GENÉTICA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA

RELATÓRIO EXTRACÇÃO E

QUANTIFICAÇÃO DE DNA

Docente: Paula Lopes

Discentes: CRISTIANA VALENTE Nº 33708; DAVID RODRIGUES Nº 33714; FRANCISCO PINTO Nº 33707; LUÍS SAMPAIO Nº 33706; PEDRO VEIGA Nº 33698

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

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Índice

Introdução ..................................................................................................................................... 3

Objectivos .................................................................................................................................... 4

Resultados ..................................................................................................................................... 4

Discussão ....................................................................................................................................... 5

Conclusão ...................................................................................................................................... 6

Bibliografia .................................................................................................................................... 6

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Introdução

O DNA é a biomolécula que possui toda a informação genética, permitindo

saber qual o grau de afinidade entre indivíduos.

O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura

de tecidos é uma etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma

de plantas. É necessário extrair o DNA intacto para não quebrar as ligações, já que

são estas as responsáveis pela informação genética. Qualquer que seja a técnica a

utilizar esta exige a extracção de DNA de boa qualidade, a sua quantificação e

conservação. Para estudar DNA é necessário remove-lo do núcleo da célula. Neste

trabalho estudamos o material genético de células vegetais, apesar da constituição da

sua parede celular, rica em celulose, quitina, outros polissacáridos e fenóis que

dificultam a extracção.

O DNA extraído proveio de folhas de plantas de várias espécies: cevada dos

ratos, cebola, cebolinho e alface.

O método de extracção de DNA utilizado (DNeasyTM Plant Mini Kit-QIAGEN)

consiste em:

1- Macerar 100 mg de tecido, em azoto líquido, até ficar reduzido a um pó

muito fino. Colocar num tubo de 2 mL.

2- Adicionar 400 μL de tampão AP1 e 4 μL de RNAse. Agitar vigorosamente no

vortex.

3- Incubar a mistura 10 min a 65º C. Misturar por inversão 2 a 3 vezes durante

o tempo de incubação.

4- Adicionar 130 μL de tampão AP2, misturar, e incubar 5 minutos em gelo.

5- Centrifugar 5 minutos na velocidade máxima.

6- Aplicar a fase líquida à coluna QIAshredder (Lilás) colocada num tubo de 2

mL e centrifugar 2 minutos na velocidade máxima.

7- Transferir a fase líquida, obtida no passo anterior, para um novo tubo (não

fornecido) sem tocar no “pellet”.

8- Adicionar 0,5 do volume (obtido em 7) de AP3 e 1 volume de etanol (96–

100%) ao lisado e misturar com a pipeta.

9- Colocar 650 μL da mistura obtida em 8, incluindo algum precipitado formado;

à coluna Dneasy colocada num tubo de 2 mL. Centrifugar 1 minuto a 8000 rpm e

eliminar a fase líquida obtida.

10- Repetir o passo 9, utilizando a amostra restante, e eliminar a fase líquida

conjuntamente com o tubo.

11- Colocar a coluna num novo tubo (fornecido), adicionar 500 μL de tampão

AW à coluna e centrifugar 1 min a 8000 rpm. Eliminar a fase líquida e reutilizar o tubo.

12- Repete-se o passo 11 mas com uma centrifugação de 2 min na velocidade

máxima para secar a membrana.

13- Transfere-se a coluna para um tubo de 2 mL e coloca-se 100 μL de tampão

AE previamente aquecido a 65ºC directamente na membrana. Incubar 5 min à

temperatura ambiente e centrifugar 1 min a 8000 rpm para diluir.

14- Repete-se a diluição (passo 13) utilizando o mesmo tubo.

Para quantificar DNA recorremos a dois métodos:

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- Quantificação de DNA por espectrofotometria – as medições efectuadas

para a absorvância foram feitas a 260 nm e a 280 nm, sendo que a razão entre

as absorvâncias 260/280 nm determinam a pureza das amostras de ácidos

nucleicos.

- Quantificação de DNA em géis de agarose – o gel de agarose obtém-se

por solidificação da agarose fundida em tampão TBE 1x ao qual se adiciona,

depois de arrefecido, brometo de etídio. Previamente à aplicação no gel,

adicionou-se às amostras tampão de amostra (50% de glicerol, 0,25% de azul

de bromofenol e 1mM EDTA) que facilita a aplicação e visualização destas.

Após a corrida, o gel foi visualizado com radiação UV e fotografado.

Para além dos problemas referidos anteriormente, existem outros problemas durante o

isolamento do DNA:

Contaminação por fenóis – isto pode se expressar pela coloração marron ou

muito escura do DNA;

Contaminação por polossacáridos – a amostra de DNA surge com um aspecto

gelatinoso e excesivamente viscoso;

DNA degradado – isto pode ocorrer pela contaminação das DNAses, por

quebra mecânica durante a extracção com clorofórmico ou por contaminação

com RNA. É visível pelo DNA apresentar um arraste vertical no gel.

Objectivos

Extracção e quantificação de DNA de diversas espécies vegetais;

Testar métodos de forma a compreender quais os mais correctos para cada espécie;

Resultados Tabela 1 – Quantificação de DNA por espectofotometria.

Amostra A (260 nm) A(280 nm) R (260/280) [ ] ng/ ml

Cevada rato (2ª dil.)

0.039 0,03 1,311 39

Cebola (2ª dil.) 0,046 0,029 1,577 46

Cebolinho (2ª dil.)

0,058 0,036 1,610 58

Alface (2ª dil.) 0,089 0,063 1,422 89

Cevada rato (1ª dil.)

0,123 0,073 1,692 123

Cebola (1ª dil.) 0,104 0,069 1,509 104

Cebolinho (1ª dil.)

0,060 0,044 1,368 60

Alface (1ª dil.) 0,306 0,215 1,421 306

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Fórmula para calcular a concentração de DNA:

[DNA] g/ml = Razão de diluição x A260 x 50

Fig. 1 – Visualização do gel com as amostras utilizadas.

Discussão

No que refere a razão das absorvâncias, podemos inferir que para as amostras

de razão superior a 2.0 ocorreu contaminação com RNA; por sua vez para valores de

razão inferiores a 1.8 ocorreu contaminação com proteínas.

Da análise dos dados obtidos por espectofotometria conseguimos ordenar as

amostras por ordem crescente de grau de pureza (dado pela razãoA260/A280) da

seguinte forma:

• Cevada dos ratos 2ª diluição <Cebolinho 1ª diluição <Alface 1ª diluição

<Alface 2ª diluição <Cebola 1ª diluição <Cebola 2ª diluição <Cebolinho 2ª diluição

<Cevada dos ratos 1ª diluição

As amostras mais puras são aquelas que apresentam um grau de pureza perto

de 1,8, segundo a Tabela 1.

Todas as amostras apresentam valores abaixo de 1,8 o que nos indica por

esse método que as nossas amostras estão contaminadas por proteínas.

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Pela observação da figura 1, verificamos que não está presente nenhuma

banda sobre as amostras, logo não há contaminação por RNA.

Podemos observar que as bandas 1, 2, 5, 6, 9 e 10 apresentam arrastamento,

indicando que o DNA se encontra fragmentado. Por outro lado, as bandas que não

apresentam arrastamento indicam que o DNA está intacto.

Podemos observar que a sequência de amostras do gel de agarose não

corresponde à sequência utilizada na espectrofotometria, uma vez que as as bandas

que supostamente deviam sofrer arrastamento não sofrem.

Conclusão

Podemos concluir que os nossos objectivos não foram atingidos, uma vez que

nenhuma das amostras apresentou o grau de pureza (1,8), sendo o valor mais

próximo 1,692 para a cevada dos ratos 1ª diluição. Concluímos também que todas as

amostras estão contaminadas com proteínas.

Os resultados que obtivemos , nos dois métodos, não coincidem. Pelo que

podemos concluir que, houve erros humanos durante a realização do trabalho.

Provavelmente durante o carregamento das amostras, pequenas quantidades destas

podem ter ficado em suspensão ou retidas na micropipeta. Uma outra hipotese é ter

sido trocada a ordem das amostras.

Podemos concluir que é necessário cruzar os resultados dos dois métodos

para retirar ilações. Uma vez que só possuímos dados viáveis do primeiro método,

não podemos retirar conclusões válidas.

Bibliografia

http://www.uefs.br/disciplinas/bot859/extra.pdf

http://www.fc.up.pt/pessoas/aseneca/Teresa%20Azevedo%20Tese.pdf