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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Marcos Augusto Souza Rodrigues da Silva
“Aplicação da espectroscopia Raman no diagnóstico do Câncer de Próstata.
Estudo in vitro”
São José dos Campos, 2009
Marcos Augusto Souza Rodrigues da Silva
“Aplicação da espectroscopia Raman no diagnóstico do Câncer de Próstata. Estudo in vitro”
Dissertação de Mestrado apresentada no Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco Co-orientador: Prof. Dr. Flávio Aimbire Soares de Carvalho
São José dos Campos, SP, 2009
s58 ÌSilva, Marcos Augusto Souzâ Rodrigues da
"Aplicação dâ espectroscopia Ramaìr no diagnóstico do Càlcerde Próstata. Estudo in vitro'7 Marcos Augusto Souza Rodrìgues daSilva; Orientadores: Orientador: Prof. Dr. Mârcos Tadeu TavaresPaclìeco, Prof. Dr. Flávio Aimbire Soares de Carvalho São Josédos Campos,2009.
1 disco laser: coìor.
DisseÌ1ação de Meslrado apÌesentada ao Progfama de Pós-Graduação em Engenhariâ Biomédica do Institulo de Pesq[isâ eD€senvolvimenlo daUoiversidâde do Vale do Paraíba,2009.
1. Râman, Espectroscopia 2. Próstata 3- Biópsia ópticaL Pachoco, Mârcos Tadeü Tavares, Orient. IL Carvâlho, IlávioAimbire Soares de IIl. Título
CDU:616-076
Aütorizo excltÌsivamente pâm fins
desta dissertação, por processos
citada a fonte.
acadêmicos e científicos, a reprodução totaì oÌl parciaÌ
fotocopiadores ou hansmissão eletrônica, desde que
Rodrigues da Silva
Campos,20 de Março de 2009.
MARCOS AUGUSTO SOUZA RODRIGUES DA SILVA
"ApLIcAÇÃo DA EsPEcrRoscoPla R{MAN No DIAGNósrICo Do CÂNCER DE
PRÓSTATA. ESTIJDO IN V11'RO.'
Disseltação aprovada como requlstro parcial à obtenção do gmu de Mestrç em Engenhal'la
B:iomédica, do Programa de Pós-Graduação em EÍgenharia Biomédica' do lnstjtuto de Pesqúsa
e DeseDvolvimento da Universidade do Vale do Parâíba, São José dos Campos' SP' p€la seguinte
banca examinadora:
Prot Dr. ALDERICO RODRIGUES DE PAULA
Profl. Dra. RENATA AMADEI NICOLAU (UNIVAP)
Prof. Dr. MIGUEL ANGEL CASTILLO SALGADO (UNESP)
Prof. Dra. Sandra Maria Fonsecâ da Costa
Diretor do lP&D UniVaP
São José dos Campos, 20 de março de 2009.
Dedico este trabalho ao solicito amigo,
Renato Aparecido de Souza, mestre por
excelência, pois prontamente me socorreu em
momentos de “crise cientifica”.
Agradecimentos
AO SENHOR DEUS, O TODO PODEROSO.
MINHA METADE (Aline) querida, professora, companheira, irmã, esposa, amante...
Ao meu Filho Lucas Augusto.
À minha Querida Família, Minha Mãe Sebastiana; ao Meu Pai Joaquim; aos meus irmãos: Nalva, Marcelo, Joaquim, Robson, Regiane, Felipe e Milena; aos meus Sogros: Vicente e
Elenice; aos cunhados: Rogério, Junior e Andressa e aos sobrinhos: Bruno, Jéssica, Gabriel_1 e Gabriel_2.
Ao Reitor da Universidade do Vale do Paraíba, Prof. Dr. Baptista Gargione Filho.
À Diretora do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba,
Profª. Dra. Sandra, pela oportunidade e apoio oferecido durante o mestrado.
Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco e Prof. Dr. Flávio Aimbire pela orientação.
À Profª. Dra. Renata Nicolau Amadei pela oportunidade de concessão da bolsa Capes.
Ao Prof. Dr. Landulfo Silveira Junior pela oportunidade, confiança em mim depositada, apoio intelectual e paciência durante todo decorrer deste trabalho.
À Profª. Dra. Kátia Ramos Moreira Leite e Prof. Dr. Carlos Augusto Gonçalves Pasqualucci,
pela total dedicação na coleta das amostras e análise histopatológica.
À Profª. Aline Aparecida Guimarães Rodrigues da Silva pela disposição em ajudar com as complicadas letras do Português, pelo apoio intelectual e seu carinho na revisão desta
dissertação.
Ao Urologista Ricardo Matias pela amizade, apoio e dedicação técnica.
Aos pacientes e seus familiares que acreditaram nesta pesquisa, sem os quais seria impossível sua realização.
“Quem se acha importante será humilhado e quem se humilha será exaltado”
Jesus Cristo, Filho de Deus.
“Aplicação da espectroscopia Raman no diagnóstico do Câncer de Próstata. Estudo in vitro”
RESUMO
O Câncer da próstata (CaP) se tornou para os homens um sério problema de saúde mundialmente importante. Este trabalho propôs o diagnóstico por Espectroscopia Raman no infravermelho próximo para diferenciar os tecidos da próstata entre normal e CaP, para tal foram obtidos por prostatectomia radical in vivo e post mortem, para estudo in vitro. Para caracterização dos espectros Raman, foi usado o laser de diodo em 830nm como fonte de excitação. A potência do laser utilizada foi de 80 mW, os dados foram obtidos com 50s de acumulação numa resolução inicial de 8cm-1. Os sinais Raman foram coletados por um detector de silício tipo CCD (Charge Couple Device) resfriado por nitrogênio líquido. Um total de 34 amostras (20 normal e 14 CaP) foram utilizadas neste trabalho. A histopatologia classificou os tecidos em normal e CaP. Um algoritmo baseado em Análise dos Componentes Principais (PCA) e Distância de Mahalanobis (MD), foi desenvolvido para separar os espectros de acordo com as diferenças observadas nos primeiros quatro componentes principais. Foi observado os achados nas maiores diferenças espectrais entre normal e CaP nas faixas Raman atribuídas à proteínas, lipídios e ácido nucléico. O diagnóstico por algoritmo polinomial de ordem 3, baseado nas características espectrais com PCA, mostrou sensibilidade e especificidade de 100%. Este resultado mostrou que a Espectroscopia Raman é uma potencial ferramenta para classificar e identificar as mudanças bioquímicas que acontecem no tecido com CaP quando comparado com normal. Palavras chaves: Espectroscopia Raman, Câncer, Próstata, Diagnóstico, Análise dos Componentes Principais (PCA), Distância de Mahalanobis (MD)
"Application of Raman spectroscopy in the diagnosis of prostate cancer.
Study in vitro "
ABSTRACT Prostate cancer (CaP) has become an important a health problem worldwide. Raman spectroscopy has been used to differentiate normal and neoplastic human prostate tissue samples in vitro. This paper proposes to study the use of the Near-infrared Raman spectroscopy for differentiate between healthy and CaP fragments of human prostate tissues in vitro removed from radical prostatectomy. It was used a Raman spectrometer with 80 mW and 830 nm excitation from a diode laser, an imaging spectrograph and a liquid-N2 cooled CCD for collecting Raman scattering signal. A total of 34 samples of prostate tissue (20 healthy and 14 diagnosed with CaP) scanned, with 50s exposure time for each spectrum collection. Tissues were classified in normal and CaP and an algorithm based on Principal Component Analysis (PCA) and Mahalanobis Distance (MD), were developed to separate spectra according to differences observed in first four principal components. It was observed that the greatest spectral differences between normal and CaP tissues were found in the Raman bands attributed to protein, lipids and nucleic acids. Diagnostic algorithm polinomial of order 3, based on the spectral features extracted with PCA showed sensitivity and specificity of 100%, indicating the Raman spectroscopy is a powerful technical capability to classify and identify the biochemical changes that occur in the presence of CaP when compared with normal tissue.
KeyWords: Raman spectroscopy, Prostate, Cancer, Laser, Diagnosis, Principal Component Analysis (PCA), Mahalanobis Distance (MD)
Lista de Figuras
Figura 1. Posição anatômica da próstata. .................................................................................14
Figura 2. Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2009, exceto pele não melanoma,
na população brasileira......... .............................................................................................. ......16
Figura 3. Processo de criação de um padrão x a partir de uma imagem...................................20
Figura 4. Retirada de uma amostra de tecido prostático da zona periférica (PZ), seccionada da área onde supostamente havia tumor........................................................................................22
Figura 5. Foto A: laser incidindo na amostra, a seta mostra o ponto exato de contato e a marcação com tinta nanquim. Foto B: Lâmina histológica, recorte circular mostrando o ponto de contato do laser na amostra, demarcado com tinta nanquim... ............................................22
Figura 6. Diagrama esquemático do Raman dispersivo. ..........................................................23
Figura 7. Ícones dos programas. Excel®, Matlab 6.2 e RamaCaP® . .....................................24
Figura 8 Espectros Raman obtidos de tecido prostático in vitro. Linha preta (CaP): tecido prostático tumoral (n=14); Linha cinza: tecido prostático normal (n=20); linha preta horizontal apontando para os números representantes das bandas Raman.. ...........................26
Figura 9. Gráfico de comparação com picos Raman e alterações bioquímicas em tecido prostático (N e CaP), correlacionando os picos Raman com as intensidades dos grupos. O espectro cinza representa a média (n=20) do grupo normal (N). O espectro preto representa a média (n=14) do grupo com câncer de próstata (CaP).. ...........................................................26
Figura 10. Análise dos primeiros quatro vetores dos componentes principais do conjunto de dados de treinamento usado no modelo. Características apontadas representam os picos de todos os componentes principais relacionados às faixas Raman das amostras.... ....................29
Figura 11. Análise do PC1, PC2 e PC3 dos componentes utilizados como treinamento do conjunto de dados dos 34 espectros Raman. As curvas da Distância de Mahalanobis separam os pontos de dados em grupos diferentes. Triângulo cinza representa tecido normal (N); o quadrado preto representa o câncer (CaP); e as curvas em preto representam a Distância de Mahalanobis (MD)............ .......................................................................................................29
Lista de Tabelas
Tabela 1. Parâmetros de aquisição dos espectros Raman............................................... 24
Tabela 2. Picos Raman relacionados às alterações moleculares de tecido prostático. ... 28
Tabela 3. Sensibilidade e Especificidade dos resultados................................................ 31
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos
ER Espectroscopia Raman Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation CCD Charge Couple Device SERS Surface Enhanced Raman Scattering IR Infrared (Infravermelho) NIR Near Infrared (Infravermelho próximo) UV Ultravioleta PCA Principal Components Analysis DNA Deoxyribose nucleic acid (Ácido desoxirribonucléico) RNA Ribonucleic Acid (Ácido Ribonucléico) C Carbono H Hidrogênio O Oxigênio N Prostáta Normal CaP Carcinoma de Próstata MHz Mega Hertz cm-1 1/Centímetro µm Micrômetro nm Nanômetro
mW mili Watt Ác. Ácido AN Ácido Nucléico
Sumário
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................14
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................17
2.1 Espectroscopia Raman e aplicações biomédicas ..............................................................18
2.2 Análise dos Componentes Principais – PCA ....................................................................20
2.3 Distância de Mahalanobis – MD ......................................................................................20
3 OBJETIVO ...........................................................................................................................21
4 METODOLOGIA ................................................................................................................22
4.1 Calibração e Processamento dos espectros Raman..........................................................24
4.2 Calibração do deslocamento do Número de Onda ...........................................................25
4.3 Remoção da Fluorescência de Fundo ..............................................................................25
5 RESULTADOS .....................................................................................................................26
6 DISCUSSÃO.........................................................................................................................32
6.1 Trabalhos Futuros.............................................................................................................35
7 CONCLUSÃO.......................................................................................................................36
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................37
ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO ....................................................................45
14
1 INTRODUÇÃO
A próstata é um pequeno órgão situado logo abaixo da bexiga, atravessada pela uretra,
como mostra a Figura 1, tem seu desenvolvimento estimulado pela testosterona. Confere
proteção e contém nutrientes utilizados pelo espermatozóide, em sua longa jornada até o
óvulo. Como órgão glandular, produz o líquido prostático que, somado às células
espermáticas (produzidas nos testículos) e à secreção excretada pela vesícula seminal, forma o
líquido seminal (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1989).
Figura 1. Posição anatômica da próstata. Fonte: Guyton e Hall (2006)
Além de produzir o líquido prostático, opera seu armazenamento e expulsão do
esperma durante a ejaculação. Em sua anatomia, a próstata apresenta-se envolta por uma
cápsula fibro-elástica, rica em músculo liso e soma um conjunto de 30 a 50 glândulas túbulos-
alveolares ramificadas, cujos ductos desembocam na uretra. Estas glândulas são revestidas
internamente por epitélio cúbico simples pseudo-estratificado, cujas células secretam
proteínas (GUYTON; HALL, 2006).
15
As glândulas prostáticas dividem-se em três grupos: mucosas, submucosas e
principais; em três regiões separadas, situadas concentricamente em volta da uretra. Destas, as
glândulas prostáticas principais são as que mais contribuem para a secreção prostática.
A próstata pode ser acometida por tumores benignos, malignos primários e
secundários, de vários tipos e linhagens. Porém, por sua alta frequência, o tumor maligno que
possui uma relevante importância clínica é o adenocarcinoma da próstata. Nos estágios
iniciais, limita-se à próstata, porém, sem o tratamento adequado, pode invadir órgãos
adjacentes como vesículas seminais, uretra e bexiga, bem como disseminar-se para órgãos
distantes como ossos, fígado e pulmões, tornando-se incurável. (SROUGI; SIMON, 2006).
Este adenocarcinoma atinge aproximadamente 50% dos indivíduos com 80 anos. Em
decorrência deste fato, provavelmente será o tipo de câncer que, alcançará incidência muito
maior nos homens que alcançarem a idade de 100 anos (SROUGI; SIMON, 2006).
O câncer de próstata (CaP) é encontrado em um número elevado de indivíduos, sem
lhes causar qualquer mal. Ao examinar-se a próstata de qualquer homem em idade entre 60 e
70, anos que faleceram sem doença prostática aparente, encontrar-se-á em 24% destes, focos
cancerosos. Contudo, apenas 11% dos indivíduos nesta faixa etária apresentam, em vida,
problemas com câncer de próstata. Tal estatística aponta que, 13% dos tumores neste grupo
possuem um caráter indolente, não se manifestando clinicamente. Por conseguinte, seus
portadores morrem com o câncer, mas não de câncer (SROUGI; SIMON, 2006).
No Brasil, as estatísticas apontam o carcinoma de próstata como a principal causa de
óbito no sexo masculino. De acordo com o Instituto Nacional de Câncer (INCA), o câncer
prostático é uma doença que, pode surgir a partir dos 40 anos; apresentando maior incidência
com o avanço da idade (INCA, 2008).
Nas últimas décadas, o câncer de próstata tornou-se um problema relevante de saúde
pública no Brasil, sendo a neoplasia mais freqüente no sexo masculino (figura 2).
16
Figura 2. Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2009, exceto pele não melanoma, na população brasileira. Fonte: INCA (2008).
O INCA estima que, em 2009, surgirão 49.530 novos casos. A incidência do CaP é a
mais alta em países desenvolvidos comparados a nações em desenvolvimento (JEMAL et al.,
2007; ZEIGLER-JOHNSON et al., 2008), com uma relação de incidência/mortalidade que
varia de 0,13 nos E.U.A para 0,80 na África. Mais que qualquer outro tipo de câncer o CaP é
considerado um câncer do ancião pois acomete homens com mais de 65 anos de idade
(ZERBIB et al., 2008).
17
2 REVISÃO DE LITERATURA
Técnicas de Espectroscopia Raman têm sido utilizadas para análise de tecidos
biológicos, apresentando resultados bastante confiáveis, uma vez que as bandas são sensíveis
à variação da estrutura molecular, diferenças no grupo molecular analisado, podendo ser
facilmente identificadas, tendo em vista que, a unicidade de massa e constante de força
características do espectro Raman de uma dada amostra, consistirá em picos característicos a
esta determinada molécula e sua composição correspondente (LOPES et al., 2007).
Nunes et al. (2003) aplicaram a Espectroscopia Raman como técnica diagnóstica de
lesões malignas em biópsias de pele humana. Amostras de pele normais e com carcinoma do
tipo basocelular foram analisadas, sendo possível a observação de diferenças espectrais entre
os tecidos normais e malignos. A Espectroscopia Raman se apresentou adequada para
aplicações em peles humanas, pois não se obteve interferências da fluorescência, e os
resultados corresponderam às expectativas em relação à técnica utilizada.
Pode se considerar que a espectroscopia Raman, para identificação de lesões
ateroscleróticas em humanos, foi descrita por Nogueira et al. (2005). Os espectros foram
capazes de fornecer as informações bioquímicas das artérias, auxiliando na identificação do
grau e da evolução da doença. Os estudos também demonstraram que, é possível utilizar os
resultados obtidos com o Raman para a identificação de artérias carótidas humanas in vitro.
Estes resultados sugerem que a Espectroscopia Raman pode ser considerada uma excelente
técnica de diagnóstico, diferenciando as partes saudáveis das artérias de partes patológicas
especificas. O espectro Raman é, portanto, a “impressão digital” da molécula, expressão
conhecida como “fingerprint”, demonstrando assim, suas informações bioquímicas
especificas. (SILVEIRA, 2001).
18
2.1 Espectroscopia Raman e aplicações biomédicas
A Medicina, para muitos estudiosos, é a ciência que esta firmemente ligada aos
fundamentos das Ciências Biológicas, que traça sua evolução a partir das Ciências Exatas
como Química, Física e Matemática.
A exemplo desta interação entre Ciências Biológicas e Exatas, a Espectroscopia
Raman se torna uma ferramenta potencialmente importante na análise química na área
médica, permitindo futuramente, a detecção, o monitoramento e o estudo das patologias
humanas in vivo promovendo diagnóstico em tempo real (PARKER, 1971; MIZUNO et al.,
1994; FELD et al., 1995; MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN
et al, 1998; MANOHARAN et al, 1998; PAPPAS, 2000; HAKA et al., 2006, KENDALL
et al., 2003; MOLCKOVSKY; WONGKEESONG; SHIM; WILSON, 1996; GNIADECKA et
al., 2004; SOUZA et al., 2003; CROW et al., 2004; STONE et al., 2004; KAST et al., 2007).
Idealmente, todos os procedimentos diagnósticos deveriam ser não invasivos. No
entanto, não é a realidade dos métodos atuais de análise histopatológica. Tais métodos
analisam o tecido cirurgicamente removido, antes do diagnóstico final.
Em amostras de tecidos biológicos, uma fina secção do tecido removido é examinada
pelo patologista, que identifica os elementos essenciais das patologias como: grau de
diferenciação celular, anormalidades celulares e nucleares, invasão, fibroses podem trazer
várias controvérsias. (BOSTWICK; MONTIRONI, 1997; ROBBINS et al. 2000;
ALLSBROOK et al., 2001a, 2001b; MURPHY; MCKIERNAN; OLSSON, 2004; DEAN;
NELSON, 2008).
Estas informações espectrais são altamente poderosas na caracterização biomédica,
podendo ser distribuída por toda a região do infravermelho do espectro eletromagnético.
19
No entanto, a chave do problema se encontra na elucidação de um método de
avaliação, das informações vibracionais extraídas a partir do espectro de amostras complexas
como são as biológicas (MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-KORTUM; 1996;
MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al., 1998; LASCH,
KNEIPP, 2008; LIN; LI; CHENG, 2007; MOREIRA et al., 2008).
A Espectroscopia Raman tem sido utilizada extensivamente em biologia e bioquímica,
para estudar as estruturas e dinâmicas funcionais de importantes moléculas. As posições e
intensidades relativas às diversas bandas do espectro Raman, podem ser utilizadas na
identificação de grande parte das estruturas biológicas moleculares (CARDEN et al., 2000;
PILOTTO et al., 2001; SILVEIRA, 2001; DUARTE et al., 2002; NOGUEIRA et al., 2005).
A Espectroscopia Raman é uma técnica rica em informações que podem ser aplicadas
à maioria das biomoléculas. O comprimento de onda normalmente utilizado no sistema
Raman, o infravermelho próximo, reduz o efeito da fluorescência dos tecidos; promovendo
menos degradação fotolítica nas amostras, permitindo assim a utilização de uma maior
potência no laser (PAULA; SATHAIAH, 2004).
A espectroscopia Raman ou “biópsia óptica” foi utilizada para a análise de regiões
teciduais suspeitas. O método não exige longa preparação das amostras, e com resultados em
tempo real revela-se uma técnica promissora para diferenciação dos vários estados
patológicos (SILVEIRA, 2001).
Os traumas físicos e psicológicos associados aos exames, o alto custo de detecção e a
freqüente exposição à radiações, têm motivado o desenvolvimento de técnicas ópticas para
vários diagnósticos (SATHAIAH et al., 1998; LIMA et al., 2000, 2004).
Assim, a espectroscopia Raman vem se tornando a técnica espectroscópica de escolha
no estudo do CaP, devido à sua alta especificidade e sensibilidade (STONE et al 2002a,
2002b; CROW et al., 2004).
20
2.2 Análise dos Componentes Principais – PCA
PCA é uma ferramenta utilizada para classificação de amostras espectrais, utilizando
integralmente o espectro. Para tanto, o PCA utiliza-se de um conjunto de espectros de
“treinamento”, não exigindo nenhum conhecimento da composição das amostras a serem
analisadas. A análise é baseada na idéia de que vários fatores influenciam na obtenção dos
espectros, porém, nem todos os fatores representam as alterações no espectro observado
(somente as diferenças na composição da amostra). Com isto, pode-se encontrar um número
de fatores contributivos para detecção das diferenciações espectrais observadas. Sendo uma
melhor opção quando comparada à seleção manual dos fatores.
Figura 3. Processo de criação de um padrão x a partir de uma imagem Fonte: Romdhani (1996).
A Figura 3 ilustra didaticamente o processo de criação de um padrão x, a partir de uma
imagem facial. Importa perceber, que esta é apenas uma representação, pois em imagens reais,
o pixel não possui contorno.
2.3 Distância de Mahalanobis – MD
Opção relevante na separação de grupos, o MD é um discriminador que opera um
modelo matemático útil na determinação da semelhança de um conjunto de valores de um
grupo de amostras, em comparação a outro grupo para análise distinta (MAESSCHALCK;
JOUAN-RIMBAUD; MASSART, 2000). Esta ferramenta matemática compara a distância de
um ponto observado, aos pontos que incluem o espaço modelo, que permanece fixo durante a
calibração, quando um conjunto de treinamento for estabelecido. (CIACCIO; DUNN; AKAY,
1994).
21
3 OBJETIVO
A presente pesquisa buscou avaliar e determinar parâmetros espectroscópios ideais;
além de analisando e, qualificando os dados espectrais, através da Análise dos Componentes
Principais (PCA) e Distância de Mahalanobis (MD); visando constatar se, de fato, as
diferenças encontradas se estabeleceriam verdadeiramente válidas.
22
4 METODOLOGIA
As amostras de tecido, de próstata normal (N), foram obtidas post mortem através de
peça anatômica (cadáver). Enquanto as amostras de tecido, de próstata neoplásica, foram
obtidas in vivo de pacientes submetidos à prostatectomia radical.
Figura 4. Retirada de uma amostra de tecido prostático da zona periférica (PZ), seccionada da área onde supostamente havia tumor. Fonte: Salomon (2009).
Os espécimes foram recebidos a fresco, em período máximo de 10 minutos após a
retirada, sendo a peça imersa em solução aquosa a 0.9%, examinada e identificada. Foram
realizados cortes transversais na porção posterior, compreendendo a zona periférica (Figura
4), e um fragmento da ordem de 1 cm2, palpável com alterações de coloração. Após o
procedimento descrito acima, as amostras foram marcadas com caneta nanquim (para guiar o
patologista na análise histopatológica) e armazenadas em criotubos, conservadas em
nitrogênio líquido, à temperatura de -196ºC, até o momento do registro do Espectro Raman.
Figura 5. Foto A: laser incidindo na amostra, a seta mostra o ponto exato de contato e a marcação com tinta nanquim. Foto B: Lâmina histológica, recorte circular mostrando o ponto de contato do laser na amostra, demarcado com tinta nanquim. Fonte: Acervo do autor (2008).
23
Para coleta de dados através do equipamento Raman demonstrado na Figura 6 e os
padrões espectroscópicos ideais na Tabela 1, as amostras congeladas foram levadas à uma
sala climatizada a 20ºC, esperando para realização das medidas 10 segundos. Após a
estabilização do equipamento em 5 segundos. Somente a amostra, alvo imediato de registro
espectral, foi imersa em solução aquosa (cloreto de sódio) a 0.9%, garantindo assim a
preservação de suas características estruturais.
A Figura 6 mostra o diagrama esquemático do equipamento. A excitação do tecido foi
realizada através de um laser semicondutor de Diodo, (Micro Laser Sistemas o Inc., modelo
L4830S) operando em 830 nm com uma potência incidente de 80 mW, A luz passou por um
filtro passa-banda, passou por um prisma, que a conduziu para um pinhole e uma lente
(Newporte), potencializando o feixe laser. Fragmentos de tecido 3x3 mm foram colocados em
uma porta amostra de alumínio (Figura 5, foto A). A luz incidente na amostra foi espalhada
em um ângulo de 45o passando por um conjunto de lentes f = 100 mm (Newporte), e por um
filtro filtro “notch”, bloqueando o sinal Rayleigh. A luz espalhada é coletada pelo detector
(Chromex, modelo 2501S, 600 linhas/mm), dispersada sobre uma câmera CCD (Princeton
Instruments, modelo LN/CCD-1024-EHR1) refrigerada por nitrogênio líquido. O sinal passa
para um controlador (Princeton Instruments, ST130 modelo), onde foi enviado para um
computador.
Figura 6. Diagrama esquemático do Raman dispersivo. Fonte: Silveira et al. (2002).
24
A Tabela 1 aponta os parâmetros ajustados no equipamento, para aquisição dos espectros.
Tabela 1. Parâmetros de aquisição dos espectros Raman. Parâmetros Ópticos
Detector Silício (tipo CCD)
Refrigeração Nitrogênio líquido
Propriedade do laser Diodo
Abertura do feixe 5 mm
Potência do laser 80 mW
Comprimento de onda (λ) 830 nm
Abertura do slits 200 µm
Região de deslocamento 800 a 1800 cm-1
4.1 Calibração e Processamento dos espectros Raman
A obtenção dos espectros Raman sem artefatos está ligada ao correto procedimento de
calibração e filtragem do ruído de fundo (background), bem como à filtragem do ruído de
fóton (alta freqüência). Os softwares utilizados (Figura 7) para o manejo dos espectros foram
o Matlab® (The Mathworks, MA, USA, versão 4.2) e o Excel® (Microsoft Corporation, WA,
USA, versão 7.0), utilizando um polinômio de ordem 3, para aplicação da PCA e MD, todos
lendo arquivos do tipo ASCII formatados com separação de colunas por tabulação (extensão
.prn).
Figura 7. Ícones dos programas. Excel®, Matlab 6.2 e RamaCaP® . Fonte: Acervo do autor (2008)
25
4.2 Calibração do deslocamento do Número de Onda
Na calibração dos espectros Raman utilizou-se 7 bandas principais do naftaleno
(C10H8), pois esse solvente tem a característica de bandas intensas e bem espaçadas na região
espectral de 800 a 1800 cm-1, que é a região de interesse para a espectroscopia Raman quando
usada para análise de materiais biológicos (SILVEIRA, 2001).
4.3 Remoção da Fluorescência de Fundo
O processamento dos espectros Raman envolveu a remoção da emissão de
fluorescência de fundo (componente espectral de baixa freqüência) e a filtragem do ruído
eletrônico e ruído de fóton (componente de alta freqüência). A emissão fluorescente, sem
importância em termos de características espectrais para o Raman, foi removida por um filtro
passa-alta com a ajuda do software Matlab®, já citado anteriormente (SILVEIRA et al., 2002).
Uma interpolação polinomial de ordem 3 foi utilizada em todos os pontos do espectro,
em função do perfil de fluorescência do espectro esta interpolação foi subtraída do espectro
original, evidenciando as bandas de alta freqüência (SILVEIRA et al., 2003; NOGUEIRA et
al., 2005).
Imediatamente após a coleta do espectro Raman, as amostras foram transferidas à uma
solução de formaldeído a 10% e enviados para à análise histopatológica, realizada pelo
Laboratório de Patologia Cirúrgica e Molecular do Hospital Sírio Libanês, São Paulo,
conforme recomendações da literatura (HUMPHREY; VOLLMER, 1990; BOSTWICK;
FOSTER, 1998).
Os espectros foram coletados, armazenados e processados no Laboratório de
Espectroscopia Biomolecular, localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D),
Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Av. Shishima Hifumi, 2911, Urbanova, São
José dos Campos, CEP 12244-000, SP, Brasil.
26
5 RESULTADOS
Os espectros foram utilizados para identificar semelhanças com os espectros a serem
classificados também chamado de reconhecimento de padrões, anteriormente citado na por
Romdhani (1996).
Figura 8. Espectros Raman obtidos de tecido prostático in vitro. Linha preta (CaP): tecido prostático tumoral (n=14); Linha cinza: tecido prostático normal (n=20); linha preta horizontal apontando para os números representantes das bandas Raman.
Todos os espectros obtidos foram divididos em dois grupos: normal (N) e câncer
(CaP) distintos a partir dos dados da análise histopatológica das amostras estudadas.
Posteriormente foram realizadas as médias de cada grupo, a fim de se obter um padrão
espectral.
A inspeção visual dos espectros, na Figura 8 e 9, demonstra uma diferença
potencialmente distinta entre os grupos N e CaP. As análises objetivaram destacar as
variações de intensidade e deslocamento dos picos e faixas espectrais dos diferentes grupos,
associando os espectros às alterações bioquímicas.
27
Figura 9. Gráfico de comparação com picos Raman e alterações bioquímicas em tecido prostático (N e CaP), correlacionando os picos Raman com as intensidades dos grupos. O espectro cinza representa a média (n=20) do grupo normal (N). O espectro preto representa a média (n=14) do grupo com câncer de próstata (CaP).
Tanto os tecidos normais quanto os malignos estão sob influência de processos
bioquímicos. Portanto, possuem fatores particulares ou marcadores que podem ser usados
para diferenciá-los. Podemos entender marcadores bioquímicos, como sendo, componentes
teciduais importantes que fazem parte do metabolismo e/ou constituição celulares, como o
citrato, glicogênio, fosfolipídios, glicose e DNA (MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-
KORTUM, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al., 1998; MANOHARAN; WANG; FIELD,
1998; FORATO; BERNARDES FILHO; COLNAGO, 1998).
28
Na figura 9, as regiões demarcadas mostram o aumento da intensidade do sinal em
relação ao grupo N do CaP, e especialmente o aumento da intensidade no grupo CaP nos
picos em 863, 940, 1007, 1079, 1247, 1271, 1330, 1452, 1563 e 1665 cm-1 estas alterações
bioquímicas estão descritas na Tabela 2.
Para melhor entendimento apresenta-se na Tabela 2, as alterações bioquímicas nos
espectros Raman, acordado à literatura.
Tabela 2. Picos Raman relacionados às alterações moleculares de tecido prostático. Picos (cm-1) ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS Referências
863 Colágeno Tirosina/prolina Stone et al. (2004)
940 Proteína (glicogênio), prolina e valina Stone et al. (2004)
1007 Anel de fenilalanina Mahadevan-Jansen et al. (1998) Stone et al. (2004)
1079 Proteína e lipídios Stone et al. (2004)
1247 Amido III (colágeno) e ácido nucléico Mahadevan-Jansen et al. (1998) Stone et al. (2004)
1271 Amido III da proteína Stone et al. (2004)
1330 Colágeno, lipídio e DNA Mahadevan-Jansen et al. (1998) Stone et al. (2004)
1452 Proteína, lipídios Stone et al. (2004)
1563 Ácido nucléico Mahadevan-Jansen et al. (1998)
1665 Amido I e lipídios Mahadevan-Jansen et al. (1998) Stone et al. (2004)
29
A Figura 10 aponta o cálculo dos quatro primeiros PCs do conjunto espectral de dados
do treinamento. O conjunto de dados de treinamento, que utilizou os quatro primeiros PCs;
identificou aproximadamente 95% de todas as variações espectrais. Fato oriundo da
concentração das principais informações utilizadas pelo conjunto de treinamento.
Os testes estatísticos aplicados aos espectros, sendo PCA e MD serviram para validar
diferenças espectrais, desenvolvendo algoritmos matemáticos para classificação dos espectros
de acordo com análise histológica.
Figura 10. Análise dos primeiros quatro vetores dos componentes principais do conjunto de dados de treinamento usado no modelo. Características apontadas representam os picos de todos os componentes principais relacionados às faixas Raman das amostras.
As variáveis representam a intensidade de todos os PCs formadores do espectro. Cada
PC representa matematicamente os espectros, contendo as informações bioquímicas mais
relevantes presentes nos tecidos (SILVEIRA et al., 2002).
De acordo com a Figura 11, o primeiro componente (PC1) tem a maioria das
características que podem ser relacionadas aos picos em 863, 940, 1007, 1079, 1452 e 1665
cm-1. O segundo (PC2) tem características dos picos em 1330, 1452 e 1563 cm-1. O terceiro
30
(PC3) tem características dos picos em 1247 e 1271 cm-1. O quarto componente (PC4) não
provêem de nenhum pico importante para identificação de tecido.
Discriminadora, a Distância de Mahalanobis (MD) pode ser aplicada na separação das
classes de qualquer conjunto de dados. A MD de cada grupo foi calculada para todos os
quatro PCs (MAESSCHALCK; JOUAN-RIMBAUD; MASSART, 2000).
O algoritmo de diagnóstico realizou a operação a distinção dos espectros em dois
grupos, construiu superfícies de separação baseados na MD, que calculou os “scores” do par
selecionado (figura 11). As superfícies de separação são os “scores” que representam a
Distância de Mahalanobis dos grupos N entre CaP.
Com a finalidade de observar, se estes dados quando agrupados, promoveriam a
separação dos grupos de acordo com o tipo histopatológico; todos os espectros observados
foram dispersos. Seguem os gráficos dos resultados da análise MD.
Figura 31. Análise do PC1, PC2 e PC3 dos componentes utilizados como treinamento do conjunto de dados dos 34 espectros Raman. As curvas da Distância de Mahalanobis separam os pontos de dados em grupos diferentes. Triângulo cinza representa tecido normal (N); o quadrado preto representa o câncer (CaP); e as curvas em preto representam a Distância de Mahalanobis (MD).
31
As MDs mais significantes, utilizaram o primeiro PC1 com segundo PC2; primeiro
PC1 com um terceiro PC3 e; segundo PC2 e terceiro PC3, do conjunto de dados de
treinamento (PC1 x PC2, PC1 x PC3 e PC2 x PC3, respectivamente). A Figura 11 estabelece
relação com a Tabela 3 que confirma a utilização de todas as informações espectrais contidas
nos PCs, há uma distinção, bem definida, entre os dados dos grupos N e CaP.
Tabela 3. Sensibilidade e Especificidade dos resultados. PCA*
Sensibilidade (%) Especificidade (%)
Normal (n=20) 100 100
Câncer (n=14) 100 100
* PCA: Análise dos Componentes Principais
Os índices de sensibilidade e especificidade para o algoritmo de diagnóstico como
descrito por Weiss (1986). A análise dos dados do grupo de treinamento (Figura 11) mostrou
que entre as 20 amostras do grupo N, 20 foram classificadas verdadeiramente como normais;
e entre as 14 amostras do grupo CaP, 14 amostras foram classificadas verdadeiramente CaP;
indicando 100% de distinção em ambas as situações, conforme Tabela 3.
32
6 DISCUSSÃO
A taxa de mortalidade de pacientes com CaP é relativamente baixa, o que
parcialmente, reflete seu bom prognóstico (MAKAROV et al., 2009). Embora tendo um
prognóstico relativamente bom se diagnosticado precocemente, o CaP ainda permanece sendo
o tipo de neoplasia mais prevalente em homens e continua acarretando um grave problema de
saúde pública no mundo (JEMAL et al., 2007). Atualmente, os métodos de avaliação e
monitoramento do CaP, tais como o teste de PSA, não promovem com total sucesso e eficácia
a redução da mortalidade e, além disso, alguns procedimentos cirúrgicos são conduzidos
desnecessariamente, resultando em gastos financeiros adicionais e reduzindo a qualidade de
vida desses pacientes (INCA, 2008). Nesse contexto, fica claro a necessidade do
desenvolvimento de novas tecnologias aplicadas no tratamento e especialmente na prevenção
do CaP.
Recentemente, alguns autores tem investigado o CaP por espectroscopia Raman (ER)
(STONE et al., 2004; CROW et al., 2003b, CROW et al., 2005b). O principal resultado
desses estudos foi à confirmação do emprego da ER como técnica para diferenciação entre o
tecido prostático normal e o CaP. No presente estudo foi apresentado um algoritmo de
diagnóstico baseado em escores de PCA utilizando-se da ferramenta estatística MD como um
discriminador, objetivando desenvolver um método simples e rápido para identificar achados
de normalidade e malignidade em amostras de tecido prostático. Tendo em vista que as
mudanças químicas precedentes e que acompanham as alterações morfológicas teciduais são
extremamente complexas (BIRD et al., 2008), técnicas multivariadas podem ajudar no
diagnóstico do espectro Raman e proporcionar a extração do máximo de informações
possíveis para facilitar os achados, utilizando o mínimo de componentes espectrais (HALON
et al., 2000).
33
A técnica PCA tem sido empregada com sucesso na análise espectral de amostras
biológicos objetivando o diagnóstico de doenças (NOGUEIRA et al., 2005). Essa análise
identifica e extrai grandes tendências dentro de um determinado conjunto de dados espectrais,
gerando um pequeno conjunto de componentes principais, como forma de condensar todas as
informações espectrais com o mínimo de informações perdidas (RAMANUJAM et al., 1996a,
1996b; MAHADEVAN-JANSEN et al., 1998). Dessa forma, tem sido demonstrado que os
escores de PCA aplicados ao espectro Raman podem ser usados para classificar amostras
normais e patológicas quando associado a uma ferramenta estatística discriminante, como MD
e PCA (OLIVEIRA et al., 2006). A espectroscopia Raman (ER) foi aplicada para caracterizar
pré-cancer cervical (MAHADEVAN-JANSEN et al.,1998), para identificar o estágio da
aterosclerose em artérias coronárias humanas (ROCHA et al., 2007), para discriminar tecido
neoplasico da mucosa do cólon (CHOWDARY et al., 2007), patologias do tecido da glândula
paratireóide (DAS et al., 2006), câncer de mama (CHOWDARY et al., 2006), câncer de pele
(SIGURDSSON et al., 2004), câncer de esôfago e bexiga (STONE et al., 2008).
Como uma ferramenta estatística, a MD é um modo muito útil para encontrar a
semelhança de um conjunto de valores a partir de um grupo de amostras, em comparação com
outro grupo de análise discriminante (MAESSCHALCK; JOUAN-RIMBAUD; MASSART,
2000; SILVEIRA et al., 2002; SILVEIRA et al., 2003; NOGUEIRA et al., 2005). Em um
estudo anterior, a MD foi aplicada para classificar os espectros Raman da aterosclerose com
alta sensibilidade e especificidade (SILVEIRA, 2001).
No presente estudo verificou-se que o cálculo de sensibilidade e especificidade para
o grupo CaP foi de 100%. Os espectros deste grupo têm características espectrais que podem
ser utilizadas na classificação discriminante do grupo de treinamento (STONE et al., 2007;
CROW et al., 2005a) devido às grandes diferenças nos componentes moleculares que estão
associadas com a doença e o tecido normal (STONE et al., 2004; CROW et al., 2003a).
34
É importante notar que a formação de conjuntos de dados deste estudo foram tecidos
normal (N) e neoplasico (CaP), que prevêem uma distinção relevante entre os espécimes, ao
contrário, de outros estudos que utilizaram amostras benignas e malignas da próstata
observando a menor distinção molecular entre as amostras (STONE et al., 2004; CROW et
al., 2002; CROW et al., 2003b, CROW et al., 2005b).
Neste estudo, a comparação dos resultados do espectro Raman normal (N) e câncer
(CaP) demonstrado na Figura 9 e na Tabela 2, revelaram redução da quantidade de proteína e
glicogênio em 940 cm-1, lipídios , principalmente em 1665 cm-1. Aumento do conteúdo de
ácidos nucléicos em 1330 cm-1, relacionadas as bases purinas de DNA e em 1563 cm-1 bases
adenina e guanina em tecidos malignos quando comparados ao tecido normal. Estes
resultados estão de acordo com Stone et al. (2004), que encontrou maiores concentrações de
guanina, adenina, citosina, uracil, proteínas, lipídios e possivelmente porfirinas no tecido
neoplasico quando comparado ao tecido benigno da próstata. Outros estudos da técnica
Raman em tecidos malignos parecem apresentar diferenças moleculares sobre nos picos em
863, 940, 1007, 1079, 1247, 1271, 1330, 1452, 1563 e 1665 cm-1, tais como laringe (STONE
et al., 2000), cólon (FELD et al., 1995), esôfago (BAKKER et al., 1997), cérvix
(MAHADEVAN-JANSEN et al., 1998) e mama (MANOHARAM et al., 1998).
Por fim, verificou-se como em outros estudos, que se pode ter acesso as informações
relativas à composição bioquímica dos tecidos prostáticos não destrutivamente (CROW et al.,
2005a; 2005b; STONE et al., 2002a, 2002b; CROW et al., 2003b; STONE et al., 2004). A
ER, não só discrimina molecularmente, entre tecidos normais e patológicos da próstata, com
especificidade, mas também oferece uma impressão exclusiva (fingerprint) para cada tipo de
tecido (STONE et al., 2007; HANCHANALE et al., 2008, MOREIRA et al., 2008).
Futuramente, acredita-se que esta técnica permitirá o estudo da malignidade prostática in situ,
permitindo a investigação da progressão do tumor.
35
6.1 Trabalhos Futuros
A utilização da Espectroscopia Raman para fins diagnósticos, está apenas iniciando seu
desenvolvimento, linhas específicas de pesquisa deverão ser plenamente concretizadas, antes
que esta técnica seja aplicada, rotineiramente, em hospitais e clínicas. Para tanto, segue
descrito o apontamento de tais linhas futuras, que seguirão à presente pesquisa.
Raman in vivo através da implementação de Fibras Ópticas
a. Desenvolvimento de cateteres ópticos em uso clínico para diagnóstico e
monitoramento de patologias via espectroscopia óptica;
b. Classificação e confecção de banco de dados espectrais com finalidade
diagnóstica.
36
7 CONCLUSÃO
A constatação qualitativa e discriminadora dos grupos teciduais normal (N) e câncer
(CaP), revelaram redução nos picos de proteína em 1271 cm-1, lipídio em 1665 cm-1 e do
ácido nucléico em 1563 cm-1 no grupo CaP, sendo tais diferenciações provenientes de
mudanças moleculares e alterações bioquímicas.
Os resultados deste estudo avaliaram a técnica, atestando a capacidade da ER em
identificar o CaP quando comparada ao tecido normal. Os mesmos obtiveram 100% de
sensibilidade e especificidade, utilizando o algoritmo de ordem 3 baseado no PCA e MD,
ambos revelaram-se imprescindíveis ferramentas estatísticas discriminantes.
37
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45
ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO
MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO PARA PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA
Para obter um maior conhecimento clínico e científico do câncer da próstata, o Corpo Clínico deste Hospital (médicos e pesquisadores) desenvolverão pesquisas clínico-científicas, as quais possibilitarão conhecer melhor os mecanismos da doença, oferecendo novas possibilidades de diagnóstico. Para tanto, você está sendo admitido(a) neste Hospital para estabelecimento de diagnóstico de câncer de próstata. Para fins de diagnóstico, fator prognóstico e/ou como parte de seu tratamento, há necessidade da remoção do tumor para exames clínicos laboratoriais, para um diagnóstico definitivo. O restante do tumor é retirado e não será utilizado, sendo descartado, conforme legislação sanitária que regulamenta sobre o assunto. Um fragmento do tumor será encaminhado para um projeto de pesquisa, previamente submetido à apreciação da Comissão de Ética em Pesquisa, através da utilização da Espectroscopia Raman para estudos de materiais biológicos, com ênfase em tecidos com câncer de próstata normal e com câncer, o qual fornece informações bioquímicas detalhadas, através de alterações microscópicas detectadas por espectroscopia óptica. O fragmento do tumor será identificado no laboratório por um código formado por números e letras e, portanto, sua publicação científica será feita de modo a manter o anonimato absoluto dos pacientes. Concordando com o uso do material para fins acima descritos faz-se necessário esclarecer que não existem quaisquer benefícios ou direitos financeiros a receber sobre eventuais resultados decorrentes da presente pesquisa. Se você não concordar em doar materiais para pesquisa, sua decisão não influenciará, de modo algum, no seu tratamento. Dúvidas ou questões sobre o Termo de Consentimento poderão ser esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis ou seu médico, a qualquer dia e hora. Você receberá uma cópia deste documento e o original será arquivado em seu prontuário. I - Dados de identificação do sujeito da pesquisa:
Nome do voluntário: ___________________________________________________ Endereço: ____________________________________________________________ Cidade:______________________________________________________________ Telefone para contato:__________________________________________________ II - Dados sobre a pesquisa científica:
As informações contidas neste formulário tem como objetivo firmar acordo escrito
mediante o qual, o voluntário da pesquisa autoriza sua participação com pleno conhecimento
da natureza dos procedimentos e riscos a que se submeterá, com a capacidade de livre arbítrio
e sem qualquer coação.
1-Título do Trabalho Experimental: “ESTUDO DO TECIDO HUMANO DA PRÓSTATA
COM CÂNCER VISANDO OBTENÇÃO DO DIAGNÓSTICO ÓPTICO PELA TÉCNICA
RAMAN”
46
2- Pesquisadores: MD. Marcos Augusto Souza Rodrigues da Silva, Orientadores:
Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco e Prof. Dr. Flávio Aimbire Soares de Carvalho.
3- Desconforto ou Riscos Esperados: Os voluntários não serão submetidos a riscos durante
o período experimental, uma vez que o estudo constará apenas de analisar as amostras já
coletadas dos fragmentos de tumores removidos através de prostatectomia radical.
4- Duração da pesquisa: 02 (dois) anos.
III – Registro das explicações do pesquisador ao paciente ou seu representante legal
sobre a pesquisa, consignando:
1. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo aplicar a técnica da Espectroscopia Raman no estudo de neoplasias em tecido humano normal, benigno e maligno da próstata.
2. Justificativa: Auxiliar os profissionais da área da Saúde estudando o tecido humano da
próstata normal e com câncer, caracterizando as mudanças bioquímicas no desenvolvimento
de tumores e identificando nos Espectros Raman fatores de diferenciação nos tecidos,
investigando as diferenças Espectrais Raman e transformando a Espectroscopia Raman em
uma ferramenta de diagnóstico minimamente invasivo e de rápida identificação.
3. Procedimento em Fase Experimental: As amostras in vivo serão coletadas no
Laboratório de Patologia Cirúrgica e Molecular do Hospital Sírio Libanês, coordenado pela
Profª. Drª. Kátia Ramos Moreira Leite. As amostras ex vivo serão coletadas no Laboratório de
Análise Histopatológica de Orgãos e Tecidos, LIM 22 da Faculdade de Medicina da USP,
coordenado pelo Profº. Drº. Carlos Augusto Pasqualucci. Todas as amostras serão
identificadas e armazenadas em nitrogênio líquido (-196 ºC), imediatamente sua retirada, até o
momento da obtenção dos Espectros Raman. Os dados coletados serão analisados, e os
resultados serão quantitativamente classificados utilizando análise espectral baseada na
Análise dos Componentes Principais – (PCA) e Distância de Mahalanobis, na tentativa de
separação dos mesmos a fim de se obter a classificação dos espectros. Durante as avaliações,
os voluntários poderão ser submetidos a registros fotográficos.
4. Informações: Os voluntários têm a garantia que receberão respostas a qualquer pergunta
ou esclarecimento de qualquer dúvida quanto aos procedimentos, riscos, benefícios e outros
47
assuntos relacionados com a pesquisa em questão. Os pesquisadores supracitados assumem o
compromisso de proporcionar informação atualizada obtida durante o estudo, ainda que esta
possa afetar a vontade do indivíduo em continuar participando.
5. Retirada do Consentimento: O voluntário tem a liberdade de retirar seu consentimento a
qualquer momento e deixar de participar do estudo.
6. Aspectos Legais: Elaborados de acordo com as diretrizes e normas regulamentadas de
pesquisa envolvendo seres humanos atendendo à Resolução no 196, de 10 de outubro de
1996, do Conselho nacional de saúde do Ministério de Saúde – Brasília – DF.
7. Garantia de Sigilo Absoluto: Os pesquisadores asseguram a privacidade dos voluntários
quanto aos dados confidenciais envolvidos na pesquisa.
8. Formas de ressarcimento das despesas decorrentes da participação na pesquisa: Não
se emquadra, neste projeto.
9. Local da pesquisa: A pesquisa será desenvolvida no Laboratório de Espectroscopia
Biomolecular (Raman), localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D),
Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Av. Shishima Hifumi, 2911, Urbanova, São
José dos Campos, Cep 12244-000, SP, Brasil.
10. Telefone dos pesquisadores para contato: MD. Marcos Augusto Souza Rodrigues da
Silva (12) 9141-7990 24hs ou (12) 3947-1124, Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco
(12) 3947-1120 e Prof. Dr. Flavio Aimbire Soares de Carvalho (12) 3947-1125.
11. Consentimento pós-informação:
DECLARAÇÃO
Eu _________________________________________________________, após
leitura e compreensão deste termo de informação e consentimento, entendo que minha
participação é voluntária, e que posso sair a qualquer momento do estudo, sem prejuízo
algum. Confirmo que recebi cópia deste termo de consentimento. Declaro estar ciente das
informações ora prestada, tendo lido atentamente e concordando com o teor, autorizo a
execução do trabalho de pesquisa e a divulgação dos dados obtidos neste estudo no meio
científico.
48
Somente assine este Termo, se consentir.
São José dos Campos, __________de ____________de 200__.
Assinatura do Responsável, Paciente ou Médico
Assinatura do pesquisador Marcos Augusto Sousa Rodrigues da Silva
r- ai= PundâçâoI Pq' / /É vâteptreibaía deLl \JE: Iìnsino
Eilonfl\flcn6rUNIVERSID-{DE DO YALE DO PARÀIEA
concru'Ê pm Éllca EM Fpseuxs.auNIvERsTDADE uo var-n lo ParuÍna
UNIVAP
CERTIFICADO
CerliÍicamos qrÌe o Protocolo n.' H 29lcEP/2008, sobre "EsÍutlo do
Íecido ham(no tle prósíuta normttl e com câncer visando obíenção do
tliognóstico tiplico pela tëcnico Raman", sob a responsabili dade do Marcos
AugusÍo Souzs Rodrigues da Silva, está de acordo com os Prir.rcípios Éticos,
seguinclo as Diretrizes e Nomas Regulamentacloras de Pesquisa Envolvendo
Seres Humanos, confome Resolução n." 196/96 do Conselho Nacional de Saúde
e foi aprovado por esta Comissão de Ética em Pesquisa.
Infonnamos que o pesquisador responsável poÍ este ProtocÔlo de
Pesquisa deverá apresentaÍ a este Comitê cle Ética un relatório das alividades
desenvolvidas no período de 12 meses a contar da <1ata de sua aprovação
São José clos Campos, 10 de Abril de 2008.
PROF, DRÁ. A REGINA ZÀMUI.{ER.
Presiclente clo Comitê de Etica em Pesquisa
Universidade c1o Vale do Paraíba Univap
l r S L i : L ] ì . . l | ; ì ' ' : ] , ] - ] ì l l ] | . . ' \ \ : ' , . . . ; i , ' ì : ] l i . 0 i r . ' i À l \ i i : J l ' ' l : ] ] ] ' i , t r ' l ' ( ! : ) ] : r , l j l t - c t : \ : ' P o l | l r
