I

-1-

j ?

~

A m b r e . . . de l alum-: Alma Topi l t z ín PBrez ?;Iéndeo. .._ I~ Celdfono particular: ~. 6-51-89-56.

*.. matrícula: 83323760.

clave: AJ./p7. ,@a . $ - -

/co,zr,ern: Biología experimental. c

tr inestre: 88- - .- . . '."" horns D O ~ semana: 30.

- luxar dbnde se lleva a cabo: Departamento de bioquímica de l a fa- ,-. cu.Ltad de quhica de l a UNAM. Divisi6n de estudios de pos-

grado. h e c h a de in ic io : ab r i l 30'de 199%

I-

'- .-

fechq de t;erminacián: octubre. 30 de 1998. c

fiui;or externo: Dra. Estela SQnchez de Jiménez. Jefa de l a d iv is ión .- ,_ de b ioquhice y farmacia de l a facultad de química de l a UNM, fa- '

, c cziltad a l a que se encuentra adscrita. ii - A f t u l o de l nroyecto: Acción de las'auxinas sobre los ribosomas de

.- naiz.

c

,-

.- I-

.-

BlBIr20. DEL ALULINO:

-_ -2-

t JUSTIFiGMfON Y NATURiIiEZA DXL PROYECTO: Este trabajo forma par-

i t e de un

grado de

objet ivo

minación

S i se

mentaria

otorqado

I

groyocto que se rea l i za en l a d iv is ión de estudia8 de p o ~

l a facultad de química de l a U,'N,A,L.I, * y que t iene como

e l estudio de l mecanismo de acci6n de auxinas sobrie l a gez I d e l maíz, i

1 considera que eBta especie vegetal constieuye l a base a l i - del pa í s , y que l o s estudios sobre fitorrepaladores no han

suficiente información sobre su mecanismo de acción y e f e z

I

I

t o , resulta evidente l a importancia de l proyecto.

E l presente trabajo Lj/e ubica dentro del campo de l a ciencia b4s4

ca, y e l conjunto d e sus resultados podría convertlrae a su vez en

en un nuevo campo de estudio.

3n l a medida en que se conozca mejor l a f i s i o l o g í a y bioquímica

de las plantas, se podrá inc id i r específicamente en aquellos proce-

"4 80s y eventos que l e s confieran característ icas más deseables por e l

hombre.

INTRODUCCION: Uno de les aspectos más asombrosos de l a f i s i o l og í -

a vegetal es e l que UD pequeño ~ r u p o de mensajeros quími.cos, los Q

tonreguladores, produzcan una variedad de e fectos t a n extraordina--

r j n , 'en un nfimero t a n grande de situaciones tan diferentes. (E) . M t r e este grupo de reguladores de l creciniento vegetal se encuen

tran las auxinas, que producen diversos e fectos sobre e l desarrol lo

ü e las Dlantas ; takes cono l a elongaclbn, div is ibn celular, d i f e res

ciación, morfogéncsis, etc. La auxinn natura l está identi f icada cg

mo e l dcido i.ndol-3-ac8tico (A IA ) y se sabe que existe un buen nShg

r o dii compuestos sint6ticos que producen efectos similares a los de

la awina natural, tales como el ácido 2,4,-diclorofenoxiac6tico (2,

4,D) , y sdi derivado; el Acido 2-metll,4-clorofenoxipropi~n~ico (EiICPP)

(.2 1 Partiendo de que todas las células de un organismo conti-enen exas

tamonte la misma Información genética, el problema es conocer los me - canismos por los cuales se controla la expresibn de esta informacibn.

Debido a la complejidad del fenómeno, los mecanismos de control de

6s$e Pueden darse en múltiples niveles. Tan solo los ya comprobados

Comprenden procesos tan variados como la traducción, pos-traducci6n,

transcripción y pos-transcripción.

-

A nivel molecular va5hos grupos deJ.nve&igadores han encontrado en

distintm sistemas biológicos que las awrioas alteran los patrones

de proteínas sintetizadas; se.ha observado que hay algunas proteínas

(denominedas reguladas por aUinaS) que se estimulan, en tanto que o! tras se inhiben en presencia de dicho fitorregulador, ( 3)

ii Por otra parte, el desarrollo de sistemas ‘de síntesis in-vitro de

proteinas dependientes de mRNAs exógenos, así como el análisis por

medio de elecimoforésis bidimensional de las proteínas traducidas,

han permitido establecer la acción, a tiempos cortos, de las auxInas

en algunos sistemas.

ANTESEDENTES: En nuestro sistema biol6gico de estudio (maíz), se ha

observado que aquellos semillas que se imbiben en presencia de aux&

nas , después de unos pocos días producen una masa amorfa de células parcialmente desdiferenciados (callo), en cambio aquellas que germi-

nan en un medio a l que no Be han asregado auxinas, desarrollan una

pldntula normal, con todos sus tejidos y brganos bien diferenciados:

Mbs idin, existen trabajos donde se demuestra una intoraccibn, cuan-

,‘

-4-

tativa entre aqcinas y cii$cininas en el control de la formación de

raíz y yemas a partir de emlentas. ( 2 )

A otro nive1,se ha observado en experimentos previos que la pre-

qencia dr auxinas altera el patrón electroforético do protieinas sin

tetimdas; algunaCaumentan mientras que otras disminuyen y no ep - i lguaL proporción. ( 3 ) Estos cambias no pueden ser explicados única- mente por el aumento en

-

- tranScripcibn(provocado por auxinas ) qqe

algunos autores reportan . Es necesario proponer otro t i p o de regula - ción que bien puede ser directamente en l a maquinqrLa de síntesis.

Esta maquinqria de síntesis(1os ribaeemas) está constituida por

mclldculas de proteína s‘de RNAr.

tos las proteínas son fáciles de modificar transitoriamente, y ya que

hay reprtes de fosforilación de proteínas en plantas( 4 ) y en pro - tehas ribosomales de éstas, se sugiere que sea a nivel de cambio.de

estrdictura en las proteinas ribosomales donde pueda llevarse a &bo

la rugulactón. Ademds se encontró que l a fraccion ribosomal(pre-

fprentemente) sucre fosforilación, y que este fenómeno es afectado

Considerando que de estos elemen-

;i

por gran

Hasta

procesos

fenómeno

variedad de eetímulos fisiolbgicos.

la fecha no se sabe que acci6n o signigicado teTigan estos

de fesforilación de proteínas en plantas, sin embargo este

coincide con los memnismos que muchos mensajeros qufmicos

en animalec(hormonas) usan para la regulación de mecanismos en casca

da ( I + ) . Como complenenbo a los estudios electroforéticos de los cambios

estructurales en las proteínas ribosomales, nos interesa saber si eg

tos cambios alteran la Puncionalidad de los ribosomns en traducciones

in I- vitro. --

-5L)

1.- Obtener ribosomas de maíz chalqueiio funcionales para l a sínte-

sis - in-vitro de proteínas.

2.- Una vez montada l a técnica de sintesiis de proteinas en i isado de

mtieul.ocito tie conejo, asegurar l a dependencAa de las íntesis Dam:

a)ní?i?A exbgenc. - b) ribosonas de maíz.

3.- Obtener l o s patrones e iectro forét icos en segunda dimensión para

las proteinas ribosomales de eJes embrionarios de maíz chalqueño;

e jes embrionarios imblbidos o no en medio de cul t ivo con y s in aux&

nas.

4.-

entre l os tratamientos con auxlna natura l o MCPP.

h-BTOüOLOGIA:

/

Observar si se manifiesta por estas técnicas alguna diferencia

- Obtenci6n del sistema de s íntes is de proteínas in-v i tro a pa r t i r i

de sanpe de conejos previamente anemizados.

- Prueba de l a incorporación endógena del sistema.

- Pruebas para hacer e l sistema dependiente de mensajero y ribo-

mas exógenos.

-'Gbtención de ribosomas de maíz chalqueño funcionales para nues-

t r o sistema de síntesis.

=extracción de proteínas ribosomales de maíz chalqueño,

- separación de las proteínas ribosomales por t6cnicas de electro-

foreois en segunda dimensibn y obtoncibn de l o s patrones correspon-

d i cn t os.

” I I

-7-

, I. .

, ,. BTRTIICGRAI?IA 2

J..-BID;VELI>. R. G. S. (1974). Plant Physiology. N%illan pU blishing CO. New York. ü6A.

2.- Barn T.C. (1979). Biochemestry and Phgslology of Plant hormones. Springer Verlag. New York.

J.-THEOIXñ.lST.A; (1986). Rapid Gene Regulation by Auxin.

Annu.Rev. Plant Physiology. 37: 497- 438:

4.- RANJEVA,R. and A,M.Boudet. (1987).Phosphorylatioñ of prg

teins in plants: Regulatory effects and potential

involvement in stimulua7respoase coupling. Annu.

1- Rev. Plant. Physiol. 38:73-93. I -

._ ,- .- .- ._ c

._ I-

.- I -

* -

c.

trimestre: ’35-1.

horas por sema-: 30 hrs.

Lugar donde se ‘llevó a cabo: Oepartamento de bi mica de la división de estudios de posghado de la facultad de

qu ím i ca . fecha de iniciq: .abril 30 de 1938.

fecha de términs octubre 30 de 1958.

tutor externo: Dra. Estela Sánchez de Jiménez. Jefa de la divisi,Ón de . . 0 bioquímica y farmacia de l a facultad de químicade

. I

ta’UNAM,facultad a la que se encuentra adscrita.

titulo del proyecto: ACCION 9 E LAS AUXINAS SOBRE LOS RIBOSOM4S DE MAIZ.

F I RM.4 DEL ALU!*!SO:

FIRMA 9EL TUTOR:

1 I

J i

4or 'de l a s c é l u l a s se d i s t i n gue ciel medio ex t e rno po r

nc ia de moléculas de gran tamaño y a l t a complej idad.

c

. .

.". r..

r-

La capacidad de s i n t e t i z a r e s t o s complejos químicos siwe s i e g

do una de I l a s c a r a c t e r l s t i c a s suprerras que d is t inguen a una

c é l u l a (1).

Un buen po rcen ta j e de e s t a s moléculas son p r o t e l nas . Además

de c o n s t i t u i r l a Sustancia "sb l ida" de 1 l a s c é lu l a s , t i en en p r o - piedades c a t a l í t i c a s : conv i r t i éndose a s í en p ro tagon i s tas p r i n -

c i p a l e s de todas l a s r eacc i ones químicas que const i tuyen l a vi da.

La s f n t e $ i s de p r o t e í nas a p a r t i r de pequeñas unidades estruc-

t u r a l e s (aminoácidos) t i e n e lugar b a j o l a e s t r i c t a d i r e c c i 6n

d e l á c i do d e sox i r r i b onuc l e i c o (DNA) que c ons t i t uy e e l 5enoma

c e lu l a r . Y aunque todas l a s c é l u l a s de un organismo poseen

exactamente l a misma informacibn gené t i ca , "a lgo" provoca que

catia una de e l l a s exprese d i s t i n t o s mensajes a p a r t i r de e s t a

informacibn común, generando f inalmente a c t i v i d a l e s c e l u l a r e s

que pueden ser dramáticamente d i s t i n t a s .

¿Qué sucefie dentro d e l d e s a r r o l l o cie l a s c é l u l a s para hace r l as

d i f e r e n t e s e n t r e s í ?

La h i p b t q s i s d e l a constancia d e l genoma no e x p l i c a l a adapta-

c i ó n c e l u l a r a un ambiente va r i ab l e , rri-i l a G i f e r enc iac i ón . Es

e v i d en t e que l a expresibn de los genes debe e s t a r sometida a

un p roce$o de c o n t r o l .

El mecanjismo g ene ra l que permite l a s í n t e s i s s e l e c t i v a üe una

o v a r i a s p r o t e í nas se c o n w e como c o n t r o l de l a expres ibn gene - - tics y ebte c o n t r o l puede e j e r c e r s e en uno o en todos l o s pasos

2.

sigue :

,...

,

...

...

.._

. , .

”..

..._

....

,...

I.

*. .

.~

...

... ~~

Una sección del DNA (gene) e s t ranscr i ta a una molécula de á c i -

do ribonucleico (REIA) por l a acción principal de l a FNA polime-

rasa. Esta molécula de RNA mensajero ( t ranscr i to primario) s u -

f re modificaciones que l a convierten en un t ranscr i to maduro,

l i s t o para transmitir l a informacidn genética que posee. Des-

pués de ser transportada fuera del ncicleo se acopla a l a maqui-

naria responsable de l a traducci6n de wnsa jes : l a estructura

ribosomal, que usando como adaptadores o acarreadores de amino-

ácidos pequeñas moléculas de RNA conocidas como BNA de transfe-

rencia, u t i l i z a l a secuencia de bases que posee e l mensaje como

código o templete para señalar cuál e s l a secuencia de amino-

ácidos que tendrá l a proteína sintetizada. Es ta nueva proteína

a l desprenderse del ribosoma, puede todavía sufr ir modificacio-

nes (glucos il acidn , hidról i s is de fragmentos, empaquetamiento,

e t c . ) antes de ser enteramnte funcional.

Los programas de regulaci6n de l a expresión genética están for-

mados por diferentes combinaciones de un conjunto de estrategias

básicas de regulaciSn, que operan a todos los niveles del proce-

samiento de l a información genética ( 2 ) .

La velocidad de s ín tes i s de una proteína especí f ica y l a veloci-

dad con que se degrada determinan l a cantidad de proteína pre-

sente en l a cé lula en un momento dado.

Una célula e s diferente de o t r a por l a batería de proteínas que

produce y de l a s queishace uso.

3.

animales l a r egu lac i ón i n t e r c e l u l a r se l l e v a a ca-

y humoral. En l a s p l an t a s l a r egu lac i ón re-

rcediante e l cual son transportados

a c é l u l a y de órgano a 6rgano.

I

,.

L . .

,.. ,

I .

..

c.

.., c ,

-. , r,

- .. , ....

.. ,

.. ,

. . ,

Las hormonas v e g e t a l e s o f i t o r r e gu l ado r e s t i enen aquí un pape l

predominante ( 3 ) . Como todas l a s hormonas, l os f i t o r r e g u l a d o r e s son también sus-

t anc i a s mensajeras, l a mayoría de l a s veces a c t i v a s , y de l a s

cua l e s se requieren muy pequeñas cantidades. Una misma hormona

puede i n f l u i r en procesos totalmente d i f e r e n t e s , é s t o e s un he-

cho que deben cons iderar t odas l a s h i p o t e s i s sobre e l mecanismo

de acci6n de l o s f i t o r r e g u l a d o r e s .

a n t r e l a s hormonas v e g e t a l e s se encuentra e l grupo de l o s d e r i -

vados d e l á c ido i ndo l a c é t i c o : l a hormona natura l 6 á c i do 3-in-

d o l a c é t i c o (P.E+) y una s e r i e importante de der ivados ' s i n t é t i c o s

como e l MCPP ( á c i d o 2-nieti1, 4-cior0, 2- fenoxipropibnico) o e l

NAA ( á c i do na f t a l enac é t i c o ) . Fueron descubier tos po r Xogl en 1 9 3 4 en l a o r i n a humana, luego

en microorganismos y f ina lmente en p l an t a s super iores . Debido

a su i n f l u enc i a en e l cremimiento de denominaron auxinas o sus-

t anc i a s de c r e c h i e n t o .

Algunas funciones d e l ATA son:

,

Crecimiento po r a largamiento de l a s c é l u l a s en l o s t e j i d o s .

Div is ionesr .ce lu lares en e l cambirroi.

D i v i s i one s c e l u l a r e s y formación de r a l c e s .

Dominancia ap i c a l .

Caída de l a ho ja y d e l fruto.

Partenocarp ia ( formaci6n de f r u t o s s i n copulac ión de gametos) .

4 :- ...

r. - A l t e r a c i ó n en a c t i v i d a d e s de c i e r t a s enzimas.

- En muchos sistemas, e n t r e o t r o s maíz, se observa que l a pre-

senc ia de auxinas exógenas en semi l l a s en germinación genera

l a formaci6n de una masa amorfa de cé lulas ind i f e r enc iadas

( c a l l o ) en v e z de dar lugar a una p ldn tu la normal ( 4 ) .

A n i v e l molecular l a s auxinas a l t e r a n e l patrón de p r o t e í nas

s i n t e t i z a d a s ( 5 ) y estimulan l a f o s f o r i l a c i ó n de p r o t e í nas (6).

La f o s f o r i l a c i ó n r e v e r s i b l e de p r o t e í nas es una p a r t e i n t e g r a l

d e l mecansimo r e g u l a t o r i o bá s i c o de todas l a s células eucarió-

t i c a s como l o es por ejemplo, l a r e gu l a c i ón enzimdtica po r a-

l o s t e r i smo ( 7 ) .

En l a s í n t e s i s de p ro t e ínas , más espec í f i camente en l a traduc-

c i ó n d e l mensaje, se ha d e s c r i t o un mecanismo de r egu lac i ón en

l a i n i c i a c i b n d e l proceso, e j e r c i d o por una m l é c u l a presente

en e l l i s a d o de re t icu loc i to de conejo: l a hemina.

En ausencia de hemina, l a s í n t e s i s de p r o t e l nas se de t i ene a-

bruptamente po r l a acc i ón i n h i b i t o r i a de una prote in-c inasa.

E l b lanco de esta c inasa es e l f a c t o r de i n i c i a c i ó n 2 ( e I f - 2 ) , 0

que f o s f o r i i a d o es incapáz de c o n s t i t u i r ( j u n t o con GTP, l a sub

unida6 ribosomal 40-S y tRNA in i c i ado& ) e l complejo t e r n a r i o de

i n i c i a c i ó n de l a s í n t e s i s .

A su ve z , l a c inasa que f o s f o r i l a e l eIF-2 existe en dos formas:

un es tado d e s f o s f o r i l a d o i n a c t i v o y un es tado f o s f o r i l a d o a c t i -

vo. La enzima responsable de e s t a f o s f o r i l a c i ó n es otra protein_

c inasa dependiente de cAiQ y c ons t i t u i da por 2 unidades regula-

t o r i a s (R) y 2 unidades ca ta l í t i cas ( C ) . E). compiejo R2C2 e s

d i s o c i ado por CAMP en 2 unidades ca ta l í t i camente a c t i v a s . L a

hemina bloquea l a d i s o c i a c i ón de R2C2 impidiendo que l a c inasa

I.

I. - ..

r

--

,.. .

.. I.

. ..

*. ,

9. -- que f o s f o r i l a a l eiF-2 se encuentre activa. Como consecuencia

de é s t o e s p o s i b l e l a formación d e l complejo de i n i c i a c i ó n ( 8 ) .

Por o t ra par te , e l hecho de que l a s p ro t e ínas ribosomales pue-

dan s u f r i r f o s f o r i l a c i ó n f u e descub ie r to en 1970 por Kabat y

Loeb ( 9 ) . Los primeros in t en tos para l o c a l i z a r l a po s i c i on de

e s t a f o s f o r i l a c i ó n asro jaron como resul tado c a s i e x c lu s i v o a S6

como l a p ro t e ína f o s f o r i l a d a ( 9 ) . En g e l e s bidimensionales se

han podido observar hasta 5 (10) 6 6 ( 9 ) formas de S6, que pro-

bablemente t i enen cant idades c r e c i e n t e s de res iduos f o s f o r i l a -

dos.

En e s tud ios p o s t e r i o r e s se encontraron o t r a s p r o t e í nas ribosoma-

l e s f o s f o r i l a d a s : S2, S3, S16, L6 y L14 ( 1 0 ) . Este fenómeno se

ha confirmado en d i v e r s o s sistemas como hígado de ra ta , l i s a d o

CZe r e t i c u l o c i d o de cone jo , c é l u l a s Hela, hígado en regeneración,

A s c i t e s , Lemna einor, tomate y Tet-hymena p y r i f o r m i s ( 9 ) .

Una gran var i edad de es t ímulos a f ec tan e l es tado f o s f o r i l a d o de

S6: hormonas, c-, i n f e c c i one s v i r a l e s , cambio en l a s condic io-

nes de c u l t i v o ( 9 ) e s t r e s . por c a l o r (10) y o t r os . De nanera

concomitante se ha observado aumento en l a s í n t e s i s de p ro t e ínas

cuando hay f o s f o r i l a c i ó n múl t ip l e de S6 (11).

S i n embargo no hay seguridad de que cada est ímulo se traduzca

en f o s f o r i l a c i b n en e l mismo s i t i o de S6 o l a misma combinación

de s i t i o s :

Hay 1 5 res iduos de ser ina en l a p r o t e í na y parece que más de 6

son f o s f o r i l a b l e s . No necesar ia rente se f o s f o r i l a n l a s mismas

6 ser inas .

Así, l a f o s f o r i l a c i ó n en cada uno de e s t o s s i t i o s po t enc i a l e s o

en cada combinación p o s i b l e de s i t i o s , puede provocar d i f e r e n t e s

cambios en l a función ribosomal.

6 , -

Para r e f o r z a r l a idea de que l a f o s f o r i l a c i ó n de p r o t e í nas r i bo -

somales puede a l t e r a r l a función del ribosoma, mencionaré l o s

s i gu i en t e s datos:

- Mutantes bacterjlanos con a l t e r a c i o n e s e s t ruc tu ra l e s en l a s

p r o t e í nas r ibosomales presentan d i f e r e n c i a s en l a v e l o c idad

de s í n t e s i s , l e c tu ra de prueba (proo freading ) , y / o f r e cuenc ia

de error en l a traducción, r e spe c t o a l a s observadas en e l ti-

p o silvestre (12).

- Sustancias que se sabe interactt ian con e l ribosoma como ant i -

b i ó t i c o ~ (12 , 13 ) o pol iaminas (14) a l t e r a n l a v e l o c i dad y / o

l a e x a c t i t u d de la s í n t e s i s .

Por los datos a n t e r i o r e s e s p o s i b l e sugerir que l a función r ibo-

somal puede ser un mecanismo r e g u l b t o r i o de l a expresión gené t i -

ca en l a s c é lu l a s , y en e s p e c i a l l a f o s f o r i l a c i ó n de p r o t e í nas

r ibosomales puede c o n s t i t u i r un mecanismo f i n o de c o n t r o l de l a

tr a ducc ión . OBJETIVOS

1. Obtener l o s patrones electroforéticos en segunda dimensión

de i l a s p r o t e í nas r i b o s o m l e s de e jes embrionarios de maíz y

a n a l i z a e l efecto causado en e l l a s po r l a acc ión de auxinas.

2. Obtener ribosomas func i ona l e s de maíz para l l e v a r a cabo s ín-

tesis i n v itro de p ro t e ínas . Demostrar que e l sistema es de-

pendiente de :

a ) mRNA ex6geno y b) ribosomas de maíz.

ME TODOL OG Ui

I. Mate r i a l e s :

a ) Reac t i vos . Todos l o s r e a c t i v o s u t i l i z a d o s (grado r e a c t i -

vo a n a l í t i c o ) procede de l a s compañías, t é cn i c a química,

Merck, Sigma y Pharmacia.

..

r'

...

c.

*,."

- .

,. .

,.. .

7,-

b ) Equipo: Campana de f lu jo laminar Clean Bench H i t a ch i , cen-

t r í f u g a J2-21 de Beckman, u l t r a c en t r í f u ga in t e rnac i ona l

,Z$K o Beckman TL-100. Equipo para e l e c t r o f o r e s i s en t u g

JSCG m d e l o 150A, equipo para e l e c t r o f o r e s i s en p l a ca JSCG

m d e l o 220, fuen te de poder JSCG modelo 490. Espectro fo tó-

metro Pye UNICAM SPG-550 uv/vis, l i o f i l i z a d o r a Labconco-3.

r c ) Ma t e r i a l b i o l ó g i c o . s e r i i l l a s de maiz (Zea mays L.) va r i e -

dad chalqueño de PRONASE, Y f x i c o .

Conejos Nva. Zelanda de 2 a 4 kq de peso, obtenidos d e l

Bioterio de a l Facul tad de Química.

11. Métodos.

a ) Preparac ien d e l material biolbgico: LOS ejes embrionarios

se d i sec tan manualmente con navaja de b i s t u r l , se almace-

nan hasta su uso en frascos de v i d r i o tapados y s e l l a d o s

con pape l pa ra f i lm , para e v i t a r l e s e l con tac to con l a hu-

medad ambiental.

b) Incubacibn: Los e j e s embrionarios de maíz se siembran en

condic iones de e s t e r i l i d a d en f r a s co s qe rbe r con 5 ml de

medio Muraghige and Skooq ( 16 ) al que se ha adic ionado ( s i

e s e l caso) 5 mq/lt de medio de AIA o K P P durante su pre-

paración.

Brevemente: los ejes se e s t e r i l i z a n super f ic ia lmente por

con tac to con e tanol a l 70% durante 30 ;sBg&VlÜQs. Después

de en juagar l os con agua e s t é r i l , se agrega solución de h i -

p o c l o r i t o de c a l c i o a l 5%, so luc ión en l a que permanecen

l o s e j e s po r 1 0 minutos con a g i t a c i o n e s ocas ionales . Se

lavan con agua estér i l v a r i a s veces y se co locan en e l me-

¿ io de incubacibn correspondiente. Todo l o a n t e r i o r , s e

..‘ .

5.- , .

r e a l i z a en l a campana de f l u j o laminar y con ma t e r i a l es-

t é r i l . E l f r a s c o qe rbe r se m n t i e n e a 25OG y en oscuridad

por 24 horas (t iempo de incubation).

c) Obtención de p r o t e l nas r ibosomales para patrones electro-

foréticos (6 , 1 0 ) .

Los ejees embrionarios incubados po r 24 horas en medio

c o n t r o l ( s i n auxinas) o con auxinas (MCPP 6 Ai&) se reti-

ran d e l medio y se enjuagan con aqua e s t é r i l .

Originalmente se siembran 0 .7 q de e jes l o s cua l e s a l f i -

n a l d e l p e r i odo de incubacidn muestran un peso aproximado

de 2.5 q . Se congelan con n i t r ógeno l í q u i d o y se procede

a l a m l i e n d a : en un mortero de porcelana se pu l v e r i z an

con arena de mar y más N2 l l g u i d o , poster iormente se homo-

qenizan con 7 ml de buffer de extraction (Tr i s -HC1 2 0 mM

pII 7.8, NaC125mM, KC1 20 MM,

NaF lmK, PMSF (fluoruro de metii, s u l f o n i l f o s f a t o ) 1mK O,i5%

de p-mercaptoetanol, 1% de t r i t b m X-100 y sacarosa 0.25K).

E l homoqenado se f i l b r a a t r a v é s de 4 capas de gasa y se

c en t r i f uqa a 29000 xq po r 1 0 minutos. E l sobrenadante se

f i l t r a a t r a v é s de pape l m i rac l o th y se c en t r i fuqa nueva-

mente a 29000 xg po r 10 minutos. E l sobrenadante se colo-

ca cuidadosamente sobre 3 m i de colch6n de sacarosa 1.2 M

en KC1 0.5 M y se cen t r i fuqa 3.5 horas a 200 O00 xq. La

p a s t i l l a obtenida se resuspende en loop1 de buf fer de re-

suspensión (Hepps-KOH 20 mM y p r c a p t o e t a n o l 6 mM) con l a

ayuda de una p i p e t a Pasteur de punta cerrada.

Se toma una a l i c u o t a de 5 p1 para determinar su absorban-

c i a a 260 nm y as1 obtener e l rendimiento d e l proceso (a-

proximadamente 30 D0/0.7 q e j e s ) . A l r e s t o de l a p a s t i l l a

9..-

r:Lbosomal se añaden 0.1 volúmenes de a c e t a t o de magnesio

1 M y 2 volúmenes de á c i do a c é t i c o g l a c i a l . Se a g i t a 3

minutos y se d e j a p r e c i p i t ando una hora en h i e l o . Con es-

t e procedimiento se l o g r a l a p r e c i p i t a c i 6 n d e l RNA r iboso-

mal. Después se c e n t r i f u g a 10 minutos a 10000 xy. E l

sobrenadante se d i a l i z a 3 v e c e s (1.5 horas cada una) con-

t r a á c i do acético 0.5 M. Se l i o f i l i e a y se almacena a

-70 OC.

di)! Geles bidimensionales. Se r e a l i z a s iguiendo e l sistema

ác i do de l a t é cn i c a de Vadjar et a l ( 1 7 ) .

Soluciones para l a . dimensi6n.

b u f f e r super ior : 0 . 0 1 M b i s - t r i s ác ido a c é t i c o pH 3.8

b u f f e r i n f e r i o r : 0.01 M b i s - t r i s ác ido acético pH 6

b u f f e r de l a muestra: 0 .01 M b i s - t r i s á c i d o acético pH 4.2

con 8 K de urea y pmercaptoetanol a l 1% Y/v

g e l de separación: 4 % p/v acrylamida, met i lb isacry lamida

a l 0.066%, EM de urea, bis-tris.

La po l im ' r i z a c i 6n se r e a l i z a con 5 p1 de TEMED y 2 0 p l d e

p e r s u l f a t o de amonio ( A P S ) a l 40% pos cada 5 ml de g e l .

Soluciones para 2a. dimensi6n.

b u f f e r super ior : 0.05 N bis-tr is-VaS ( ác ido 2 [-N-morpho-

l i n l e tano su l fSn i co ) , pH 6.5, duodec i l su l f a t o de sod i o

SDS) a l 0 .2% ác ido l i o f l i c ó l i c o o d i t i o t r e i t o l a l 0 .02%.

b u f f e r i n f e r i o r : 0.02 M b i s - t r i s - a c é t i c o pii 6.75.

gel de separaci6n: 12.5% de acrylamida, met i lb isacry lamida

a l 0.25% p/v, 6 Ni urea, 0 .1 M b i s - t r i s - á c i do acético 0. lK

pH 6.15.

La po l imer i zac i6n se r e a l i z a con 5 ~ 1 TE-@ y 40 pl de RPS

. ..

,. , .

...

..

.

..

.

10.-

a l 40% p o r c a d a 2 1 m l de g e b . ,

g e l a p i l a d o r : 4% p/ir de a c r y l a m i d a , 0.066% p/v m e t i l b i s a -

c r y l a m i d a , u r e a 6M, SDS a l 0.2%, b i s - t r i s - á c i d o acét ico

0.04M, pII 6.

La p o l i m e r i z a c i 6 n se da con 2 5 pl APS a l 40% y 5 pl de

TEMED p o r cada 15 m l de g e l .

b u f f e r de d i á l i s i s p a r a geles de l a l a D : 0.04 M b i s - t r i s -

á c i d o acético pH 6 . Urea 6M y 1% de SDS.

PROCEDIMIENTO

L a s p r o t e í n a s ribosomales l i o f i l i z a d a s se resuspenden en b u f f e r

de l a muestra ,habiendo r e a l i z a d o p r e v i a r e n t e e l a n á l i s i s de can-

t i d a d de p r o t e í n a p r e s e n t e p o r e l & t o d o d e Lowry.

n e r a se resuspenden e n e l volumen de b u f f e r n e c e s a r i o p a r a ob-

t e n e r 1 a 2 pg de cada p r o t e í n a r i b o s o m a l e s p e r a d a p o r c a d a 3 0

pl de s o l u c i 6 n (70-140 pg/30)11) .

E l g e l de s e p a r a c i 6 n se d e a i r e a al vacío p o r 5 minutos a n t e s de

i n i c i a r l a p o l i m e r i z a c i b n con TEMED. Una vez iniciada se vacía

rápidamente a t u b o s de v i d r i o de 1 3 c m de l o n g i t u d y 3 mm de d i a -

metro i n t e r n o . E l t u b o se l l e n a h a s t a l c m antes d e l t o p e supe-

r i o r . Una vez g e l i f i c a d o se monta e n e l a p a r a t o y se pone l a

muestra (en un volumen no mayor de 30 p i ) mezclada con pyronina,

c o l o r a n t e que servirá de f r e n t e i6nico.

La l a . dimensión se corre con p o l a r i d a d i n v e r t i d a ( h a c i a e l cá-

todo) a 150 v durante 5 h o r a s . Conc lu ida l a c o r r i d a se saca e l

g e l y se coloca 2 0 minutos e n b u f f e r d e d i b l i s i s . S i es n e c e s a -

r i o , se c o n g e l a y mantiene a -2OOC h a s t a su u s o .

Una vez montado e l a p a r a t o de 2a.cIdimensibn se coloca e l g e l de

l a . dimension h o r i z o n t a l m n t e ( con e l p r i n c i p i o d e l l a d o i z q u i e r -

De e s t a ma-

11.- ' ' .

,..

...

I

de l a p laca de 2a. dimension) y se s e l l a con agarosa a l 1%, a

l a que se l e mezcla azu l de bromofenol como f r e n t e i ón i co . Se

corre con c o r r i e n t e constante ( 5 watts/placa) con po la r idad nor-

m a l (hac ia e l ánodo) durante 5 horas.

LOS g e l e s se t i ñ e n 1 hora en a z u l de Coomassie ( b r i l l a n t blue

a l 0.2%, e n 50% de metano1 y 7% de á c i do a c é t i c o ) . P o s t e r i o r -

mente se pasan a so luc ibn des teñ idora ( a c é t i c o g l a c i a l a l 7 % )

y se cambia esta so luc i6n constantemente hasta que e l g e l queda

tota lmente desteñido .

e) Obtenci6n d e l l i s a d o de reticulocito de conejo. Se s i g u i 6

l a s i gu i en t e t écn ica (Jackson y Hunt, r e f e r e n c i a ( 8 ) ) breve-

mnte.

Inducci6n de anemia en l os cone jos : Inyecci6n subcutánea de

f e n i l h i d r a z i n a a l 1.25% de acuerdo a l siguiente esquema:

ler d l a - 2 ml

2 0 d í a - 1.6 m l

3er d í a - 1.2 m l

40 d ía - 1.6 ml

50 d í a - 2 m l

8 0 d ía - sangrado

Obtenci6n d e l l i s ado . E l sangrado se hace por punción card la-

ca obteniendo de 25 a 30 m l de sangre po r cone jo . La sangre

se pasa a un matraz de 125 m l con 0.1 m l de ác ido e t i l en dia-

m ino t e t raacé t i co (EDTA) a l 10% pH 7 por cada 5 ml de sangre.

Posteriormente se f i l t r a a 2 tubos corex a t r a v é s de pape l

mi rac lo th y se cen t r i fuga 10 minutos a 2000 xg ( 4 O C ) : E l so-

brenadante se e l im ina con una p i p e t a Pasteur y a cada tubo se

agregan 10 m l de solución sa l ina fresca: 0.134 M NaC1, 5 WI

KC1, 7.5 mM Mg ( A c O ) ~ , 5 mM D-glucosa, 10 mM Hepes pH 7.2 y

.. " ,

1Ei 0

se resuspende g e n t i l p e r o to ta lmente . Se c en t r i f u ga a 2000

xg durante 10 ' . Este proceso de lavado se r e p i t e 3 veces y

l a úl.tima centr i fugada se hace a 5000 xq por 15 minutos. Se

qu i t a per fectamente e l sobrenadante, se estima e l volumen d e l

paquete c e l u l a r y se agrega un volumen i g u a l de agua e s t é r i l

f r í a . Se mezcla suavemente un minuto y se c e n t r i f u g a a 15000

xg 30 minutos (a 2OC). E l sobrenadante se f i l t r a a t r a v é s de

maya de nylon estér i l y se d i v i d e en a l i c u o t a s pequeñas, con-

gelándose inmediatamente en N2 l í qu i do . Se almacena a - 7 O O C .

f ) Tratamiento d e l l i s a d o para e l im inar e l mensaje ( 18 ) . Para

10 ml d e l l i s a d o se agregan 0.2 m l de hemina 5 mM, 0.1 ml

de c r ea t i na dnasa (5mg/ml) 0 . 1 ml CaC12 0.1 M, 0 . 1 m l de nu-

c l e a s a microcoaal (15000 unidades/ml) . Se mezcla p e r f e c t a -

mente y se incuba a 2OoC po r 17 minutos. La d i g e s t i ó n se &-

t i e n e con 0 .1 m l de EGTA 0.2 M. ?oster iormente se añaden

60 )11 detRNA (de germen de t r i go ) 1 0 mg/ml.

9) Centr i fugac ibn d e l l i s a d o para e l im ina r l o s ribosomas endó-

tenos. La cant idad de l i s a d o gue se u s a r á se c en t r i f u ga po r

20 minutos a 550 O00 xg (2OC). El sobrenadante se separa y

se conge la inmediatamente o se procede a complementar para

su uso inmediato.

h) Conplementado d e l l i s a d o . Para 1 m l de l i s a d o : ( 1 8 )

66 111 de so luc ión KP! (2M KC1 + 1 0 mM MgC12)

66 pi de ATP 50 mM, 6 6 pl de c r ea t i na f o s f a t o 0 .2 M.

25 pl de mezcla de aminoácidos (2 mM de c/u de los 20 aa),

20 p1 de hemina 5 mM y 1 0 pl de c r ea t i na c inasa ( 5 mg/ml ) .

i) S í n t e s i s de p ro t e ínas . A 18 pl de l i s a d o complementado se

añaden: mensaje ( p o l y U 10 pg/l& u1 l i s a d o ) y ribosomas

( 0 .7 DO). La r eacc i ón se arranca con I4C-Fen 1,111 (500 u C i

5ml) y e n este momento se tom una a l i c u o t a de (tjempo

O ) que se c o l o c a en un tubo que con t i ene 0.5 ml de so luc ión

1M de NaOii con 5% u/v de H202 a l 30% f o r r ado con pape l a lu-

minio para mantenerlo en oscuridad.

5 pl

E l resto de l a mezcla de r eacc i ón se coloca a 3OoC y de é l

se toman a l i c u o t a s cada 15 minutos para s e gu i r e l curso de

l a s í n t e s i s . Una v e z tomadas todas l a s a l i c u o t a s , l o s tubos

en l o s que se detuvo l a reacc ibn (Na0H-H2O2) se pasan a un

baño a 37'C durante i0 minutos . Se sacan y se ponen en h ie-

l o donde se l es agregan 2 m l de so luc ión de á c i do t r i c l o r o -

a c é t i c o (TCA) a l 25% con 2 % de h i d r o l i z a d o pancrea t i co de ca-

se ina. Se a g i t an y se mantienen en h i e l o 45 minutos.

Poster iormente, e l contenido se f i l t r a a través de f i l t r o s

m i l l i p o r e de 0.45 um 6 y se lavan 2 v e c e s con TCA a l 8%.

E l 'prec ip i tado r e t e n i d o con l a membrana se seca y se coloca

en v i a l e s con 5 ml de l í q u i d o de c e n t e l l e o y s e procede a

contar . Así se determina l a r a d i a c t i v i d a d incorporada en po-

l ipép t idos.

Es muy importante que todo e l material que se use para l a sín-

tes is esté e s t e r i l i z a d o para e v i t a r l a presenc ia de nucleasas.

La complementaci6n de l a mezcla de r eacc i ón antes de arrancar,

se hace en h i e l o para evitar e l ráp ido decaimiento de l a ac-

t i v i d a d d e l l i s a d o .

jr Obtenci6n de ribosomas funcionales de mfz ( 1 9 ) . Los e jes

incubados 24horas con o s i n auxinas, se retiran d e l medio,se

enjuagan y se congelan en N2 l í q u i d o para l a molienda.

honwgenizan con 7 m l de buf fer de e x t r a c c i ón (200 mM t r i s - H C 1

pH 8.5, 200 mM sacarosa, 50 mM MgC12, 60 m c l Y 5 mM diti?o*

Se

. .

. ., I .

.-

" .

treitol) . E l homogenizado se f i l t r a a t r a v é s de 4 capas de ga-

sa y s e c en t r i f u ga 10 minutos a 29000 xg . E l sobrenadante se

f i l t r a por pape l mirac lo th y se vue lve a c en t r i f u ga r 1 0 minutos

a 29000 xg . E l sobrenadante se c o l o ca sobre 4 ml de colch6n de

sacarosa 1.75 M en 40 mM t r i s HC1 pH 8.5 , 1 0 mM MgC12, y 20 mM

KC1. Se c en t r i f u ga 2 horas a 240000 xg.

La p a s t i l l a se resuspende en 20 mM Hepes KOH (pH 7 .6 ) que con-

t i e n e 5 mM de a c e t a t o demagnesio, 125 mN de a c e t a t o de p o t a s i o

y 6 mM de (3mercaptoetanol.

medir absorbancia d 260 n m y ca l cu l a r DO obtenidas (aprox 2 0 DO/

0.7 g ejes ) .

De aqu í se tom una a l i c u o t a para

\

-- I

I)

. .,.

. ,s

.-

. I

. *

,, ..

- I .

15.-

RE SULTACOS

Las p r o t e i n a s r ibosomales de te j idos estimulados o no con au-

x inas fueron ana l i zadas p o r e l e c t r o f o r e s i s en g e l e s bidimen-

s i ona l e s . Para ohtener l o s g e l e s cuyas f o t o g r a f í a s se mues-

t r an en e s t e t r aba j o , f u e necesa r i o hacer l a s s i gu i en t e s mo-

d i f i c a c i o n e s a l a t é cn i ca o r i g i n a l :

-Aumentar l o s tiempos de c o r r i da para ambas dimensiones hasta

completar 7 horas para 1s dimension y 6% para l a 2s.

-Aumentar l a cant idad de muestra para cada g e l . Las f o t o s son

de g e l e s con aproximadamente 300 pg de p r o t e i n a s t o t a l e s . Lp I.

t é cn i c a sug i e r e de 1 a 2pg p o r cada p r o t e i na esperada l o cual

hubiera representado e n t r e 70 y 1 4 0 pg de p r o t e i nas ribosoma-

l es t o t a l e s .

Probar v a r i a s marcas y l o t e s de urea, y a que no todas permi-

t en l a c o r r e c t a po i imer i zac i ón del gel . Finalmente se u t i -

l i z ó urea Ferck, grado e l e c t r o f o r e s i s .

De manera g ene ra l es p o s i b l e Cec i r que se logró un buen grado

de r e so luc i ón en l a separación de l a s p r o t e í nas ribosomales,

se observan a l rededor de 70 manchas (F iguras 2, 3 y 4 ) l o

cua l co inc ide con l o esperado para ribosomas de eucariotes

( 9 ) .

La F i gura 1 muestra e l patrón hidimensional de l a s p r o t e í nas

r ibosomales de e j es embrionarios de maSz sin imbibir. A di -

f e r e n c i a de l os demás, este g e l se cargd únicamente con 200

pg de p r o t e i nas . En e l g e l 6e ribosomas 6e e j e s secos, es

c l a r o que aparecen un menor número de marchas (aproximadamen-

te 30 ) que en p a r t e podrá Üeberse a que e l g e l e s t á menos

cargado de p r o t e í na y algunas cie e l l a s no fueron tan v i s i b l e s . ,

FIGURA 1: proteínas ribosomales de ejes embrionarios sin imbibir.

' (+I * (-1

..

- . . . . . . . . . ............ F A i.. -..I-I.-.._._. c D E I_.__

~~ . . . . . . . . . . ............. i l

............. ,.._..I_ ..................... 1_" .. -.I,. _. ~ .. . . ........ ...............

FIGURA 2:proteFnas ribosomales de ejes embrionarios imbibidos 24 hrs. en medio control (sin auxinas).

(+I + (-> - . ~~~ . . . . . . ~ . . . . . ~ . _ _ _ . ~ _ ~ _ _ ...... ~ ...............

-. r: %..~

. ~ ...............

.... ........................ . . . , . . .. __I._

Sin embargo, manchas como l a s ubicadas en E-3, E-4, C - 4 , C - 5

y B-5 de l a f i g u r a 2 , no se observan o c a s i totalmente desa-

parecen d e l g e l en l a f i g u r a 1. A pesar de e l l o , es p o s i b l e

pensar que e l cambio en patrones &e e j e s secos vs. e l d e l con-

t ro l de e j e s germinados en 2 4 horas e s r e a l , pues algunas man-

chas que en e l c o n t r o l t i en en intens idades comparables e n t r e

s í , no aparecen en e l e je seco f j g u r a 1. Ejemplos de este ca-

so, son l a s p r o t e í nas que se 1.ocalizan en B - 2 , €3-3 y D-4.

I .

Las f o t o g r a f í a s de l a s f i g u r a s 2, 3 y 4 muestran experimentos

r e a l i z a d o s simultáneamente ba j o exactamente las irismas condi-

c i ones exper imentales, con cargas <e pro t e ína muy semejantes,

po r l o que l a s comparaciones que e n t r e e l l os se hagan, son aGn

más con f i ab l e s .

La primera d i f e r e n c i a importante e n t r e e s t o s t r e s patrones, se

mani f ies ta e n t r e l a s manchas l o c a l i z a d a s en e l cuadrante C - l .

En l a f i g u r a 3 ( A m ) se muestran dos manchas perfectamente bien

de f in idas de l a s cua l e s l a de mayor peso molecular ( a r r i b a ) , a

l a que llamaremos I, ~ n i g r 6 hor izontalmente una d i s t anc i a menor

que l a de peso molecular más ba j o ( a b a j o ) . Esta mancha se en-

cuentra en l a s f i g u r a s 2 y 4 como un ba r r i d o ho r i z on t a l , s in cam-

b i o en su movimiento v e r t i c a l , en r e l a c i ó n a l a pos i c i6n que

muestra en la f i p r a 3.

Otras d i f e r e n c i a s se l o c a l i z a n e n t r e l o s cuadrantes C - 2 y C - 3

de l a f i g u r a 3 ( A m ) encontramos una mancha (a l a que llamaremos

11) rodeada c a s i to ta lmente por o t r a s p ro t e ínas , A pesar de es-

t a r per fectamente d e f i n i da en e s t e g e l , en l os g e l e s de l a s f i -

guras 2 ( c on t r o l ) y 4 (bKlPP) no se encuentra. Es p o s i b l e que

su carga haya cambiado y -migrado más hac ia l a derecha, donde

FIGURA 3

t. ~ ~ . . -I .--_l___-l.l___l.l_-_,.._ II I __I_ ,,.. , ... .. .I"~ ,

FIGURA 4: proteínas ribosomales de ejes embrionarios imbibidos 24 hrs. en medio con una áuxina sintética (MCPP).

(-1 .. ~~.~~

~ ~~ ~ ~. ~~.

(+) - :q-r

19.-

quedaría enmascarada po r l a s p r o t e í nas vec inas , o que d e f i n i -

t ivamente sea una p r o t e í na que únicamente aparece a i t r a t a r

l o s e j e s con AIA.

Otra p r o t e í na a l a que llamaremos 111, e s t á claremente ubicada

en l a p a r t e super ior derecha d e l cuadrante C-4 de l a f i g u r a 3

(AIA). Sin embargo, en l a s f i g u r a s 2 ( c on t r o l ) y 4 (MCPP) no

aparece a s í . Es p o s i b l e ver un l i g e r o ba r r i d o más hac ia l a de-

recha en l a f i g u r a 2 y nada en l a f i gu ra 4 . Nuevamente, o cam-

b i 6 su carga o simplemente no aparece en l o s g e l e s 2 y 4 . Hay

o t r a s p r o t e í nas que aunque no desaparecen d e l todo, se presen-

tan en cant idades v i s i b l emente d i f e r e n t e s : p o r e jemplo l a man-

cha l o c a l i z a s a en F-4 ( a l a que asignaremos e l número IV), en

l a f i g u r a 4 (MCPP) es mucho mayor que su correspondiente en l a

f i gu ra 3 (AIA) y es tan solo un l i g e r o ba r r ido en l a f i g u r a 2

( c o n t r o l ) como puede verse en e l cuadrante F - 5 . Kien t ras que

l a s manchas que e s tán a su i zqu i e rda (V) se presentan muy inten-

sas en l a s f i g u r a s 2 y 3 y muy tenues en l a f i g u r a 4 . (Zona in-

fer ior derecha de l cuadrante E - 4 ) .

La p r o t e í na más conspicua de E-5 en l a f i gu ra 4 (MCPP) (asigna-

da con e l nGmero VI) parece disminuir en l a f i g u r a 3 (AIA) y ca-

s i desaparece en l a f i g u r a 2 ( c o n t r o l ) .

Hay dos p r o t e í n a s que son muy c l a r a s en l a f i g u r a 2 , que corres-

ponde a l c o n t r o l s i n auxinas y que s i n embargo se presentan en

mucho menor cant idad en l o s otros g e l e s estimulados po r auxinas.

Estas son l a p r o t e í na VI1 (B-5) y l a VI11 ( pa r t e baja de E-5).

Otras manchas como l a s l o c a l i z a d a s en l a p a r t e baja de C-5 de

l a f i g u r a 2 son tan tenues que aunque no se preseptan en o t r a s

f i g u r a s (ver f i g u r a 4 ) no es p o s i b l e a f i rmar s i desaparecen o - 5

20. - simplemente no f u e p o s i b l e l o c a l i z a r l a s . Otros ejemplos de

e s t e caso e s tán en B-1, E-1, 2 y po r su menor r e so luc i ón en

C-5 de l a f i g u r a 2.

SINTECIS DE PROTEINAS

Preparaci6n d e l l i s a d o de ret iculoci to de cone jo . Se prepa-

raron l i s a d o s de cua t ro cone j os d i f e r e n t e s . En algunos casos

se s i guó a l p i e de l a l e t r a e l esquema de inyecc iones de fe-

n i l h i d r a z i na para l a anemización d e l conejo. S in embargo, en

o t r o s casos l a s inyecc iones se d i s t r i buye ron en solo t r e s d í a s

con e l f í n de p e r m i t i r l a metabol izaci6n t o ta l de l a f e n i l h i -

dracina en los c i n c o d í a s an t es d e l sangrado, pues se cree que

restos de e l l a pueden ser i n h i b i t o s i o s de l a s í n t e s i s de pro-

t e í n a s ( 18 ) .

Los conejos que se usaron fueron de d i f e r e n t e s pesos y edades,

únicamente machos. La f i g u r a 5 muestra en su p i e l a s carac-

t e r í s t i c a s de cada caso. Para cada uno de los l i s a d o s se h i z o

una prueba de a c t i v i d a d enddgena ( e s d e c i r , t r aduc i r mensajes

p r op i o s con ribosomas p rop i os ) con e l f l n de observar l a "ca-

l i d a d " d e l l i s a d o obtenido.

A d i f e r e n c i a de los otros experimentos, aquí se us6 como marca

r a d i a c t i v a mezcla de aminoácidos I 4 C (aa I 4 C ) .

Es c l a r a l a v a r i a c i ón de l a c a l i d a d d e l l i s a d o de un c one j o a

0tr6. E l c one j o 3, que es e l mejor, presenta una a c t i v i d a d de

apenas e l 30% r e spe c t o a l o esperado en e l l i s a d o comercial

(Amersham). No f u e p o s i b l e encontrar r e l a c i ó n e n t r e l a edad

d e l cone j o y l a a c t i v i d a d d e l l i s a d o o inc luso e n t r e e l s i s t e -

ma de inyecc iones y d icha a c t i v i d a d , Además en algunos casos

e l conejo se recuperaba v is ib lemente antes d e l sangrado, t an t o

. .

. .

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m m E 0. o

bWO

2 1 . -

Figura 5.

Conejo 1 2

3 4

en minutos

Prueba de l a a c t i v i d a d end6gena de l i s a d o s de 4 d i f e r e n t e s cone j os . de:marca r ad i oa c t i v a (en forma de mezcla de aa C) a l mate r i a l p r e c i p i t a b l e , Las g r d f icas correspon- den a 240s datos de l a s i gu i en t e t ab l a :

sangrado después de

inyecc ión de f e n i l - h id raz ina . Sangrado 3 d í a s des- pués de l a úl t ima in- yecci6n de f e n i l - h id raz ina .

Se midi6 como incorporaciqq

SImbOlO edad t ratamiento

5 d í a s de l a úl t ima &

S A

O

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..X

que no mostraba s i gnos de anemia.

En cua lqu i e r caso, los l i s a d o s aGn con b a j a a c t i v i á ad , mostra-

ron l i n e a r i d a d con t ra tiempo bastante aceptable en l a incorpo-

r a c i ón de aa-I4C ( f i g u r a 5 ) .

Po r datos de l i t e r a t u r a (6) sabemos que l os requerimientos de

hemina son muy e s p e c í f i c o s : concentraciones mayores o nenores

d e l bptimo provocan una ca ida no tab l e de l a a.ct ividad de t r a -

duccibn. Así en l a f i g u r a 6 se muestran l a s a c t i v i d a d e s endo-

genas de l o s l i s a d o s 3 y 4 a dos concentraciones d i f e r e n t e s de

hemina exi5gena: 20 p m y 40 pm.

Para cada l i s a d o r e s u l t 6 c i i f e rente el requerimiento de hemina

exdgena, conf irr.ando claramente que l a s cant iüades endogenas

de e s t a f a c t o r en cada cone j o puede v a r i a r enormemente. Para

experimentos p o s t e r i o r e s , se us6 l i s a d o nfimero 3 con hemina

4 0 pm.

Poster iormente se probo l a e f i c i e n c i a d e l tratamiento con nu-

c l e a s a para d e s t r u i r e l r ensa j e endegeno, sust i tuyéndolo po r

un mensaje s inhd t i co @oli-U).

f i gura 7, se l o g r a l a e l iminac ibn en e l l i s a d o d e l mensaje:

con e l po l i -U se recupera e l 50% de l a a c t i v i d a d o r i g i n a l , mos

trando saturación d e l sistema y una l i n e r a r i d a d muy buena du-

r en t e l os pr imeros 30 minutos. Hay que r e s a l t a r v e e s t a a c t i -

v idad aún e s con ribosomas del. l i s a e o , y que se midi6 por in-

corporación de feni lananina I 4 C , l a cual t e n í a aproximadamente

l a misma r a d i a c t i v i d a d e s p e c l f i c a que l a mezcla de aminoácidos

r ad i a c t i v o s .

En l a f i g u r a 8, se muestran Los r esu l t ados d e l experimento que

se h i z o pa ra probar que l a centr i fugac ibn d e l l i s a d o e l im ina

De acuerdo a l o mostrado en l a

23.-

m U O Y o

m .- - P) o - 3

v, \ rJ d w

I m m

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. .1

.- I I.

._

.* I ..

..<.

20 40 bi@mps en minutos.

F i g u r a 6 . Prueba de i n c o r p o r a c i 6 n endógena con lisados 3 y 4 a dos c o n c e n t r a c i o n e s diferentes üe hemina: hemina 40 p m y 2 0 pm. ( 0 ) l i s a d o 3 , ( O ) 'li- sad0 4 . Las l í n e a s punteadas corresponden a hemi- na 2 0 pm y las c o n t i n u a s a hemina 4 0 pm.

24. -

E P U

r-.

. .

* - - h

28 4aJ 66 tienipo en minutos.

Figura 7 . Al l isado se l e t r a t ó con nucleasa micrococal t a l como se señala en l a netodología, se agregaron 10

p g de poly U a cada 18 pl de lisado. No se deple- t 6 de reibosomas. La l ínea de símbolos l lenos ( O ) es e l control s i n poly U. Los ( e > ) corresponden a l a grá f i ca de l a actividad del l isado a l que se agregó poly U .

. E Q O

-

2 5 . -

\*ns'o .j e s i fi ' P ibosomas de ma í z. /" I-

F i g u r a 8 . Aquí se probo l a eficacia de l a c e n t r i f u g a c i 6 n i l p a - ra e l i m i n a r los r ibosomas endógenos. Los t r a t a m i e n - t o s e s t á n i n d i c a d o s e n l a g r á f i c a . E l ' l i d qua centrifugado como se indica en l a metodología.

U& f w h b i & w . R u o I ~ ~ s < ~ y

. ,. . , ..

.

..

I .

...

....

..I.

26. - a l o s ribosomas, y l a func i ona l i daó de l o s ribosomas de maíz

en e l sistema heterúlogo . La a c t i v i d a d d e l l i s a d o s i n r i b o -

somas ies desprec i ab l e , s im i l a r a l a d e l l i s a d o con ribosomas

d e l c o n t r o l a l que no se ha agregado mensaje.

E l l i s a d o a l que se agregó ribosornas de maíz y mensaje, a l -

canza una a c t i v i d a d del 60% en r e l a c i 6n a l l i s a d o con riboso-

mas homólogos (loo%), con a l t a incorporac ión y l i n e a r i d a d &u-

r an t e 4 0 minutos.

D I SCU SION

En l a l i t e r a t u r e encontramos pocos t r aba j o s cpe contengan pa-

t r ones de p r o t e í nas r ibosomales en t e j i d o s de p l an t a s superio-

res como los mostrados en l a s f i g u r a s 1 a 4, por l o que resul -

t a dificil comparar l a d i s t r i buc i ón obtenida con o t r o s datos

semejantes. Sin embargo, por e l nGmero de p r o t e í nas que se

pueden l o c a l i z a r , que están (en número) cercanas a l a s repor-

tadas en otros euca r i o t e s , se considera que l a r e so luc i6n fue

muy aceptable . Además, l a reproducibhLidad del &todo 1.ogrado

es bastante exacta , pues muestras de d iverson experimentos o-

t o rgan patrones muy seme j an t es .

E l patrón de l o s ejes secos es e l que presenta mayor d i f e r e n c i a

r e spe c t o a l os otros: carece de p r o t e í nas (como E-3, E-4, C-4

y B-5) que aparecen c l a r a s en e l c o n t r o l de 2 4 horas. Aunque

s igue una d i s t r i buc i ón gene ra l seme jan te , t i e n e c a s i l a mitad

(en nbmero) de manchas r e spe c t o a l o s o t ros . E s t o parece co-

rresponder a un fenómeno natura l ya que l a s c é l u l a s de e s t o s

tejidos están en es tado metabbl ico quiescente y su iaparato de

traducción de mensajes e s t á desart icu lado. Más aGn, esos r i b o -

somas cuando se p i w b a n en un sistema de s l n t e s i s de p ro t e ínas ,

-"I-

. 2 7 . -

,..

, .-

.- I .

no son capaces de funcionar (datos de nuestro l abo ra ton io no

mostrados).

A r e s e r va de comprobarlo de manera e x t ens i v a con r e p e t i c i o n e s

en l a s mismas condic iones, t a l parece que l o s d i f e r e n t e s tra-

tam.ientos de auxinas (A iA 6 NCPP) durante l as 2 4 horas de in-

cubación producen cambios, que aunque no dramáticos, son apre-

c i a b l e s en l os g e l e s bidimensi.onales.

Hay dos p r o t e í nas que aparecen ecclusivamente en e l c o n t r o l y

que e s tán ausentes en l os dos t ratamientos de auxina: V I 1

(B-5) y V I11 ( pa r t e baja de E-5 ) .

Las p r o t e í nas I V y V I parecen encontrarse est imuladas (apare-

cen en mayor cant idad) con e l t ratamiento de auxinas, espe-

c ia lmente con MCPP, de l a misma manera que e s t e t ratamiento

provoca pérdida de l a p r o t e l na V. Reportes p r e v i o s de nues-

tro l a b o r a t o r i o señalan que las auxinas estimulan l a incorpo-

r a c i ón de f ó s f o r o a p r o t e l n a s r ibosomales ( 6 ) por 10 que nos

parece especia lmente importante d i s c u t i r l o s casos de aque l l a s

p r o t e í nas que cambian de carga.

debe ocas ionar l a f o s f o r i l a c i ó n puede hacer cambiar l a movili-

dad e l e c t r o f o r é t i c a de l a s p r o t e i nas r i b o s o m l e s l o su6iente

como para s e r observada en g e l e s de 2a. dimensión t eñ idos con

a z u l de Coomassie, a s í ha s i60 observado en p r o t e l nas r iboso-

E l cambio de carga que l e s

males que a l t e r a n su n i v e l de f o s f o r i l a c i ó n po r efecto de cho-

que térmico ( 9 , 1 0 ) .

E l comportamiento de l a p r o t e í na que designamos I pa r e c i e r a ser

un e jemplo de e s t e t i p o de comportamiento .>debido '- fosfo-

r i l a c i ó n promovida por A i A .

nega t i va en e l patrón de p r o t e í nas r ibosomales de e j e s imbibi-

dos en p resenc ia de AIA, que e n e l c o n t r o l donde su movi l idad

Esta p r o t e í na presenta carga más

28.-

e l e c t r o f o r é t i c a e s francamente d i f e r e n t e . Ta l parece que pre-

senta una mezcla de estados con d i f e r e n t e s n i v e l e s de fosfori-

l a c i o n , que l a hacen presentarse como un ba r r i d o ho r i z on t a l

dentro del mismo n i v e l de peso molecular . Esto e s consisten-

t e con r esu l t ados en l a p r o t e i na S-6 de tomate que presenta

simultáneamente d i f e r e n t e s grados de f o s f o r i l a c i 6 n (10).

La mancha I1 aparentemente t i e n e mayor f o s f o r i l a c i ó n en el pa-

t r6n de MCPP pues presenta un comportamiento s d m j a n t e a I.

Desde luego , é s t o no basta para asegurar que e l conportamien-

t o de I y 11 se debe a f o s f o r i i a c i 6 n promovida po r auxinas, es

ne c e sa r i o comprobar que l a p r o t e í na en cuest ibn ( I y 11) efec-

t ivamente s e f o s f o r i l 6 (experimentos con marca r a d i a c t i v a y au-

t o r r a d i o g r a f í a de sus g e l e s ) y que a l cambiar de carga se mo-

v i b , escondiéndose en l a s v ec inas ( e l e c t r c e l u c i 6 n de l a zona

en l a que se supone se encuentra y con e s t a nueva electrofor

r e s i s de mayor r eso luc i6n para vel e l número de p r o t e í nas pre-

sentes en l a mancha).

Esto p o d r í a ind i ca r que l a f o s f o r i l a c i ó n de p r o t e í nas ribosoma-

l es inducida por AIA o por WPP e s d i f e r e n t e , mostrando d i s t i n -

t a e s p e c i f i c i d a d cada f i t o r r e gu l ado r (natura l v s . s i n t é t i c o ) . De cua lqu i e r manera, l a t é cn i c a nos permite poner de mani f ies-

t o cambios e s t ruc tu ra l e s en l a s p r o t e í nas de los ribosomas,

inducidos durante l a germinación probablemente por l a s auxinas.

Estos cambios parecen deberse t a n t o a a l t e r a c i b n en l a carga

de c i e r t a s p r o t e l nas po r fosforilaci6n-defosforibatci6n cono por

disminución y / o desaparic ibn d e l t i p o de p r o t e í nas ribosoma-

l e s p r esen tes en l a poblacibn de l os ribosomas.

S i b i en l a s c i t a s sobre estímulos que a fectan l a f o s f o r i l a c i 6 n

de p r o t e í n a s r ibosomales son abundantes (5, 6, 7, 9, 10, 11),

I

I

I

29. - es muy poca l a informaci6n que se t i e n e r e spe c t o a l a a l t e r a -

c i6n de l a función ribosomal po r f o s f o r i l a c i 6 n ( 9 ) . Es po r l o

a n t e r i o r p o r l o que surge l a necesidad de montar una metodolo-

g í a que permita establecer experimentalmente e l cambio de ac-

. ",

. .

t i v i d a d ribosomal po r f o s f o r i l a c i ó n .

Los r e su l t ados de e s t e t r a b a j o muestran un sistema he t e rd l o go

func ional que puede r e s u l t a r adecuado para probar dicha d i f e -

r enc ia en funcional idad, con l a desventaja de que l a a c t i v i d a d

de e s t e sistema e s t á expuesta a l a v a r i a b i l i d a d en l a respues-

t a b i o l ó g i c a que presente e l animal d e l cual s e rá ex t ra ído ,

además de n e c e s i t a r una extensa opt imizac ión a iones (K , Kq , etc. ) y c o f a c t o r e s .

Reportes r e c i e n t e s de l a l i t e r a t u r a (20) comparan funcionalmen-

te f a c t o r e s de i n i c i a c i 6 n de traducción de mamiferos con l o s

equ i va l en t es en germen de t r i g o . Como resu l t ado de e s t a compa-

r a c i ón se a f i rma que en un sistema completo de traducci6n de

germen de t r i g o l o s f a c t o r e s de i n i c i a c i 6 n eIF-4 de mamlferos

pueden funcionar parcia lmente mientras que f a c t o r e s de germen

en un sistema de mamífero no son func i ona l e s para l a s i n t e s i s .

Otra v en ta j a , entonces, d e l sistema he t e rd l o go que s e propone

en e l presente t r a b a j o e s que l a l e c t u r a de po l i -U po r l o s ri-

bosomas no r e qu i e r e i n i c i a c i o n de t a l manera que e l poco é x i t o

que se l o g r e a l entrecruzar l o s f a c t o r e s de i n i c i a c i o n ( 2 0 ) no

inp ide l a func i ona l i dad d e l sistema heter6 logo .

+ ++

I

CONCLUSIONES

1 . Los o b j e t i v o s planteados en e l p r o y e c t o i n i c i a l se cumplieron

* - sat i s f actoriamente . - 2 . La t é c n i c a de e l e c t r o f o r e s i s bidimensional mostrd s u f i c i e n t e

<I r eso luc i ón como para observar d i f e r e n c i a s e n t r e l o s r i b o s o m s

..

3%: t r a tados o no con auxinas.

3 . Las d i f e r e n c i a s e s t ruc tu ra l e s se manifestaron tanto como a l t e -

rac ión en l a cargo de algunas pro te lnas , como pérdida o dismi-

nución de algunas p ro t e lnas señalads.

4 . Se l o g r ó l a dependencia t o t a l d e l sistema r espec to a r i boso -

mas y s mensaje.

5. La a c t i s i d a d d e l sistema con ribosomas he t e r ó l o go s y mensaje

s i n t é t i c o parece s u f i c i e n t e para l o s f i n e s perseguidos en t r a -

ba jos p o s t e r i o r e s .

" .

131.-

RESUMEN

Se cree que la estructura ribosomal puede jugar un papel importante en la

regulación de síntesis de proteinas; y se sabe que la fosforilación de prg

teínas ribosomales es un fenómeno afectado por diversos estímulos, entre

ellos por fitorreguladores como auxinas. El objetivo del presente trabajo

es montar dos técnicas (electroforesis bidimensional y síntesis in vitro

de proteínas) que permitan el posterior análisis del efecto de auxinas du-

rante l a germinación de ejes embrionarios de maiz, en estructura y función

ribosomal.

La técnica de electroforesis biodimensional mostró diferencias claras en-

tre los patrones de proteínas ribosomales imbibidos en presencia o no de

auxinas.

Se logró actividad sintética suficiente del lisado de reticulocito de co-

nejo para el posterior análisis de las características funcionales de los

ribosomas, además de dependencia del sistema para con ribosomas de maíz y

mensaje exógeno.

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