Várias substâncias, algumas de ocorrência natural nas células e outras
artificiais, têm a capacidade de fazer variar ou regular a actividade dos enzimas
durante as reacções. As que ocorrem naturalmente regulam o metabolismo celular
e as artificiais são sintetizadas para tratar doenças ou para estudar a forma de
acção dos enzimas. Os efeitos destas substâncias podem ser positivos ou
activadores, quando aumentam a afinidade do enzima para o substrato e aceleram
a reacção, ou podem ter efeitos negativos ou inibidores, quando reduzem a
velocidade das reacções competindo com o substrato para a ligação à enzima ou
ligando-se ao complexo enzima-substrato.
A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos
componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um
adsorvente (fase estacionária). A fase estacionária pode ser um sólido ou um
líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por
uma superfície formando uma camada fina.
A cromatografia por afinidade baseia-se numa reacção muito específica
(ex.: enzima-substrato, enzima inibidor, anticorpo-antigénio) sendo muito
utilizada para compostos biológicos. A fase estacionária é um material inerte
(normalmente agarose) que é modificado quimicamente, através da ligação de
compostos com afinidade específica para as moléculas que se querem separar, a
fase móvel é solução tamponada aquosa que transporta os analítos.
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Figura 3: Imagem representativa do método da cromatografia de afinidade
Objectivos
Este trabalho experimental teve como objectivo a utilização a técnica de
cromatografia de afinidade para a purificação da amidase da estirpe recombinante
de Escherichia coli (pKK223-3 AI3).
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Procedimento Experimental
Material Laboratorial:
Tubos de ensaio de plástico
Tubo de ultrassons
Provetas 10 mL e 50mL
Microplacas
Pontas para micropipetas
Banho de gelo
Eppendorfs
Gaze
Copos de precipitação
Microplacas
Suporte para eppendorfs
Copos de precipitação
Equipamentos:
Micropipetas 1000µL, 200µL e 20µL
Aparelho de Ultrasons
Leitor de microplacas
Centrífuga refrigerada
Coluna de cromatografia (seringa de 10 ou 20 mL)
Bomba peristáltica
Cronómetro
Soluções:
Água destilada
Sepharose 6B epoxiactivada contendo acetamida
Tampão de eluição: TME contendo KCl 100 mM
Tampão TME
TMEG com benzamidina
Solução de p-nitroacetanilida 1mM em tampão TME
Extracto celular da estirpe recombinante de E. coli (pKK223-3 AI3)
Solução de BSA 2 mg/mL
Solução do corante Azul de Coomassie G-250 a 0,06% (p/v) em HCl 0,6N
Procedimento:
Nota: todo o extracto celular e todas as fracções que continham amidase foram
mantidos em banho de gelo.
Trabalho nº2
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I - Preparação do extracto celular:
1.
2. As células foram rebentadas por desintegração ultrassónica a 105 W
durante 30 segundos no “Labsonic” num banho de gelo, repetindo-se 5
vezes.
3. O extracto celular foi centrifugado a 12000 g durante 10 minutos e o
sobrenadante foi recolhido.
II - Preparação da coluna de cromatografia:
Foi preparada uma coluna de cromatografia com Sepharose 6B
epoxiactivada contendo acetamida e equilibrada com tampão TME.
Figura 1: Coluna de cromatografia com Sepharose 6B epoxiactivada
contendo acetamida e equilibrada com tampão TME
III – Desenvolvimento do processo cromatográfico:
1. O caudal de tampão TME foi regulado para cerca de 0,3 mL/min durante 10
a 15 minutos.
2. Aplicou-se à coluna 3 mL de extracto celular enzimático (preparado no
ponto II.3 do procedimento) e quando estava quase no fim foi adicionadoa
este 3 mL de TME.
3. Foram recolhidas as sucessivas fracções de lavagem com um volume
aproximado de 1,5 mL, em eppendorfs.
Células de E. coli (pKK223-3 AI3)
2 mL de tampão TMEG com
benzamidina em cada tubo
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 12
4.
5. Quando o valor de absorvância das fracções em relação ao branco se
aproximou de 0,05, procedeu-se à eluição por gradiente utilizando:
6. Continuou-se com os passos III-3 e III-4.
Para cada fracção recolhida, a
absorvância foi lida a 280nm
em função do branco.
10 mL 20 mL
1ª:20 mM
de KCl em
TME
2ª:50 mM
de KCl em
TME
3ª:75 mM
de KCl em
TME
4ª:100 mM
de KCl em
TME
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 13
IV – Doseamento de actividade enzimática:
Procedeu-se ao doseamento da actividade no extracto celular enzimático, nas fracções de lavagem de *5 a *10 e durante a eluição da amidase a partir do momento em que se começou a registar um aumento de absorvância a 280nm, ou seja, da fracção *32 a *64:
Adicionou-se 200µL de p-nitroacetanilida 1mM com hidroxilamina a 25ºC e
registou-se a variação de absorvância a 405nm durante aproximadamente 10 min.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A *45 *45 *45 *46 *46 *46 *47 *47 *47
B *48 *48 *48 *49 *49 *49 *50 *50 *50 *51 *51 *51
C *52 *52 *52 *53 *53 *53 *54 *54 *54 *55 *55 *55 D *56 *56 *56 *57 *57 *57 *58 *58 *58 *59 *59 *59
E *60 *60 *60 *61 *61 *61 *62 *62 *62 *63 *63 *63
F *64 *64 *64
G
H Figura 4:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com o extracto celular e fracções
*45 a *64.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A *5 *5 *5 B *6 *6 *6
C *7 *7 *7
D *8 *8 *8
E *9 *9 *9
F *10 *10 *10 G
H Figura 5:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fracções *5 a *10.
20µL de cada fracção
de suspensão celular
(Ensaio em
triplicado de cada
fracção)
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A *32 *32 *32 *40 *40 *40
B *33 *33 *33 *41 *41 *41
C *34 *34 *34 *42 *42 *42
D *35 *35 *35 *43 *43 *43 E *36 *36 *36 *44 *44 *44
F *37 *37 *37
G *38 *38 *38
H *39 *39 *39 Figura 6: Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fracções *32 a *44.
Legenda: Extracto celular ; Fracções
V – Doseamento da proteína:
Procedeu-se ao doseamento de proteínas, pelo método de ligação do
corante Azul de Coomassie G, do extracto celular e das fracções de eluição que
apresentaram actividade enzimática:
1.
Solução
mãe
2 mg/mL
de BSA
1 µg/mL
de BSA
2 µg/mL
de BSA
5 µg/mL
de BSA
40 µg/mL
de BSA
20 µg/mL
de BSA
10 µg/mL
de BSA
15 µg/mL
de BSA
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 15
2. Para elaboração da recta de calibração das soluções padrão de BSA,
preparadas no ponto 1.:
Aguardou-se 5 minutos e registou-se a absorvância a 630 nm
3. Para o doseamento da proteína de cada amostra:
Aguardou-se 5 minutos e registou-se a absorvância a 630 nm
100 µL de solução padrão
de BSA, preparada em 1. 100 µL de azul de Comassie G.
(em triplicado)
100 µL de cada amostra:
extracto celular nas diluições de 1:500, 1:1000,1:2000
fracções *39 a *51 nas diluições 1:100, 1:500, 1:1000
100 µL de azul de Comassie G.
(em triplicado)
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1 1 1
B 2 2 2
C 5 5 5 D 10 10 10
E 15 15 15
F 20 20 20
G 40 40 40 H
Figura 7:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as soluções padrão de BSA.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1:500 1:500 1:500 B 1:1000 1:1000 1:1000
C 1:2000 1:2000 1:2000
D
E F
G
H
Figura 8:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com os extractos celulares.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A *39 *39 *39 *40 *40 *40 *41 *41 *41 *42 *42 *42
B *43 *43 *43 *44 *44 *44 *45 *45 *45 *46 *46 *46
C *47 *47 *47 *48 *48 *48 *49 *49 *49 *50 *50 *50
D *51 *51 *51 *39 *39 *39 *40 *40 *40 *41 *41 *41
E *42 *42 *42 *43 *43 *43 *44 *44 *44 *45 *45 *45 F *46 *46 *46 *47 *47 *47 *48 *48 *48 *49 *49 *49
G *50 *50 *50 *51 *51 *51 *39 *39 *39 *40 *40 *40
H *41 *41 *41 *42 *42 *42 *43 *43 *43 *44 *44 *44
Figura 9:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fracções *39 a *44.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A *45 *45 *45 *46 *46 *46 *47 *47 *47 *48 *48 *48 B *49 *49 *49 *50 *50 *50 *51 *51 *51
C
D
E
F G
H
Figura 10:Esquema do arranjo da microplaca de ELISA com as fracções *45 a *51.
Legenda: Extracto celular ; Soluções padrão de BSA ; Fracção 1:100 ; Fracção
1:500 ; Fracção 1:1000
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 18
Resultados e Tratamento de Resultados I – Purificação por Cromatografia de Afinidade:
Os valores registados na absorvância a 280 nm (tabela 1) foram utilizados
para traçar o cromatograma (gráfico 1) correspondente ao processo de purificação
da amidase recombinante, de fracções contendo o eluente da cromatografia.
Tabela 1: Valores de absorvância para cada volume de eluição
Eppendorf
*
Volume
Eluição
(mL)
Absorvância
(280 nm)
Eppendorf
*
Volume
Eluição
(mL)
Absorvância
(280 nm)
Eppendorf
*
Volume
Eluição
(mL)
Absorvância
(280 nm)
1 1,5 0,177
23 34,5 0,442
45 67,5 1,079
2 3 0,094
24 36 0,417
46 69 1,759
3 4,5 0,083
25 37,5 0,392
47 70,5 1,804
4 6 0,081
26 39 0,362
48 72 1,573
5 7,5 1,979
27 40,5 0,335
49 73,5 1,419
6 9 3,719
28 42 0,316
50 75 1,242
7 10,5 3,719
29 43,5 0,416
51 76,5 1,46
8 12 1,801
30 45 0,602
52 78 3,726
9 13,5 1,98
31 46,5 0,533
53 79,5 3,726
10 15 2,279
32 48 0,458
54 81 3,726
11 16,5 1,833
33 49,5 0,637
55 82,5 3,727
12 18 1,5
34 51 0,741
56 84 2,766
13 19,5 1,267
35 52,5 0,82
57 85,5 1,979
14 21 1,089
36 54 0,774
58 87 1,724
15 22,5 0,895
37 55,5 0,778
59 88,5 1,423
16 24 0,796
38 57 1,024
60 90 1,209
17 25,5 0,729
39 58,5 1,679
61 91,5 1,019
18 27 0,652
40 60 1,88
62 93 0,868
19 28,5 0,568
41 61,5 1,863
63 94,5 0,743
20 30 0,516
42 63 1,43
64 96 0,622
21 31,5 0,478
43 64,5 1,116
22 33 0,46
44 66 0,95
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 19
Gráfico 1: Cromatografia de afinidade, realizada para purificação da amidase recombinante
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 20
II – Determinação da Actividade Enzimática:
Seguidamente, foi elaborado o estudo da actividade enzimática, fazendo
ensaios enzimáticos para as várias fracções (tabela 2). Foram utilizadas as fracções
purificadas no início da cromatografia (eppendorf *5 a *10), durante a diluição
com KCl de 50mM a 100mM, quando se observou o aumento de absorvância a
280nm (eppendorf *32 a *64) e o extracto enzimático, que não foi purificado.
Tabela 2: Estudo enzimático- registo da absorvância do extracto celular e das fracções
purificadas
Tempo (minutos) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ab
sorv
ân
cia
(4
05
nm
)
An
tes
da
Pu
rifi
caçã
o
(E
xtra
to C
elu
lar)
En
saio
1 0,295 0,362 0,437 0,506 0,574 0,659 0,741 0,83 0,919
2 0,795 1,004 1,215 1,42 1,614 1,793 1,957 2,11 2,247
3 1,137 1,266 1,471 1,658 1,827 1,974 2,104 2,210 2,300
Ap
ós
a P
uri
fica
ção
Ep
pen
do
rf 5
1 0,229 0,178 0,124 0,124 0,123 0,123 0,121 0,121 0,121
2 0,264 0,224 0,165 0,112 0,112 0,112 0,112 0,112 0,112
3 0,269 0,259 0,23 0,187 0,149 0,115 0,115 0,116 0,116
Ep
pen
do
rf 6
1 0,221 0,173 0,164 0,163 0,162 0,161 0,161 0,16 0,161
2 0,267 0,226 0,168 0,159 0,159 0,158 0,157 0,156 0,155
3 0,269 0,252 0,226 0,201 0,176 0,156 0,156 0,156 0,157
Ep
pen
do
rf 7
1 0,121 0,122 0,122 0,122 0,122 0,123 0,123 0,123 0,123
2 0,122 0,122 0,121 0,121 0,121 0,121 0,122 0,122 0,122
3 0,128 0,120 0,120 0,120 0,120 0,120 0,121 0,121 0,121
Ep
pen
do
rf 8
1 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108 0,108
2 0,105 0,105 0,105 0,106 0,106 0,106 0,106 0,106 0,106
3 0,098 0,098 0,098 0,098 0,099 0,099 0,099 0,099 0,099
Ep
pen
do
rf 9
1 0,118 0,102 0,103 0,103 0,103 0,103 0,103 0,103 0,103
2 0,101 0,102 0,102 0,102 0,102 0,102 0,103 0,103 0,103
3 0,100 0,100 0,100 0,100 0,101 0,101 0,101 0,102 0,101
Ep
pen
do
rf 1
0
1 0,153 0,125 0,109 0,109 0,109 0,109 0,108 0,108 0,108
2 0,103 0,102 0,102 0,102 0,102 0,102 0,102 0,102 0,103
3 0,104 0,104 0,103 0,103 0,103 0,103 0,104 0,104 0,105
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 21
Ab
sorv
ân
cia
(4
05
nm
)
Tempo (min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ap
ós
pu
rifi
caçã
o
Ep
pen
do
rf 3
2
1 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08
2 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,088 0,088
3 0,083 0,083 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,085 E
pp
end
orf
33
1 0,091 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09
2 0,087 0,088 0,088 0,088 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087
3 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,086 0,086 0,086 0,086
Ep
pen
do
rf 3
4
1 0 0,084 0,084 0,084 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085
2 0,085 0,085 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,087
3 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,088 0,088 0,088 0,088
Ep
pen
do
rf 3
5
1 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,091 0,091
2 0,092 0,092 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093
3 0,083 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084
Ep
pen
do
rf 3
6
1 0,095 0,095 0,095 0,095 0,095 0,095 0,095 0,096 0,096
2 0,092 0,093 0,093 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092
3 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092
Ep
pen
do
rf 3
7
1 0,09 0,09 0,09 0,09 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091
2 0,092 0,093 0,093 0,093 0,093 0,094 0,094 0,094 0,094
3 0,09 0,09 0,09 0,09 0,091 0,091 0,091 0,092 0,092
Ep
pen
do
rf 3
8
1 0,117 0,125 0,134 0,144 0,154 0,164 0,174 0,184 0,195
2 0,109 0,116 0,125 0,133 0,143 0,152 0,161 0,171 0,18
3 0,105 0,114 0,122 0,132 0,142 0,152 0,163 0,173 0,184
Ep
pen
do
rf 3
9
1 0,225 0,278 0,329 0,381 0,436 0,493 0,551 0,61 0,671
2 0,214 0,263 0,313 0,364 0,418 0,473 0,528 0,586 0,641
3 0,144 0,176 0,205 0,239 0,269 0,306 0,347 0,392 0,437
Ep
pen
do
rf 4
0
1 0,149 0,192 0,237 0,283 0,329 0,378 0,428 0,48 0,533
2 0,127 0,165 0,202 0,239 0,274 0,314 0,356 0,400 0,446
3 0,124 0,163 0,204 0,245 0,288 0,330 0,374 0,419 0,465
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 22
Ep
pen
do
rf 4
1
1 0,141 0,178 0,220 0,266 0,311 0,353 0,397 0,443 0,491
2 0,176 0,239 0,310 0,385 0,461 0,537 0,615 0,695 0,778
3 0,084 0,085 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,085 0,086 E
pp
end
orf
42
1 0,139 0,172 0,207 0,244 0,282 0,322 0,361 0,400 0,437
2 0,124 0,155 0,188 0,221 0,257 0,293 0,329 0,368 0,406
3 0,123 0,157 0,191 0,228 0,267 0,306 0,346 0,388 0,431
Ep
pen
do
rf 4
3
1 0,125 0,153 0,183 0,212 0,242 0,272 0,304 0,338 0,373
2 0,121 0,148 0,176 0,205 0,234 0,264 0,295 0,326 0,358
3 0,123 0,155 0,190 0,225 0,258 0,293 0,330 0,371 0,410
Ep
pen
do
rf 4
4
1 0,121 0,142 0,163 0,187 0,211 0,235 0,260 0,286 0,312
2 0,118 0,14 0,163 0,187 0,211 0,234 0,259 0,284 0,309
3 0,121 0,140 0,160 0,180 0,202 0,224 0,247 0,271 0,296
Ep
pen
do
rf 4
5
1 0,117 0,133 0,148 0,165 0,182 0,199 0,218 0,237 0,258
2 0,115 0,129 0,145 0,161 0,177 0,195 0,213 0,232 0,251
3 0,105 0,119 0,134 0,151 0,167 0,184 0,202 0,221 0,239
Ep
pen
do
rf 4
6
1 0,102 0,111 0,12 0,132 0,143 0,154 0,166 0,178 0,190
2 0,10 0,109 0,119 0,129 0,138 0,149 0,160 0,172 0,184
3 0,095 0,105 0,116 0,127 0,138 0,150 0,163 0,176 0,189
Ep
pen
do
rf 4
7
1 0,095 0,100 0,106 0,111 0,117 0,123 0,130 0,137 0,144
2 0,096 0,100 0,106 0,111 0,116 0,122 0,127 0,133 0,140
3 0,100 0,104 0,110 0,115 0,121 0,127 0,133 0,140 0,147
Ep
pen
do
rf 4
8
1 0,101 0,106 0,111 0,116 0,121 0,127 0,133 0,138 0,145
2 0,100 0,105 0,111 0,116 0,122 0,128 0,134 0,140 0,147
3 0,091 0,096 0,101 0,107 0,112 0,117 0,123 0,128 0,134
Tempo (min) 0 1 2 3 5 6 7 8 9
Ab
sorv
ân
cia
(4
05
mn
)
Ap
ós
Pu
rifi
caçã
o
Ep
pen
do
rf 4
9
1 0,087 0,088 0,088 0,088 0,089 0,089 0,09 0,09 0,091
2 0,088 0,088 0,088 0,088 0,089 0,089 0,09 0,091 0,091
3 0,09 0,09 0,09 0,091 0,091 0,092 0,092 0,093 0,093
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 23
Ep
pen
do
rf 5
0 1 0,09 0,091 0,091 0,091 0,092 0,092 0,093 0,093 0,094
2 0,082 0,081 0,082 0,083 0,083 0,084 0,084 0,084 0,085
3 0,085 0,085 0,085 0,085 0,086 0,087 0,087 0,088 0,088 E
pp
end
orf
51
1 0,095 0,096 0,095 0,095 0,094 0,094 0,094 0,094 0,094
2 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,091 0,092 0,093
3 0,094 0,094 0,094 0,093 0,093 0,093 0,092 0,092 0,092
Ep
pen
do
rf 5
2
1 0,101 0,100 0,100 0,100 0,101 0,101 0,101 0,101 0,101
2 0,094 0,094 0,095 0,095 0,095 0,095 0,095 0,096 0,096
3 0,087 0,087 0,088 0,088 0,088 0,089 0,089 0,09 0,091
Ep
pen
do
rf 5
3
1 0,084 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,086 0,086 0,086
2 0,089 0,089 0,089 0,089 0,090 0,090 0,089 0,090 0,090
3 0,089 0,089 0,090 0,089 0,090 0,090 0,090 0,090 0,090
Ep
pen
do
rf 5
4
1 0,083 0,083 0,083 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084
2 0,083 0,083 0,083 0,084 0,084 0,084 0,084 0,085 0,085
3 0,085 0,085 0,085 0,086 0,085 0,086 0,086 0,086 0,086
Ep
pen
do
rf 5
5
1 0,083 0,083 0,083 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084
2 0,096 0,096 0,096 0,095 0,096 0,095 0,095 0,096 0,095
3 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 0,090 0,090 0,09 0,089
Ep
pen
do
rf 5
6
1 0,09 0,091 0,091 0,091 0,091 0,092 0,092 0,092 0,092
2 0,103 0,101 0,100 0,099 0,099 0,098 0,098 0,098 0,097
3 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,083
Ep
pen
do
rf 5
7
1 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,086
2 0,085 0,085 0,085 0,084 0,084 0,085 0,085 0,085 0,085
3 0,089 0,089 0,09 0,09 0,09 0,091 0,091 0,091 0,091
Ep
pen
do
rf 5
8
1 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086
2 0,085 0,085 0,085 0,086 0,086 0,087 0,087 0,087 0,087
3 0,087 0,086 0,086 0,086 0,087 0,086 0,087 0,087 0,087
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 24
Os gráficos correspondes à absorvância em função do tempo foram
construídos, para cada fracção purificada e não purificada (gráficos 2 a 13). Todas
as fracções são representadas, excepto as fracções correspondentes ao eppendorf
*5 a *10; isto pelo facto de estas fracções iniciais não apresentarem actividade
enzimática, por isso, a representação gráfica de todas é denecessária, mostrando
apenas o gráfico do eppendorf *8, servindo como gráfico exemplo (gráfico 3).
Ep
pen
do
rf 5
9
1 0,092 0,092 0,092 0,092 0,091 0,092 0,092 0,092 0,091
2 0,097 0,097 0,097 0,097 0,097 0,097 0,097 0,096 0,097
3 0,084 0,083 0,084 0,083 0,084 0,084 0,084 0,084 0,084 E
pp
end
orf
60
1 0,091 0,091 0,092 0,092 0,092 0,092 0,091 0,092 0,091
2 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,092 0,091 0,092 0,092
3 0,081 0,081 0,081 0,081 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082
Ep
pen
do
rf 6
1
1 0,09 0,089 0,088 0,087 0,088 0,087 0,087 0,087 0,087
2 0,088 0,089 0,088 0,088 0,088 0,088 0,088 0,088 0,088
3 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087
Ep
pen
do
rf 6
2
1 0,083 0,084 0,084 0,084 0,097 0,097 0,097 0,098 0,098
2 0,086 0,086 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087 0,087
3 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086 0,086
Ep
pen
do
rf 6
3
1 0,088 0,088 0,088 0,088 0,089 0,088 0,088 0,088 0,087
2 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,082 0,083
3 0,079 0,079 0,079 0,079 0,079 0,079 0,079 0,080 0,080
Ep
pen
do
rf 6
4
1 0,093 0,093 0,094 0,093 0,094 0,094 0,094 0,094 0,094
2 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,092
3 0,094 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093 0,093
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 25
Gráfico 2: Registo da Absorvancia em função do tempo para o extrato celular (antes da purificação)
Gráfico 3: Registo da Absorvância em função do tempo, para a fracção purificada do eppendorf 8.
y = 0,0777x + 0,2807 R² = 0,9972
y = 0,1831x + 0,8406 R² = 0,9949
y = 0,1511x + 1,1675 R² = 0,9873
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
y = 0,108 R² = 0
y = 0,0002x + 0,1051 R² = 0,675
y = 0,0002x + 0,0979 R² = 0,75
0,096
0,098
0,1
0,102
0,104
0,106
0,108
0,11
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 26
Gráfico 4: Registo da Absorvância em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 39.
Gráfico 5: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 40.
y = 0,0556x + 0,2192 R² = 0,9991
y = 0,0536x + 0,2078 R² = 0,9993
y = 0,0362x + 0,1347 R² = 0,9932
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
y = 0,048x + 0,1425 R² = 0,9988
y = 0,0394x + 0,1227 R² = 0,9981
y = 0,0426x + 0,1198 R² = 0,9994
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 27
Gráfico 6: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 41.
Gráfico 7: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 42.
Gráfico 8: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 43.
y = 0,0439x + 0,1354 R² = 0,9994
y = 0,0756x + 0,1637 R² = 0,999
y = 0,0001x + 0,085 R² = 0,2526
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
y = 0,0377x + 0,1341 R² = 0,9993 y = 0,0354x + 0,1187
R² = 0,9988
y = 0,0386x + 0,1166 R² = 0,9985
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
y = 0,0308x + 0,1214 R² = 0,9988
y = 0,0297x + 0,1177 R² = 0,9993
y = 0,0357x + 0,1187 R² = 0,9988
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 28
Gráfico 9: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 44.
Gráfico 10: Registo da Absorvância em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 45.
y = 0,0239x + 0,116 R² = 0,9997
y = 0,0239x + 0,116 R² = 0,9997
y = 0,0219x + 0,1172 R² = 0,9981
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
y = 0,0175x + 0,1141 R² = 0,9977
y = 0,0171x + 0,1116 R² = 0,9979
y = 0,0169x + 0,1017 R² = 0,9982
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
an
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 29
Gráfico 11: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 46.
Gráfico 12: Registo da Absorvâncio em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 47.
y = 0,0111x + 0,0995 R² = 0,998
y = 0,0105x + 0,0982 R² = 0,9976 y = 0,0118x + 0,0928
R² = 0,9979
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
an
cia
(n
m)
Tempo (nm)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
y = 0,0061x + 0,0936 R² = 0,9964
y = 0,0055x + 0,0949 R² = 0,9975
y = 0,0059x + 0,0983 R² = 0,996
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 30
Gráfico 13: Registo da Absorvância em função do tempo, para a freacção purificada do
eppendorf 47.
Para determinação da actividade enzimática, a Lei de Lambert-Beer foi
adaptada, sendo possível utilizar os dados obtidos. Com a existência dos dados
obtidos da velocidade das reacções enzimáticas (variação da absorvância com o
tempo), então divide-se ambos os lados da equação por t:
(
) (
) (
)
Em que com esta adaptação tem-se todos os dados necessário para o cálculo
da actividade enzimática ((
)), sendo Ɛ (11500 M-1cm-1) e l (1cm) constantes.
Seguidamente, foram feitos os cálculos para determinação da actividade
enzimática final que existia na cultura, correspondente ao ensaio enzimático.
Como cálculo exemplo, para o extracto celular não purificado do ensaio 1:
(
) (
)
Este valor está expresso em molaridade e como o ensaio enzimático condiz
a um valor total de 0,2mL, tem-se:
( )
No ensaio enzimático apenas 20µL foram utilizados, tendo sido retirados de
um volume final de 3000 µL. Então, tem-se:
y = 0,0055x + 0,1002 R² = 0,9978
y = 0,0059x + 0,0992 R² = 0,9986
y = 0,0054x + 0,0906 R² = 0,9995
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0 2 4 6 8 10
Ab
sorv
ân
cia
(n
m)
Tempo (min)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 31
( )
O resultado anterior tem que ser convertido mol em µmol, para obtenção da
actividade enzimática da cultura em UI:
( )
Os resultados dos restantes ensaios foram tratados da mesma forma que o
exemplo dado para o ensaio 1.
Como cálculo exemplo, para cada fracção purificada que contem amidase,
para o ensaio 1 do eppendorf 39:
(
) (
)
Este valor está expresso em molaridade e como o ensaio enzimático condiz
a um valor total de 0,2mL, tem-se:
( )
No ensaio enzimático apenas 20µL foram utilizados, tendo sido retirados de
um tubo eppendorf com volume final de 1500µL. Então, tem-se:
( )
O resultado anterior tem que ser convertido mol em µmol, para obtenção da
actividade enzimática da cultura em UI:
( ) ( )
Os resultados dos restantes ensaios foram tratados da mesma forma que o
exemplo dado para o ensaio 1 do eppendorf 39.
Para melhor e facilitada visualização dos resultados da actividade
enzimática dos restantes eppendorfs foi elaborada uma tabela:
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 32
Tabela 3: Actividade Enzimática média para cada amostra recolhida e para cada
tempo
Eppendorf *
Poço Velocidade da reacção (min-
1) (declive)
Actividade Enzimática (UI) Desvio
Padrão Por Poço Média
Extracto
A1 0,0777 0,203
0,358 0,1409 A2 0,1511 0,394 A3 0,1831 0,478
39
H1 0,0536 0,0699
0,063 0,0139 H2 0,0556 0,0725
H3 0,0362 0,0472
40
A5 0,048 0,0626
0,057 0,0057 A6 0,0394 0,0514
A7 0,0426 0,0556
41
B5 0,0439 0,0573
0,052 0,0494 B6 0,0756 0,0986
B7 0,0001 0,00013
42
C5 0,0377 0,0492
0,049 0,0021 C6 0,0354 0,0462
C7 0,0386 0,0503
43
D5 0,0308 0,0402
0,042 0,0042 D6 0,0297 0,0388
D7 0,0357 0,0466
44
E5 0,0239 0,0312
0,030 0,0015 E6 0,0239 0,0312
E7 0,0219 0,0286
45 A4 0,0175 0,0228
0,022 0,0004 A5 0,0171 0,0223
A6 0,0169 0,0220
46
A7 0,0111 0,0145
0,015 0,0009 A8 0,0105 0,0137
A9 0,0118 0,0154
47
A10 0,0061 0,0004
0,005 0,0041 A11 0,0055 0,0072
A12 0,0059 0,0077
48
B1 0,0055 0,0072
0,007 0,0004 B2 0,0059 0,0077 B3 0,0054 0,0070
O valor médio de actividade enzimática no extracto celular é de 0,358 UI. A
soma das actividades das vária fracções é de 0,202 UI. É de salientar que este
ultimo valor referido não incluíu os eppendorfs *42, *43, *45, *46, *47, *48, tendo
sido desprezados.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 33
III – Quantificação da Proteína:
Continuamente determinou-se a concentração de proteína, tanto no
extracto não purificado como nas fracções purificadas com amidase.
Foi construída uma curva de calibração, apartir das absorvâncias lidas das
soluções padrão de BSA de diferentes concentrações . Os valores de absorvância
para cada concentração e a curva de calibração encontram-se na tabela 4 e no
gráfico 14, respectivamente.
Tabela 4: Registo da Absorvância em função da concentração de padrões de BSA
Ensaio
Absorvância (630 nm)
[Padrões] (µg/mL)
1 2 5 10 15 20 40
1 0,348 0,353 0,426 0,426 0,539 0,518 0,613
2 0,343 0,357 0,434 0,434 0,571 0,600 0,664
3 0,328 0,344 0,449 0,449 0,585 0,586 0,712
Média 0,339 0,351 0,436 0,436 0,565 0,568 0,663
Desvio Padrão
0,0104 0,0067 0,0117 0,0117 0,0236 0,0439 0,0439
Gráfico 13: Curva de Calibração de padrões de BSA
y = 0,0126x + 0,3385 R² = 0,915
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 5 10 15 20 25
Ab
sorv
ânci
a
[BSA] (µg/mL)
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 34
Logo a seguir, a absorvância do extracto não puricado e das fracções
purificadas que contêm amidase foi lida (tabela 5).
Tabela 5: Registo da Absorvância das amostras do extracto celular e das fracçoes
purificadas com amidase, nas diferentes diluições
Ensaio 1 2 3 Média Desvio Padrão
Ab
sorv
ân
cia
(6
30
nm
)
Ext
ract
o n
ão
pu
rifi
cad
o
Dil
uiç
ão
1:500 0,428 0,41 0,418 0,419 0,00902
1:1000 0,329 0,324 0,312 0,322 0,00874
1:2000 0,29 0,297 0,295 0,294 0,00361
Fra
cçõ
es p
uri
fica
das
co
nte
nd
o a
mid
ase
Dil
uiç
ão
1:1
00
Ep
pen
do
rf *
39 0,426 0,424 0,408 0,419 0,00987
40 0,394 0,405 0,379 0,393 0,01305
41 0,362 0,355 0,36 0,359 0,00361
42 0,322 0,331 0,34 0,331 0,00900
43 0,314 0,316 0,313 0,314 0,00153
44 0,347 0,347 0,347 0,347 0,0000
45 0,293 0,3 0,308 0,300 0,00751
46 0,301 0,31 0,316 0,309 0,00755
47 0,272 0,282 0,263 0,272 0,00950
48 0,315 0,316 0,304 0,312 0,00666
1:5
00
Ep
pen
do
rf *
39 0,339 0,339 0,346 0,341 0,00404
40 0,296 0,298 0,291 0,295 0,00361
41 0,281 0,291 0,288 0,287 0,00513
42 0,268 0,265 0,252 0,262 0,00850
43 0,257 0,275 0,251 0,261 0,01249
44 0,271 0,29 0,289 0,283 0,01069
45 0,309 0,311 0,326 0,315 0,00929
46 0,262 0,27 0,263 0,265 0,00436
47 0,263 0,26 0,211 0,245 0,02919
48 0,228 0,279 0,284 0,264 0,03099
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 35
1:1
00
0
Ep
pen
do
rf *
39 0,297 0,314 0,334 0,315 0,01852
40 0,285 0,281 0,286 0,284 0,00265
41 0,268 0,274 0,274 0,272 0,00346
42 0,264 0,27 0,277 0,270 0,00651
43 0,276 0,275 0,278 0,276 0,00153
44 0,284 0,262 0,268 0,271 0,01137
45 0,23 0,222 0,216 0,223 0,00702
46 0,224 0,228 0,219 0,224 0,00451
47 0,225 0,219 0,244 0,229 0,01305
48 0,244 0,235 0,234 0,238 0,00551
Com os valores obtidos e a curva de calibração da proteína calculou-se a
concentração de proteína.
No caso do extracto não purificado, foi utilizado o valor da diluição 1:500,
sendo a menor diluição em que absorvância cai dentro da gama dos valores dos
padrões. Então:
[ ]
[ ]
[ ]
Multiplicando pelo facto de diluição:
[ ]
Voltando a multiplicar o valor anterior por 3mL, correspondente ao volume
de extracto purificado na coluna cromatográfica, tem-se:
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 36
Em relação às fracções purificadas que contêm amidase, a diluição
utilizada foi de 1:100, sendo a menor diluição cuja absorvância cai dentro da gama
dos valores padrão. Como cálculo exemplo foi utilizado o eppendorf *39. Então:
[ ]
[ ]
[ ]
Multiplicando pelo facto de diluição:
[ ]
Voltando a multiplicar o valor anterior por 1,5mL, correspondente ao
volume de cada eppendorf, tem-se:
Procedendo de igual modo para as restantes fracções, obtiveram-se os
seguintes resultados:
Tabela 6: Quantidade de proteína nas fracções purificadas que contêm amidase
Eppendorf * Proteína (mg)
39 0,959
40 0,649
41 0,244
42 -0,089
43 -0,292
44 0,101
45 -0,458
46 -0,351
47 -0,792
48 -0.315
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 37
É de salientar os valores negativos para as fracções *42, *43, *45, *46, *47 e
*48. Estes valores foram desprezados para o cálculo total de proteína.
O valor de proteína no extracto é de 9mg e o total de proteína para as várias
fracções com amidase é de 1,95mg.
IV – Corrida cromatográfica, rendimento e factor de purificação:
Para resumo de todos os resultados obtidos anteriormente o próximo
gráfico mostra o cromatograma e a actividade enzimática.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 38
Gráfico 15: Cromatograma e actividade enzimática ao longo do tempo de eluição
As fracções *5 a *10 foram incluídas no gráfico, em que o valor foi
determinado como zero.
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 39
Foram determinados os parâmetros associados ao processo de purificação,
o rendimento (ɳ) e o factor de purificação, respectivamente:
As actividades enzimáticas específicas foram determinadas:
Tabela7: Purificação ilustrativa do processo
Proteína
(mg)
Actividade Enzimátic
a (UI)
Actividade Enzimática Específica (UI/mg
proteína)
ɳ (%)
Factor de purificação
Extracto não purificado
9 0,358 0,0398
56 2,61 Fracções purificantes com amidase
1,95 0,202 0,104
Trabalho nº2
Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 40
Discussão e Conclusão
Neste trabalho analisámos os parâmetros relacionados com a estirpe
recombinante em estudo, Escherichia coli pKK223-3 AI3, e a técnica de purificação
por cromatografia de afinidade, tais como: a separação e purificação da amidase
produzida pela bactéria por esta técnica, a actividade enzimática no início e da
amidase purificada, a quantidade de proteína no início e após purificação, o
rendimento do processo e o factor de purificação.
A purificação da amidase produzida pela Escherichia coli recombinante, por
cromatografia, foi a primeira parte do trabalho. Verifica-se pelo gráfico 1, a
absorvância foi aumentando rapidamente e foram necessários cerca de 39mL de
tampão TME para diminuir a absorvância para um nível mais baixo e estável,
indicando que todo o conteúdo do extracto enzimático celular que não foi
absorvido pela coluna cromatográfica foi eluído até esse ponto. Os valores de
absorvância voltaram a aumentar gradualmente com a mudança da fase móvel. O
aumento gradual da concentração de KCl no tampão TME alterou a carga à
superfície da fase estacionária, perdendo as suas características de afinidade com o
substracto, a enzima amidase e outras proteínas e enzimas; assim, foram sendo
gradualmente libertados os compostos com afinidade. Observou-se um pico, no
início da eluição com KCl 75mM, correspondente a um máximo de absorvância,
indicando que a amidase devia estar a ser eluída nessa altura; então foram
guardadas as fracções correspondentes, *38 a *48, para posterior análise. O gráfico
do cromatograma indica que mais proteína com afinidade para a coluna estava a
ser eluída, devido às oscilações na absorvância observadas no cromatograma.
Seguidamente, executou-se a análise da actividade enzimática. Foram
analisados o extracto celular enzimático não purificado, as fracções recolhidas no
início do cromatograma (*5 a *10) e as fracções purificadas *39 a *48,
correspondentes ao pico observado no cromatograma. Nas primeiras fracções não
foi observada actividade enzimática, sendo de esperar porque nesta fase da
cromatografia a coluna continua com as suas propriedades que lhe possibilita ter
afinidade com a enzima e assim absorvê-la. Para o extracto celular não purificado e
para as fracções purificadas com amidase foram feitos os cálculos para a
determinação das actividades enzimáticas que são 0.358 UI e 0.202 UI,
respectivamente. O valor somatório das fracções com actividade enzimática
deveria ser igual ou menor que o valor da actividade do extracto celular, sendo o
resultado obtido. A amidase, quando é eluída, é recolhida em várias fracções de
1.5mL, e não numa só. A soma das actividades de todas as fracções deveria obter-
se um valor bastante próximo do extracto, não tendo acontecido isto
possivelmente por ter sido eluída alguma amidase noutras fracções recolhidas mas
que não foram analisadas, fazendo com que o valor total tenha sido mais baixo.
Analisou-se a actividade em todas as fracções de *5 a *10 e de *32 a *64, mas
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Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 41
algumas não foram aqui tratadas graficamente e na elaboração dos cálculos pelo
facto de análise destas mostrar a ausência de actividade, sendo um método de
garantia desta ausência; apesar de serem mostrados os resultados (tabela 2)
apenas foram tratados as fracções *39 a *48.
Na determinação da quantidade de proteína, foram testados o extracto
enzimático celular e as fracções purificadas com amidase, sendo detectados 9mg e
1,95mg de proteína, respectivamente. Verifica-se, e era esperado, que o menor
valor de proteína é nas fracções e não no extracto, pois o extracto não possui
apenas a enzima que se esteve a purificar mas também uma grande diversidade de
proteínas, enquanto que as fracções analisadas supostamente possuem apenas a
amidase. Obteve-se valores negativos de proteína para eppendorf *42, *43, *45,
*46, *47 e *48, pois os valores de absorvância na menor diluição relativos a estes
estavam fora dos limites da curva de calibração dos padrões de BSA utilizada. Estes
valores foram desprezados tanto na soma da quantidade de proteína como na
soma das actividades enzimáticas.
Para finalizar, foi construído o gráfico 15, mostrando a cromatografia e
actividade ao longo desta. As primeiras fracções não continham actividade
enzimática, sendo esta zero, e esta manteve-se assim até perto do ponto da eluição
com KCl 75mM, quando a amidase foi eluída; assim observa-se um rápido aumento
da actividade enzimática, seguida de também de uma rápida diminuição da mesma,
porque a enzima é rápida e facilmente eluída. O rendimento foi determinado e foi
de 56%, sendo considerado já um bom valor, e o factor de purificação foi de 2.61,
em que as fracções purificadas têm 2.61 vezes mais actividade enzimática que o
extracto celular, para a mesma quantidade de proteína.
Como conclusão, o processo de purificação foi bem realizado porque houve
separação da amidase, proteína de interesse neste trabalho, dos restantes
componentes. Esta ficou ligada à coluna e só foi eluída quando o tampão TME com
KCl 75mM foi utilizado. Obteve-se um bom rendimento, 56%, mas um factor de
purificação um pouco baixo, 2.61. A soma das actividades das fracções purificadas,
0.202 UI, é um valor menor mas próximo do valor da actividade para o extracto
celular (não purificado), 0.358, como o esperado; acontecendo o mesmo para a
quantidade de proteína, que foi menor nas fracções, 1.95mg, do que no extracto
celular, 9mg.
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Tecnologia de Enzimas |Évora, 7 de Novembro de 2012 42
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