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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PADRONIZAÇÃO, ATIVIDADE BIOLÓGICA E DESENVOLVIMENTO DE
FORMAS FARMACÊUTICAS SEMI-SÓLIDAS À BASE DE Ximenia americana L.
MARIANA TRYCIA BRASILEIRO
RECIFE, 2008
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PADRONIZAÇÃO, ATIVIDADE BIOLÓGICA E DESENVOLVIMENTO DE
FORMAS FARMACÊUTICAS SEMI-SÓLIDAS À BASE DE Ximenia americana L.
MARIANA TRYCIA BRASILEIRO Orientador: Prof°. Dr. Pedro José Rolim Neto Co-orientador: Profª. Dra. Karina Perreli Randau
RECIFE, 2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas.
iii
Brasileiro, Mariana Trycia
Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L. / Mariana Trycia Brasileiro. – Recife: O Autor, 2008.
xiv, 98 folhas: il., fig., tab., quadros.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Farmácia, 2008.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Ximenia americana L. 2. Farmacologia 3. Farmacotécnica. I.Título.
615.014 CDU (2.ed.) UFPE 615.321 CDD (22.ed.) CCS2008-030
iv
v
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Jane Sheila Higino
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Samuel Daniel de Souza Filho
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Beate Saegesser Santos
vi
Dedicatória
Aos meus pais, pelo amor incondicional
vii
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus, por todas as alegrias e bênçãos da minha vida, e por mais um projeto realizado. À Universidade Federal de Pernambuco, em particular ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela oportunidade de realização deste curso. Ao meu orientador, Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto, pela oportunidade, orientação e apoio. A minha co-orientadora, Prof. Dra. Karina Perreli Randau, pela dedicação, orientação e tão importante amizade. Aos meu pais, Edmar e Lourdinha, pelo incentivo, carinho e investimento, e aos meus irmãos, que apesar de distantes sei que torcem pelo meu sucesso. Ao meu amor, Ricardo, por todo carinho, paciência e companheirismo em toda essa etapa. À Amanda, por toda dedicação e ajuda tão importantes para o trabalho. Aos amigos que fiz nessa jornada, Ádley e Jeckson, que tanto me ajudaram na realização deste trabalho. Às minhas amigas, Kássie, Priscila e Adriana, por todo o apoio e alegrias vividas juntas. Às minhas amigas, Iara, Mônica e Márcia, pelo acolhimento quando da minha chegada à Recife, pelo apoio e pela amizade. Aos colegas do LTM (Laboratório de Tecnologia de Medicamentos), pelo apoio e convivência, especialmente a Aíla, Sara, Alexandre, Januária, Luciana, Francy, Larissa, Magaly, Regina, Keyla, Mônica, Lamartine, Diego, Lariza, Roberto, Flávia, Danilo e Otávio. À Prof. Dra. Ivone Antônia de Souza e à Prof. Dra. Rejane Magalhães de Mendonça Pimentel, pela ajuda na realização de algumas análises. À Gustavo Campos Pereira, pelo fornecimento da matéria-prima (X. americana L.), indispensável para a realização deste trabalho. À CAPES, pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.
viii
"A felicidade não depende do que nos falta,
mas do bom uso que fazemos do que temos."
Thomas Hardy.
ix
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Siglas................................................................................................ix
Lista de Símbolos...................................................................................................................x
Lista de Figuras......................................................................................................................xi
Lista de Tabelas e Quadros...................................................................................................xii
Resumo................................................................................................................................xiii
Abstract................................................................................................................................xiv
Introdução...............................................................................................................................1
Objetivos.................................................................................................................................4
Geral........................................................................................................................................5
Específicos..............................................................................................................................5
Capítulo I - Ximenia americana L.: botânica, química e farmacologia no interesse da
tecnologia farmacêutica (Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmácia)......................6
Capítulo II - Padronização Farmacognóstica das cascas do caule de Ximenia americana L
(Olacaceae) para utilização no desenvolvimento de fitoterápicos (Artigo submetido à
Revista Latin American Journal of Pharmacy).....................................................................19
Capítulo III - Determinação da atividade antioxidante in vitro de Ximenia americana L.
(Artigo a ser submetido à Revista LWT)..............................................................................34
Capítulo IV – Atividade cicatrizante do extrato da casca do caule de Ximenia americana L.
veiculado em forma farmacêutica semi-sólida (Artigo submetido à Revista Brasileira de
Ciências Farmacêuticas).......................................................................................................51
Capítulo V – Tecnologia de obtenção de fitoterápico à base de Ximenia americana L.
(Artigo a ser submetido à Revista Brasileira de Farmácia)...................................................70
Conclusões e Perspectivas.....................................................................................................92
Referências Bibliográficas....................................................................................................95
Anexos...................................................................................................................................98
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA: Análise de Variância
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
CV:Coeficiente de variação
DP: Desvio Padrão
DPPH: 1,1 –difenil-2-picrilhidrazil
EROS:Espécies reativas de oxigênio
GL:Graus de liberdade
IPA: Instituto de Pesquisas Agropecuárias
LTM: Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos
Ph: Potencial de hidrogênio iônico
PE: Pernambuco
UFPE: Universidade Federal de Pernambuco
xi
LISTA DE SÍMBOLOS
%: porcentagem
mL: mililitro
µL: microlitro
L: litro
µg: micrograma
mg: miligrama
g: grama
M: molar
mM: milimolar
nm: nanômetro
Mo: molibidênio
Min: minuto
H: hora
R2: coeficiente de correlação
m/v: porcentagem massa por volume
cP: centipoise
±: mais ou menos
®: marca registrada
xii
LISTA DE FIGURAS Capítulo I Figura 1: A: Hábito; B: Folhas; C: Caule lenhoso; D: Flor e espinho; E: Fruto de Ximenia americana L..........................................................................................................................11 Capítulo II Figura 1: Caule de Ximenia americana L. (Olacaceae). A. Vista transversal do córtex, mostrando início da formação da periderme. B. Córtex mostrando colênquima angular. C. Tecidos de condução em arranjo colateral, dispostos em anel. D. Fibras com paredes espessadas e lignificadas na medula. E-H. Elementos de condução, mostrando espessamento helicoidal em G. H. Célula com prolongamento de parede (seta). eva – elemento de vaso agrupado; evp – elemento de vaso com prolongamento; evr – elemento de vaso com parede terminal reta; p – prolongamento. Barras: A,B = 100 μm; C = 300 μm; D = 30 μm; E-H = 50 μm..........................................................................................................28 Capítulo III Figura 1. Percentual de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico a 70% em função do tempo................................................................................................................................44 Figura 2. Percentual de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico a 90% em função do tempo................................................................................................................................45 Figura 3. Percentual de inibição do radical DPPH pelo extrato acetônico a 70% em função do tempo................................................................................................................................45 Figura 4. Percentual de inibição da oxidação pelo Peróxido de Hidrogênio........................47 Capítulo IV Figura 1. Cauterização com ponta esférica de bisturi elétrico..............................................60 Figura 2. Aplicação por via tópica........................................................................................60 Capítulo V Figura 1. Gel de Carbopol com extrato etanólico (1) e Gel de carbopol com extrato glicólico (2) submetido à estabilidade acelerada (AC) e à estabilidade de longa duração (LD) no período de 3 meses..................................................................................................80 Figura 2. Gel-creme com extrato etanólico (3) e Gel-creme com extrato glicólico (4) submetido à estabilidade acelerada (AC) e à estabilidade de longa duração (LD) no período de 3 meses.............................................................................................................................82 Figura 3. Pomada de Polietilenoglicol submetida à estabilidade acelerada (AC) e à estabilidade de longa duração (LD) no período de 3 meses..................................................84 Figura 4. Linearidade do método verificando a regressão das três curvas de calibração.....85
xiii
LISTA DE TABELAS E QUADROS Capítulo II Tabela 1. Determinação do teor de fenóis totais em extratos do caule de Ximenia americana L. (Olacaceae).......................................................................................................................30 Capítulo III Tabela 1. Teor de fenóis totais dos diferentes extratos de X. Americana L..........................43 Tabela 2. Capacidade de seqüestrar o radical DPPH (% de inibição)..................................44 Tabela 3. Atividade antioxidante total dos extratos etanólicos (70% e 90%) e acetônico (70%) de X. americana em AAR% rutina............................................................................46 Tabela 4. Atividade antioxidante pelo método do peróxido de hidrogênio(H2O2)...............47 Capítulo IV Tabela 1. Formulação do gel-creme......................................................................................58
Quadro 1. Grupos de animais e esquemas de tratamento para o estudo de cicatrização......59 Tabela 2. Controle de qualidade do gel-creme de Ximenia americana L.............................62 Quadro 2. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle negativo....................63 Quadro 3. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle positivo.....................64 Quadro 4. Resultados da avaliação macroscópica do grupo teste.........................................64 Capítulo V Tabela 1. Lotes de bancada dos géis.....................................................................................75 Tabela 2. Lotes de bancada dos géis-creme..........................................................................75 Tabela 3. Lote de bancada da pomada..................................................................................76 Tabela 4. Teor de Fenóis de extrato glicólico e extrato etanólico.........................................79 Tabela 5. Controle de qualidade (pH, viscosidade e teor) da forma farmacêutica gel com extrato etanólico e com extrato glicólico..............................................................................81 Tabela 6. Controle de qualidade (pH, viscosidade e teor) da forma farmacêutica gel-creme com extrato etanólico e com extrato glicólico......................................................................83 Tabela 7. Controle de qualidade (pH, viscosidade e teor) da forma farmacêutica pomada com extrato glicólico.............................................................................................................84 Tabela 8. Dados das curvas de calibração para a determinação da linearidade do método..85 Tabela 9. Resultados da análise de variância para a linearidade...........................................86 Tabela 10. Determinação dos resultados estatísticos da Exatidão de acordo com o teste t de Student...................................................................................................................................87 Tabela 11. Teste t de student: duas amostras presumindo variâncias equivalentes – Robustez da realização ou não de sonicação durante a diluição da amostra.........................87 Tabela 12. Avaliação através da ANOVA dos diferentes tempos de reação usados no parâmetro robustez................................................................................................................88 Tabela 13. Resultados da Repetitividade..............................................................................88 Tabela 14. ANOVA precisão intermediária..........................................................................89
xiv
RESUMO
PADRONIZAÇÃO, ATIVIDADE BIOLÓGICA E DESENVOLVIMENTO DE
FORMAS FARMACÊUTICAS SEMI-SÓLIDAS À BASE DE Ximenia americana L.
Ximenia americana L. é uma planta comumente encontrada nas regiões tropicais e
temperadas do mundo e bastante utilizada na Nigéria para o tratamento da malária e de
diversas infecções na pele. A sua casca, avermelhada e lisa, apresenta diversas atividades e
está sendo usada para diversos fins, como para infecções na pele, hemorróidas e
inflamações das mucosas. O presente trabalho objetivou a padronização do extrato da casca
do caule de X. americana proveniente de Serra Talhada (PE), a determinação das suas
atividades antioxidante e cicatrizante, o desenvolvimento e estabilidade de formas
farmacêuticas semi-sólidas à base desses extratos e a validação da metodologia analítica.
Na etapa fitoquímica da padronização do extrato evidenciou-se a presença de taninos
condensados, saponinas e açúcares redutores. O doseamento dos fenóis totais foi realizado
através do reagente de Folin & Ciocalteau em extratos etanol: água (70:30 e 90:10) e
acetona: água (70:30), onde verificou-se teores de 16,45%, 12,9% e 16,44%
respectivamente, correlacionado-se com a atividade antioxidante verificada pelo método do
peróxido de hidrogênio, do DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) e do molibidênio. A planta
apresentou atividade cicatrizante do ponto de vista macroscópico em relação ao padrão D-
pantenol, demonstrando ter capacidade de aumentar a velocidade de cicatrização de feridas.
As diferentes formulações semi-sólidas foram submetidas ao estudo de estabilidade
acelerado e de longa duração e foram avaliadas ao longo dos 3 primeiros meses. O método
de doseamento de fenóis totais em forma farmacêutica foi validado e demonstrou atender
aos requisitos exigidos pela legislação brasileira em vigor, RE nº 899, da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária.
Palavras-chave: Ximenia americana, padronização, atividades biológicas, formulações.
xv
ABSTRACT
STANDARTIZATION, BIOLOGICAL ACTIVITY AND DEVELOPMENT OF
SEMI-SOLID PHARMACEUTICAL FORMS BASED ON Ximenia americana L.
Ximenia American L. is a plant commonly found in tropical and temperate regions of the
world and much used in Nigeria for the treatment of malaria and various infections in the
skin. Its bark, red and smooth, offers various activities and is being used for various
purposes, such as for skin infections, hemorrhoids and inflammation of the mucous
membranes. This work aimed to standardize the extract of the bark of the stem of X.
americana from Serra Talhada (PE), the determination of their antioxidant activity and
healing, the development and stability of semi-solid pharmaceutical forms based on these
extract, and validation of analytical methodology. In step phytochemical the standardization
of the extract showed up the presence of condensed tannins, saponins and reducing sugars.
The determination of total phenols was conducted through the reagent of Folin &
Ciocalteau in extracts ethanol: water (70:30 and 90:10) and acetone: water (70:30), where it
was found levels of 16,45%, 12,9% and 16,44% respectively, correlated with the
antioxidant activity verified by the method of hydrogen peroxide, the DPPH (1,1-diphenyl-
2-picrilhidrazil) and the molibidênio. The plant presented healing activity of the
macroscopic point of view in relation to the standard D-pantenol, demonstrating be able to
speed the healing of wounds. The different semi-solid formulations were undergone to
accelerated study of stability and long term and have been evaluated over the first 3
months. The method of determination of total phenols in pharmaceutical form was
validated and proved to serve requirements demanded by the Brazilian legislation, RE no
899, the ANVISA.
Keywords: Ximenia americana, standardization, biological activities, formulations.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
1
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
2
INTRODUÇÃO
Especialmente nas últimas duas décadas, a humanidade vem despertando para a
relevância dos produtos naturais para a recuperação e manutenção da saúde. Assim,
devido ao crescimento da população mundial, especialmente na camada dos idosos, ao
estresse da vida moderna e a deficiência das terapias, o homem se volta para a natureza
em busca de soluções para os problemas que o aflige, especialmente problemas de saúde
(NEWALL, ANDERSON & PHILLIPSON, 2002).
As plantas medicinais e seus derivados em muitos países, principalmente
naqueles em desenvolvimento, têm seu uso disseminado por grande parte da população
(LASHARI, 1984; YAMADA, 1998; VASCONCELOS, 2003). O Brasil inclui-se entre
os países de maior biodiversidade mundial, abrigando cerca de 50 mil espécies de
plantas superiores, das quais apenas uma pequena parcela tem sido pesquisada
cientificamente quanto ao seu potencial de produção de fármacos (BRASIL, 2006).
Atualmente, muitas atividades farmacológicas de plantas de uso popular estão
sendo estudadas, entre elas podemos citar a Ximenia americana, que é uma planta
comumente encontrada na África, Índia, Nova Zelândia, América Central e América do
Sul (SACANDE & VAUTIER, 2006). É uma espécie cosmopolita tropical com
ocorrência silvestre, inclusive nos tabuleiros litorâneos do nordeste do Brasil (MATOS,
2007). A sua casca, avermelhada e lisa, apresenta diversas atividades e vem sendo usada
para diversos fins, como no tratamento da lepra, da malária, da dor de cabeça, como
moluscicida, nas infecções da pele, hemorróidas e inflamações das mucosas. A ação
cicatrizante relatada na literatura pode ser justificada pela presença de algumas
substâncias como os taninos (VERAS & MORAIS, 2004).
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
3
As plantas medicinais, que têm avaliadas a sua eficácia terapêutica e a
toxicologia ou segurança do uso, dentre outros aspectos, estão cientificamente
aprovadas a serem utilizadas pela população nas suas necessidades básicas de saúde
(MARTINS et al., 1998). O uso inadequado dos constituintes de plantas medicinais
pode causar danos à saúde do paciente ou fazer com que a substância terapêutica não
tenha o efeito esperado. Justifica-se, portanto, nosso interesse em padronizar extratos,
avaliar tóxico-farmacologicamente em ensaios pré-clínicos e veicular em forma
farmacêutica com adequado estudo de estabilidade.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
4
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
5
OBJETIVOS
Geral
Padronização, estudo farmacológico e desenvolvimento de formas farmacêuticas
semi-sólidas utilizando a casca do caule de Ximenia americana L.
Específicos
• Identificação botânica da espécie;
• Padronização botânica da espécie;
• Padronização do extrato;
• Avaliação da atividade antioxidante do extrato;
• Avaliação da toxicidade e da atividade cicatrizante do extrato;
• Desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas (gel, gel-creme e
pomada) à base de extrato etanólico e glicólico de Ximenia americana;
• Estudo de estabilidade acelerado e de longa duração das formas farmacêuticas
desenvolvidas;
• Validação da metodologia analítica para determinação do teor do princípio ativo
na forma farmacêutica.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
6
Ximenia americana L.: BOTÂNICA, QUÍMICA E FARMACOLOGIA NO INTERESSE DA TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
(Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmácia)
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
7
Ximenia americana L.: botânica, química e farmacologia no interesse da tecnologia farmacêutica
Ximenia americana L.: botany, chemistry and pharmacology in the interest of pharmaceutical technology
Mariana Trycia Brasileiro1, Amanda Alencar do Egito2, Januária Guedes de Lima2,
Karina Perrelli Randau3, Gustavo Campos Pereira2, Pedro José Rolim Neto4*.
RESUMO Ximenia americana é uma planta cosmopolita tropical com ocorrência silvestre, no
nordeste do Brasil, utilizada na medicina popular principalmente para o tratamento da
dor de estômago, sífilis, reumatismo, câncer e infecções da boca. Estudos realizados
com a espécie foram compilados objetivando registrar o nível de conhecimento
disponível sobre a planta, incluindo sua caracterização botânica, seus constituintes
químicos e suas propriedades farmacológicas, itens indispensáveis a sua utilização na
tecnologia farmacêutica. Sua atividade antimicrobiana em diferentes microorganismos e
sua atividade antiinflamatória, antialérgica, e seus efeitos vasoprotetores tornam a planta
uma promissora fonte de matéria-prima para a utilização na produção de medicamentos
fitoterápicos.
Palavras-chave: Ximenia americana, farmacobotânica, tecnologia farmacêutica.
1 Aluna do Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE. 2 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE. 3 Pesquisadora do Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos e do Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE. 4* Docente do Departamento de Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, UFPE. Endereço: Av. Prof. Arthur de Sá s/n, Cidade Universitária, 50740-521 Recife-PE, Brasil. E-mail: [email protected]
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
8
ABSTRACT Ximenia americana is a cosmopolitan tropical plant with wild occurrence in northeast
Brazil, primarily used in popular medicine for the treatment of pain in the stomach,
syphilis, rheumatism, cancer and mouth infections. Studies with the species were
compiled aiming register the level of knowledge available on the plant, including its
characterization botany, its chemical constituents and their pharmacological properties,
essential items for use in pharmaceutical technology. The antimicrobial activity in
different microorganisms and its antiinflammatory activity, antialergic, and its
vasoprotector effects make the plant a promising source of material for use in the
production of medicines phytotherapeutic. Keywords: Ximenia americana,
pharmacobotany, pharmaceutical technology.
INTRODUCAO
Ximenia americana é comumente encontrada na África, Índia, Nova Zelândia,
América Central e América do Sul (SACANDE & VAUTIER, 2006). É uma planta
cosmopolita tropical com ocorrência silvestre, inclusive nos tabuleiros litorâneos do
nordeste do Brasil (MATOS, 2007).Ximenia americana vem sendo bastante utilizada na
Nigéria para fins medicinais (OGUNLEYE & IBITOYE, 2003); é utilizada na medicina
popular para o tratamento da dor de estômago, sífilis, reumatismo, câncer e infecções da
boca (MWANGI et al., 1994).
Os frutos de X. americana são ricos em vitamina C, constituindo-se em um
importante componente da dieta; são ingeridos puros, na forma de geléia ou de xarope.
A sua casca, avermelhada e lisa, apresenta diversas atividades e vem sendo usada para
diversos fins, como no tratamento da lepra, da malária, da dor de cabeça, como
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
9
moluscicida, nas infecções da pele, hemorróidas e inflamações das mucosas. A ação
cicatrizante relatada na literatura pode ser justificada pela presença de algumas
substâncias como os taninos (VERAS & MORAIS, 2004).
Sua madeira, de cor rósea, é compacta e leve, muito elástica, bastante durável,
fácil de trabalhar e bastante utilizada como cabo de ferramentas e de instrumentos
agrícolas. As flores desempenham um importante papel na indústria de perfumaria. Das
sementes assadas faz-se um pó que serve para misturar ao sagu e fazer pão (BRAGA,
1976; PIO-CORREA, 1984).
As suas sementes são consideradas purgativas e muito saborosas, possuem um
óleo viscoso, o qual é usado como tempero; os indígenas de alguns países africanos
usam para untar o corpo e os cabelos (PIO-CORREA, 1984). O óleo da semente é
comestível e usado na culinária, no entanto, seu principal uso é como emoliente, óleo
capilar, condicionador e hidratante para a pele, na fabricação de sabonetes e como
componente de batons e lubrificantes (REZANKA & SIGLER, 2007).
DESENVOLVIMENTO
BOTANICA
A família Olacaceae possui distribuição pantropical, compreendendo 27 gêneros
com, aproximadamente, 200 espécies; seus representantes são plantas lenhosas, árvores
ou arbustos. No Brasil encontram-se, aproximadamente, 13 gêneros e cerca de 60
espécies, sendo os de maior número de espécies os gêneros Heisteria, Ximenia,
Liriosma e Schoepfia. No Brasil, os gêneros e espécies de Olacaceae são mais comuns
na Amazônia, fora desta região destacam-se os gêneros Ximenia e Heisteria. A espécie
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
10
mais comum deste primeiro gênero é X. americana, que apresenta ampla distribuição
em diversos ecossistemas florestais (JOLY, 2002; SOUZA & LORENZI, 2005).
Embora muitas das Olacaceae possuam porte arbóreo, sem qualquer evidência
externa de que sejam hemiparasitas, existem referências de que diversos exemplares
desta família apresentam este tipo de hábito, como exemplo: Olax, Ptychopetalum,
Schoepfia e Ximenia (JOLY, 2002; SOUZA & LORENZI, 2005).
O gênero Ximenia apresenta diversas espécies como X. pubescens, X. parviflora,
X. caffra, X. americana, X. perrieri, X. intermedia e X. coriacea. Entre essas espécies, a
X. caffra se destaca por ser utilizada na Tanzânia para o tratamento da menstruação
irregular, reumatismo e câncer (CHHABRA & UISO, 1990) e, na província de
Limpopo, no Sul da África, para o tratamento da diarréia (MATHABE et al., 2006).
Segundo Matos (2007), X. americana é caracterizada como arbusto de 3-4
metros de altura ou árvore pequena espinhosa, de casca fina, avermelhada ou cinza, lisa
ou pouco rugosa, com folhas pequenas, simples, inteiras, alternas, pecioladas, oblongas,
glabras e flores branco-amareladas, aromáticas, com as pétalas recurvadas, dispostas em
racemos curtos, axilares ou terminais (Figura 1). Tem frutos aromáticos, do tipo drupa
subglobosa de cor amarelo alaranjado, medindo de 1,5 a 2 cm de diâmetro, envolvendo
uma única semente com amêndoa branca. Apresenta polpa de consistência firme e sabor
doce (EROMOSELE & EROMOSELE, 2002). As sinonímias de nomes vulgares mais
usadas são: ameixa-do-mato, ababuí, ameixeira-do-brasil, ameixa-do-brasil, ambuí,
ameixa-da-bahia, ameixa-da-terra, ameixa-de-espinho, ameixa-do-pará, limão-bravo-do-
brejo, sândalo-do-Brasil, umbu-bravo ou ximenia. Em Angola é conhecida, ainda, pelos
nomes de ganzi, lumeque, mepeque, muinje, munjaque, omupeque e umpeque
(WIKIPEDIA, 2007).
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
11
Principais sinonímias botânicas: Amyris arborescens P. Browne, Heymassoli
inermis Aubl., Heymassoli spinosa Aubl., Pimecaria odorata Raf., Ximenia aculeata
Crantz, X. americana fo. inermis (Aubl.) Engl., X. americana fo. inermis S. Moore, X.
americana var. ovata DC., X. arborescens Tussac ex Walp., X. fluminensis M. Roem.,
X. inermis L., X. montana Macfad., X. multiflora Jacq., X. oblonga Lam. ex Hemsl., X.
spinosa Salisb., X. verrucosa M. Roem (PLANTAMED, 2007).
Figura 1: A: Hábito; B: Folhas; C: Caule lenhoso; D: Flor e espinho; E: Fruto de Ximenia americana L.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
12
QUIMICA
James et al. (2007) realizaram uma pesquisa acerca dos constituintes químicos
de X. americana utilizando extratos aquosos e metanólicos das folhas, da casca do caule
e da raiz. Os resultados indicaram que os constituintes presentes na planta foram
carboidratos, na forma de açúcares, e amido solúvel, exceto para o extrato aquoso das
folhas. Saponinas, taninos, flavonóides, glicosídios cardiotônicos e antraquinonas
estiveram presentes em todos os extratos, exceto nos extratos das folhas, onde não
foram encontradas antraquinonas. Observações semelhantes foram relatadas por
Ogunleye e Ibitoye (2003), que também detectaram a presença de flavonóides e taninos
nos extratos das folhas, enquanto que os alcalóides e antraquinonas estiveram ausentes.
Mevy et al. (2006) estudaram o óleo volátil das folhas de X. americana
utilizando GC-MS e identificaram 33 componentes, representando 98% do total do óleo.
O óleo estudado continha em sua composição, 69% de compostos aromáticos, 12,5% de
compostos lipídicos e 13% de terpenos. O constituinte encontrado em maior quantidade
foi o benzaldeído (63,5%), seguido pelo cianeto de benzila (13%) e isoforona (3,5%).
Este último composto já teve atividade carcinogênica relatada por outros autores, o que
contraria o uso tradicional da planta para o tratamento do câncer.
A análise fitoquímica do fruto registra para as amêndoas das sementes um teor
de 70% de óleo fixo viscoso, amarelo, derivado de ácidos graxos. Das raízes foi
extraído, também, um óleo contendo os ácidos graxos acetilênicos com 18 átomos de
carbono: tarírico (octadeca-5-inóico) e outro composto acetilênico recém descrito na
literatura: (10Z, 14E, 16E-octadeca-10,14,16-triene-12-inóico). As suas cascas
apresentam elevado teor de taninos ainda não identificados quimicamente (MATOS,
2007).
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
13
Eromosele & Eromosele (2002) estudaram a composição dos ácidos graxos das
sementes de X. americana baseados em análises preliminares, indicando que o óleo
poderia conter níveis significativos de ácidos graxos insaturados. Eles identificaram dez
ácidos graxos, dos quais sete eram insaturados. Os estudos detectaram que o óleo
contém ácidos graxos essenciais como o linoléico (1,34%), o linolênico (10,31%) e o
araquidônico (0,6%), conferindo ao óleo um considerável valor nutricional, além de
variados níveis de ácidos graxos insaturados de alto peso molecular. Segundo
Eromosele & Paschal (2003), o óleo das sementes de X. americana apresenta
características físico-químicas que sugerem potenciais aplicações para ele, pois
apresenta redução de apenas 5% na densidade quando submetido a variações de
temperatura entre 30 e 70ºC e uma elevada viscosidade a 30ºC. Esses óleos vegetais têm
sua importância aumentada não apenas pelo valor nutricional, mas também pelo uso na
indústria de produtos cosméticos, além do uso como lubrificantes e como resina para
tintas.
Freiberger et al. (1998), avaliaram o conteúdo nutricional de folhas comestíveis
de sete plantas silvestres da Nigéria, entre elas a X. americana. Eles descobriram que as
folhas contém grande quantidade de cálcio (32 mg.g-1) e de magnésio (14 mg.g-1), e
pequena quantidade de ferro (107 µg.g-1), manganês (39,4-49,8 µg.g-1) e proteínas
(7,87%). As folhas também continham altos níveis de palmitatos, dos quais muitas das
estruturas lípídicas são derivadas.
ATIVIDADE BIOLÓGICA
Segundo Quintans et al. (2002), já foram isolados metabólitos secundários de X.
americana que podem ser responsáveis pelo possível efeito anticonvulsivante. Estes
mesmos autores realizaram estudos acerca da atividade anticonvulsivante do extrato
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
14
etanólico bruto da planta em camundongos albinos Swiss, demonstrando que ele
provoca um aumento na latência para o aparecimento das convulsões, sendo, portanto,
um forte indicativo de uma ação anticonvulsivante.
Voss, Eyol & Berger (2006) investigaram a atividade antineoplásica de vários
extratos da planta in vitro. Eles realizaram um estudo químico-farmacológico da planta
que permitiu o isolamento de material protéico com ação antineoplásica no ensaio com
o modelo de câncer de colo-retal em ratos, cuja estrutura química foi caracterizada por
análise espectrométrica de massas, com a detecção da presença de um peptídeo com
cadeia de 11 aminoácidos.
Uchoa et al., (2006) avaliou a atividade moluscicida da casca de X. americana
frente ao caramujo adulto Biomphalaria glabrata e observou que a madeira do caule
apresenta atividade moluscicida significativa.
Fatope, Adoum & Takeda (2000) estudaram a atividade pesticida do extrato das
raízes e de ramos da X. americana. Durante o teste com os extratos da planta, eles
observaram que os extratos preparados com solventes menos polares foram mais ativos
no teste de letalidade em camarões e que as frações ativas de X. americana não são
letais para crisálidas e percevejos adultos. Elas apenas podem ser usadas para a
supressão da população através da destruição dos ovos viáveis.
James et al. (2007) compararam a atividade antimicrobiana de extratos aquosos e
metanólicos de X. americana (casca do caule, folhas e raiz) frente a microorganismos
patogênicos isolados de pacientes no Departamento de Microbiologia da Universidade
de Ahmadu Bello, na Nigéria. Os microorganismos testados foram Staphylococcus
aureus, Salmonella typhi, Escherischia coli, Shigella flexneri e Klebsiella pneumoniae.
A atividade do extrato metanólico da raiz foi mais pronunciada em Klebsiella
pneumoniae e Staphylococcus aureus, principalmente quando comparada com o extrato
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
15
metanólico das folhas e do caule. Não existiu diferença significativa entre a atividade do
extrato metanólico e aquoso das folhas e caule frente à Shigella flexneri. A atividade
antimicrobiana observada pode ser atribuída à presença de taninos e flavonóides; esta
atividade foi anteriormente relatada por WILD & FASEL (1969) e ERAH et al. (1996).
Omer & Elnima (2003) testaram a atividade antimicrobiana e antifúngica dos
extratos clorofórmicos, metanólicos e aquosos da casca do caule, das folhas e das raízes
de X. americana e concluíram que o extrato metanólico foi o mais ativo e o aquoso
também mostrou elevada atividade. Os microorganismos Staphylococcus aureus foram
as bactérias mais susceptíveis, enquanto que Candida albicans foi o fungo de maior
resistência aos extratos testados. Segundo Matos (2007), ensaios para avaliação da
atividade antimicrobiana mostraram que o extrato das folhas é ativo contra Escherischia
coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans.
Koné et al. (2004) realizaram um estudo com extratos etanólicos de 50 plantas
medicinais pertencentes a 31 famílias diferentes utilizadas como remédios tradicionais
para doenças bacterianas. O extrato das raízes de X. americana foi testado e comprovou
ser um dos 10 extratos que apresentou maior atividade contra Enterococcus faecalis e
Streptococcus pyogenes.
CONCLUSOES
Ximenia americana ainda é uma espécie pouco investigada cientificamente,
porém é bastante utilizada na medicina popular, principalmente em países como a
Nigéria e África do Sul. Sua atividade antimicrobiana em diferentes microorganismos
pode ser parcialmente atribuída aos seus constituintes químicos, como os taninos, que
vêm sendo tradicionalmente usados, principalmente para a proteção de superfícies
inflamadas. A presença de polifenóis pode ser um forte indicativo da sua atividade
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
16
antiinflamatória, antialérgica, antibacteriana, antifúngica, além de seus efeitos
vasoprotetores. Neste contexto, a planta passa a ser uma promissora fonte de matéria-
prima para a utilização na produção de medicamentos fitoterápicos. Situação esta
desejada pela Política Nacional de Medicamentos como contribuição ao Sistema Único
de Saúde (SUS).
AGRADECIMENTOS
A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio financeiro na realização desta pesquisa.
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PADRONIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA DAS CASCAS DO CAULE DE Ximenia
americana L (OLACACEAE) PARA UTILIZAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DE
FITOTERÁPICOS
(Artigo submetido à Revista Latin American Journal of Pharmacy)
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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Padronização Farmacognóstica das cascas do caule de Ximenia americana L
(Olacaceae) para utilização no desenvolvimento de fitoterápicos
Mariana Trycia Brasileiro1, Amanda Alencar do Egito1, Karina Perrelli Randau1, Clébio Pereira Ferreira2, Rejane Magalhães de Mendonça Pimentel2, Gustavo Campos Pereira1,
Pedro José Rolim Neto*1.
1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco-UFPE, 50.740-521, CDU, Recife,
PE, Brasil, 2 Laboratório de Fitomorfologia Funcional, Departamento de Botânica; Universidade
Federal Rural de Pernambuco – UFRPE, 52171-900, Dois Irmãos, Recife, PE, Brasil.
RESUMO
Ximenia americana L. um representante da família Olacaceae que ocorre nas regiões do
semi-árido do nordeste do Brasil. Suas cascas são utilizadas como cicatrizante, no
tratamento da malária, entre outros. Este estudo objetivou a padronização das cascas de
X. americana, permitindo o reconhecimento seguro desta espécie. Foram realizadas
análises microscópicas das cascas do caule, juntamente com a histoquímica, perfil
fitoquímico, teor de fenóis totais, e os testes de pureza: determinação do teor de cinzas
totais, cinzas insolúveis em ácido e determinação da perda por dessecação. Os
resultados obtidos podem ser utilizados como parâmetros no controle de qualidade de
matérias-primas para um futuro fitoterápico.
Palavras-chave: fitoterápicos, padronização, Ximenia americana.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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ABSTRACT
Ximenia americana L. is a representative of the Olacaceae family that occurs in the
semi-arid regions of Northeast Brazil. Its bark is used for healing in the treatment of
malaria, amongst others. The objective of this study is the standardization of the bark of
the X. americana, so as to permit a positive recognition of this species. Microscopical
analyses of the bark were carried out, together with a histochemical, phytochemical
profile of total phenol content and purity tests: determination of total ash content, ashes
that are insoluble in acid and determination of loss by drying. The results that were
obtained can be used as parameters in quality control of raw material for future
phytotherapy.
Key words: phytoterapics, standardization, Ximenia americana.
INTRODUÇÃO
A Família Olacaceae possui distribuição pantropical, compreendendo 27 gêneros
e aproximadamente 200 espécies, sendo seus representantes plantas lenhosas, árvores ou
arbustos. No Brasil encontram-se aproximadamente 13 gêneros e cerca de 60 espécies,
sendo o gênero Ximenia um dos maiores em número de espécies (JOLY, 2002; SOUZA
& LORENZI, 2005).
X. americana é uma planta cosmopolita tropical com ocorrência silvestre
inclusive nos tabuleiros litorâneos do nordeste do Brasil (MATOS, 2007).
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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O gênero Ximenia é utilizado popularmente para fins medicinais, como o
tratamento de menstruação irregular, reumatismo, câncer, infecções da boca, dor de
estômago, sífilis, (CHHABRA & UISO, 1990; MWANGI et al., 1994; OGUNLEYE &
IBITOYE, 2003) e para o tratamento da diarréia (MATHABE et al., 2006). Sua casca é
utilizada para o tratamento da lepra, da malária, da dor de cabeça, como moluscicida,
para infecções da pele, hemorróidas e inflamações das mucosas. A ação cicatrizante
relatada na literatura pode ser justificada pela presença de algumas substâncias com essa
atividade como os taninos (VERAS & MORAIS, 2004).
O presente estudo objetivou a padronização botânica e química das cascas de
Ximenia americana, identificando caracteres diagnósticos que permitam o
reconhecimento seguro desta espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
Droga vegetal
Amostras da espécie de X. americana foram coletadas em Serra Talhada-PE. O
material testemunho foi depositado no Herbário Dárdano de Andrade Lima da Empresa
Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA –73349).
Análise macroscópica e microscópica do pó das cascas do caule
A caracterização macro e microscópica das cascas foi realizada utilizando-se
material fresco e fixado em FAA 50 (formaldeído, ácido acético, etanol, água,
5:5:45:45).
Lâminas semipermanentes foram confeccionadas de macerados obtidos de
fragmentos de casca com aproximadamente 1 cm de comprimento, imersos em uma
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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mistura de ácido crômico e ácido nítrico na proporção de 1:1. Os fragmentos foram
mantidos nesta solução por um período de 24 horas e a solução foi trocada toda vez que
se tornava escura. As amostras foram lavadas em água destilada sucessivas vezes e
lavadas em solução de álcool a 50%, e coradas com safranina alcoólica a 1% em etanol
por 24 horas. Em seguida foram lavadas três vezes em etanol a 30% para a retirada do
excesso do corante. O material macerado foi montado em glicerina aquosa a 60%
(KRAUS & ARDUIM, 1997).
Uma amostra de macerado foi utilizada para realizar medições do comprimento
e largura dos principais elementos celulares, como vasos de xilema, fibras e células de
parênquima.
Observações e análises foram feitas em imagens digitais a partir do programa de
análise de imagens, Image Tool (WILCOX et al., 2002). As barras foram determinadas
de imagens de uma lamina micrometrada nas mesmas condições das imagens dos cortes
histológicos da planta.
Análise histoquímica
Secções transversais da casca do caule, foram utilizadas para as análises
histoquímicas. Alcalóides foram testados com reagente de Wagner (FURR &
MAHLBERG, 1981), amido com lugol (JOHANSEN, 1940), compostos fenólicos
gerais com cloreto férrico (JOHANSEN, 1940), lignina com floroglucina ácida
(KRAUS & ARDUIM, 1997) e lipídeos, cutina e suberina com Sudan III (SASS, 1951)
e proantocianidinas (taninos) com vanilina clorídrica (RICCO et al., 2002). A
verificação da presença de iridóides foi feita com uma mistura de vanilina sulfúrica a
2% em etanol e ácido sulfúrico em solução alcoólica a 5% na proporção de 1:1.
Fragmentos frescos do caule, cortados à mão livre, foram colocados em uma lâmina e
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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secos em papel absorvente para eliminação do excesso de água. Os fragmentos foram
mantidos entre lâmina e lamínula e levados à estufa a 100º C por um período de 5 min,
seguida de observação em microscópio óptico.
A cor produzida na lâmina foi fotografada em diferentes aumentos usando
câmera digital (Sony W5) e microscópio óptico (Olympus).
Perfil Fitoquímico
Para o perfil fitoquímico, foi preparado um extrato metanolico a 20% (m/v) de
amostra por maceração durante 48 horas. Alíquotas de 10 μL foram analisadas por
cromatografia em camada delgada (placas de gel de sílica Merck - Alemanha,
Art.105554) para análise da presença de grupos de metabólitos, empregando-se diversas
fases móveis e reveladores específicos (HARBORNE, 1998; WAGNER & BLADT,
1996; XAVIER et al., 2002; SENA FILHO et al., 2006).
Preparação dos extratos
Amostras de 5g de casca do caule de Ximenia americana foram submetidas a
maceração durante 24 horas com diferentes misturas de 100 mL etanol:água 90:10,
etanol:água 70:30 e acetona:água 70:30. Os extratos obtidos foram evaporados, o
rendimento foi calculado e posteriormente determinou-se o teor de fenóis totais.
Determinação dos fenóis totais
Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância de referência o
ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de ácido tânico a
100 µg/mL, foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e adicionados 2,5
mL de Folin-Ciocalteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de solução de
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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carbonato de sódio 15% e o volume foi completado com água destilada. As soluções
foram deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As amostras foram
preparadas utilizando 3 mL dos extratos hidroalcoólicos de X. americana a 2 mg/mL. O
branco do sistema foi preparado da mesma forma, sem a alíquota da amostra.
Testes de pureza
Nos testes de pureza, as determinações da perda por dessecação, do teor de
cinzas totais e de cinzas insolúveis em ácido foram realizadas segundo a Farmacopéia
Brasileira IV edição (2000).
Determinação da perda por dessecação
A determinação da perda por dessecação foi feita em três amostras de 3 g de
droga vegetal em pesa-filtro, previamente tarado, as quais foram colocadas em estufa a
105° C por 2 horas, resfriadas em dessecador por 30 min., repetindo-se o processo até
peso constante.
Teor de cinzas totais
Para a determinação do teor de Cinzas totais, três amostras de 3 g da droga
vegetal foram acondicionadas em cadinhos de porcelana previamente pesados e foram
carbonizadas em mufla a 400° C por 4-5 horas; resfriadas em dessecador e pesadas até
obtenção de valor constante. Calculou-se o teor de cinzas totais pela diferença entre o
peso do conjunto cadinho e amostra, antes e após a incineração.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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Cinzas insolúveis em ácido
A determinação das cinzas insolúveis em ácido foi realizada em 25 mL de ácido
clorídrico a 10% em cadinho contendo resíduos das cinzas totais, fervidos por 5 min,
filtrado duas vezes em papel de filtro com tarja preta. Após lavagem do papel de filtro
com água fervente até obter pH neutro, acondicionou-se o papel de filtro em um
segundo cadinho tarado e pesado. Carbonizou-se a 100°C na mufla por 4-5 horas, até
peso constante, resfriou-se no dessecador e pesou-se o cadinho.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
X. americana pode ser caracterizada como arbusto de 3-4 metros de altura ou
árvore pequena espinhosa, de casca fina, avermelhada ou cinza, lisa ou pouco rugosa,
com folhas pequenas, simples, inteiras, alternas, pecioladas, oblongas, glabras e flores
branco-amareladas, aromáticas, com as pétalas recurvadas, dispostas em racemos
curtos, axilares ou terminais. Tem frutos aromáticos, do tipo drupa subglobosa de cor
amarelo alaranjado, medindo de 1,5 a 2 cm de diâmetro, envolvendo uma única semente
com amêndoa branca. Apresenta polpa de consistência firme e sabor doce (PIO
CORREA, 1978; EROMOSELE & EROMOSELE, 2002, MATOS 2007).
Em vista transversal, o caule mostrou-se com contorno cilíndrico (Fig. 1A); o
córtex está constituído por células colenquimáticas do tipo lamelar, seguidas por
parênquima fundamental (Fig. 1B). Em estrutura secundária, o feixe vascular, do tipo
colateral, está disposto em anel (Fig. 1C). O desenvolvimento da periderme é tardio,
iniciando-se após o início da atividade do câmbio no cilindro vascular (Fig. 1A).
Cilindro vascular delimitado por periciclo constituído por grupos esparsos de
fibras com paredes espessadas (Fig. 1A,B). A região medular está constituída por
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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células lignificadas, com paredes mostrando variados graus de espessamento; algumas
delas estão agrupadas e se destacam pelo maior espessamento de suas paredes (Fig. 1D).
As células do floema e parênquima cortical repletas de compostos fenólicos.
Idioblastos contendo lipídeos estão presentes no parênquima cortical e no parênquima
do floema.
O macerado do caule (Fig. 1E-H) mostrou tipos celulares comuns, com algumas
particularidades. As fibras agrupadas presentes na medula permanecem assim, mesmo
após o processo de maceração (Fig. 1F) para dissociação celular; estas células são
ligeiramente alongadas, curtas com pontoações arredondadas. Na Figura H é observado
um prolongamento da parede em uma destas células, por onde elas se prendem entre si.
Os elementos de vaso do xilema mostraram tipos variados: 1 – vasos longos com
paredes terminais oblíquas com prolongamentos de tamanhos discrepantes; 2 – vasos
alongados, curtos e fechados, agrupados, ligados entre si por prolongamentos nas
paredes laterais (Fig. 1H); 3 – vasos longos e estreitos com paredes terminais oblíquas,
placas de perfuração simples e espessamento helicoidal; 4 – células alongadas,
cilíndricas com paredes terminais retas e placa de perfuração simples (Fig. 1H).
Foi abundante a presença de fibras alongadas longitudinalmente e três tipos de
células de xilema: tipo 1- vasos com ambas as paredes terminais retas de comprimento
variado; tipo 2- vasos com uma parede terminal reta e a outra transversa sem
prolongamentos e; tipo 3- vasos com paredes terminais tangenciais com
prolongamentos. As células de parênquima se mostraram alongadas.
Os testes histoquímicos confirmaram a presença de amido no parênquima cortical
e em células parenquimáticas do floema; compostos fenólicos foram detectados em
células do parênquima medular e no floema. Taninos foram detectados por vanilina
clorídrica em células do parênquima cortical, medular e floema; vanilina sulfúrica
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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marcou fracamente a presença de taninos nas células do parênquima dos raios
medulares. As células do súber foram fortemente marcadas por sudan III, indicando a
presença de suberina. Lignina foi fortemente marcada nos elementos de vaso no xilema
e fibras, entretanto, foi fracamente marcada nos grupos de fibras que constituem o
periciclo.
Figura 1. Caule de Ximenia americana L. (Olacaceae). A. Vista transversal do córtex,
mostrando início da formação da periderme. B. Córtex mostrando colênquima angular.
C. Tecidos de condução em arranjo colateral, dispostos em anel. D. Fibras com paredes
espessadas e lignificadas na medula. E-H. Elementos de condução, mostrando
espessamento helicoidal em G. H. Célula com prolongamento de parede (seta). eva –
elemento de vaso agrupado; evp – elemento de vaso com prolongamento; evr –
elemento de vaso com parede terminal reta; p – prolongamento. Barras: A,B = 100 μm;
C = 300 μm; D = 30 μm; E-H = 50 μm.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
29
A mistura etanol: água (70:30) foi a que resultou em maior rendimento para as
cascas, seguido da mistura acetona:água (70:30) e finalizando com a mistura
etanol:água (90:10). Os extratos com maior percentual de água foram os que obtiveram
um melhor rendimento.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
30
Para a determinação do teor de fenóis totais, a partir da solução extrativa à 5%,
não houve diferença significativa de melhor rendimento entre as misturas etanol:água
(70:30) e acetona:água (70:30), mas quando se utilizou etanol:água (90:10) o
rendimento dessa extração foi de 12,9% (Tabela 1).
Tabela 1: Determinação do teor de fenóis totais em extratos do caule de Ximenia
americana L. (Olacaceae).
Sistemas binários Rendimento dos extratos Teor de fenóis totais
etanol:água 90:10 25.8% 12.9%
etanol:água 70:30 34.8% 16.45%
acetona:água 70:30 32.28% 16.44%
O perfil fitoquímico evidenciou a presença de um elevado teor de taninos do tipo
proantocianidinas condensadas, de saponinas e de açúcares redutores. Mono e
sesquiterpenos, triterpenos e esteróides, alcalóides, cumarinas, flavonóides,
fenilpropanóides, e derivados cinâmicos não foram detectados.
Todos os testes de pureza realizados ficaram dentro das normas preconizadas
pela Farmacopéia Brasileira e WHO (1998). No ensaio da perda por dessecação, o
resultado obtido (12%) encontra-se dentro do valor recomendando para cascas que é de
8 a 14% proporcionando assim uma redução no ataque por fungos, bactérias e enzimas
(OLIVEIRA et al, 1998). Em relação ao teor de cinzas o percentual foi de 10% e o teor
de cinzas insolúvel em ácido clorídrico de 0,38%.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos podem ser empregados como parâmetros no controle de
qualidade de matérias-primas a base de X. americana para fitoterápicos. A casca do
caule de X. americana L, apresentou fibras alongadas longitudinalmente e três tipos de
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
31
células de xilema: tipo 1- vasos com ambas as paredes terminais retas de comprimento
variado; tipo 2- vasos com uma parede terminal reta e a outra transversa sem
prolongamentos e; tipo 3- vasos com paredes terminais tangenciais com
prolongamentos. As células de parênquima se mostraram alongadas.
A presença predominante de taninos se mostra promissora para uso como
marcadores fitoquímicos. Os testes farmacopéicos contribuem para a especificação da
droga vegetal garantindo uma padronização da matéria –prima para utilização em
produtos fitoterápicos. As informações disponíveis na literatura acerca da morfologia e
anatomia de espécies de Ximenia são escassas, restringindo-se à caracterização da
família Olacaceae; o parênquima é do tipo apotraqueal (WATSON & DALLWITZ,
2007). Deste modo, todas as informações acerca da anatomia desta espécie são inéditas.
AGRADECIMENTOS
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo
apoio financeiro na realização desta pesquisa.
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BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DE Ximenia
americana L.
(Artigo a ser submetido à Revista LWT)
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
35
Determinação da atividade antioxidante in vitro de Ximenia americana L.
Mariana Trycia Brasileiro1, Amanda Alencar Egito1, Alexandre Bezerra Galindo1,
Jeckson Luiz da Silva1, Karina Perreli Randau1,2, Pedro José Rolim Neto1*.
1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE.
2 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE.
RESUMO
No organismo humano, a atividade metabólica normal produz constantemente radicais
livres. A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos
compostos antioxidantes os quais podem ter origem endógena ou serem provenientes da
dieta alimentar e outras fontes. Destas últimas destacam-se tocoferóis (vitamina E),
ácido ascórbico (vitamina C), polifenóis, selênio e carotenóides. O objetivo deste
trabalho foi avaliar a capacidade antioxidante da casca do caule de Ximenia americana
L. por diferentes métodos e correlacionar essa atividade com o teor de fenóis totais
presente. Para isto, foram preparados extratos da casca do caule de X. americana (etanol
70% e 90%, e acetona 70%) que tiveram seus fenóis totais doseados utilizando-se o
reagente de Folin & Ciocalteau. A atividade antioxidante foi verificada através do
método do radical livre DPPH• (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), do método do
fosfomolibdênio e do peróxido de hidrogênio. O extrato etanol 70% apresentou maior
capacidade antioxidante em todos os métodos empregados, assim como também
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
36
apresentou um maior teor de fenóis totais. A planta estudada apresentou considerável
atividade antioxidante comprovada por três diferentes métodos, nos diferentes extratos
estudados.
Palavras-chave: Ximenia americana, fenóis totais, atividade antioxidante.
ABSTRACT
In the human body, the normal metabolic activity produces free radicals constantly. The
production of free radicals in living beings is controlled by several antioxidant
compounds which can be caused endogenous or be from diet and other sources. Of
these latter it is tocopherols (vitamin E), ascorbic acid (vitamin C), polyphenols, selênio
and carotenoids. The objective of this work was to evaluate the antioxidant capacity of
the stem bark of Ximenia American L. By different methods and this activity correlate
with the level of total phenols present. For this, extracts were prepared from the bark of
the stem of X. American (ethanol 70% and 90%, and acetone 70%) who have had their
total phenols assayed using the reagent of Folin & Ciocalteau. The antioxidant activity
was verified by the method of radical free DPPH• (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), the
method of fosfomolibdênio and of hydrogen peroxide. The extract ethanol 70%
presented greater antioxidant capacity in all the methods employed, and also had a
higher content of total phenols. The plant studied presented considerable activity
antioxidant proven by three different methods in different extracts studied.
Keywords: Ximenia americana, total phenols, antioxidant activity
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
37
1- INTRODUÇAO
Há muito tempo, as plantas tem sido avaliadas para auxiliar na manutenção da
saúde humana, especialmente na ultima década (KUMAR et al., 2005). A constatação
de que os vegetais possuem substâncias biologicamente ativas que trazem benefícios à
saúde ou efeitos fisiológicos desejáveis tem impulsionado estudos sobre as suas
propriedades (MELO et al., 2006).
No organismo humano, a atividade metabólica normal produz constantemente
radicais livres. Estas moléculas, geradas in vivo, reagem com DNA, RNA, proteínas e
outras substâncias oxidáveis, promovendo danos que podem contribuir para o
envelhecimento e a instalação de doenças degenerativas como câncer, aterosclerose,
artrite reumática, entre outras (MELO et al., 2006). A produção de radicais livres é
controlada nos seres vivos por diversos compostos antioxidantes os quais podem ter
origem endógena ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Destas
últimas destacam-se tocoferóis (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), polifenóis,
selênio e carotenóides (SOUSA et al., 2007). Atualmente, o interesse em encontrar
antioxidantes de ocorrência natural tem aumentado consideravelmente tanto para o uso
em alimentos como em medicamentos (KUMARAN & KARUNAKARAN, 2007).
Os compostos fenólicos, constituintes de um amplo e complexo grupo de
fitoquímicos, são produtos secundários do metabolismo vegetal que apresentam em sua
estrutura pelo menos um anel aromático com uma ou mais hidroxilas, o que possibilita
atuarem como agentes redutores, exercendo proteção ao organismo contra o "stress"
oxidativo (SCALBERT & WILLIAMSON, 2000). A formação de radicais livres é
controlada por vários compostos conhecidos como antioxidantes. O mecanismo de ação
dos antioxidantes não é muito claro devido à existência de uma variedade muito grande
desses agentes (MELO et al., 2006). Alguns compostos fenólicos não se apresentam em
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
38
forma livre nos tecidos vegetais. São aqueles presentes sob a forma de polímeros, na
qual estão os taninos e as ligninas. Os taninos são compostos de alto peso molecular,
que classificam-se em dois grupos, baseados em seu tipo estrutural: taninos
hidrolisáveis e taninos condensados. Os primeiros contêm um núcleo central de glicose
ou um álcool poliídrico, esterificado com ácido gálico ou elágico, e são prontamente
hidrolisáveis com ácidos, bases ou enzimas. Os outros são polímeros de catequina e/ou
leucoantocianidina, não prontamente hidrolisáveis por tratamento ácido (SOARES,
2002).
Recentes estudos tem investigado a potente atividade de produtos à base de
plantas como agente antioxidante para várias doenças induzidas por radicais livres
(HOU et al., 2003; TUNG et al., 2007). Paralelamente, tem sido determinado que o
efeito antioxidante dessas plantas é comumente atribuído aos compostos fenólicos,
como os flavonóides, ácidos fenólicos, taninos e diterpenos (CHUNG et al., 1998;
PIETTA, 2000; TUNG et al., 2007).
Ximenia americana L. é uma planta comumente encontrada nas regiões tropicais
e temperadas do mundo e bastante usada na Nigéria para o tratamento da malária e de
diversas infecções na pele (OGUNLEYE & IBITOYE, 2003). Várias partes da planta
como o fruto, a casca da árvore, a folha e suas raízes são utilizadas na medicina popular
como matéria-prima para o tratamento de diversas patologias. A sua casca, avermelhada
e lisa, apresenta várias atividades e está sendo usada para diversos fins, como para o
tratamento da lepra, da malária, da dor de cabeça, como moluscicida, para infecções da
pele, hemorróidas e inflamações das mucosas (VERAS & MORAIS, 2004). Devido as
suas propriedades medicinais, a fitoquímica da Ximenia americana tem sido investigada
por vários autores (MEVY et al., 2006).
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
39
O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade antioxidante de extratos da
casca do caule de Ximenia americana L. por diferentes métodos e correlacionar essa
atividade com o teor de fenóis totais.
2- MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Preparação dos extratos
As amostras do caule da Ximenia americana L. foram coletadas na cidade de
Serra Talhada (PE). Os extratos foram preparados a 5%(m/v) da casca da planta,
utilizando álcool etílico 90%, álcool etílico 70% e acetona 70% em água, por maceração
durante 48 h. Após isto, foram filtrados e acondicionados em frasco de vidro âmbar.
2.2. Determinação dos fenóis totais
O teor de fenóis totais foi determinado pelo método de Folin & Ciocalteau
(1927). O reagente consiste da mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico,
no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+, porém, em
presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os
chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação
dos metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a determinação da concentração das
substâncias a 760 nm (KUSKOSKI et al., 2006; SOUSA et al., 2007).
Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância de referência o
ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de ácido tânico a
100 µg/mL foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e adicionados 2,5
mL de Folin-Ciocalteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de solução de
carbonato de sódio 15% e o volume foi completado com água destilada. As soluções
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
40
foram deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As amostras foram
preparadas utilizando 3 mL dos extratos hidroalcoólicos (70 e 90%) e do extrato
acetônico (70%) de X. americana a 2 mg/mL. O branco do sistema foi preparado da
mesma forma, sem a alíquota do extrato.
2.3. Atividade antioxidante
2.3.1. Análise qualitativa
Os extratos de X. americana (álcool etílico 90%, álcool etílico 70% e acetona
70% a 5% m/v) foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD), usando
rutina como padrão positivo. A fase móvel utilizada foi: AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O
(100:0.2:0.2:0.2v/v) e AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O (100:0.3:0.3:0.3 v/v). Após
secagem, foram nebulizadas com solução a 0,4 mM do radical DPPH em MeOH. As
placas foram observadas até o aparecimento de manchas amarelas sob fundo de
coloração púrpura, indicativa de possível atividade antioxidante (SOLER-RIVAS et al.,
2000).
2.3.2. Método do radical livre DPPH• (1,1-difenil-2-picrilhidrazil)
Foi preparada uma solução estoque de DPPH em metanol na concentração de 0,4
mM. A partir desta, foram feitas diluições de 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 e 0.0125 mM. A
curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a 517 nm de todas
as soluções.
Alíquotas (0,4 mL) das soluções metanólicas de X. americana, preparadas a
partir dos extratos hidroalcoólicos (70% e 90%) e acetônico (70%) , com concentrações
totais de X. americana de 25, 50 e 100 μg/mL, foram colocadas em diferentes tubos de
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
41
ensaio. Em seguida, 3,6 mL da solução de DPPH em metanol (0,05 mM) foram
adicionados e, após agitação, os tubos foram deixados em repouso ao abrigo da luz. Ao
final de 15, 30, 45 e 60 min, a absorbância foi medida a 517nm e a capacidade de
seqüestrar o radical, expressa como percentual de inibição, foi calculada de acordo com
a seguinte equação matemática:
% inibição = Abs controle – Abs da amostra x 100 Abs controle
Onde: Abs controle = absorbância do controle (solução de DPPH sem antioxidante)
Abs amostra = absorbância da amostra a ser testada
O mesmo procedimento foi realizado empregando-se soluções metanólicas de
padrão rutina, nas concentrações de 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 e 200.0 μg/mL, para a
construção de uma curva padrão (MELO et al., 2006).
2.3.3. Determinação da capacidade antioxidante total
A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelo método do
fosfomolibdênio, descrito por Prieto, Pineda e Aguilar (1999). O ensaio baseia-se na
redução do Mo(VI) – Mo(V) pelo extrato e subseqüente formação do complexo verde
de fosfato/Mo(V). A 0,6 mL das soluções metanólicas (25, 50 e 100 μg/mL) foram
adicionados 6 mL da solução reagente (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e
molibdato de amônio 4 mM). Os tubos contendo a solução reacional foram incubados a
95oC por 90 minutos. Em seguida, a absorbância da solução foi medida a 695 nm,
usando como branco uma solução contendo metanol no lugar do extrato. A atividade
antioxidante foi expressa em atividade antioxidante relativa ao padrão rutina (AAR%),
dada pela fórmula (KUMARAN & KARUKUMARAN, 2007):
AAR% = Abs (amostra) – Abs (branco) x 100 Abs (rutina) – Abs (branco)
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
42
2.3.4. Método do Peróxido de Hidrogênio
Uma solução (4 mM) de peróxido de hidrogênio foi preparada em tampão
fosfato (pH 7,4). A concentração de peróxido de hidrogênio foi determinada por
espectrofotometria no comprimento de onda de 230 nm, usando absortividade molar de
81 (mol/L)-1 cm-1 (YEN & CHEN, 1995). Às soluções metanólicas de X. americana (25,
50 e 100 μg/mL), adicionou-se a solução de peróxido de hidrogênio (0,6 mL). Após 10
minutos de reação, à temperatura ambiente (25ºC), realizou-se leitura em
espectrofotômetro, em comprimento de onda de 230 nm, contra solução branco
contendo o extrato em tampão sem peróxido de hidrogênio. A atividade antioxidante foi
expressa em percentual conforme a seguinte fórmula:
(%) = 1 – (Abs da amostra – Abs branco) x 100 Abs controle
2.3.5. Análise estatística
Os experimentos foram realizados em triplicata. A análise de variância
(ANOVA) e o teste de Tukey foram utilizados para a análise estatística. Valores de
p≤0,05 foram considerados como indicativos de significância.
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Teor de fenóis totais
Na determinação dos fenóis totais observou-se que o maior teor foi encontrado
no extrato etanólico à 70%, seguido do acetônico à 70% e do etanólico 90%, conforme
mostra a Tabela 1.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
43
3.2. Análise qualitativa
A avaliação preliminar qualitativa dos extratos por CCD, revelada com solução
metanólica a 0,4 mM de DPPH, revelou a presença de substâncias com atividade
antioxidante, evidenciadas pela presença de manchas amarelas sobre fundo púrpuro,
resultantes da redução do radical DPPH. Porém, nos extratos a 70%, a existência de
substâncias com atividade antioxidante ficou mais evidente.
3.3. Método do radical livre DPPH
Entre os métodos químicos aplicados para determinar a capacidade antioxidante
de um composto em capturar radicais livres, o método DPPH• (1,1,-difenil-2-
picrilhidrazil) é um dos mais utilizados por ser considerado prático, rápido e estável
(KUSKOSKI et al., 2006).
A equação da curva de calibração do DPPH foi A = 10,489C + 0,0053, onde A é
a absorbância no comprimento de onda de 517 nm e C corresponde à concentração de
DPPH, e o coeficiente de correlação R2 = 0,9999. As amostras testadas foram obtidas a
partir dos extratos hidroalcoólicos a 70 e 90%, e acetônico à 70%.
Tipos de extratos
Abs Média
Eq. de Ác. Tânico(µg)
Teor de fenóis %
Etanol 70% 0,903 9,875 16,46
Etanol 90% 0,723 7,74 12,9
Acetona 70% 0,902 9,867 16,44
Tabela 1: Teor de fenóis totais dos diferentes extratos de X. Americana L.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
44
A capacidade de seqüestrar o radical DPPH, expressa em % de inibição exibida
pelos extratos e padrão rutina nas concentrações de 25, 50 e 100 µg/mL e no intervalo
de tempo entre 0-60 min, encontra-se na Tabela 2.
Todas as amostras de X. americana apresentaram atividade seqüestradora do
radical DPPH e essa atividade foi crescente à medida que se aumentou a concentração
da amostra, conforme pode ser observado nas Figuras 1, 2 e 3.
Tabela 2: Capacidade de seqüestrar o radical DPPH (% de inibição)
*Letras iguais, na mesma coluna e numa mesma concentração, indicam que, no nível de 5%, não há diferença estatisticamente significativa entre as respectivas médias pelo teste de Tukey.
0
10
20
30
40
50
60
70
15 min 30 min 45 min 60min
Tempo
% d
e in
ibiç
ão
[ ] de 25µg/mL[ ] de 50µg/mL[ ] de 100µg/mL
15 min 30 min 45 min 60 min Amostras [ ] de 25 µg/mL*
Médias Signif Médias Signif Médias Signif Médias Signif Rutina 37,48 a 39,74 a 41,62 a 43,29 a
Ximenia EtOH 70% 28,79 b 29,34 b 29,91 b 30,88 b Ximenia EtOH 90% 26,88 bc 26,97 b 26,55 bc 26,81 b
Ximenia Acetona 70% 27,39 bc 27,60 b 29,34 b 30,16 b [ ] de 50 µg/mL*
Rutina 58,99 a 62,75 a 65,26 a 66,94 a Ximenia EtOH 70% 34,23 b 34,99 b 37,26 b 37,44 b Ximenia EtOH 90% 33,18 b 31,60 b 32,48 b 33,04 b
Ximenia Acetona 70% 34,22 b 33,46 b 33,76 b 36,73 b [ ] de 100 µg/mL*
Rutina 81,8 a 84,07 a 84,31 a 84,52 a Ximenia EtOH 70% 58,08 b 60,24 b 60,34 b 62,19 b Ximenia EtOH 90% 54,39 b 52,99 b 53,49 b 55,29 b
Ximenia Acetona 70% 55,57 b 57,03 b 56,75 b 57,24 b
Figura 1. Percentual de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico a 70% em função do tempo.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
45
0
10
20
30
40
50
60
15 min 30 min 45 min 60min
Tempo
% d
e in
ibiç
ão
[ ] de 25µg/mL[ ] de 50µg/mL[ ] de 100µg/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
15 min 30 min 45 min 60min
Tempo
% d
e in
ibiç
ão
[ ] de 25µg/mL[ ] de 50µg/mL[ ] de 100µg/mL
Segundo alguns autores, o tempo de medida de reação entre o radical e a amostra
de 30 minutos é suficiente, embora outros autores determinem 20 minutos (KUSKOSKI
et al., 2006). Foram avaliados os intervalos de 15, 30, 45 60 minutos de reação, porém a
análise estatística revela que não há diferenças significativas entre as determinações
efetuadas nos diferentes intervalos de tempo para uma mesma concentração de amostra.
Figura 2. Percentual de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico a 90% em função do tempo.
Figura 3. Percentual de inibição do radical DPPH pelo extrato acetônico a 70% em função do tempo.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
46
3.4. Determinação da capacidade antioxidante total
O método fosfomolibdênio é baseado na redução do Mo(VI) para Mo(V), pelo
composto antioxidante, e formação do complexo verde fosfato/Mo(V), o qual tem
absorção máxima a 695 nm (KUMARAN & KARUKUMARAN, 2007).
A atividade antioxidante total dos extratos etanólicos 70 e 90% e acetônico 70%
de X. americana 25, 50 e 100 µg/mL é mostrada na Tabela 3. Os resultados estão
expressos em atividade antioxidante relativa ao padrão rutina (AAR% rutina). O estudo
revelou que a atividade antioxidante cresceu com o aumento da concentração da
amostra e foi maior para o extrato etanólico 70%, seguido do acetônico 70% e por
último do etanólico 90%, porém não houve diferença estatisticamente significativa entre
os dois primeiros.
*Letras iguais, na mesma coluna e numa mesma concentração, indicam que, no nível de 5%, não há diferença estatisticamente significativa entre as respectivas médias pelo teste de Tukey.
Teste Tukey a 5% - 25 µg/mL Amostras AAR% rutina Signif*
Padrão Rutina 100,00 a Ximenia EtOH 70% 22,47 b Ximenia EtOH 90% 15,20 c Ximenia Acetona 70% 21,70 b
Teste Tukey a 5% - 50 µg/mL Amostras AAR% rutina Signif*
Padrão Rutina 100,00 a Ximenia EtOH 70% 32,96 b Ximenia EtOH 90% 21,77 c Ximenia Acetona 70% 28,62 b
Teste Tukey a 5% - 100 µg/mL Amostras AAR% rutina Signif*
Padrão Rutina 100 a Ximenia EtOH 70% 61,42 b Ximenia EtOH 90% 37,62 c Ximenia Acetona 70% 57,30 b
Tabela 3: Atividade antioxidante total dos extratos etanólicos (70% e 90%) e acetônico (70%) de X. americana em AAR% rutina
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
47
3.5. Método do Peróxido de Hidrogênio
Assim como nos outros métodos, a atividade antioxidante foi maior para o
extrato etanólico 70% e menor para o extrato etanólico 90% (Tabela 4 e Figura 4). A
capacidade de inibir o efeito oxidativo do H2O2 através deste método, também
demonstrou correlação com o teor de fenóis encontrado anteriormente.
0,00 5,00
10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
25µg/mL 50µg/mL 100µg/mL
Concentração
% d
e in
ibiç
ão
Ximenia Etanol 70%Ximenia Etanol 90%Ximenia Acetona 70%
Teste Tukey a 5% - 25 µg/mL Médias Signif Padrão Rutina 100,00 a Ximénia EtOH 70% 45,81 b Ximénia EtOH 90% 31,33 c Ximénia Acetona 70% 40,71 bc
Teste Tukey a 5% - 50 µg/mL Médias Signif Padrão Rutina 100,00 a Ximénia EtOH 70% 45,92 b Ximénia EtOH 90% 31,37 c Ximénia Acetona 70% 40,86 bc
Teste Tukey a 5% - 100 µg/mL Médias Signif Padrão Rutina 100,00 a Ximénia EtOH 70% 43,26 b Ximénia EtOH 90% 30,35 c Ximénia Acetona 70% 40,10 bc
Tabela 4: Atividade antioxidante pelo método do peróxido de hidrogênio(H2O2)
Figura 4. Percentual de inibição da oxidação pelo Peróxido de Hidrogênio
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
48
4- CONCLUSÃO
A Ximenia americana estudada apresentou considerável atividade antioxidante
comprovada por três diferentes métodos, nos diferentes extratos estudados (Etanol 70%
e 90%, e Acetona 70%). O teor de fenóis totais variou conforme o tipo e a concentração
do líquido extrator utilizado, sendo maior para extratos etanólicos à 70%, seguido do
acêtonico à 70% e do etanólico 90%. O extrato etanólico a 70% apresentou maior
capacidade antioxidante em todos os métodos empregados, assim como também
apresentou um maior teor de fenóis totais, porém diferenças estatisticamente
significativas praticamente não foram verificadas quando este foi comparado ao extrato
acetônico 70%. Para o tempo médio de reação no método do DPPH, a análise estatística
revelou que não houve diferenças estatisticamente significativas entre as determinações
efetuadas nos diferentes intervalos de tempo para uma mesma concentração de amostra.
5- AGRADECIMENTOS
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo
apoio financeiro na realização desta pesquisa.
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51
ATIVIDADE CICATRIZANTE DO EXTRATO DA CASCA DO CAULE DE Ximenia americana L. VEICULADO EM FORMA FARMACÊUTICA SEMI-SÓLIDA
(Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas)
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
52
Atividade cicatrizante do extrato da casca do caule de Ximenia americana L.
veiculado em forma farmacêutica semi-sólida
Mariana Trycia Brasileiro1, Amanda Alencar do Egito1, Alexandre Bezerra Galindo1,
Karina Perrelli Randau1,2; Sérgio Lécio Albuquerque Nóbrega3, Ivone Antônia de
Souza3; Gustavo Campos Pereira1; Pedro José Rolim Neto1*.
1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE. 2 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE. 3 Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE.
RESUMO
A descoberta de substâncias que possam modelar a resposta à agressão tecidual tem sido
objeto de pesquisas, havendo, atualmente, um crescente interesse em produtos
medicinais naturais com este tipo de atividade. Este trabalho objetivou realizar o perfil
fitoquímico, estudar a toxicidade aguda e avaliar a atividade cicatrizante in vivo de gel-
creme à base do extrato da casca do caule de X. americana L. O screanning fitoquímico
foi realizado em placas cromatográficas Merck. Para o estudo de toxicidade aguda
foram selecionados camundongos machos albinos Swiss (Mus muscullus) e para a
atividade cicatrizante foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos adultos
onde o gel-creme desenvolvido foi testado. O ensaio fitoquímico evidenciou a presença
de açúcares redutores, saponinas e taninos condensáveis. A planta apresentou atividade
cicatrizante do ponto de vista macroscópico em relação ao padrão D-pantenol,
demonstrando ter capacidade de aumentar a velocidade de cicatrização de feridas,
podendo assim tornar-se uma potencial fonte de matéria-prima para produção de
medicamentos fitoterápicos.
Palavras-chave: Ximenia americana, gel-creme, cicatrização.
1* Endereço: Av. Prof. Arthur de Sá s/n, Cidade Universitária, 50740-521 Recife-PE, Brasil. E-mail: [email protected]
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
53
ABSTRACT The discovery of substances that may shape the answer to aggression tissue has been the
subject of research, there is currently a growing interest in natural medicinal products
with this type of activity. This work objectives achieve the phytochemical profile, acute
toxicity study and evaluate the in vivo activity scarring cream to the base of the extract
from the bark of the stem of X. americana L. The phytochemical profile was conducted
in Merck chromatography plates. For the study of acute toxicity were selected Swiss
albino male mice (Mus muscullus) and the activity scarring were used Wistar rats
(Rattus norvegicus) adult male where the cream developed has been tested. The
phytochemical profile showed the presence of reducing sugars, saponins and
condensable tannin. X. Americana showed activity scarring in macroscopic point of
view in relation to the standard D-pantenol, demonstrating be capable increasing the
speed of healing wounds and could thus become a potential source of raw material to
medicines production phytotherapeutical produts.
Keywords: Ximenia Americana, cream, healing.
1- INTRODUÇÃO
A cicatrização de feridas consiste em uma perfeita e coordenada seqüência de
eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a repavimentação e a
reconstituição do tecido (MANDELBAUM et al., 2003). O processo de reparo ocorre
com o objetivo de restaurar a integridade anatômica e funcional do tecido
(CARVALHO, 2002). Nos organismos superiores, o reparo do tecido pode ocorrer de
duas formas: regeneração com a reposição de atividade funcional ou cicatrização com
restabelecimento da homeostasia do tecido e perda da atividade funcional pela formação
de cicatriz fibrótica (BALBINO et al., 2005).
A cicatrização é um processo biológico dinâmico, bem ordenado, didaticamente
dividido nas seguintes fases: hemostasia, fase inflamatória, fase proliferativa ou de
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
54
granulação e fase de remodelação da matriz extracelular (BRANSKI et al., 2005;
SHIMIZU, 2005). A cicatrização pode ocorrer por primeira, segunda intenção ou ainda
fechamento primário retardado, na dependência do tipo de ferida, localização,
contaminação e viabilidade do tecido (KENT LLOYD, 1992). Para que um ferimento
seja curado com êxito, os eventos devem suceder-se em uma seqüência apropriada e o
resultado final é geralmente uma cicatriz de tecido conjuntivo (CARVALHO, 2002).
Logo após o tecido ser lesionado, uma cobertura primária composta por fibrina
restabelece a hemostase e fornece um ambiente para que as plaquetas secretem fatores
de crescimento (FCs), citocinas e elementos da matriz extracelular (MEC). Estes
mediadores do processo inflamatório recrutam macrófagos e neutrófilos, os quais
secretam diversos fatores específicos que orquestram as fases seguintes do processo de
reparação tecidual (SANTORO & GAUDINO, 2005).
A inflamação é conduzida pela ação de substâncias químicas auto-elaboradas
chamadas autacóides, que atuam como mediadores químicos responsáveis pelas
alterações morfofuncionais próprias de tecidos inflamados. O gatilho disparador das
reações bioquímicas é a histamina e a serotonina, dois autacóides com estrutura protéica
apresentando intensa atividade farmacológica sobre os vasos sanguíneos sendo por isso
chamados vasoativos (GREGORI, 1996).
Na fase inflamatória, os neutrófilos aderem-se ao local da lesão poucas horas
após ocorrer a injúria, através de quimiotaxia por mediadores liberados por plaquetas,
células pertencentes ao sistema imune, microrganismos ou ainda devido à ativação do
complemento (PARK & BARBUL, 2004; SZPADERSKA & DIPIETRO, 2005). Além
de sua função fagocitária, os neutrófilos possuem ação pró-inflamatória pela liberação
de citocinas que ativam fibroblastos e queratinócitos. Caso a ferida não esteja
severamente infectada, em poucos dias o número de neutrófilos diminui devido à
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
55
fagocitose por macrófagos (MARTIN, 1997; WERNER & GROSE, 2003). Depois de
um ou dois dias, monócitos teciduais se infiltram e entram no local da lesão, se
diferenciando em macrófagos que participam e concluem o processo inflamatório
(SCHÄFFER et al., 1996).
Os macrófagos possuem função essencial na continuidade do processo
cicatricial, por secretarem fatores de crescimento, promovendo não só a proliferação
celular e síntese protéica, como também a produção de componentes da matriz
extracelular. Estas células também estimulam a proliferação de linfócitos e liberação de
citocinas (IBA et al., 2004; SZPADERSKA & DIPIETRO, 2005), que provocam o
influxo de neutrófilos, bem como a migração e proliferação de células endoteliais,
fibroblastos e células indiferenciadas que começarão a repopular o sítio da lesão
(DANTAS, 2000).
Durante a fase proliferativa observam-se o surgimento do tecido de granulação,
reepitelização e contração da ferida, os quais desempenham papéis importantes na
cicatrização normal. São vários os fatores responsáveis pela formação do tecido de
granulação. Embora os fatores de crescimento desempenhem um papel crucial na
migração e diferenciação das células necessárias à formação desse tecido, os
macrófagos presentes na ferida e as plaquetas capturadas no trombo são, provavelmente,
os principais contribuintes para o processo (CARVALHO, 2002).
A remodelação ocorre durante a fase final do processo reparatório e pode
continuar durante alguns meses, observando-se síntese, depósito, contração e
remodelação da matriz extracelular (MEC) neoformada. (PILCHER et al., 1999;
GRINNELL, 2003). A cicatriz passa a apresentar a forma de uma massa fibrótica
acrescida de fibras colágenas. Observa-se apoptose dos fibroblastos e das células
endoteliais, e os eosinófilos aparecem nas últimas fases da reparação, possivelmente
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
56
devido a fatores de crescimento. Os anexos da pele, como folículos pilosos e glândulas
sudoríparas sofrem regeneração limitada; a coloração da cicatriz é pálida, pois a
regeneração dos melanócitos é deficitária (DIPIETRO & BURNS, 2003).
Apesar do desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, biologia molecular e
biologia industrial, parte dos fármacos empregados na cicatrização permanece sendo
obtida de matérias-primas naturais (AQUINO et al., 2006). No tratamento de feridas,
tem-se intensificado a pesquisa de produtos naturais para auxiliar a cicatrização, como o
óleo de copaíba (CORRÊA, 1984; EURIDES & MAZZANTI, 1995), papaína
(SANCHEZ NETO et al., 1993), açúcar (PRATA et al., 1988), colágeno (ABRAMO,
1990) e vitamina A (BONDI, 1989). Por isso, a descoberta de substâncias que possam
modelar a resposta à agressão tecidual tem sido objeto de pesquisas (BATISTA et al.,
2006), havendo, atualmente, um crescente interesse em produtos medicinais naturais
(RAHAL et al., 2001). Este trabalho objetivou realizar o perfil fitoquímico, estudar a
toxicidade aguda e avaliar a atividade cicatrizante in vivo de gel-creme à base do extrato
da casca do caule de X. americana L.
2- MATERIAL E MÉTODOS
2.1- Identificação da espécie e preparo do material botânico
Ximenia americana L. foi coletada na cidade de Serra Talhada (PE) e
devidamente identificada no herbário do CCS (Centro de Ciências da Saúde) da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e no herbário do IPA (Instituto de
Pesquisas Agropecuárias de Pernambuco). O material botânico foi submetido a secagem
em estufa com ar circulante à uma temperatura de aproximadamente 35ºC por 5 horas,
em seguida foi triturado em forrageira e padronizado em malha de 40-50 mesh.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
57
2.2- Perfil fitoquímico
Para o perfil fitoquímico de Ximenia americana L. foi preparado um extrato
metanólico a 20% (m/v) de amostra por maceração durante 48 h. Após esse tempo, o
extrato foi filtrado e acondicionado em frasco de vidro âmbar. Alíquotas de 10 µL do
extrato foram submetidas à Cromatografia em Camada Delgada (placas de gel de sílica
Merck - Alemanha, Art.105554) para análise da presença de grupos de metabólitos
secundários, empregando-se diversas fases móveis e reveladores específicos
(HARBORNE, 1998; WAGNER & BLADT, 1996; XAVIER et al., 2002; SENA
FILHO et al., 2006).
2.3- Estudo da toxicidade aguda
Para a realização do protocolo experimental para o estudo de toxicidade aguda
da X. americana L., foram selecionados camundongos machos albinos Swiss (Mus
muscullus) com idade entre 2-3 meses e peso entre 25 a 35 g que foram mantidos antes
e durante o período experimental em gaiolas plásticas de polipropileno. Os animais
foram mantidos sob condições controladas de iluminação (ciclo de 12 horas
claro/escuro) e temperatura (22±2ºC). Doses de 750 mg/Kg, 1000 mg/kg, 1.500 mg/kg e
1.800 mg/Kg do extrato etanólico da planta seco em rotaevaporador foram
redispersados em água destilada e aplicados por via intra-peritonial. A avaliação da
toxicidade aguda do extrato de Ximenia americana L. foi realizada através da
observação de efeitos gerais sugestivos de ação sobre o sistema nervoso central e
periférico dos camundongos, a partir dos quais foi feita uma estimativa da DL50.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
58
2.4- Desenvolvimento da forma farmacêutica gel-creme
Para a realização do estudo da atividade cicatrizante, foi preparado um gel creme
para a veiculação do extrato, conforme formulação descrita na Tabela 1. O Permulen®
(TR-1) foi disperso em óleo mineral e em seguida acrescentou-se o Novemer (EC-1) até
homogeneização. Em outro recipiente, dissolveu-se o Silsense (DW-18) em água
destilada e esta mistura foi adicionada a anterior. Procedeu-se agitação até completa
homogeneização. Por último, adicionaram-se os conservantes, previamente dissolvidos
em álcool, e o extrato seco de X. americana L. à 5% dissolvido em propilenoglicol.
Tabela 1. Formulação do gel-creme
Componentes Quantidade
(%)
Permulen (TR-1)® 0,4
Novemer (EC-1) 2,0
Silsense (DW-18) 1,0
Óleo mineral 4,0
Nipagim 0,18
Nipazol 0,02
Extrato seco de X. americana L. 5%
Bissulfito de sódio 0,02
Álcool etílico q.s
Propilenoglicol q.s
Água destilada q.s.p. 100
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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2.5- Estudo de cicatrização in vivo
Foi realizado com ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos adultos, com idade
de 2-3 meses e peso entre 180-250 g, os quais foram mantidos durante o período
experimental em gaiolas plásticas (polipropileno), forradas com maravalha trocada a
cada dois dias.
Os animais foram divididos em três grupos de cinco animais cada, conforme
descrito no Quadro 1. Após marcados e pesados, todos foram anestesiados com 0,2
mL, para cada 100 g de peso corpóreo, com uma mistura de 1:1 dos anestésicos
ketamina a 5% e xilazina a 2%. A administração da solução anestésica foi realizada por
via intramuscular em região de pata posterior esquerda do animal, sendo utilizadas para
isso agulhas de insulina e seringas de 1,0 mL.
Quadro 1. Grupos de animais e esquemas de tratamento para o estudo de cicatrização
Grupo I
(controle negativo)
Animais tratados com placebo (gel-creme sem extrato de X.
americana L.)
Grupo II
(controle positivo)
Animais tratados com D-pantenol
Grupo III
(teste)
Animais tratados com gel-creme à base de X. americana L.
Em seguida, procedeu-se a tricotomia do dorso dos animais, os quais foram
postos em decúbito dorsal sobre mesa operatória com campo cirúrgico estéril, para a
realização da assepsia do dorso com álcool iodado a 0,3%. Posteriormente, foram
realizadas as cauterizações (queimaduras), utilizando-se, para este fim, a ponta esférica
de um bisturi elétrico (Figura 1), o qual proporcionou um dano tecidual cutâneo
(queimadura de 3º grau) de 0,3 cm de diâmetro e uma profundidade que atingiu os
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
60
tecidos subcutâneos, porém preservando a fascia muscular da região, conforme descrito
por Martorelli (2006).
Figura 1. Cauterização com ponta esférica de bisturi elétrico
O tratamento dos animais foi realizado conforme determinado para cada grupo.
As aplicações (controle positivo, controle negativo ou amostra teste) foram realizadas
com uma posologia padrão, por via tópica, e realizada a cada 24 horas durante 14 dias,
conforme mostra Figura 2.
Figura 2. Aplicação por via tópica
Após 03, 07 e 14 dias de tratamento, os animais foram sedados para que fossem
realizadas fotografias da região do ferimento e para a análise macroscópica das fases de
cicatrização.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
61
As avaliações macroscópicas das feridas foram realizadas em todos os animais,
sendo os critérios de avaliação previamente estabelecidos nos seguintes padrões:
presença de infecção, presença de halo hiperêmico, formação de crosta cicatricial,
presença de borda necrótica, fundo sangrante da ferida e cicatriz final (MARTORELLI,
2006).
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Perfil Fitoquímico
O ensaio fitoquímico do caule de X. americana L. evidenciou a presença de
açúcares redutores, saponinas e proantocianidinas condensadas (taninos condensáveis).
Não foi detectada a presença de alcalóides, iridóides, monoterpenos e sesquiterpenos,
triterpenos e esteróides, flavonóides, cumarinas, derivados cinâmicos e antraquinonas.
A presença de açúcares, saponinas e taninos corrobora com James et al (2007), que
também os encontrou em extrato metanólico do caule de X. americana coletada na
Nigéria. Este mesmo autor também verificou no mesmo extrato a presença de
flavonóides. A ausência deste no nosso extrato pode estar relacionada aos fenômenos
de sazonalidade ou até mesmo ao próprio local de coleta, fatores estes que podem
ocasionar diferenças na presença de metabólitos secundários em uma mesma espécie
submetida a diferentes condições.
3.2- Estudo da toxicidade aguda
Em todas as doses testadas, foi verificado um aumento na freqüência respiratória
dos camundongos, ereção de cauda, piloereção, movimento circular, movimento de
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
62
fuga, agitação, abaixamento dos membros posteriores, palidez, posição de ataque,
postura em garra, diarréia e diurese, além de movimento estereotipado, estando estes
efeitos relacionados a provável ação da planta sobre o sistema nervoso periférico. A
dose responsável pela morte de 100% dos camundongos foi a de 1.800 mg/Kg e a que
matou 50% dos animais foi a de 750 mg/Kg de peso do animal.
3.3- Forma farmacêutica e o controle de qualidade
O gel-creme obtido apresentou-se com coloração marrom-avermelhado e
aparentemente estável.
Foram realizados os seguintes testes de controle de qualidade para a forma
farmacêutica: teor de fenóis totais pelo método Folin Ciocalteau (FOLIN &
CIOCALTEAU, 1927), com o resultado obtido em equivalentes de ácido tânico; pH; e
viscosidade utilizando spindle número 7 (sete) e velocidade 12 (doze) rotações por
minuto. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Controle de qualidade do gel-creme de Ximenia americana L.
Teor (% de equiv. em ácido
tânico) Viscosidade (cP) pH
1,894 70.000 5,83
3.4- Estudo de cicatrização in vivo
O cálculo da quantidade de extrato que foi incorporada no gel-creme está
baseado na estimativa da DL50 (750 mg/Kg), que representa aproximadamente 10%
desta dose. A concentração final foi de 50 mg de extrato seco / grama de gel-creme.
Na fase inicial (3 dias), foi verificada a ação do produto na etapa de inflamação
aguda. Verificamos que, na fase intermediária, a reparação conjuntiva, através da
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
63
deposição extracelular de colágeno, ficou demonstrada a eficácia do creme à base de
extrato da casca do caule de X. americana L., dada a rapidez do processo cicatricial
seguido da regressão do processo inflamatório. Esta fase intermediária é que divide o
processo de cicatrização, com a reparação conjuntiva e inflamação crônica, que se
caracteriza pelo infiltrado mononuclear.
A última etapa permite avaliar a qualidade do tecido cicatricial, presença ou
ausência de fibrose e falha na recomposição do tecido. Observamos excelente qualidade
do tecido cicatricial na região dorsal dos animais tratados, quando comparados com o
grupo controle. Os Quadros 2, 3 e 4 trazem os resultados das avaliações macroscópicas
dos grupos controle negativo, controle positivo e teste realizados nos 3º, 7º e 14º dias de
tratamento.
Quadro 2. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle negativo
Dias de Tratamento Aspectos
Macroscópicos 3 7 14
Infecção ausente ausente sem vestígios
Halo hiperêmico presente visível ausente
Bordas necróticas ausente ausente ausente
Crosta espessa visível ausente
Fundo sangrante vestígios não verificado ausente
Cicatriz final ausente ausente ausente
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
64
Quadro 3. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle positivo
Dias de Tratamento Aspectos
Macroscópicos 3 7 14
Infecção ausente ausente ausente
Halo hiperêmico discreto ausente ausente
Bordas necróticas não verificadas ausente não verificadas
Crosta vestígios ausente ausente
Fundo sangrante espessa sem vestígios recuperado
Cicatriz final espessa normal pêlo recuperado
Quadro 4. Resultados da avaliação macroscópica do grupo teste
Dias de Tratamento Aspectos
Macroscópicos 3 7 14
Infecção ausente ausente ausente
Halo hiperêmico vestígios ausente ausente
Bordas necróticas ausente ausente ausente
Crosta ausente ausente ausente
Fundo sangrante ausente ausente ausente
Cicatriz final não verificada sem vestígios pêlo recuperado
Os resultados obtidos no ensaio de cicatrização relacionam-se com os resultados
do perfil fitoquímico e concordam com os relatos da literatura, que atribuem aos taninos
as propriedades de regeneração tecidual, cicatrização de úlceras, feridas e queimaduras.
Segundo Santos & Mello (2004), os taninos são responsáveis pela formação de uma
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
65
camada protetora (complexo tanino-proteína e/ou polissacarídeo) sobre a pele ou
mucosa danificada e a formação desta camada favorece o processo de cicatrização.
4- CONCLUSÃO
A partir do estudo da atividade cicatrizante in vivo, evidenciou-se que o extrato
da casca do caule de Ximenia americana coletada na cidade de Serra Talhada (PE)
apresentou atividade cicatrizante do ponto de vista macroscópico em relação ao padrão
D-pantenol. A planta demonstrou ter capacidade de aumentar a velocidade de
cicatrização de feridas, podendo tornar-se uma potencial fonte de matéria-prima para
produção de medicamentos fitoterápicos.
5- AGRADECIMENTOS
A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo
apoio financeiro na realização desta pesquisa.
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70
TECNOLOGIA DE OBTENÇÃO DE FITOTERÁPICO À BASE DE Ximenia
americana L.
(Artigo a ser submetido à Revista Brasileira de Farmácia)
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
71
Tecnologia de obtenção de fitoterápico à base de Ximenia americana L.
Mariana Trycia Brasileiro1, Amanda Alencar do Egito1, Karina Perrelli Randau1,2;
Jeckson Luiz da Silva1, Severino Granjeiro Júnior3; Pedro José Rolim Neto1*.
1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE.
2 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE.
3 Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco - LAFEPE
RESUMO
As preparações farmacêuticas semi-sólidas incluem as pomadas, as emulsões cremosas,
os géis e as espumas rígidas. A propriedade que lhes é comum é a capacidade de adesão
à superfície de aplicação. Ximenia americana é uma planta comumente encontrada nas
regiões tropicais e temperadas do mundo cuja ação cicatrizante relatada na literatura
pode ser justificada pela presença de taninos. O objetivo deste trabalho foi o
desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana, a
realização do estudo de estabilidade destas formulações e a validação da metodologia
analítica para o doseamento do princípio ativo na formulação. Foram preparados dois
tipos de extratos, um etanólico (etanol : água 50%) e um glicólico (polietilenoglicol:
água 50%) que foram doseados e incorporados em diferentes formulações (gel, gel-
creme e pomada) de modo a obter-se um teor final de equivalentes em ác.tanico de 2%.
As formulações foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerado e de longa
duração e a metodologia de doseamento dos taninos na forma farmacêutica foi
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
72
devidamente validada. O extrato etanólico não se comportou de maneira satisfatória em
nenhuma das formulações, devido a problemas de viscosidade e teor, enquanto que o
extrato glicólico apresentou características muito boas em se tratando da formulação de
gel de carbopol, podendo ser uma formulação promissora no desenvolvimento de um
medicamento à base de X. americana.
Palavras-chave: Ximenia americana, semi-sólidos, validação de método.
INTRODUÇÃO
Novos fármacos podem ser descobertos a partir de várias fontes naturais ou
sintetizados em laboratório. Ao longo da história, as plantas têm servido como
reservatório de potenciais novos fármacos. Algumas das principais contribuições para a
terapia medicamentosa moderna podem ser atribuídas à conversão bem-sucedida da
medicina popular em medicamentos eficazes (ANSEL, ALLEN JR & POPOVICH,
2007).
Ximenia americana é uma planta comumente encontrada nas regiões tropicais e
temperadas do mundo e bastante usada na Nigéria para o tratamento da malária e de
diversas infecções na pele (OGUNLEYE & IBITOYE, 2003). A sua casca, avermelhada
e lisa, apresenta diversas atividades e está sendo usada para diversos fins, como para o
tratamento da lepra, da malária, da dor de cabeça, como moluscicida, para infecções da
pele, hemorróidas e inflamações das mucosas. A ação cicatrizante relatada na literatura
pode ser justificada pela presença de algumas substâncias com essa atividade como os
taninos (VERAS & MORAIS, 2004). Os taninos no processo de cicatrização precipitam
as proteínas dos tecidos lesados, formando um revestimento protetor que favorece a sua
regeneração (HEIJMEN et al., 1997; PANIZZA et al., 1998).
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
73
O interesse por drogas com alto teor de taninos obtidas de plantas medicinais
tem aumentado nos últimos anos, tanto para uso humano quanto veterinário, pois elas
seriam potenciais promotores de cura no tratamento de feridas e queimaduras de tecidos
epiteliais (FERNANDEZ et al., 2002).
As preparações farmacêuticas semi-sólidas incluem as pomadas, as emulsões
cremosas, os géis e as espumas rígidas. A propriedade que lhes é comum é a capacidade
de adesão à superfície de aplicação por um uso. Esta adesão deve-se ao seu
comportamento reológico plástico, que permite aos semi-sólidos manter a sua forma e
aderir como um filme até a aplicação de uma força externa, caso em que deformam e
fluem. (LACHMAN et al., 2001).
As pomadas são preparações destinadas à aplicação sobre a pele ou membranas
mucosas e suas bases podem ser hidrofóbicas, de absorção, removíveis por água ou
bases hidrossolúveis (ANSEL, ALLEN JR & POPOVICH, 2007). O gel-creme é uma
preparação que apresenta características de ambas as preparações: gel e creme. Podem
ser constituídas de uma preparação geleificada na qual incorpora-se um polímero
emulsificante Permulen® ou Emulsome® ou um emulsificante em conjunto com uma
fase oleosa que pode ser um óleo mineral ou vegetal (GOODRICH, 1997; SILVA,
1999), enquanto que os géis apresentam estruturas contínuas em que um polímero
constrói uma matriz tridimensional por meio do líquido hidrofílico (AULTON, 2005).
A seleção da base a ser utilizada na formulação irá depender não só da influência
do fármaco sobre a consistência ou outras propriedades da base, como também da
estabilidade do fármaco na base (ANSEL, ALLEN JR &POPOVICH, 2007).
O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-
sólidas à base de Ximenia americana, a realização do estudo de estabilidade destas
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
74
formulações e a validação da metodologia analítica para o doseamento do princípio
ativo na formulação.
MATERIAL E MÉTODOS
Preparação dos extratos
Foram preparados por maceração durante 48h, diferentes extratos etanólicos e
glicólicos de X. americana à 20% (m/v) utilizando-se como solventes o etanol em água
(1:1) e o polietilenoglicol 400 em água (1:1). Em seguida, os extratos foram doseados
utilizando-se a metodologia de Folin & Ciocalteau (1927).
Doseamento dos extratos
Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância de referência o
ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de ácido tânico a
100 µg.mL-1 foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e adicionados 2,5
mL de Folin-Ciocalteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de solução de
carbonato de sódio 15% e o volume foi completado com água destilada. As soluções
foram deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As amostras foram
preparadas utilizando 3 mL dos extratos etanólicos e glicólicos de Ximenia americana a
2mg/mL. O branco do sistema foi preparado da mesma forma, sem a alíquota da
amostra.
Preparação das formulações
As formulações foram preparadas objetivando-se uma concentração final de 2%
de equivalentes em ácido tânico no produto final. Foram formulados: gel de carbopol,
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
75
gel- creme com o polímero Permulen® e pomada de polietilenoglicol conforme mostra
as tabelas 1, 2 e 3.
Tabela 1. Lotes de bancada dos géis
Lotes de Bancada Componentes L1 L2 Carbopol 910 1% 1%
Nipagin 0,18% 0,18% Nipazol 0,02% 0,02%
Bissulfito de sódio 0,02% 0,02% Extrato etanólico de X. americana 59% - Extrato glicólico de X. americana - 57%
Álcool etílico q.s q.s Trietanolamina q.s q.s
Água destilada q.s.p. 100% 100%
Os géis foram obtidos pela adição do nipagin e nipazol (previamente dissolvidos
em álcool etílico) e do bissulfito de sódio à água sob agitação constante. Em seguida, o
extrato foi acrescentado, e o carbopol foi adicionado pouco a pouco até completa
homogeneização. Logo após, fez-se à adição da trietanolamina em quantidade suficiente
para se obter pH entre 6,0-6,5. O gel foi acondicionado em recipiente plástico
hermeticamente fechado.
Tabela 2. Lotes de bancada dos géis-creme
Lotes de Bancada Componentes L1 L2 Permulen® (TR-1) 0,4% 0,4% Novemer (EC-1) 2,0% 2,0% Silsense (DW-18) 1,0% 1,0%
Óleo mineral 4,0% 4,0% Nipagin 0,18% 0,18% Nipazol 0,02% 0,02%
Bissulfito de sódio 0,02% 0,02% Extrato etanólico de X. americana 59% - Extrato glicólico de X. americana - 57%
Álcool etílico q.s q.s Água destilada q.s.p. 100% 100%
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
76
O Permulen® (TR-1) foi disperso em óleo mineral. Em seguida, acrescentou-se
o novemer (EC-1) até homogeneização. Em outro recipiente, dissolveu-se o silsense em
água destilada e esta mistura foi adicionada a anterior. Procedeu-se agitação até
completa homogeneização. Por último, adicionaram-se o Nipagin e Nipazol,
previamente dissolvidos em álcool etílico, o bissulfito de sódio e o extrato de X.
americana. O gel-creme foi acondicionado em recipiente plástico hermeticamente
fechado.
Tabela 3. Lote de bancada da pomada
Lote de Bancada Componentes L1 Polietilenoglicol (PEG 4.000) 41%
Nipagin 0,18% Nipazol 0,02%
Bissulfito de sódio 0,02% Propilenoglicol 2% Álcool etílico q.s
Extrato glicólico de X. americana 57%
O polietilenoglicol (PEG 4.000) foi fundido e acrescentou-se o Nipagin e o
Nipazol dissolvidos em álcool etílico e depois o Bissulfito de sódio dissolvido em água
sob agitação. Em seguida, o extrato foi acrescentado. Esperou-se resfriar e acrescentou-
se o propilenoglicol. A pomada foi acondicionada em recipiente plástico
hermeticamente fechado.
Estudo de Estabilidade
O estudo foi realizado em câmara climática devidamente certificada em
temperatura e umidade adequadas, conforme preconiza a resolução RE nº 1 de 29 de
julho de 2005 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. No estudo de estabilidade
acelerado, a câmara climática foi certificada à temperatura de 40ºC e umidade ± 75% e
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
77
no de longa duração à temperatura de 30ºC e umidade de ±75%. As amostras foram
analisadas conforme preconiza a RE nº 01.
Controle de Qualidade
Todas as formulações foram submetidas aos testes de Controle de Qualidade.
Foram avaliados os parâmetros: cor, aspecto, pH, viscosidade e teor.
Validação do método analítico para doseamento dos fenóis totais em forma
farmacêutica
A validação da metodologia analítica foi realizada na formulação de gel de
carbopol com extrato glicólico (à base de polietilenoglicol: água). O teor de fenóis
totais foi determinado utilizando-se o reagente de Folin & Ciocalteau. Foi realizada uma
validação onde foram avaliados os parâmetros: linearidade, limite de detecção, limite de
quantificação, robustez, exatidão e precisão nos níveis de repetitividade e precisão
intermediária.
Preparação das amostras
As amostras foram preparadas pesando-se 1g da formulação gel de carbopol com
extrato glicólico e diluindo-se em balão volumétrico de 100 mL. Alíquotas de 3 mL
foram tomadas para a realização da reação de Folin & Ciocalteau.
Linearidade
A linearidade foi avaliada através do tratamento dos dados por regressão linear
pelo método dos mínimos quadrados dos pontos médios de 3 (três) curvas de calibração
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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autênticas, contendo seis concentrações equivalentes a 2, 4, 6, 8, 10 e 12 µg/mL de
ácido tânico.
Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação(LQ)
Os limites de detecção e o de quantificação foram calculados pela divisão do
desvio padrão dos coeficientes lineares das três curvas de calibração do ensaio de
linearidade pela média dos coeficientes angulares destas respectivas curvas e
multiplicado por 3,0 e 10,0 respectivamente (Resolução RE nº 899, 2003).
Robustez
A robustez do método avaliou as seguintes variáveis: uso ou não da sonicação na
preparação da amostra durante a diluição e tempo de reação. A avaliação dos resultados
foi realizada através da análise estatística utilizando o teste t de student e a ANOVA.
Precisão
A precisão foi avaliada nos níveis: repetitividade e precisão intermediária. A
repetitividade foi determinada pela análise de seis amostras individuais (sextuplicata). A
precisão intermediária foi determinada em dois dias por dois analistas diferentes. Os
resultados foram expressos através do coeficiente de variação entre as amostras (CV).
Exatidão
A exatidão do método foi avaliada a partir da análise de amostras em
concentrações conhecidas do extrato de Ximenia americana equivalentes a 50, 100 e
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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150% da concentração teórica analisada. Os resultados foram avaliados através do teste
t de student.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Doseamento dos extratos
No doseamento dos extratos constatou-se um maior teor de fenóis totais no
extrato glicólico quando comparado com o extrato etanólico conforme mostra Tabela 4.
Este doseamento permitiu calcular a quantidade de extrato necessária para cada
preparação (57% quando usado o extrato glicólico e 59% quando usado o extrato
etanólico) para se obter uma forma farmacêutica final com 2% de equivalentes em ácido
tânico.
Tabela 4. Teor de Fenóis de extrato glicólico e extrato etanólico
Estudo de estabilidade das formulações e controle de qualidade
Após o período de estudo de três meses, algumas preparações apresentaram
algumas modificações conforme mostram as Figuras 1, 2 e 3 e as Tabelas 5, 6 e 7.
Extratos ABS
Média % de equivalentes ác.
Tânico na planta % no extrato à 20% Polietilenoglicol 50% 0,953 17,45 3,49
Etanol 50% 0,929 16,97 3,39
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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Figura 1. Gel de Carbopol com extrato etanólico (1) e Gel de carbopol com extrato
glicólico (2) submetido à estabilidade acelerada (AC) e à estabilidade de longa duração
(LD) no período de 3 meses.
Todas as preparações de gel de carbopol apresentaram-se com aspecto
homogêneo durante o estudo, exceto a preparação com extrato etanólico submetida à
estabilidade acelerada (1AC), que formou um aspecto grumoso como mostra a Figura
1AC 1LD
2AC 2LD
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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1. O odor característico de cada extrato e a cor castanho-escura permaneceram em todas
as preparações. O pH, a viscosidade e o teor estão descritos na Tabela 5.
Tabela 5. Controle de qualidade (pH, viscosidade e teor) da forma farmacêutica gel
com extrato etanólico e com extrato glicólico.
T0 = Tempo zero T1 (AC) = Estabilidade acelerada aos 3 meses T1 (LD) = Estabilidade de longa duração aos 3 meses
Nas duas formulações houve diminuição do pH das amostras, principalmente
quando se tratou do estudo acelerado. Em se tratando de viscosidade, a preparação com
extrato glicólico manteve uma boa faixa de viscosidade durante o estudo ao contrário da
preparação com extrato etanólico, que apresentou uma grande elevação no estudo
acelerado. No aspecto do teor, a formulação glicólica demonstrou maior estabilidade
que a formulação etanólica, principalmente quando se tratou do estudo acelerado.
Parâmetros pH Viscosidade(cP) Teor(%) Formulações
T0 T1(AC) T1(LD) T0 T1(AC) T1(LD) T0 T1(AC) T1(LD)Gel +Extrato
etanólico 6,22 5,09 5,48 79.000 200.000 70.000 100% 63,90% 93,50%Gel +Extrato
glicólico 6,06 5,59 5,86 80.000 67.000 70.500 100% 87,40% 93,80%
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Figura 2. Gel-creme com extrato etanólico (3) e Gel-creme com extrato glicólico (4)
submetido à estabilidade acelerada (AC) e à estabilidade de longa duração (LD) no
período de 3 meses.
Todas as preparações de creme apresentaram-se com aspecto homogêneo
durante o estudo de estabilidade de longa duração, porém a não homogeneidade foi
presente nas amostras submetidas ao estudo de estabilidade acelerado (3AC e 4AC). O
odor característico de cada extrato e a cor castanho-escura permaneceram em todas as
3AC 3LD
4AC 4LD
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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preparações, com exceção da amostra 3LD que apresentou uma pequena mudança de
coloração. O pH, a viscosidade e o teor estão descritos na Tabela 6.
Tabela 6. Controle de qualidade (pH, viscosidade e teor) da forma farmacêutica gel-
creme com extrato etanólico e com extrato glicólico.
Parâmetros pH Viscosidade (cP) Teor (%) Formulações
T0 T1(AC) T1(LD) T0 T1(AC) T1(LD) T0 T1(AC) T1(LD)Gel-
creme+Extrato etanólico 5,83 5,13 5,38 79.000 86.000 78.000 100% 88,20% 85,20%
Gel-creme+Extrato
glicólico 6,11 5,68 5,76 78.000 20.000 35.000 100% 88,70% 88,40% T0 = Tempo zero T1 (AC) = Estabilidade acelerada aos 3 meses T1 (LD) = Estabilidade de longa duração aos 3 meses
Nas duas formulações houve reduções no pH das amostras, principalmente
quando se tratou do estudo acelerado. Em se tratando de viscosidade, a preparação com
extrato etanólico manteve uma boa faixa de viscosidade durante o estudo ao contrário
da preparação com extrato glicólico, que apresentou uma grande perda de viscosidade
tanto no estudo acelerado como no estudo de longa duração. No aspecto do teor,
praticamente não houve diferença entre as formulações, exceto no estudo de longa
duração da formulação com extrato etanólico que o teor foi um pouco menor.
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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Figura 3. Pomada de Polietilenoglicol submetida à estabilidade acelerada (AC) e à
estabilidade de longa duração (LD) no período de 3 meses.
Na pomada, as duas amostras perderam sua forma provavelmente devido à ação
da temperatura. Em relação ao odor e cor, tanto a submetida a estabilidade acelerada
quando a submetida a longa duração continuaram apresentando o odor característico do
extrato e a cor castanho-escura. O pH, a viscosidade e o teor estão descritos na Tabela
7.
Tabela 7. Controle de qualidade (pH, viscosidade e teor) da forma farmacêutica
pomada com extrato glicólico.
Parâmetros pH Viscosidade(cP) Teor(%) Formulação
T0 T1(AC) T1(LD) T0 T1(AC) T1(LD) T0 T1(AC) T1(LD)Pomada de
Polietilenoglicol 7,18 6,93 7,05 150.000 9.000 11.000 100% 97,50% 97,20%
A pomada de polietilenoglicol comportou-se de maneira satisfatória em relação
ao pH e ao teor, mas teve uma enorme diminuição da sua viscosidade tanto no estudo
acelerado como no estudo de longa duração.
5AC 5LD
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Validação da metodologia analítica do gel com extrato glicólico
Linearidade
Os resultados do estudo da linearidade estão agrupados na tabela 8, assim como
a média dos pontos estudados.
Tabela 8. Dados das curvas de calibração para a determinação da linearidade do método
Absorbâncias Conc.Teórica µg de ácido
tânico Curva 1 Curva 2 Curva 3 Média D. P. CV%
2,000 0,214 0,216 0,219 0,216 0,003 1,16 4,000 0,406 0,404 0,423 0,411 0,010 2,54 6,000 0,560 0,568 0,584 0,571 0,012 2,14 8,000 0,722 0,754 0,751 0,742 0,018 2,38 10,000 0,856 0,890 0,915 0,887 0,030 3,34 12,000 1,012 1,062 1,070 1,048 0,031 3,00
Os resultados dos pontos das três curvas de linearidade foram plotados na figura
4 e pelo método dos mínimos quadrados obteve-se a equação da reta y = 0,0823x +
0,0701.
Figura 4. Linearidade do método verificando a regressão das três curvas de calibração
y = 0,0823x + 0,0701R2 = 0,9982
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0
0 2 4 6 8 10 12Concentração (µg/mL)
Abs
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A análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados demonstrou
um coeficiente de correlação R2= 0,9982 valor que comprova a linearidade do método.
A partir da análise de variância (Tabela 9) podemos verificar a linearidade do
método e a significância estatística da curva ajustada. As análises de variância dos
dados demonstraram que o método é linear, na faixa de concentração testada e que não
há falta de ajuste do modelo com 95% de confiança.
Tabela 9. Resultados da análise de variância para a linearidade
SQ= Soma quadrática; GL= Graus de Liberdade; MQ= Média quadrática
Limite de Quantificação (LQ) e Limite de Detecção (LD)
Uma vez observada a linearidade do método, foram calculados os valores de LD
e LQ utilizando a média do desvio padrão (DP) do primeiro ponto da reta e coeficientes
angulares (ic).
LQ = DP x 10/ ic LQ = 0,003x 10 / 0,0823 = 0,36452µg/mL
LD = DP x 3/ ic LD = 0,003 x 3 / 0,0823 = 0,10936µg/mL
Os limites LD e LQ obtidos de acordo com o tratamento descrito, demonstram
que o método é bastante sensível e que da ordem de grandeza com que foi obtido pode
servir como um excelente critério de aceitação.
Fonte SQ GL MQ F F-crítico Modelo 1,420909886 1 1,420909886 3068,136 4,4940
Residual 0,007409892 16 0,000463118 Curva Linear Falta de ajuste 0,002525892 4 0,000631473 1,551531 3,2592
Erro puro 0,004884 12 0,000407 Não há falta de ajuste Total 1,428319778 17 0,08401881
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Exatidão
A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações
diferentes (50%, 100%, 150%) e o percentual de recuperação nas três concentrações
analisadas encontrou-se dentro dos limites como mostram os resultados da Tabela 10.
O estudo estatístico aplicado foi o teste t de Student o qual demonstrou que o T
calculado foi menor que o t tabelado comprovando que não houve diferença
estatisticamente significativa entre as médias das três concentrações analisadas.
Tabela 10. Determinação dos resultados estatísticos da Exatidão de acordo com o teste t
de Student
TEORICO PRATICO T CALC T TABELADO 50% 47,26 2,5
100% 94,90 3,89 4,3 150% 143,16 3,41
Robustez
Para o parâmetro realização ou não de sonicação analisado durante o estudo da
robustez, verificou-se estatisticamente através do Teste t de student para duas amostras
presumindo variâncias equivalentes, (Tabela 11) que não há diferença significativa
entre os resultados, admitindo-se um nível de 95% de intervalo de confiança entre a
média das concentrações.
Tabela 11. Teste t de student: duas amostras presumindo variâncias equivalentes –
Robustez da realização ou não de sonicação durante a diluição da amostra
Sem sonicação Com sonicação Média 0,4473 0,4406 Variância 0,00003733 0,00003233 Stat t 1,383428928 P(T<=t) bi-caudal 0,238731614 t crítico bi-caudal 2,776450856
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Na avaliação da influência do tempo de reação, observou-se que não há
diferenças estatisticamente significativas entre as amostras e entre o tempo de leitura da
reação pesquisado.
Tabela 12. Avaliação através da ANOVA dos diferentes tempos de reação usados no
parâmetro robustez
ANOVA Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 8,95556E-05 2 4,47778E-
05 0,568406 0,594211 5,143253
Dentro dos grupos 0,000472667 6 7,87778E-
05 Total 0,000562222 8
Precisão
*Repetitividade
Observando-se os resultados expostos na Tabela 13, podemos observar que o
método tem uma boa repetitividade, visto que o coeficiente de variação 0,69% é inferior
ao especificado pela Resolução RE nº 899 vigente, que especifica o limite do
coeficiente de variação de 5,0%.
Tabela 13. Resultados da Repetitividade
Amostras Abs Concentração% 1 0,442 105,9952038 2 0,454 108,8729017 3 0,446 106,9544365 4 0,439 105,2757794 5 0,445 106,7146283 6 0,441 105,7553957
MÉDIA 0,4417 105,9153 DESAPD 0,00305505 0,73262601 CV% 0,691709539 0,691709539
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*Precisão intermediária
O estudo da precisão do método entre ensaios demonstrou que não há diferenças
estatisticamente significativas entre as amostras pesquisadas individualmente (Tabela
14) em pequeno intervalo de tempo, tanto para dias diferentes, quanto para analistas
diferentes de acordo com a ANOVA. A precisão entre dias e entre analistas foi realizada
e os resultados encontrados demonstram que mesmo havendo pequenas variações entre
dias e entre analistas, estas se enquadram dentro dos limites especificados.
Tabela 14. ANOVA precisão intermediária
ANOVA Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Linhas 1,80067E-05 2 9,00333E-
06 1,18413 0,368594 5,143253Colunas 0,00004641 3 0,00001547 2,034634 0,210606 4,757063
Erro 4,562E-05 6 7,60333E-
06 Total 0,000110037 11
CONCLUSÃO
Através do desenvolvimento de diferentes formulações utilizando o extrato
etanólico e glicólico de X. americana, concluiu-se que os extratos comportaram-se de
maneira diferente nas três formulações. O extrato etanólico não se comportou de
maneira satisfatória em nenhuma das formulações, devido à problemas de viscosidade e
teor, enquanto que o extrato glicólico apresentou características muito boas em se
tratando da formulação de gel de carbopol, podendo ser uma formulação promissora no
desenvolvimento de um medicamento à base de X. americana.
O método de doseamento do extrato glicólico em gel foi validado, pois
apresentou exatidão, precisão, robustez e linearidade requeridos para um método
analítico. Os resultados obtidos mostram que o método atende aos requisitos de Boas
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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Práticas de Laboratório, pois apresentou a confiabilidade exigida para um método
analítico.
AGRADECIMENTOS
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo
apoio financeiro na realização desta pesquisa.
BIBLIOGRAFIA
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BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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CONCLUSÕES
♦ Ximenia americana é bastante utilizada na medicina popular, principalmente em
países da África e no sertão nordestino, porém pouco investigada
cientificamente;
♦ A presença predominante de polifenois do tipo taninos condensados observada
durante a padronização se mostra promissora para uso destes como marcadores
fitoquímicos.
♦ Os testes de autenticidade, pureza e integridade contribuíram para a
padronização da droga vegetal, fornecendo parâmetros essenciais no controle de
qualidade de matérias-primas para um futuro medicamento fitoterápico;
♦ A casca do caule da Ximenia americana estudada apresentou considerável
atividade antioxidante, comprovada por três diferentes métodos, nos diferentes
extratos estudados;
♦ A planta demonstrou ter capacidade de aumentar a velocidade de cicatrização de
feridas, apresentando atividade cicatrizante do ponto de vista macroscópico em
relação ao padrão D-pantenol;
♦ O extrato etanólico não se comportou de maneira satisfatória em nenhuma das
formulações, enquanto que o extrato glicólico apresentou características
adequadas em se tratando da formulação de gel de carbopol, podendo ser uma
formulação promissora no desenvolvimento de um medicamento à base de X.
americana.
♦ O método de doseamento na forma farmacêutica foi validado, apresentando a
confiabilidade exigida por um método analítico.
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PERSPECTIVAS
♦ Realização do estudo de sazonalidade da planta;
♦ Conclusão do teste de atividade cicatrizante com a realização da parte
histológica;
♦ Continuação do estudo de estabilidade acelerado e do estudo de estabilidade de
longa duração da forma farmacêutica gel de carbopol com extrato glicólico;
♦ Realização de uma otimização nas formulações testadas;
♦ Preparação de extratos secos (nebolizados e liofilizados) para incorporação em
diferentes formulações;
BRASILEIRO, M. T. Padronização, atividade biológica e desenvolvimento de formas farmacêuticas semi-sólidas à base de Ximenia americana L.
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ISSN 0370-372x
Rio de Janeiro, 31 dezembro de 2007.
Prezado (a) Prof. (a) Pedro José Rolim Neto, comunicamos o recebimento do trabalho intitulado: “Ximenia americana L.: botânica, química e farmacologia no interesse da tecnologia farmacêutica”, do qual o senhor é o autor correspondente. O trabalho recebeu o N°131/2007 e foi encaminhado para os revisores da Revista Brasileira de Farmácia, que farão uma análise a fim de orientar o parecer do corpo editorial. Tão logo tenhamos uma resposta, entraremos em contato.
Atenciosamente, Prof. Nuno Álvares Pereira Diretor da Revista Editor
Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
A scientific journal of the College of Pharmacists of Buenos Aires Province, Argentina Calle 5 Nº 966, 1900 La Plata, Argentina (http://www.actafarmbonaerense.com.ar)
La Plata, 15 de diciembre de 2007 Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos - LTM/ Departamento de Farmácia Universidade Federal de Pernambuco, Av: Professor Artur de Sá, S/N, Cidade Universitária, 50740-521, Recife - PE, Brasil E-mail: [email protected]
Ref.: LAJP 1405-07 Estimado Dr. Rolim Neto:
Tengo el agrado de dirigirme a usted con el objeto de poner en su conocimiento que en la fecha hemos dado entrada a su trabajo “Pharmacognostic standardization of Ximenia americana L. (Olacaceae) bark for utilization in the development of phytotherapics”, de Autor(es): Mariana T. Brasileiro, Amanda A. Egito, Karina P. Randau, Clébio P. Ferreira, Rejane M.M. Pimentel, Gustavo C. Pereira, Pedro J. Rolim Neto*. El trabajo ya ha sido remitido a los árbitros, cuya opinión le haremos conocer oportunamente.
Al tiempo de agradecer su colaboración, hago propicia la oportunidad para
saludarlo con las expresiones de mi mayor consideración.
Dr. Néstor O. Caffini, Editor E-mail: [email protected]
.