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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CURSO DE ZOOTECNIA
EVELYN DRIELLE DA SILVA
ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO EM ANIMAIS RUMINANTES - ANÁLISES MOLECULARES
CUIABA 2015
EVELYN DRIELLE DA SILVA
ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO EM ANIMAIS RUMINANTES - ANÁLISES MOLECULARES
Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso, apresentado como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Zootecnia. Orientador: Profa. Dra. Maria Fernanda Soares
Queiroz Orientador do Estágio Supervisionado: Prof. Dr. Dimas Estrasulas de Oliveira
CUIABA
2015
À minha maravilhosa mãe, Joelma Lima, que
sempre me incentivou para a realização de meus
ideais, encorajando-me a enfrentar todos os
momentos difíceis da vida.
Com muito carinho, à minha avó materna, Maria
Lima, meus avós paternos, Divina Augusta e
Sebastião Manoel e meu irmão, Marcus Vinícius, pela
compreensão, apoio e contribuição para minha
formação acadêmica.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À DEUS por nunca me abandonar, me dando forças para seguir em frente diante
dos obstáculos da vida.
À Universidade Federal de Mato Grosso por me dar condições para concluir minha
graduação.
À Universidade do Estado de Santa Catarina, pela oportunidade de realização do
meu estágio final.
Ao professor Dimas Estrasulas de Oliveira por ter me aceitado em seu grupo de
estudos, por sua recepção e por me dar suporte durante todo o período de estágio
final, me inspirando a seguir a vida acadêmica.
À Mônica, Grégory e Eveline pelo acompanhamento, paciência, dedicação e
amizade durante todo o período de estágio.
À professora Maria Fernanda por ter me aceitado como orientada e ter dedicado sua
atenção para a realização desse estágio final, pela amizade e paciência.
Ao Pedro Ceron, por me apoiar em minhas decisões e me ajudar a passar por esse
período importante na minha vida.
As minhas amigas dentro e fora da faculdade, Clarissa Rocha, Jessica Rosa, Larissa
Santi, Marcela Rodrigues e Nathalia Barros, pelo companheirismo, carinho e
desespero compartilhado, superação e alegrias.
As minhas amigas da vida, Laynara Lugli, Anni Amorim, Elise de Paula, por toda a
amizade e amor envolvido durante anos e anos e por sempre acreditarem em mim.
Muito Obrigada!
“A felicidade só é real quando compartilhada”.
Henry David Thoreau
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Via metabólica da bio-hidrogenação do ácido linoleico no rúmen .............. 5 Figura 2- Esquema da produção de CLA em ruminantes ........................................... 5 Figura 3- Amostras dentro dos criotubos .................................................................. 11 Figura 4- Amostras de tecido hepático mantidas no gelo durante a homogeneização
com a probe homogeneizadora .......................................................................... 11 Figura 5– Separação do RNA após centrifugação .................................................... 12 Figura 6– kit comercial para extração do RNA .......................................................... 13 Figura 7- Amostras em eppendorf ............................................................................. 13 Figura 8- Amostras em eppendorf de 200 μL ............................................................ 14 Figura 9– Quantificação da concentração de RNA (Aparelho NanoDrop) ................ 14 Figura 10– Amostras e componentes do kit comercial em resfriamento durante a
análise ................................................................................................................ 16 Figura 11– Amostras no termociclador ...................................................................... 16 Figura 12 – Homogeneização de amostras no vortex e centrífuga minispin ............. 17 Figura 13– Placa utilizada nas análises de qRTPCR ................................................ 18 Figura 14– Curva padrão .......................................................................................... 18 Figura 15– Placa lacrada com um filme adesivo especifico e coberta por papel
alumínio .............................................................................................................. 19 Figura 16– Equipamento StepOne Real-Time........................................................... 19
LISTA DE ABREVIATURAS
ACCα Acetil-CoA carboxilase alfa
AGPAT Acil glicerol-3-fosfato aciltransferase
CAV Centro de Ciências Agroveterinárias
cDNA DNA complementar
CEDIMA Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal
CLA Ácido linoleico conjugado
DGL Depressão da gordura do leite
DNA Ácido desoxirribonucleico
EE Extrato Etéreo
eGF Fator de crescimento epidermal
FASN Ácido graxo sintase
GB Gordura Bruta
GPAT Glicerol 3-fosfato aciltransferase
LPL Lipoproteína lipase
mRNA RNA mensageiro
MS Matéria Seca
PPARγ Receptores ativados por proliferadores de peroxissomo gama
qRTPCR Técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real
RNA Ácido ribonucleico
SCD Estearoil-CoA-dessaturase
SPOT14 Hormônio responsivo a tireoide
SREBP1 Proteína de ligação ao elemento regulatório esterol
UDESC Universidade do Estado de Santa Catarina
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 2. OBJETIVO ............................................................................................................... 2
2.1 Objetivos específicos .......................................................................................... 2 3. REVISÃO ................................................................................................................. 3 4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO ..................................................................................... 9
4.1 Local do Estágio .................................................................................................. 9 4.2 Setor .................................................................................................................... 9
5. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS E DISCUSSÃO ............................................... 10 5.1 - Extrações de RNA ........................................................................................... 10 5.2 - Síntese do DNA complementar (cDNA) .......................................................... 15 5.3 - Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase em tempo real ....... 17
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 22 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 23
RESUMO
Em alimentos oriundos da produção de animais ruminantes é possível encontrar um grupo de compostos, derivados do ácido linoleico, chamados de ácido linoleico conjugado (CLA). Os isômeros mais estudados de CLA têm propriedades bioativas distintas e originam-se da bio-hidrogenação incompleta dos ácidos linoleico e linolênico realizada pelas bactérias ruminais ou da dessaturação do trans-11 na glândula mamária e no intestino delgado. Objetivou-se com esse trabalho de conclusão de curso buscar o entendimento da funcionalidade de fornecimento de fontes lipídicas na dieta de ruminantes, através de grupo de estudos e acompanhamento de análises utilizando técnicas moleculares do experimento da Doutoranda Monica Urio, estudante da Universidade do Estado de Santa Catarina tendo como título: Efeitos de uma mesma dose de CLA trans-10, cis-12 em ovelhas lactantes de diferentes pesos vivos e de isômeros de ácidos graxos no cultivo in vitro de explantes de glândula mamária. Este relatório de estágio supervisionado II descreve as atividades realizadas na Universidade do Estado de Santa Catarina - Centro de Ciências Agroveterinárias UDESC/CAV, no Departamento de Produção Animal e Alimentos no período de 23 de Fevereiro a 31 de Maio de 2015 totalizando 480 horas. O estágio nessa área de pesquisa foi muito importante, principalmente por possibiltar conhecimento sobre técnicas laboratoriais que permitiram melhor entendimento em relação à síntese de lipídeos na glândula mamária em animais ruminantes. Palavras chaves: gordura do leite, expressão gênica, ovelhas leiteiras
1
1. INTRODUÇÃO
O ácido linoleico conjugado (CLA) é o termo utilizado para descrever isômeros
posicionais e geométricos do ácido linoleico (18:2) que possuem duplas ligações
conjugadas. Os isômeros de CLA são naturalmente produzidos por bactérias ruminais
como intermediários da bio-hidrogenação incompleta de ácidos graxos poli-
insaturados da dieta e, devido a seus efeitos biológicos dois isômeros têm sido
considerados os principais e mais estudados, sendo estes, o CLA cis-9, trans-11 e o
CLA trans-10, cis-12. O CLA cis-9, trans-11 possui características de um agente anti-
carcinogênico em alguns tipos de câncer (Pariza et al., 2001), e o CLA trans-10, cis-
12 possui capacidade de alterar o metabolismo lipídico e também de particionar os
nutrientes dentro do organismo animal (BAUMGARD et al., 2000).
O CLA trans-10, cis-12 não é considerado um intermediário comum da bio-
hidrogenação e ocorre no rúmen apenas em certas condições específicas como baixo
pH e/ou presença de ácidos graxos poli-insaturados. Estas condições são frequentes
em dietas onde há maior proporção de alimento concentrado em detrimento de
alimento volumoso ou ainda em dietas cujo tamanho da partícula fibrosa seja
diminuída prejudicando a efetividade da fibra em manter a ruminação, o que ocasiona
maior proporção molar do propionato em relação ao acetato e induzem à redução na
síntese da gordura do leite.
A redução de gordura do leite acarretada pelo CLA trans-10, cis-12, tem
relação direta com a inibição de enzimas responsáveis pela lipogênese mamária. A
fim de compreender este processo e verificar os efeitos do uso de CLA trans-10, cis-
12 em animais lactantes o grupo de estudo do Prof. Dr. Dimas Estrasulas de Oliveira,
da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), estuda o metabolismo de
síntese dos componentes do leite, em especial alterações no teor de gordura, através
da suplementação de CLA trans-10, cis-12 na dieta dos animais, e posteriormente,
utilização de técnicas moleculares capazes de dar suporte quanto aos mecanismos
de respostas de genes que codificam enzimas regulatórias.
2
2. OBJETIVO
Realizar o estágio supervisionado II por meio de acompanhamento das
atividades do grupo de pesquisa em nutrigenômica da UDESC, buscando adquirir
experiência prática e conhecimento teórico na área de síntese de lipídeos em animais
ruminantes.
2.1 Objetivos específicos
Realizar atividades supervisionadas na área de Zootecnia;
Acompanhar as análises moleculares na área de síntese de lipídeos referentes
à Tese da acadêmica Monica Urio;
Acompanhar a rotina laboratorial na extração de RNA das amostras de tecido
mamário, hepático e adiposo oriundas dos experimentos anteriormente
realizados pelo grupo de pesquisa;
Acompanhar a rotina laboratorial de síntese de DNA complementar e análise
quantitativa da reação em cadeia da polimerase destas amostras.
3
3. REVISÃO
O fornecimento de fontes lipídicas na dieta de ruminantes é uma estratégia
nutricional capaz de promover benefícios aos animais de alta produção, pois podem
incrementar o aporte energético em momentos de elevada demanda pelo animal para
a produção de leite, como no início da lactação; e também por ser capaz de alterar o
perfil de lipídeos nos produtos oriundos destes animais após o processo de bio-
hidrogenação ruminal, além de serem considerados nutrientes essenciais à vida.
Apesar de ser um nutriente com inclusão limitada na alimentação animal, os
lipídeos têm papel importante no metabolismo energético, possuindo diferentes
funções: desde componentes de membranas celulares e precursores das moléculas
regulatórias (Berchielli et al., 2006) até a principal forma de reserva de energia no
organismo.
A suplementação da dieta com lipídeos, em algumas circunstâncias, pode
afetar o padrão de fermentação ruminal alterando o perfil de ácidos graxos do leite
(Chilliard, 1993); aumentar a densidade energética da dieta (Smith, 1990); conter
ácidos graxos essenciais e melhorar a absorção de compostos lipossolúveis
(CHURCH, 1988).
No decorrer da evolução das espécies de ruminantes, os animais foram
adaptados à ingestão de forragens, que são caracterizadas por serem naturalmente
pobres em lipídeos, com teores em torno de 3% na base seca (Kozloski, 2011). Sob o
ponto de vista analítico, o teor de lipídeo representa a fração ou componente que é
extraído do alimento pelo éter, determinação laboratorial conhecida como extrato
etéreo (EE) (SILVA & QUEIROZ, 2006).
Valores críticos estabelecidos para a inclusão de lipídeos na dieta são de, no
máximo, 6% de EE na base seca (Medeiros, 2007), pois, quantidades mais elevadas
deste componente podem interferir na degradação ruminal da porção fibrosa devido
ao efeito de recobrimento das partículas alimentares com lipídeos, ocasionando uma
redução do contato destas partículas alimentares com os micro-organismos ruminais
e subsequente efeitos negativos na fermentação ruminal; além do efeito tóxico que os
ácidos graxos poli-insaturados exercem sob os micro-organismos.
Os lipídeos fornecidos na dieta são modificados pelos micro-organismos
ruminais a partir da lipólise e bio-hidrogenação dos ácidos graxos insaturados
presentes na dieta (Jenkins, 1993), convertendo os ácidos graxos insaturados em
4
saturados, tornando, portanto, o perfil lipídico dos produtos como a gordura do leite ou
da carcaça, mais rico em ácidos graxos saturados do que aqueles fornecidos na dieta.
A lipólise corresponde ao início do processo de metabolismo dos lipídeos no rúmen,
sendo imprescindível para que ocorra a bio-hidrogenação (HARFOOT &
HAZLEWOOD, 1997).
Os ruminantes ao ingerirem os lipídeos da dieta, consomem os ácidos graxos
principalmente na forma de triglicerídeos e galactolipídeos. A hidrólise ruminal por
ações de enzimas lipolíticas microbianas liberam os ácidos graxos das ligações éster,
tornando-os livres, permitindo que a galactose e o glicerol sejam rapidamente
fermentados a ácido propiônico. Os ácidos graxos em sua forma livre ficam
suscetíveis à ação das bactérias ruminais, que agem adicionando hidrogênio nas
ligações insaturadas (duplas ligações), tornando-as ligações saturadas (simples),
processo esse chamado de bio-hidrogenação, determinando o alto grau de saturação
dos ácidos graxos encontrados em produtos de ruminantes quando comparados aos
produtos oriundos de animais não ruminantes (LOCK & BAUMAN, 2004).
Um resumo do processo de bio-hidrogenação no rúmen foi descrito por Harfoot
& Hazelwood (1997), no qual o ácido linoleico presente na dieta (C18:2 cis-9, cis-12) é
isomerizado a cis-9, trans-11 (CLA) e, posteriormente, reduzido em duas etapas a
C18:1 trans-11 e por fim reduzido a ácido esteárico (18:0), conforme a Figura 1.
A redução de C18:1 trans-11 para C18:0 parece ser o passo limitante da bio-
hidrogenação e, portanto, este ácido graxo vai se acumulando no rúmen (Van Soest,
1994), podendo ser absorvido no intestino e levado para o tecido adiposo ou glândula
mamária, onde pode ser convertido à CLA cis-19, trans-11 por ação do complexo
enzimático da enzima estearoil CoA-dessaturase. Esta é considerada a principal via
de bio-hidrogenação, mas há outras que formam diferentes isômeros de CLA e outros
ácidos graxos monoinsaturados (Figura 2).
5
Figura 1 - Via metabólica da bio-hidrogenação do ácido linoleico no rúmen
Fonte: Adaptado de Harfoot & Hazelwood (1997)
Figura 2- Esquema da produção de CLA em ruminantes
Fonte: (Adaptado de Bauman & Griinari, 2001) Os passos do quadro à esquerda, ocorrem no rúmen e os da direita, na glândula mamária ou tecido adiposo.
CLA são um conjunto de isômeros posicionais e geométricos do ácido
octadecadienóico (C18:2) com duplas ligações conjugadas (duas duplas ligações
separadas por uma ligação simples), que podem ser encontradas nas posições dos
carbonos 9 e 11, 10 e 12 ou 11 e 13, e podem ser em ambas configurações, cis ou
trans (BAUMAN et al., 1999).
Alguns tipos específicos de dietas, como as que contêm gordura poli-
insaturada ou onde há maior proporção de alimento concentrado em detrimento de
6
alimento volumoso ou ainda em dietas cujo tamanho da partícula fibrosa seja
diminuída prejudicando a efetividade da fibra em manter a ruminação, favorecem a
bio-hidrogenação de ácidos graxos poli-insaturados no rúmen para C18:2 trans-10,
cis-12, isômero de CLA capaz de modificar a composição do leite. Além disto,
infusões abomasais de CLA trans-10, cis-12 também tem efeito inibidor na síntese de
gordura do leite (BAUMGARD et al., 2000).
Além dos ácidos graxos fornecidos pela dieta que poderão ser bio-
hidrogenados no rúmen também existem formas sintéticas de se fornecer CLA aos
animais. CLA sintéticos são utilizados em estudos por meio da sua inclusão na dieta
como lipídio encapsulado, como sais de cálcio de ácidos graxo ou também na forma
de ésteres metílicos, via infusão intravenosa ou abomasal. O fornecimento de CLA
trans-10, cis-12 aos animais em formas de ésteres metílicos possui vantagens na
produção comercial e facilidade operacional, quando comparado à produção de CLA
na forma de ácidos graxos livres ou sais de cálcio, não causando danos ao
metabolismo animal ou digestão dos animais.
Estudos mostraram que pequenas concentrações de CLA trans-10, cis-12 na
dieta (menores do que 1%) são capazes de reduzir em 50% a secreção de gordura no
leite em poucos dias, conforme demonstrado por Baumgard et al. (2001) utilizando a
dose de 14 g/d de CLA trans-10, cis-12 infundida no abomaso de vacas.
A dose efetiva para se obter 25% de inibição no teor de gordura no leite é de
aproximadamente 2,5 g/d de CLA trans-10, cis-12 (± 0,01% do consumo de matéria
seca), e poucos incrementos na queda da gordura foram observados com o aumento
da dose acima de 6 g/d (VETH et al., 2004; BAUMAN et al., 2008). O CLA trans-10,
cis-12 é o único ácido graxo que atua na redução da síntese de gordura do leite
(BAUMGARD et al., 2000; BAUMGARD et al., 2001; de VETH et al., 2004).
Descrita pela primeira vez pelo cientista francês Boussingault em 1845 (VAN
SOEST, 1994), a depressão na gordura do leite (DGL) induzida pela dieta é
caracterizada pela redução de até 50% no teor deste nutriente, sem que ocorram
mudanças na produção de leite e dos outros componentes (BAUMAN & GRIINARI,
2003).
Chouinard et al. (1999) avaliaram o efeito do CLA para vacas leiteiras, e
relataram redução na produção de gordura do leite superior a 50% quando
comparada ao tratamento sem CLA, sendo esta redução mais significativa para
7
ácidos graxos de cadeia curta ou média, indicando, portanto, uma interferência na
síntese de novo de ácidos graxos pelas células epiteliais da glândula mamária.
A redução da gordura no leite pelo CLA trans-10, cis-12 está relacionada com
a menor produção de ácidos graxos de cadeia curta e média (C6 e C16) e, uma vez
que esses ácidos graxos advêm da síntese na glândula mamária, esta queda se deve
possivelmente ao decréscimo da atividade de enzimas envolvidas nesse processo,
como a acetil-CoA carboxilase e a ácido graxo sintase (PIPEROVA, 2000).
Um dos primeiros estudos que demonstraram a redução na expressão gênica
das enzimas envolvidas na síntese lipídica no tecido mamário de vacas foi realizado
por Baumgard et al. (2002), que relataram a DGL induzida pelo CLA trans-10, cis-12
e, após outros estudos (Peterson et al., 2003; Harvatine & Bauman, 2006; Gervais et
al., 2009) deram suporte ao conceito do decréscimo na expressão das enzimas
lipogênicas.
De forma geral, a quantidade de mRNA para as enzimas acetil-CoA carboxilase
(ACC), ácido graxo sintase (FASN), estearoil-CoA dessaturase (SCD), lipoproteína
lipase (LPL), glicerol-fosfato acil transferase (AGPAT) e acil glicerol-fosfato
aciltransferase (GPAT) é diminuída na DGL induzida pelo CLA trans-10, cis-12
(BAUMGARD et al., 2002; PETERSON et al., 2003; BAUMAN et al., 2011).
A síntese de gordura no leite necessita da ação coordenada de alguns fatores
(substratos, enzimas, transportadores, etc.,) e para isso necessita a organização de
alguns genes que controlam o fornecimento desses agentes (Rudolph et al., 2007). A
família de fatores de transcrição SREBP1 funciona como regulador global da síntese
de lipídeos (Eberle et al., 2004; Peterson et al., 2004), ligando-se à sequência de DNA
dos genes responsivos ao elemento regulatório de esterol.
A enzima acetil-CoA carboxilase (ACC) é considerada limitante na síntese de
ácidos graxos (Kim, 1997). O aumento na atividade celular da ACC resulta em
aumento na produção de malonil-CoA, este por sua vez é essencial para a síntese de
ácido graxo. A ACC desempenha função decisiva, durante a lactação, ao facilitar a
entrega de precursores de ácidos graxos à glândula mamária para a síntese de
gordura no leite (TRAVERS & BARBER, 1997).
Possuindo atuação multifuncional, a enzima ácido graxo sintase (FASN) é
considerada uma enzima do complexo homodimérico, que catalisa a síntese de novo
dos ácidos graxos, formando palmitato através do acetil-CoA e malonil-CoA, (Roy et
al., 2006; Alim et al., 2013). Desempenhando um papel importante na biossíntese de
8
lipídeos, a FASN atua como uma das enzimas responsáveis pelo teor de gordura do
leite em animais (Roy et al., 2006). A expressão do gene da FASN é principalmente
controlada ao nível da transcrição e é responsivo para ambos os sinais hormonais e
nutricionais (Sul & Wang, 1998). Há, ainda, relatos (Joseph et al., 2002) de que
proteínas de ligação ao elemento responsivo a esteróide (SREBP1) desempenham
papel crítico na regulação da transcrição de um número de genes na via lipogênica,
incluindo FASN e ACC.
9
4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO
4.1 Local do Estágio
O estágio foi realizado na Universidade do Estado de Santa Catarina – Centro
de Ciências Agroveterinárias – UDESC/CAV no Departamento de Produção Animal e
Alimentos na cidade de Lages (SC), com supervisão do professor Dimas Estrasulas
de Oliveira. A UDESC tem como missão a produção, preservação e difusão do
conhecimento científico, tecnológico, artístico, desportivo e cultural, por intermédio do
fomento das atividades de ensino, pesquisa e extensão.
4.2 Setor
O acompanhamento das análises moleculares foi realizado durante os meses
de março a maio de 2015, no Laboratório de Virologia, localizado no Centro de
Diagnóstico Microbiológico Animal – CEDIMA, onde foram feitas as análises de
extração de RNA, síntese de cDNA e no Laboratório de Bioquímica onde foram
realizadas as análises de qRTPCR, ambos situados na UDESC/CAV.
10
5. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS E DISCUSSÃO
Foi realizado o acompanhamento de análises moleculares do experimento da
Doutoranda Monica Urio, estudante da Universidade do Estado de Santa Catarina
tendo como título: Efeitos de uma mesma dose de CLA trans-10, cis-12 em ovelhas
lactantes de diferentes pesos vivos e de isômero de CLA no cultivo in vitro de
explantes de glândula mamária.
As análises laboratoriais acompanhadas durante o período de estágio foram
realizadas para avaliação dos efeitos de uma mesma dose de CLA trans-10, cis-12
em ovelhas lactantes de diferentes pesos vivos.
5.1 - Extrações de RNA
A extração de RNA foi realizada em amostras de tecido hepático, glândula
mamária e também de tecido adiposo. Não houve diferença entre os tipos de
amostras e o processo de extração de RNA.
Para a preparação da extração de RNA foi requerido ambiente altamente limpo
e a utilização de luvas, para se evitar qualquer contaminação das amostras por
RNAses presentes na pele. Primeiramente foi realizada a limpeza da bancada com
hipoclorito de sódio e álcool a 70% e todos os equipamentos a serem utilizados foram
colocados à vista para início da análise.
Posteriormente, criotubos contendo as amostras de tecido hepático foram
retirados do botijão de nitrogênio a -196 ºC, e as amostras foram retiradas de dentro
dos criotubos (Figura 03).
A amostra de tecido hepático foi colocado em um tubo contendo QIAzol Lysis
(Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA), e estes foram pesados e posteriormente
homogeneizados, utilizando equipamento de homogeneização específico, chamado
de probe homogeneizadora (Figura 04). Este equipamento deve ser lavado com
NaOH por 5 min e etanol 70% antes de sua utilização. No início das análises, bem
como entre as análises das amostras, foi realizada a lavagem desta probe
homogeneizadora com etanol 100%, água livre de RNA e QIAzol Lysis reagente,
nesta ordem.
Durante todo o processo de homogeneização as amostras devem estar
alojadas em gelo (Figura 04), e o tempo dispendido para que ocorra a
11
homogeneização da amostra é dependente do tipo de tecido analisado (hepático,
adiposo, glândula mamária). Neste caso, descrição da análise do tecido hepático, o
tempo de homogeneização foi de aproximadamente 5 minutos.
Figura 3- Amostras dentro dos criotubos
Fonte: Arquivo pessoal
Figura 4- Amostras de tecido hepático mantidas no gelo durante a homogeneização com a probe homogeneizadora
Fonte: Arquivo pessoal
12
Depois de homogeneizadas, as amostras foram levadas à bancada para dar
sequência ao protocolo. Foi adicionado clorofórmio em cada tubo e estes foram
centrifugados durante 15 min a 4 ºC. Este processo fez com que houvesse a
separação do RNA contido nas amostras (Figura 05). A fase sobrenadante (que
contém RNA) foi coletada e adicionou-se álcool 70% a esta amostra que foi
posteriormente agitada no equipamento vortex para homogeneização.
Figura 5– Separação do RNA após centrifugação
Fonte: Arquivo pessoal
Para a extração de RNA foi utilizado o kit comercial RNeasy Lipid Tissue
(Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA). Neste mesmo KIT também havia o
“buffer” RW1 que foi adicionado às colunas, para lavagem e remoção de
biomoléculas, certo tipo de proteínas que pudessem estar ligadas a membrana do
RNA, e o “buffer” RPE que foi utilizado para remover os vestígios de sais que ainda
estivessem agregados à membrana (Figura 06).
Os “buffers” foram acrescentados às amostras e estas foram centrifugadas.
Após a centrifugação DNAse I mix foi adicionado às amostras, tendo como função a
remoção de DNA que poderia estar ligado ao RNA das amostras. A amostra restante
13
foi então coletada em tubos eppendorf (1,5 mL) para armazenagem e posterior
análise no procedimento de síntese de DNA complementar (Figura 07).
Figura 6– kit comercial para extração do RNA
Fonte: Arquivo pessoal
Figura 7- Amostras em eppendorf
Fonte: Arquivo pessoal
Neste momento também houve separação de uma alíquota da amostra, em
outro tubo eppendorf (200 μL), conforme a Figura 08, para verificação da pureza do
14
RNA através da utilização do espectrofotômetro NanoDrop - ND-2000 (NanoDrop
Technologies, Wilmington, DE, USA), conforme Figura 09.
Figura 8- Amostras em eppendorf de 200 μL
Fonte: Arquivo pessoal
Figura 9– Quantificação da concentração de RNA (Aparelho NanoDrop)
Fonte: Arquivo pessoal
A principal dificuldade que poderia ocorrer durante o processo de extração de
RNA seria a presença de ribonucleases (RNAses) estáveis e ativas nas amostras,
que permitiriam que o RNA (altamente instável) fosse rapidamente degradado.
15
Todavia, durante as análises realizadas no período estagiado não foi verificado este
acontecimento.
A análise do RNA pode fornecer informações importantes sobre expressão
gênica, por isso há a necessidade em se fazer uma purificação eficaz do RNA, para
manter sua integridade e qualidade.
5.2 - Síntese do DNA complementar (cDNA)
A sínteses de DNA complementar (cDNA) foi realizada em amostras de tecido
hepático, glândula mamária e também de tecido adiposo. Não houve diferença entre
os tipos de amostras e o processo de síntese de cDNA.
Para a síntese do cDNA foi requerido ambiente altamente limpo e a utilização
de luvas, para se evitar qualquer contaminação das amostras por DNA presente na
pele. Primeiramente foi realizada a limpeza da bancada com hipoclorito de sódio e
álcool a 70% e todos os equipamentos a serem utilizados foram colocados à vista
para início da análise.
Para a síntese de cDNA foi utilizado o Kit GeneAmp composto por “random
primers”, e todo o procedimento foi realizado com as amostras e componentes do kit
resfriados em gelo (Figura 10).
Utilizou-se o RNA obtido anteriormente por extração, o qual estava
armazenado no freezer a -80 ºC. Primeiramente as amostras foram colocadas no
equipamento termociclador Biocycler a 65 ºC durante cinco minutos, para que
houvesse uma mistura da água livre de RNAse com o RNA. Posteriormente foram
adicionados os componentes do kit comercial: 10x buffer, 25x DNTP, Random
primers, RT enzyme, RNase inibidor, Nuclease free H2O, de acordo com o peso e
quantidade de cada amostra. Após esta etapa, as amostras foram colocadas
novamente no termociclador a -25 ºC por 10 minutos; -37 ºC por 2 horas e, então,
resfriadas até -4 ºC (Figura 11). Ao final do procedimento as amostras foram
armazenadas a -20 ºC para posterior análise da reação em cadeia da polimerase em
tempo real (qRTPCR).
É importante considerar que para que este procedimento tenha sucesso, o
RNA das amostras deve estar intacto e sua quantificação, precisa, para evitar
variações na utilização deste molde em técnicas futuras, como por exemplo, em
arranjos de DNA ou PCR quantitativo.
16
Figura 10– Amostras e componentes do kit comercial em resfriamento durante a análise
Fonte: Arquivo pessoal
Figura 11– Amostras no termociclador
Fonte: Arquivo pessoal
17
5.3 - Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase em tempo
real
Primeiramente foi realizada a limpeza da bancada com hipoclorito de sódio e
álcool 70% e todos os equipamentos a serem utilizados foram colocados na bancada
para início dos procedimentos de análise quantitativa da reação em cadeia da
polimerase em tempo real (qRTPCR).
As amostras obtidas no procedimento de síntese de cDNA foram retiradas do
freezer em que estavam armazenadas a -20 ºC e homogeneizadas no equipamento
vortex (Figura 12). Após este procedimento foram colocadas na centrifuga minispin
durante 15 segundos para que houvesse completa homogeneização (Figura 12).
As amostras foram então transferidas para placas (MicroAmp® Fast Optical 48-
Well Reaction Plate - Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), conforme Figura 13.
Também é feita uma curva padrão, que também será colocada na placa. A curva
padrão foi feita com a adição de água a um “pool” de todas as amostras (Figura 14).
Foram utilizados nesta análise iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA), e primers específicos para cada gene de interesse, para
visualização das curvas de amplificação e quantificação da expressão gênica.
Em cada amostra foi adicionado 10 µL de um mix de reagentes (este mix era
composto por 7,5µL de Syber, 0,6µL de Primer e 1,9µL de H2O). Após este
procedimento, a placa foi lacrada com um filme adesivo especifico e coberta por papel
alumínio para que não houvesse incidência de luz (Figura 15). As amostras foram
analisadas em triplicata.
Figura 12 – Homogeneização de amostras no vortex e centrífuga minispin
Fonte: Arquivo pessoal
18
Figura 13– Placa utilizada nas análises de qRTPCR
Fonte: Arquivo pessoal
Figura 14– Curva padrão
Fonte: Arquivo pessoal
Este procedimento foi realizado no Laboratório de Imunologia do CEDIMA.
No Laboratório de Bioquímica da UDESC/CAV ficava o equipamento StepOne
Real-Time (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA), que realizava a leitura da
placa e a quantificação da expressão gênica das amostras (Figura 16). As
informações foram salvas em pendrive para posteriores tabulação e interpretação dos
dados.
Os genes de interesse nas amostras coletadas no experimento in vivo da
doutoranda foram: ACCα (acetil Coa carboxilase alfa), FASN (ácido graxo sintase),
SCD1 (estearoil CoA dessaturase), SREBP1 (proteínas de ligação ao elemento
19
regulatório de esterol), Spot14 (hormônio responsivo tireodiano) na glândula mamária,
e leptina no tecido adiposo.
Figura 15– Placa lacrada com um filme adesivo especifico e coberta por papel alumínio
Fonte: Arquivo pessoal
Figura 16– Equipamento StepOne Real-Time
Fonte: Arquivo pessoal
20
O método de PCR quantitativa em tempo real tem se mostrado uma ferramenta
de extrema importância na quantificação de RNAs mensageiros em baixos níveis,
tornando a quantificação mais rápida e acurada quando comparado a outros métodos.
21
6. CONCLUSÕES
O estágio nessa área de pesquisa foi de grande importância, pois, foi gerado
conhecimento sobre análises moleculares que deram condições de um melhor
entendimento em relação à síntese de lipídeos em ruminantes. As análises
moleculares são importantes no estudo e determinação da síntese de lipídeos na
glândula mamária de animais ruminantes suplementados com CLA na dieta e,
certamente, ajudarão a entender e manipular a síntese da gordura no leite de vacas,
cabras e ovelhas.
22
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estágio supervisionado II foi extraordinário, pois através dele obtive
engrandecimento profissional e pessoal, aprendendo técnicas e análises laboratoriais
que não tive oportunidade de contato durante a graduação, aumentando ainda mais o
interesse que eu já tinha em fazer mestrado, seguindo a vida acadêmica, despertando
em mim interesse em continuar nessa área de pesquisa.
Com as análises realizadas foi possível deslumbrar futuras intervenções na
área de produção animal, na síntese de componentes do leite, como, por exemplo, a
utilização do CLA em animais de alta produção, no início da lactação quando há uma
elevada mobilização de reservas dos animais lactantes para atendimento da síntese
de gordura láctea. Com a utilização do CLA, estes animais poderiam diminuir a
composição da gordura láctea e, consequentemente, teriam menor mobilização de
reservas corporais, permitindo que voltassem à reprodução antecipadamente quando
comparados aos animais de alta produção que não receberiam o CLA na dieta.
A adição do CLA também pode ser importante para agregar valor ao leite
comercializado, haja vista que o leite enriquecido com CLA pode ser considerado um
alimento nutracêutico, além de possivelmente também ter sua composição em
proteína aumentada.
23
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