View
26
Download
0
Category
Preview:
DESCRIPTION
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO SOLO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas
EN2105 - Microbiologia Ambiental
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO SOLO E OBTENÇÃO DE
CULTURA PURA
David Ávila Almeida RA 11011711
Gabriela Pena Massari RA 11031407
Natalia Alves Cordeiro RA 11045212
Noele de Araujo Falcão RA 11080913
Tárcila Oliveira de Miranda RA11032510
Victor A. S. Almeida RA 11009610
Prof. Dra. Luísa Helena dos S. Oliveira
Santo André
2015
Sumário
1.Introdução
2.Objetivo
3.Materiais
4.Procedimentos
5.Resultados e Discussões
6.Conclusão
7.Bibliografia
1. INTRODUÇÃO
Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e
desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, como
componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos [4], são
seres vivos muito pequenos que não podem ser vistos individualmente sem auxílio de
microscópio. Estes organismos são classificados como bactérias, archaeas, fungos,
protozoários, algas e parasitas [1]. Para este experimento, os microrganismos de
interesse são bactérias e fungos.
As bactérias são seres unicelulares e seu material genético não está envolto por
uma membrana, ou seja, são procariotos. O material orgânico proveniente de
organismos vivos ou mortos são fonte de alimento para muitas bactérias. Há ainda
bactérias que são capazes de sintetizar o próprio alimento através da fotossíntese ou
ainda outras que podem obter alimento de matéria inorgânica [1]. As bactérias
constituem o grupo mais numeroso, talvez o mais importante dentre os componentes
microbianos do solo. Num solo normal, obtido por métodos comuns de análise, podem
ser avaliados ao redor de vinte milhões de talos bacterianos por grama de solo. Essa
quantidade corresponde a aproximadamente 0,01% do volume do solo na sua camada
superior, ou, ainda, a cerca de trezentos quilogramas de talos bacterianos por hectare.
[5]
Os fungos podem ser unicelulares ou multicelulares e são seres eucariotos, ou
seja, possuem núcleo celular. O alimento é obtido através de material orgânico em um
ambiente ou em um hospedeiro [1]. A quantidade de fungos, dentro da população
microbiana do solo, é acentuadamente inferior a das bactérias; seu número, num solo
nas condições do caso anterior, poderia variar entre quinhentos mil e dois milhões de
indivíduos. [5]
O sucesso de um microrganismo em um determinado ambiente se dá em função
da extensão e rapidez de suas respostas fisiológicas às condições ambientais, sendo,
portanto, encontrados em diversos ecossistemas terrestres, especialmente nos solos
[8]. A biodiversidade de solos tem um papel fundamental na regulação dos processos
biogeoquímicos formadores e mantenedores dos ecossistemas. Dentre estes, incluem-
se: a formação e estruturação de solos; a decomposição da matéria orgânica; a
ciclagem de nutrientes; e a formação dos gases componentes da atmosfera terrestre.
[4]
A presença de um microrganismo em determinado solo é função das condições
ambientais dominantes e dos limites da sua bagagem genética. Dessa forma, existem
fatores ambientais que limitam a sobrevivência e a atividade dos microrganismos do
solo. Os principais fatores abióticos do solo são a temperatura, o pH, a salinidade, as
fontes de energia e substratos orgânicos, os nutrientes e os elementos tóxicos. [2]
Entre os principais componentes do meio, as fontes de nitrogênio, fósforo e sais
minerais juntamente com os açúcares formam os nutrientes necessários para o
desenvolvimento desses seres. A aplicação de estercos e compostos orgânicos ao solo
favorece a atividade e o desenvolvimento da microbiota. De outro lado, a aplicação de
compostos orgânicos como pesticidas e poluentes pode ocasionar prejuízos aos
microrganismos e ao processo bioquímico. [2]
Os microrganismos na natureza existem em culturas mistas, ou seja, várias
espécies diferentes ocupam um mesmo ambiente. No entanto, para determinar as
características de um certo microrganismos é necessário que ele esteja em uma cultura
pura, o que significa que todas as células da população tem as mesmas características
genéticas. Para que esse estudo possa ser realizados existem procedimentos para a
obtenção dessas culturas, chamados de isolamentos, e são essenciais para se ter o
microrganismo disponível para estudos de morfologia, taxonomia, reprodução e
fisiologia.
Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia através da observação
da produção de determinado produto ou da morfologia da colônia. Para fazer o
isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado
para o seu desenvolvimento. O meio de cultura é um material nutriente preparado em
laboratório cuja utilização é importante para o crescimento, transporte e estocagem de
microrganismos [3]. As técnicas de isolamento podem ser classificadas de acordo com
a consistência do material e as operações são executadas sob rigorosa assepsia, em
ambiente próprio, usando-se ferramentas e material desinfestados ou esterilizados
1.1 Isolamento em Cultivo Sólido
1.1.1 Técnica de Semeadura por Estrias
Esse método também é chamado de esgotamento de alça. Através de uma alça
de platina, de um fio de platina ou até mesmo um swab, coleta-se uma pequena
parcela do meio de inóculo e o espalha sobre uma placa de Petri com ágar fazendo
movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem
várias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontínua ou contínua [6]. A
forma descontínua é mostrada na figura abaixo, onde são feitas estrias na porção 1 da
placa e em seguida flamba-se a alça; após, faz-se uma retirada de bactérias da região
1 e espalha-se sobre a região 2; flamba-se mais uma vez e espalha-se bactérias da
região 2 na 3. As colônias presentes na região 3 estarão mais isoladas [3].
Figura 1: Técnica de Semeadura por Estriar
Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.
1.1.2 Técnica de Semeadura por Espalhamento
Nessa técnica um pequeno volume da solução de microrganismos contendo de
30-300 células é transferido para o cento de uma placa de ágar já solidificado com o
auxílio de uma pipeta estéril. Em seguida, mergulha-se uma alça de Drigalski em álcool
e a flamba de modo a manter todo o material estéril. Com o auxílio dessa alça,
espalha-se aquele volume depositado por toda a superfície do ágar. As colônias
cresceram espalhadas por toda a superfície do ágar [3].
1.1.3 Técnica de Semeadura por Derramamento
O método de semeadura por derramamento, ou também denominado de pour
plate é muito utilizado para bactérias e fungos. A amostra original é diluída de forma
que quando é feita a placa consegue-se colônias bem separadas. Um pequeno volume
da melhor diluição é então derramado em uma placa de Petri sem ágar. Em seguida,
derrama-se ágar fundido na temperatura de 45ºC e mistura-se os dois com uma
agitação leve da placa e deixa-se o meio solidificar.
Esse método permite o crescimento de colônias na superfície e dentro do ágar,
pois algumas células foram misturadas no ágar durante a sua solidificação, onde há a
comparação do crescimento após a semeadura por pour plate e por espalhamento [3].
1.1.4 Técnica de Semeadura em Profundidade
Faz-se a utilização da agulha de platina e semea-se o material contido nela
picando um ágar sólido contido num tubo. Com isso haverá o crescimento de
microrganismos em anaeróbio se no fundo e aerobiose perto da superfície do ágar [6].
Figura 2: Semeadura em Profundidade
Fonte: DROVAL, LIMA e HABU, 2001.
1.2. Isolamento em Cultivo Líquido
Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de determinada
população microbiana são geralmente líquidos. Após o crescimento avantajado então
ocorre o isolamento de determinadas células. Isso pode ser feito como mostrado nas
técnicas em estado sólido ou através de uma série de diluições em meio líquido.
Fazendo uma diluição em novo meio estéril, espera-se que em certo momento
se obterá culturas provenientes de somente uma única célula. Série de diluição para
isolamento de um microrganismo é apresentado na figura abaixo.
Figura 3: Isolamento pela técnica de diluição
Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN.
2. OBJETIVOS
O experimento foi dividido em duas etapas, onde cada uma possui objetivos
específicos. A primeira parte do experimento teve com objetivos isolar os
microrganismos no solo, quantificar a densidade de bactérias e fungos por Unidades
Formadoras de Colônias (UFC) e praticar a técnica de diluição e semeadura. Já na
segunda parte do experimento, de obtenção de cultura pura, os objetivos foram
demonstrar práticas de assepsia e outros procedimentos necessários para isolamento
de culturas e demonstrar os principais métodos de obtenção de culturas axênicas.
3. METODOLOGIA
3.1. Materiais
As duas partes do experimento utilizaram diferentes materiais. Na parte de
isolamento de microrganismos do solo foram utilizadas amostras de solo (areia da praia
e agapanto), 4 placas de petri, uma pipeta automática de 1 mL, Luria Bertani Agar
(LBA), Meio Martin (previamente fundido e mantido a temperatura de 45ºC), 200 mL de
solução salina 0,7% NaCl esterilizado, um frasco esterilizado com capacidade para 90
mL de solução salina, Bico de Bunsen, estufa de incubação, caneta azul para
retroprojetor e 4 frascos para diluição contendo 9 mL de solução salina 0,7% NaCl.
Na parte de obtenção de culturas puras foram utilizados os seguintes materiais:
duas placas de Petri pequenas contendo o meio Ágar nutriente (já vertido e solidificado
nas placas), duas placas de Petri pequenas contendo o Meio Martin (já vertido e
solidificado nas placas), palito de dente, alça de platina e estufa de incubação.
3.2. Procedimentos
3.2.1. Isolamento de Microrganismos do Solo
Primeiramente, foram coletadas 50g de amostra de solo (areia da praia e
agapanto) em frasco estéril. Utilizando a caneta para retroprojetor, foram marcados os
frascos para diluição com: 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 . A seguir, as 50g de amostra de solo
foram diluídas no frasco com 90 mL de água de diluição.
Com o auxílio de pipeta, 1 mL de líquido foi retirado do frasco com amostra
diluída e, próximo ao bico de Bunsen foi transferido para o frasco marcado como 10-2 e
então o tubo foi agitado. O procedimento foi repetido transferindo 1 mL do frasco
marcado como 10-2 para o frasco marcado como 10-3 e depois transferindo 1 mL do
frasco 10-3 para o frasco 10-4.
Figura 4: Diluição em tubos de ensaio.
Uma placa de Petri foi marcada como 10-2 MM (Meio Martin), uma como 10-3 MM
(Meio Martin), outra como 10-3 LBA (Luria Bertani Agar) e a última como 10-4 LBA (Luria
Bertani Agar). Novamente com a pipeta e próximo ao bico de Bunsen, 1 mL do frasco
10-2 foi transferido para a placa de Petri 10-2 MM. Depois, 1 mL do frasco 10-3 foi
transferido para a placa 10-3 MM e 1 mL para a placa 10-3 LBA. Finalmente, 1 mL do
frasco 10-4 foi transferido para a placa de Petri marcada como 10-4 LBA.
Próximo ao bico de Bunsen, aproximandamente 10 mL de Meio Martin foram
vertidos nas placas de Petri marcadas como 10-2 MM e 10-3 MM. Nas placas de Petri
marcadas como 10-3 LBA e 10-4 LBA foram vertidos aproximadamente 10 mL de meio
Luria Berani Agar em cada.
Esperou-se a solidificação dos meios nas placas e então estas foram invertidas
para evitar a formação de água na superfície do agar. Por fim, as placas foram
colocadas na estufa de incubação a 35º C. A contagem de colônias formadas nas
placas foi realizada um dia após o preparo das placas, 4, 5, 6 e 7 dias após o preparo
das culturas.
3.2.1. Isolamento e Obtenção de Cultura Pura
Antes de cada etapa do experimento, a alça de platina foi esterilizada na chama
do bico de Bunsen e resfriada através da imersão em tubo contendo água destilada e
as placas de Petri foram marcadas como 10-2 MM, 10-3 MM, 10-3 LBA e 10-4 LBA.
Próximo ao Bico de Bunsen, a placa de Petri 10-3 LBA contendo os
microoganismos isolados na parte 1 foi aberta e a alça de platina foi inserida nesta
cultura. Fechou-se a placa e então, na nova placa de Petri também marcada como 10-3
LBA foram desenhadas três estrias com a alça contendo microganismos retirados da
outra placa. Após esterilização da alça de platina, o mesmo procedimento foi realizado
retirando microrganismos da placa 10-4 LBA da parte 1 e transferindo-os para a nova
placa de Petri com a mesma marcação, 10-4 LBA.
Ainda próximo ao bico de Bunsen, a placa contendo microrganismos marcada
como 10-2 MM da parte 1 foi aberta e o palito de dente foi inserido em uma colônia. A
placa foi fechada e o palito de dente contendo microrganismos foi inserido no centro da
nova placa de Petri marcada como 10-2 MM. A placa de Petri marcada como 10-3 MM
da parte 1 não apresentou crescimento de colônias, portanto uma segunda colônia da
placa 10-2 MM foi utilizada na segunda nova placa de Petri contendo Meio Martin.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
“O solo é um recurso natural vital para o funcionamento do ecossistema terrestre
e representa um balanço entre os fatores físicos, químicos e biológicos.”(ARAÚJO;
LEITE, 2007) Bactérias e fungos compõe a fração biológica de microrganismos no solo,
realizando diversas funções importantes para a manutenção do solo, tais como
degradando substâncias tóxicas, fornecendo nutrientes responsáveis pelo crescimento
da flora e decompondo a matéria orgânica. Esses microrganismos podem viver tanto
em simbiose quanto isolados. A distribuição dos mesmos no solo depende de muitas
variáveis, dentre elas a temperatura, pH, umidade e disponibilidade de oxigênio.
A temperatura afeta diretamente a fisiologia dos microrganismos e altera
também o ciclo de nutrientes e a atividade da água. Observa-se uma taxa mais alta de
crescimento tanto bacteriano quanto de fungos ao passo que estes chegam à sua
temperatura ótima, que varia de espécie para espécie. Diferentes grupos de bactérias
possuem diferentes temperaturas ótimas, as bactérias Psicrófilas possuem uma
temperatura ótima de aproximadamente 15 °C, já as Mesófilas possuem uma
temperatura ótima de 37°C, as Termófilas são bactérias que aguentam temperaturas
extremas e possuem uma temperatura ótima na faixa de 85°C.
As bactérias podem crescer em meios cujo o pH esteja entre 6,5 a 9, faixa
normalmente observada na natureza. Elas podem ser classificadas em Neutrófilas,
Acidófilas e Alcalinófilas, com a faixa de pH respectivamente entre 5,4 a 8,5; 0,1 a 5,4 e
8,5 a 11,5. Como toda célula metabolicamente ativa necessita de água, a umidade é
essencial para o crescimento bacteriano, sendo apenas possível para o endósporo da
bactéria viver na sua ausência.
Para os fungos, a temperatura ótima de proliferação ocorre por volta dos 25 °C,
porém existem espécies que se adaptam a temperaturas mais baixas. Eles são
essencialmente aeróbicos, ou seja, dependem do oxigênio para sobreviverem. Fungos
crescem em meio ao pH que pode variar de muito ácido (pH 2) até levemente ácido,
próximo a 6.
Os solos arenosos são caracterizados por possuirem grãos largos e numerosos
poros, o que facilita a rápida penetração da água em camadas profundas do solo,
levando com ela, todos os nutrientes e sais necessários para o desenvolvimento da
vida vegetal, resultando em um solo pobre em matéria orgânica. Por outro lado, nos
solos de Agapanto, utilizam-se fertilizantes e adubos orgânicos para o crescimento da
flor, que deve ser cultivada e regada em abundância na primavera e verão, o que indica
um alto teor de umidade deste tipo de solo.
Figura 5: Microrganismos e processos biológicos afetados pelo pH do solo.
Fonte: ARAÚJO; LEITE, 2007
Na primeira etapa, observamos as culturas depois de 1, 4, 5, 6 e 7 dias, fizemos as
contagens de UFCs e tiramos fotos. Como a turma foi dividida, temos apenas as fotos das
culturas de Agapantos. São elas:
Imagem 1: após 1 dia de cultura. Imagem 2: após 4 dias de cultura.
Imagem 3: após 5 dias de cultura. Imagem 4: após 6 dias de cultura.
Imagem 4: após 7 dias.
Foram observados os seguintes resultados:
Solo Bactéria
10-3 Bactéria
10-4 Fungo 10-
2 Fungo 10-
3
Massa do Solo
Úmido
pH
Agapantos 86 48 82 69 11,52% 6,0
Areia da Praia
70 42 1 0 10,45% 7,0
Tabela 1: Quantidade de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por microrganismo, nos dois tipos de
solo.
Observando-se a tabela 1, nota-se que a melhor diluição para ambos
microrganismos foram as de 10-3 LBA para bactérias e 10-2 MM para fungos, onde se
obteve uma homogeneidade maior entre o número de microorganismos contados, ou
seja, nessas concentrações as condições para o desenvolvimento dos mesmos foram
otimizadas em comparação com as outras diluições propostas. O solo de Agapantos foi
o que se mostrou mais favorável aos dois microrganismos.
5. CONCLUSÃO
Nesse trabalho utilizamos a técnica de semeadura e diluição a fim de isolarmos
microrganismos, como bactérias e fungos os quais foram quantificados por Unidades
Formadoras de Colônias (UFC), como apresentadas nos resultados. A contagem de
fungos na areia da praia não apresentou uma quantidade de colônias esperada,
justificada pelo valor do pH. Observou-se que houve um crescimento muito mais
acentuado de microrganismos nos solos de agapanto, uma vez que estes são ricos em
matéria orgânica e possuem melhores condições físicas para o desenvolvimento dos
mesmo.Cada grupo em seu respectivo meio de crescimento, meios LBA e Meio Martin,
respectivamente para bactérias e fungos.
Já sobre a assepsia, aplicamos a flambagem ou esterilização por calor seco sob bico
de bunsen da alça de platina utilizada no experimento, para obtenção da cultura pura
aplicado de maneira satisfatória.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8ª edição, 1ª
reimpressão, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.
2 ARAÚJO, A. S. F.; LEITE, L. F. C. Ecologia Microbiana do Solo. Sapiência, Teresina,
v. 4, n. 12, p 3. jul. 2007.
3 PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5 th edition. The
McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.
4 MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE. Microorganismos e biodiversidade dos
solos.Versão de 28/10/98. Disponível em :
<http://www.mma.gov.br/estruturas/sbf_chm_rbbio/_arquivos/Microrganismos%20e%20
Biodiversidade%20de%20solos.pdf>
5 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. Microrganismos do solo. Disponível em :
<http://www.revistas.usp.br/aesalq/article/viewFile/38761/41645>.
6 DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prático de Microbiologia de
Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante. CEFET/PR –
Unidade de Medianeira, 2001.
7 MENDES, I. de C.; REIS JUNIOR, F. B. d. Microrganismos do solo e a
sustentabilidade dos agroecossistemas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2010.
Disponível em: <http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/publicados/188/>.
8 SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S. Biologia e Bioquímica do Solo. Universidade
Federal de Lavras.
9 GALLI, Fernando. Microrganismos do Solo. Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”. Vol XXI, 1964.
Recommended