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1 APOSTILA CURSO DE MICOLOGIA MÉDICA

Apostila Micologia

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APOSTILA

CURSO DE MICOLOGIA MÉDICA

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1.- Introdução

Identificação dos fungos Generalidades

Os fungos são organismos eucarióticos, desprovidos de clorofila e de celulose, uni

ou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido, imóveis na sua maioria. Cada célula

pode gerar, por si só, um novo organismo da mesma espécie. São considerados os

principais biodegradradores de matéria orgânica de nosso planeta.

As células fúngicas apresentam morfologia variável, mostrando grande diferença em

tamanho, estrutura e atividade metabólica, formando diferentes tipos de colônias quando

cultivados em meios apropriados, estruturas de frutificação complexas e/ou elaborados

mecanismos de propagação e dispersão.

REINO PROTOZOA: Rhinosporidium seeberi

REINO CHROMISTA: Pythium insidiosum

Divisões

REINO EUMYCOTA (De Hoog et al 2000)

Chytridiomycota Zygomycota Ascomycota Basidiomycota

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Os fungos são organismos distintos das bactérias em tamanho, estrutura celular e

composição química. Os fungos são eucariontes isto é possuem núcleos envolvidos por

membrana própria, heterotróficos, com nutrição de absorção, uni ou pluricelulares, com

parede formada de polissacarídeo incluindo glucanas, mananas, quitina bem como

glicoproteínas, sem celulose. A composição desses compostos é variável e depende da

posição sistemática dos fungos, ergosterol é o principal componente da membrana fúngica.

A célula fúngica é constituída pelos componentes encontrados em outros

organismos eucarióticos.

As organelas citoplasmáticas e inclusões são: mitocôndrias, vacúolos, vesículas,

retículo endoplasmático, microtúbulos, ribossomos e cristais de glicogênio. Os típicos

aparelhos de Golgi irão estar sempre presentes. Quase todos os fungos são aeróbios e todos

necessitam matéria elaborada para sua alimentação (heterotróficos).

Os fungos não ingerem seu alimento, mas possuem nutrição de absorção e parasitam

seres vivos ou atacando matéria morta como sapróbios, parasitas, simbiontes ou patógenos.

Os fungos se desenvolvem em meios de cultivos especiais, formam colônias que são

classificadas em dois tipos principais, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciam

pela macromorfologia e micromorfologia.

As colônias de leveduras são, em geral, de consistência cremosa de cor branca a

creme, brilhantes ou opacas podendo apresentar às vezes coloração escura ou alaranjada.

As leveduras produzem células simples, arredondadas, ovais ou alongadas que se

reproduzem quase sempre por brotamento, geralmente na posição polar chamadas de

blastoconídio. Algumas leveduras podem produzir, brotos simultaneamente em vários

pontos.

Os brotamentos ou células filhas são liberados da célula mãe, formando células

independentes ou continuar unidos formando células alongadas chamadas de pseudohifas

que se diferenciam das hifas verdadeiras por apresentarem constrição nos septos. Além dos

blastoconídios as leveduras podem apresentar artroconídios, pseudohifas e

clamidoconídios típicos.

As colônias de fungos filamentosos podem ser granulares, cotonosas, aveludadas,

pulverulentas, membranosas. O seu talo consiste de hifas que podem ser contínuas ou

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interrompidas em intervalos irregulares por septos (septada) que dividem as hifas em

células.

Um conjunto de hifas forma o micélio que pode ser vegetativo ou reprodutivo. O

micélio vegetativo penetra no meio de cultivo, para absorver substâncias nutritivas para o

fungo. O micélio vegetativo é o que fica na parte superior do meio e produz as estruturas de

reprodução típicas para cada grupo de fungos.

Os fungos sexuados se reproduzem por esporos que podem ser formados internamente

(ascoporas) ou externamente (basidiosporas).

Os fungos sexuados também se reproduzem assexuadamente.

Na reprodução assexuada, as estruturas de reprodução tomam nomes variados de

acordo com o grupo a que pertencem os fungos.

Conídios são estruturas assexuadas de reprodução encontradas entre os fungos

filamentosos. Podem apresentar tamanhos, formação, cores e septos diferentes

(macroconídios, microconídios, ameroconídios, didimoconídios, fragmoconídios,

dictioconídios, etc.). As hifas que sustentam os conídios são denominadas de conidióforos

e as células que dão origem aos conídios conidiogênicas.

Os conídios podem ser claros ou hialinos – hialoconídios ou pigmentados e escuros

- feoconídios.

Entre os fungos de hifas não septadas, as hifas aéreas produzem esporos assexuados

(esporangiosporos) dentro de estruturas chamadas esporângios. As hifas que sustentam os

esporângios são conhecidas como esporangióforos.

Columela é uma invaginação estéril do esporangióforo na área fértil do esporângio.

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2.- Coleta de Material Biológico

A coleta de material biológico é a primeira etapa no processo de identificação dos

fungos. Quando realizada incorretamente, dificulta a observação, isolamento e identificação

do agente causal da doença.

O primeiro passo consiste em obter os dados do paciente: nome, idade, RG,

procedência, endereço, telefone para contato, entre outros; dados epidemiológicos:

profissão, contato com animais, doença associada, estado imunológico, etc; informações

clínicas: local anatômico acometido, aspecto da lesão, suspeita clínica, antibioticoterapia

prévia, evolução e dados do médico responsável.

O procedimento de coleta varia segundo a região acometida, suspeita clínica e tipo

de material biológico. A quantidade de amostra coletada deve ser suficiente para permitir o

procedimento de identificação laboratorial do fungo: como exame microscópico direto e

cultivos em vários meios, com eventuais repetições desses exames para confirmação dos

achados laboratoriais.

Procedimento da coleta

Para efeitos práticos, a coleta de material biológico, depende da localização e do

tipo da micose.

• Amostras de micoses superficiais e cutâneas

Também denominadas dermatomicoses acometem: pele, pêlo, unhas, provocando

algumas delas alterações somente de importância estética.

A.- Amostras de pele.

A prévia desinfecção da lesão com algodão embebido em álcool 70% diminui a

biota bacteriana, aumentando a sensibilidade do exame micológico.

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Raspar a lesão com bisturi, cureta esterilizada ou com lâminas de vidro previamente

flambadas. Nas lesões sugestivas de dermatofitose, a coleta deve ser feita nas bordas da

lesão, já que este é o sitio ativo da infecção.

Quando o raspado da lesão não pode ser realizado, pode-se optar por métodos tais

como o de Porto (só para pitiríase versicolor) que consiste em utilizar uma fita adesiva

transparente (Durex) que é pressionada sobre a lesão, removida e fixada sobre uma lâmina

ou a utilização de um tapetinho estéril de aproximadamente 4 cm que e pressionado sobre a

lesão, embrulhado e transportado ao laboratório (Mariat & Tapia, 1966). As desvantagens

são a falta do cultivo ao empregar a técnica de Porto e do exame direto, quando se usa o

tapetinho.

B.- Amostras de unha.

A lesão pode-se localizar na região subungueal distal, proximal ou lâmina

superficial da unha. A tomada amostra dependerá do tipo de lesão.

Deve-se remover a presença de esmalte antes da coleta. Na onicomicose superficial

branca, raspa-se as áreas esbranquiçadas da parte superficial com o auxilio de bisturi estéril.

No acometimento sub-ungueal, deve-se raspar profundamente a área infectada desde a

porção distal à proximal.

Os primeiros detritos coletados da porção distal deverão ser eliminados já que são

ricos em contaminantes. As escamas obtidas da porção profunda da lesão poderão ser

usadas para o exame micológico. Quando as unhas são distróficas, pode-se auxiliar a coleta

com tesouras limpas e desinfetadas.

C.- Amostras de cabelo e pêlo.

Nos casos de piedras cortam-se com tesoura os cabelos ou pêlos apresentando

nódulos fúngicos (observados com auxilio de lupa).

Nas tinhas do couro cabeludo e da barba, as amostras podem incluir escamas da pele

e os pêlos ou cabelos alterados. Os cabelos opacos e engrossados são facilmente

arrancados, a partir das bordas das placas alopécicas com ajuda de uma pinça limpa e

flambada.

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Os pêlos, escamas de pele ou de unhas, podem ser colhidos e transportados entre

duas lâminas de vidro limpas, secas e flambadas, embrulhadas em papel, ou em placas

esterilizadas, sempre com a identificação da amostra.

D.- Amostras oculares.

Material de conjuntiva é colhida da mucosa, desde a porção proximal em direção a

borda, com "swab" estéril, embebido em solução salina. O "swab" pode ser colocado num

tubo estéril, contendo meio semi-sólido de transporte ou 0,5ml de solução salina.

Material ocular (córnea) colhido só por oftalmologistas, raspando as áreas

necróticas, ulceradas e supurativas da lesão com espátula esterilizada. Esta amostra será

processada em lâmina (exame microscópico direto) e semeada imediatamente nos meios de

cultivo apropriados ou tubo estéril contendo solução salina.

E.- Amostras óticas.

Geralmente o material biológico é obtido a partir do conduto auditivo externo, com

“swab” esterilizado umedecido previamente em solução salina.

E.- Mucosas.

i- Mucosa oral.

As amostras devem ser obtidas por raspado da superfície epitelial acometida,

empregando espátula ou bisturi rombo esterilizado. Na candidíase oral em que se verificam

placas esbranquiçadas, o material pode ser colhido com “swab” estéril, ou alça de platina,

colocar em tubo esterilizado contendo solução salina.

ii- Mucosa nasal.

O material nasal pode ser colhido com espátula, bisturi, alça ou ¨swab¨. Nos casos

de suspeita de aspergilose, feohifomicose, zigomicose ou rinosporidiose, recomenda-se

coleta do material com procedimento cirúrgico, como biópsia, etc.

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iii- Mucosa vaginal.

As amostras de fluxo vaginal se tomam sem asseio prévio da paciente, com “swab”,

colocar em um tubo com solução salina esterilizada.

iv- Mucosa genital Masculina.

A amostra pode ser colhida com swab da área da glande que apresenta pontos

esbranquiçados ou pseudomembranas, ou do prepúcio em onde podem ser encontradas,

vesículas.

v- Mucosa perianal.

Pode apresentar lesões esbranquiçadas ou ulceradas de aspecto granulomatosos. As

amostras são obtidas por raspado com bisturi rombo estéril ou “swab”

• Micoses subcutanêas

A.- Lesões sugestivas de Esporotricose.

No caso de abscessos fechados a obtenção de material purulento é feita por punção,

com seringa esterilizada ou por drenagem com prévia limpeza da zona implicada. Quando o

abscesso drena espontaneamente, o material purulento deve ser colhido com espátula, alça

ou “swab” e transferido a um tubo estéril de tampa de rosca, com solução salina.

B.- Lesões sugestivas de Micetoma.

O material compreende pus que deve conter grãos que podem ser visíveis a olho nu.

Quando é difícil a coleta da amostra, recomenda-se colocar gaze sobre a superfície lesada

por 18 a 24 h o que permitirá recuperar os grãos para o estudo micológico completo.

C.- Lesões sugestivas de Cromoblastomicose.

Na superfície cutânea lesada, observam-se geralmente pontos negros devido à

eliminação trans-epitelial do fungo. O material biológico deve ser coletado a partir dos

pontos enegrecidos da lesão. Escamas e crostas com auxilio de bisturi e agulhas estéreis,

biópsias podem também ser obtidas.

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D.- Lesões sugestivas de Lobomicose ( Doença de Jorge Lobo).

A amostra compreende material biológico coletado por biopsia ou secreção das

lesões ulceradas colhidas com espátula, bisturi rombo, alça ou ´swab¨ e transferido a um

tubo estéril contendo solução salina. O exame microscópico direto e/ou anatomopatológico

confirmam o diagnóstico de lobomicose. Cultura não obtida, até o presente.

E.- Lesões sugestivas de Rinosporídiose

O material biológico deve ser colhido da superfície de crescimento polipóide.

Exame microscópico direto e cortes de tecido corados confirmam o diagnóstico.

F.- Feohifomicose subcutânea

Colher o material dos abscessos subcutâneos por punção ou biópsia. Fazer exame

microscópico direto, cultura e cortes sem coloração.

G.- Zigomicose subcutânea

Colher uma pequena porção do material por biópsia. Fazer preparações, exame

microscópico direto com KOH, anátomo patológico e cultura.

• Amostras de micoses sistêmicas

A.- Trato respiratório.

i- Escarro.

Amostras de escarro são coletadas após prévia lavagem bucal preferentemente em

jejum. O material deverá conter escarro profundo, livre de saliva e será colhido em frasco

estéril de boca larga. No caso dos pacientes que não expectoram facilmente, podem ser

usadas nebulização, com solução salina hipertônica.

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ii- Lavado brônquico.

Procedimento realizado pelo médico com broncoscópio. O material clínico é

colocado em frasco estéril e enviado ao laboratório.

Aproximadamente 1 ml de escarro ou lavado brônquico, é levado a um tubo cônico

de centrifuga contendo 250 ul aproximadamente de KOH 20% mais tinta, sendo incubada

por 12 h a 37ºC. O material biológico é centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos. A

preparação microscópica é realizada a partir do sedimento.

B.- Biópsia.

Devem ser obtidas amostras representativas da patologia suspeita. O material deve

ser dividido em dois frascos estéreis diferentes, um contendo formol ao 0.4% e outro

contendo solução salina, destinados ao exame histopatológico e micológico,

respectivamente.

C.- Medula óssea.

É um procedimento médico que exige rigorosa assepsia. Podem ser obtidas 2-3 ml

do material com seringa com heparina, que deve ser transportado imediatamente ao

laboratório micológico.

D.- Líquido cefalorraquídiano (LCR)

Para o estudo micológico devem ser colhidos 5 a 10 ml de LCR, obtido por punção

lombar, em condições de rigorosa assepsia. O LCR é normalmente, livre de

microrganismos. Qualquer agente observado deve ser considerado como um patógeno

potencial.

E.- Sangue

Realizar assepsia do sitio escolhido para puncionar com álcool 70 % esperar 5

segundos e aplicar solução de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 ml de sangue venoso

(adultos) e de 1 a 3 ml (crianças), para cada frasco coletado. Terminada a punção retirar a

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agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no frasco enviando de imediato ao

laboratório.

Número e intervalo das amostras:

-Suspeita de septicemia: colher duas amostras de sangue de diferentes locais com intervalo

de uma hora.

-Febre de origem desconhecida: colher duas amostras com intervalo de uma hora. Se forem

negativos, após 24 a 36 h, colher as outras duas amostras com intervalo de 1 hora.

F.-Urina

A assepsia com água e sabão da região genital deve ser rigorosa pudendo após lavar

com povidine, enxugar com água estéril e secar com gaze estéril. (sexo masculino retrair o

prepúcio e lavar a zona do glande e meato urinário)

Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinário (sexo feminino afastando os grandes

lábios) em frasco esterilizado.

Crianças: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e região perianal com água e sabão,

colocar o coletor urinário adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar o

coletor fechado ao laboratório. (o coletor deverá ser trocado a cada 30-40 minutos caso a

criança não tenha urinado)

Paciente com sonda vesical de permanência: Desprezar a urina remanescente na

sonda vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinçar a sonda vesical 20 cm

de distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prévia assepsia com álcool 70 %,

coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, e

depositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratório. (no

caso da sonda urinária não apresentar dispositivo para coleta de urina é recomendável

desligar a sonda vesical do sistema de drenagem e obter amostra de urina mediante gota a

gota diretamente no frasco estéril. Todo o procedimento deverá ser realizado respeitando as

normas de assepsia).

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G.- Fezes.

Aproximadamente 20g de fezes recém emitidas devem ser coletadas em frasco

esterilizado e enviadas rapidamente ao laboratório. Para cultivo de vigilância, utiliza-se

“swab” anal.

H.- Outros líquidos corporais.

Todos os líquidos corpóreos são obtidos por aspirações percutânea ou drenagem,

empregando procedimentos invasivos praticados pelo médico. Deve ser coletado tanto

líquido quanto seja possível 2 a 10 ml ou mais, pois as concentrações dos microrganismos

podem ser muito baixas e coletadas em recipientes com tampa rosca contendo heparina

1:1000.

Todas as amostras de material clínico devem ser colhidas adequadamente, em

condições ideais e transportadas rapidamente ao laboratório, com a solicitação do tipo de

exame, suspeita clínica, dados clínicos e epidemiológicos do paciente, para processamento

micológico imediato.

3.- Exame Microscópico Direto e Cultura

O exame microscópico direto de material clínico é um dos procedimentos mais

simples e úteis para o diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas. Vários clarificadores

podem ser usados, sendo KOH a 10 ou 20% o mais empregado.

A observação de elementos fúngicos em escamas de pele, pêlos ou unhas pode

proporcionar uma clara indicação do tipo de micoses envolvida: dermatofitose, candidíase

ou pitiríase versicolor.

O exame microscópico direto de fluidos, biópsia ou outro material clínico pode

também estabelecer o diagnóstico de uma micose sistêmica, orientando a etiologia da

infecção como paracoccidioidomicose, histoplasmose, zigomicose, hialohifomicose,

feohifomicose entre outras.

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Técnica:

Colocar parte do material biológico a ser estudado sobre lâmina limpa, adicionar

uma a duas gotas de KOH a 20%, cobrir com lamínula e flambar ligeiramente.

As lâminas previamente marcadas serão colocadas em câmara úmida, “overnight” a

4 °C e posteriormente se realizará a segunda observação microscópica.

Nunca se deve pressionar a lamínula com os dedos, uma vez que os ácidos graxos

naturais da pele dificultam a observação. Quando a amostra é muito espessa é aconselhável

pressionar a lamínula com uma pinça ou outro objeto. O fungo pode ser então liberado do

material biológico, o que permite sua visualização.

A adição de tinta Parker (Quink) azul permanente ou tinta Scheaffer 22 ao KOH,

permite melhor visualização e contraste dos fungos em especial das células de Malassezia

furfur que se tingem mais intensamente do que outras estruturas fúngicas.

Outras substâncias tais como goma de Berlesse, DMSO e Chloroblack E podem ser

empregadas na visualização do fungo a partir do material biológico.

Para verificação da presença de cápsula, devem-se fazer preparações do material

clínico com tinta da China, diluída 1:1 em água destilada ou salina esterilizada.

Cultura dos Fungos:

Os fungos preferencialmente se desenvolvem à temperatura de 25°C, sendo seu

crescimento mais lento que o das bactérias. Por isto há necessidade de acrescentar

inibidores bacterianos aos meios de cultura ao trabalhar com material biológico

contaminado. Entre os antibióticos cloranfenicol 50 a 300 mg/l é empregado para inibir o

desenvolvimento de bactérias. Para inibir o crescimento de determinados fungos

contaminantes do ar que têm desenvolvimento rápido deve-se usar cicloheximida.

Fungos filamentosos crescem melhor entre 24 e 28°C e os leveduriformes entre 24 e 37°C,

em pH de 6,6 a 7,2.

Existe um grupo de fungos que apresenta dimorfismo térmico: uma fase saprofítica ou

filamentosa à temperatura (24-28°C) e uma fase parasitária ou leveduriforme a 37°C.

São os fungos dimórficos: S. schenckii, H. capsulatum, P. brasiliensis, B.

dermatitidis.

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Técnica:

A semeadura está na dependência do tipo de amostra e da suspeita clínica. Pêlos,

escamas de pele ou de unhas, serão semeadas em 6 a 8 picadas com alça em L sobre ágar

inclinado em tubo. Fluidos biológicos como LCR, lavado brônquico, etc., serão

centrifugados a 3000 rpm. por 5 minutos e semeados com pipeta Pasteur estéril ou pipeta

graduada sobre ágar inclinado. Material de biopsia deve ser fragmentado e semeado

fazendo picadas na superfície do ágar. Amostras de hemoculturas serão semeadas

acrescentando 0,5 ml do caldo na superfície do meio.

A adequada coleta e transporte de material biológico são essenciais para se obter o

diagnóstico micológico preciso.

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LISTA DE MATERIAL BIOLÓGICO, EXAMENS MICROSCÓPICOS DIRETOS E MEIOS DE CULTURA PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MICOSES

Micoses Amostra clínica Exame Microscópico Direto Meio de Cultura Agentes etiológicos

T°e tempo de incubação

Pitiriase Versicolor

Escamas de Pele Células leveduriformes esféricas ovaladas com ou sem brotamento e filamentos curtos septados.

Ágar bile de boi adicionado de azeite de oliva

Malassezia furfur

37°C durante 7 dias

Tinha negra Escamas de Pele Hifas escuras septadas, irregulares.

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**

Hortae werneckii 25°C durante 20 dias

Piedra negra Cabelo Nódulos marron - escuros, formados por artroconídios escuros; ascos com 2 a 8 ascosporos típicos

Sabouraud-dextrose ágar**.

Piedraia hortae 25°C durante 30 dias.

Piedra branca Pêlos região genitais, axilares, etc.

Nódulos claros, formados por artroconidós claros e blastocon.

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**

Trichosporon spp 25°C durante 7 dias

Dermatofitose do couro cabeludo

Cabelo com raíz Artroconídios refringentes ectothrix, endothrix ou ectoendothrix. Parasitismo fávico

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**. Mycosel

Microsporum spp,

Trichophyton spp. 25°C durante 15 a 30 dias

Dermatofitose da pele.

Escamas e pêlos Hifas septadas, ramificadas. Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**. Mycosel

Epidermophyton

spp, Microsporum

spp, Trichophyton

spp.

25°C durante 15 a 30 dias

Onicomicose borda livre espessa.

Escamas lâmina interna da unha (raramente lâmina externa)

Hifas septadas com artroconídios retangulares ou esféricos.

Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**. Mycosel

Trichophyton spp. 25°C durante 15 a 30 dias

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Onicomicose borda livre fina e de borda periungueal (candidíase)

Escamas lâmina interna da unha e do arco periungueal

Células leveduriformes e/ou pseudohifas

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**

Candida albicans,

Candida spp. 25°C durante 7 a 15 dias

Cromomicose Crostas, secreção ou pus.

Estruturas globosas de cor marrom, de parede grossa, septada em dois planos (corpos escleróticos) ou talo moriforme.

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**

Phialophora spp,

Cladosporium spp,

Rhinocladiella spp.

Fonsecaea spp.

25°C durante 20 dias

Esporotricose Secreção ou pus Leveduras alongadas como charuto, o observadas raramente.

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**.

Sporothrix schenckii 25°C e 37 °C durante 20 dias

Eumicetoma Secreção ou pus Grânulos parasitários formados por aglomeração de hifas claras ou escuras

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**.

Madurella spp (grãos

escuros),

Pseudallescheria

boydii (grãos claros),

Acremonium spp, P.

romeroi

25°C durante 20 dias

Rinosporidiose Descarga nasal ou tecido do pólipo

Esférulas até 350 paredes espessas em diversos graus de maturação

Rhinosporidium

seeberi

Lobomicose Material de lesão queloides e tumores

Células leveduriformes tamanho uniforme 9-10 um. Uma ponte tubular une uma célula a outra

Glenosporella loboi,

Loboa loboi, P. loboi

Feohifomicose Secreção ou pus Hifas escuras septadas, elementos leveduriformes, sem corpos escleróticos

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**

Phialophora spp,

Cladosporium spp.,

Fonsecaea spp.,

Wangiella spp.

25°C durante 20 dias

Zigomicose Nódulos Hifas largas não septadas Sabouraud-dextrose Conidiobolus

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subcutânea subcutâneos com reação eosinofílica (corte)

ágar*; coronatus,

Basidiobolus

haptosporus

Paracoccidioido micose

Escarro, pus, raspado de mucosa, etc.

Células esféricas de tamanho variável de membranas duplas com um ou muitos brotamentos, células esfericas isoladas, células caten., Células caliciformes.

Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**

Paracoccidioides

brasiliensis 25°C e 37°C durante 30 dias

Histoplasmose Escarro, raspado das lesões.

Células leveduriformes pequenas 2-3�m, esféricas ou ovaladas no interior de macrófagos ou mononucleares (coloração com Giemsa).

Sabourad-dextrose ágar*;Lactrimel ágar,

Histoplasma

capsulatum 25°C e 37°C durante 30 dias

Criptococose L.C.R., escarro, pus, etc

Células leveduriformes esféricas com cápsula grande (em observação com tinta da China)

Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**.

Cryptococcus

neoformans 37°C durante 15 dias

Candidíase Raspado mucosa, biopsia, escarro, etc.

Células leveduriformes ou pseudohifas

Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**.

Candida albicans,

Candida spp. 37°C durante 15 dias

Otomicose Pseudomembrana com pontos de cores ou massa em migalha de pão

Filamentos com ou sem cabeças aspergilares ou células leveduriformes e pseudohifas

Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**.

Aspergillus niger, A.

Fumigatus, Aspergillus

spp, Candida albicans,

etc..

25°C durante 15 dias

* Meio adicionado de Cicloheximida e cloranfenicol.; ** Meio adicionado de cloranfenicol

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Micologia médica, micoses e seus agentes

Em micologia médica, as micoses são divididas para seu estudo em:

Micoses superficiais

Os agentes de micoses superficiais, formam um grupo heterogêneo de fungos que

não sensibilizam o indivíduo, não provocam reações alérgicas a distancia como os agentes

de micoses cutâneas.

Malassezia furfur, Hortae werneckii, Trichosporon spp., Piedraia hortae são os

fungos envolvidos nessas micoses.

MICOSES CUTÂNEAS: DERMATOFITOSES CANDIDIASES

MICOSES SUBCUTÂNEAS: ESPOROTRICOSE CROMOBLASTOMICOSE MICETOMAS RINOSPORIDIOSE ENTOMOFTOROMICOSE MICOSE DO JORGE LOBO

MICOSES SUPERFICIAIS: PITIRIASES VERSICOLOR TINHA NEGRA PIEDRA NEGRA PIEDRA BRANCA

MICOSES SISTÊMICAS: PARACOCCIDIOIDOMICOSE BLASTOMICOSE HISTOPLASMOSE COCCIDIOIDOMICOSE

MICOSES OPORTUNÍSTICAS: ZIGOMICOSES HIALOHIFOMICOSE FEOHIFOMICOSE CANDIDIASE CRIPTOCOCOSE ASPERGILOSE PNEUMOCISTOSE LEVEDUROSES

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Malassezia furfur - Agente da pitíriase versicolor, afecção cutânea assintomática

que se caracteriza por placas descamativas de diferentes cores: castanho-avermelhadas,

marrons ou brancas. O papel do fungo em doenças de natureza seborreica como psoríase,

dermatite seborreica, foliculite é discutível.

M. furfur tem sido isolada também de infecções sistêmicas, principalmente em

neonatos.

Hortae werneckii - agente da tinha negra, lesão que se caracteriza pela formação de

mancha pouca descamativas de coloração castanha a preta, principalmente nas palmas das

mãos. Essas lesões vão aumentando de tamanho, durante meses ou anos.

Trichosporon spp - causa piedra branca, que consiste em nódulos castanho-claros

e macios em torno de pêlos da região genital, axilar e do couro cabeludo. Os nódulos são

menos aderentes que os da piedra negra. Nos pacientes com imunodeficiência, pode ocorrer

invasão do sangue, dos rins, dos pulmões e da pele.

Piedraia hortae - produz piedra negra, que consiste em nódulos duros, pretos e

firmes em torno dos cabelos.

Micoses cutâneas

Agrupam as dermatofitoses e as candidíase cutâneas. Os agentes das micoses

cutâneas atacam a epidermes e as camadas mais profundas da córnea, chegando a produzir

granulomas, se localizando na pele, pêlos, unhas e mucosas.

Os dermatófitos são fungos relacionados entre si que invadem a queratina morta.

Pertencem aos gêneros Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton. As espécies

geofílicas vivem principalmente no solo; as zoofílicas, em animais; as antropofílicas, nos

seres humanos.

Esses fungos infectam locais específicos do corpo, que servem de base para o

diagnóstico clínico. A localização da dermatofitose pode ajudar na identificação preliminar

do fungo.

Page 20: Apostila Micologia

20

AGENTE PELE UNHAS PÊLO INVASÃO

ECTÓTRICA

PÊLO INVASÃO

ENDÓTRICA

Microsporum + +(raro) + -

Epidermophyton + - - -

T.mentagrophytes + + + -

T.rubrum + + + (raro) -

T. verrucosum + + + -

T.tonsurans + + - +

T.shoenleinii + + - +

T.violaceum + + - +

Microsporum canis - causa dermatofitose do corpo e do couro cabeludo, geralmente

encontrado em crianças adquirido de animais infectados como cães e gatos.

Microsporum gypseum - causa dermatofitose inflamatória do corpo ou do couro

cabeludo, contraído por contato com solo contaminado.

Epidermophyton floccosum - dermatofitose epidêmica (pé de atleta) em locais de

veraneio, bem como dematofitose inguinal.

Trichophyton rubrum - dermatofitose do corpo, dos pés, da virilha e das unhas. Em

paciente imunodeprimidos, pode causar nódulos ou abscessos subcutâneos.

Trichophyton mentagrophytes - dermatofitose inflamatória nos pés, no corpo, nas

unhas, na barba e no couro cabeludo. É causa comum de pé de atleta, apresenta as

variedades granular e cotonosa.

Trichophyton tonsurans - causa tinha do couro cabeludo, tinha capilar com pontos

pretos e às vezes dermatofitose do corpo, dos pés e das unhas.

Page 21: Apostila Micologia

21

Trichophyton verrucosum - dermatofitose do couro cabeludo, da barba ou do corpo,

geralmente adquirida por contato com o gado infectado.

Trichophyton shoenleinii: dermatofitose do couro cabeludo chamado FAVO (tinha

favosa) com alopécia definitiva, raramente, dermatofitose do corpo ou das unhas.

Candidíases

São causadas primordialmente por C. albicans, embora outras espécies de Candida

estejam se tornando cada vez mais importantes como agentes etiológicos. A C. albicans

existe como normal no trato gastrointestinal, na área vulvovaginal, na pele e fezes. Em

casos de comprometimento imunológico e conseqüente queda da resistência causados por

AIDS, neoplasias, lúpus eritematoso, tuberculose ou terapias com esteróides ou agentes

citotóxicos, as leveduras podem proliferar e causar auto-infecções.

As candidíases atingem principalmente as mucosas, exemplo candidíase oral.

broncopulmonar, vulvovaginal; candidíase mucocutânea crônica, cutânea, ungueal, etc. são

algumas das manifestações que podem ocorrer.

Micoses subcutâneas

Os agentes de micoses subcutâneas, tem habitat no solo. Podem ocorrer micoses

subcutâneas quando há traumatismo por espinhos ou outro tipo de vegetação ou materiais

contaminados por fungos. Os organismos alojam-se na pele e passam a produzir infecção

localizada na pele e no tecido subcutâneo e às vezes nos linfonodos da região. Raramente a

infecção se se dissemina. As lesões subcutâneas caracterizam-se pela cronicidade de áreas

duras, nodulosas, crostosas e ulceradas. Que não cicatrizam e periodicamente produzem

exsudação. Os membros inferiores, sobretudo os pés, são muitas vezes comprometidos,

visto que seu contato com espinhos e outros vegetais é mais freqüente.

Esporotricose – Esta infecção decorre de ferimentos cutâneos provocados por

materiais contaminados, como espinhos de flores, gravetos, madeira, etc. Produz lesões

ulcerativas subcutâneas, nos membros, que podem avançar ao longo dos vasos linfáticos. A

Page 22: Apostila Micologia

22

esporotricose pulmonar está sendo observada com mais freqüência, deve ser distinguida da

tuberculose, coccidioidomicose, histoplasmose e sarcoidose.

O agente etiológico é Sporothrix schenckii, fungo dimórfico.

Cromoblastomicose – As lesões produzidas evoluem com grande lentidão torna-se,

vão-se formando muitas protuberâncias sobrepostas, o que cria a aparência de couve-flor.

Geralmente, a erupção é seca, mas pode ulcerar-se. Na suas camadas mais profundas,

encontram-se corpos escleróticos.

Os principais agentes envolvidos: F. pedrosoi, F. compacta, P. verrucosa, C.

carrionii, Rhinocadiella aquaspersa.

Micetomas – O micetoma geralmente se restringe aos pés, mas pode ser visto em

outras regiões como mãos e nádegas.

Os nódulos, que periodicamente exsudam um líquido oleoso contem grãos que podem ser

brancos, amarelos, vermelhos ou pretos. Aos poucos as lesões comprometem toda a perna.

A infecção causada pelos fungos superiores (micetoma eumicótico) produz lesões

fistulosas, com pouca dor ou destruição óssea, enquanto a causada por bactérias

fungiformes (micetoma actinomicótico) apresenta lesões tumorosas cônicas semelhantes às

erupções de acne, com grande exsudação e comprometimento ósseo com dor.

Principais agentes de micetoma eumicótico: Scedosporium apiospermum,

Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Exophiala jeanselmei, Madurella

mycetomatis, Madurella grisea.

Principais agentes de micetoma actinomicótico: Nocardia asteroides, Nocardia

brasiliensis, Nocardia otitidiscavarium, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletierii,

Streptomyces somaliensis, Actinomyces israelii e Actinomyces bovis.

Rinosporidiose – doença que se caracteriza pela formação de granuloma vegetante,

poliposo, com sede predominantemente nasal ou ocular. (conjuntiva palpebral, conjuntiva

bulbar e saco lacrimal). Já foram verificados casos de localização vaginal, retal e peniana,

assim como no conduto auditivo externo.

Page 23: Apostila Micologia

23

Agente etiológico Rhinosporidium seeberi que não tem sido cultivado.

Entomoftoromicose ou zigomicose subcutânea – Granuloma eosinofilico causados

por zigomicetos que invadem primariamente a gordura do tecido celular subcutâneo. É

comum em crianças, traduzindo-se pelo aparecimento de um nódulo subcutâneo que

aumenta em volume, provocando intumescimento extensivo, progressivo e lento.

Geralmente o paciente não apresenta imunodepressão

Agentes envolvidos pertencentes aos gêneros Conidiobolus e Basidiobolus.

Doença de Jorge Lobo – dermatose que provoca lesões tipo quelóides com ausência

de comprometimento visceral, ausência de adenopatia satélite, longa evolução do processo.

Nem sempre as lesões cutâneas assumem aspecto puramente queloidiano ao lado e lesões

papulosas, nodulares, verrucosas, e tuberosas podem ocorrer.

Agente etiológico, Lacazia loboi (Loboa loboi) ainda não cultivado.

Micoses sistêmicas

Os fungos que causam micoses sistêmicas vivem em forma sapróbia no solo.

Alguns animais de vida silvestre são reservatórios importantes. Os indivíduos podem

desenvolver a doença principalmente por inalação de propágulos.

Todos os agentes de micoses profundas apresentam dimorfismo térmico. Na

natureza e nos cultivos a 25°C, formam colônias filamentosas com reprodução assexuada.

Nos tecidos e cultivos a 37°C eles apresentam sua forma leveduriforme.

Estes fungos são taxonomicamente heterogêneos: Histoplasma capsulatum,

Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis.

Histoplasma capsulatum – é agente de infecção relacionada a indivíduos que

visitam grutas ou lugares com morcegos. 90-95% dos casos são assintomáticos ou sub-

clínicos e os sintomas respiratórios gripais se resolvem espontaneamente. Esporadicamente

algum paciente pode apresentar uma forma pulmonar aguda da doença, com suores

noturnos, tosse, febre e emagrecimento. É fulminante em pacientes com imunodeficiência.

Page 24: Apostila Micologia

24

Paracococcidioides brasiliensis – a infecção geralmente se caracteriza por lesões

pulmonares semelhantes às da tuberculose e de outras micoses. Lesões nas mucosas nasais,

oral, pele e outros órgãos podem ocorrer.

Blastomyces dermatitidis – O microrganismo ao ser inalado, produz infecção

respiratória crônica e branda, que piora gradualmente, ao longo de semanas ou meses.

Escarro torna-se purulento, sanguinolento. A fase respiratória da doença tem semelhanças

com tuberculose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose e histoplasmose. Pode

provocar lesões subcutâneas, ósseas, etc.

Coccidioides immitis – Por inalação dos conídios após 14 dias, 60% dos pacientes

apresentam infecção respiratória assintomática. O restante 40% apresenta sintomas da

doença respiratória gripal leve ou raramente grave. Complicações pulmonares, na forma de

cavidades ou de pneumonia ocorrem em 5%. Pode ocorrer disseminação por via

hematogênica dos pulmões para os ossos, as articulações, a pele, os tecidos subcutâneos,

etc.

Micoses oportunísticas

A maioria dos fungos que produzem micoses oportunísticas são saprófitos do meio

ambiente, de crescimento rápido, normalmente inalado. Esses organismos geralmente não

são patogênicos, mais atuam como patógenos oportunistas. O indivíduo que apresenta

algum tipo de depressão imunitária em decorrência de doença ou em especial, do uso de

medicamentos imunossupressores, antibioticoterapia por longo tempo, pode ser alvo de

infecções oportunísticas.

Zigomicose – infecção fúngica aguda causada por fungos da divisão Zigomycota, os

esporos desses fungos podem infectar os seios paranasais e a área peri-orbital. A infecção

rapidamente se dissemina para os vasos sanguíneos vizinhos, causando necrose e trombose,

vascular (CID). A partir daí se difunde para o encéfalo e para as meninges, produzindo

Page 25: Apostila Micologia

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meningoencefalíte, rapidamente fatal. Essa doença pode se disseminar para os pulmões e

para o tubo digestivo.

Principais agentes envolvidos: Absidia sp., Apophysomyces sp., Mucor sp., Rhizopus

sp., Saksenaea sp., Cunninghamella sp..

Feohifomicoses – Infecções causadas por fungos demáceos que apresentam hifas

escuras nos tecidos. O número de agentes envolvidas é, em geral, muito grande e tende a

aumentar.

Alternaria spp. – produz quadros como ceratomicose, infecções cutâneas,

osteomielite, doenças pulmonares e infecção do septo nasal.

Bipolaris spp. – causam ceratomicose e sinusite fúngica, abscessos subcutâneos,

meningite, alergias e peritonite.

Cladosporium spp., Epicoccum spp. e Nigrospora spp. – causa ceratomicose e

alergias.

Curvularia spp. – causam ceratomicoses, micetoma, endocardite, infecção

pulmonar, alergias e infecção do septo nasal.

Exserohilum spp. – sinusite fúngica, embolia aórtica, úlcera de córnea e meningite.

Hialohifomicoses – Infecção causada por fungos hialinos (hifas hialinas)

Acremonium sp. - pode causar ceratomicose, lesões do palato duro, meningite,

artrite e doenças sistêmicas.

Aspergillus sp. - o Aspergillus fumigatus é o patógeno oportunista mais comum do

gênero. Aspergilose disseminada, doenças pulmonares, broncopneumonia alérgica,

ceratomicose, otomicose e infecção dos seios paranasais.

Page 26: Apostila Micologia

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Fusarium spp. - causa mais comum de ceratomicoses, onicomicoses, otomicoses,

úlceras varicosas, micetoma, osteomielite. Tem sido identificado também em lesões

sistêmicas em transplantados de medula óssea.

Paecilomyces spp. – implicados em casos de peniciliose, endoftalmite, endocardite,

derrame pleural e lesões cutâneas.

Penicillium spp. – causam ceratomicose, peniciliose, otomicose, onicomicose e,

raramente, infecções profundas. Penicillium marnefei produz uma forma disseminada de

peniciliose, é o único agente dimórfico do grupo.

Scopulariopsis sp. – ceratomicose, otomicose e onicomicose.

Criptococose – Em geral produz infecções pulmonares brandas muitas vezes

subclínicas. Em pacientes sintomáticos manifesta-se como tosse e febre, radiografias

demonstra nódulos isolados ou múltiplos nos campos pulmonares médio e inferior que

podem calcificar. Muitos pacientes apresentam infiltrados densos pulmonares. Na

disseminação ocorre infecção hepato-esplênica, osteomelite, comprometimento subcutâneo

e nódulos cutâneos semelhantes ao molusco contagioso. A meningites é a forma grave da

doença foi atinge grande parte de indivíduos com AIDS.

Agente etiológico: Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus

neoformans var gattii, com os sorotipos A, B, C, D.

Candidíse, Trichosporonose e Malasseziose – descritos anteriormente.

Leveduroses por:

Geotrichum candidum – Produz infecções orais com placas brancas semelhantes às

de candidíase, ao passo que a forma intestinal da doença provoca colite e fezes

sanguinolentas. As manifestações bronquiais são as mais comuns; tosse crônica e o escarro

Page 27: Apostila Micologia

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mucóide e sanguinolento que provocam lembra tuberculose. Já foram documentadas

infecções vaginais.

Toluropsis glabrata – patógeno oportunista que geralmente provoca doenças em

pacientes debilitados. Os pulmões e os rins são os órgãos mais afetados, embora esse fungo

possa disseminar-se para o restante do corpo através do sangue, causando fungemia e

choque séptico.

Pneumocystis carinii – Pneumocystis se adere às células epiteliais e penetram ao

citoplasma, aumentando a permeabilidade capilar do alvéolo, produzido danos na

membrana basal do alvéolo formando exudado alveolar eosinofílico. O agente não tem sido

cultivado.

Page 28: Apostila Micologia

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4.- Identificação dos Fungos

PRINCIPAIS CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICAS DOS FUNGOS

4.a- Identificação dos Fungos

Os caracteres macromorfológicos da colônia fúngica podem variar

consideravelmente entre um meio de cultivo e outro, dependendo da constituição

nutricional ou devido a diferentes tempos e temperaturas de incubação. Conseqüentemente

é fundamental em que meio e condições foi incubado o agente.

A análise macroscópica dos cultivos visa caracterizar.

1- Textura: serosa, cremosa, mucóide, membranosa, pulverulenta, granular, camurça,

cotonosa.

2- Topografia: plana, convexa, umbilicada, pregueada, cerebriforme.

3- Aspecto: brilhante, opaco, seco, úmido.

4- Superfície: lisa, fissurada, rugosa.

5- Bordas: regulares, irregulares, radiadas.

6- Cor da colônia: branco, preto, verde, vermelho, etc.

7- Pigmento: presença ou ausência, cor do pigmento, difuso ou restrito à colônia.

8- Tempo de crescimento.

9- Diâmetro da colônia.

Técnica de esgarçamento:

Utilizada para identificação micromorfológica de fungos filamentosos. Com alça de

platina em L, retirar um fragmento da colônia, colocar em lâmina com una gota de

lactofenol azul de algodão e com auxilio de agulhas esgarçar bem. Cobrir com lamínula,

comprimir levemente e observar ao microscópio com aumento 10X ou 40X.

Page 29: Apostila Micologia

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Cultivo em lâmina.

Nesta técnica as estruturas permanecem devem permanecer íntegras e o meio

utilizado pode ser Sabouraud dextrose ágar, batata ágar, lactrimel ágar ou V8.

Esterilizar placas de Petri com uma lâmina no interior, papel de filtro e lamínula.

Colocar o meio de ágar em placa. Deixar solidificar.

Com a alça em L, destacar porções bem pequenas da colônia do bolor, crescida no ágar e

colocar nos quatro lados do pedaço de ágar.

Cobrir com lamínula esterilizada, pressionando levemente.

Lâmina suporte

Lâmina para microcultivo

Àgar batata

Lamínula

Umedecer com 4 ml de água esterilizada

Page 30: Apostila Micologia

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Colocar um pouco de água destilada esterilizada no fundo da placa esterilizada,

repor a água esterilizada, sempre que necessário. Deixar por 10-15 dias, dependendo da

velocidade de crescimento do fungo.

Para montar, retirar a lamínula com pinça estéril. Fixar o fungo na lamínula

colocando 1 a 2 gotas de álcool e esperar secar. Montar essa lamínula em uma lâmina

limpa, com uma gota de lactofenol azul-algodão.

A lamínula pode ser vedada com esmalte de unha ou Etellan para conservar por

mais tempo.

Pode, também, ser montada a lâmina do microcultivo, retirando-se o pedaço de

ágar, fixando com álcool e colocando uma lamínula limpa, com uma gota de Lactofenol

azul-algodão.

A classificação e identificação dos fungos estão baseadas principalmente nos caracteres

macro e micromorfológicos, assim como no método de reprodução sexual do organismo

isolado. O processo de identificação de leveduras inclui testes bioquímicos, que serão

discutidos posteriormente. Observamos atualmente em micologia, a participação crescente

das técnicas de biologia molecular, no auxílio taxonômico.

Nosso primeiro grande objetivo é diferenciar colônias leveduriformes e filamentosas.

1.- Observe e descreva as principais características macroscópicas das diversas colônias

fúngicas a serem analisadas:

a) Colônias leveduriformes

b) Colônias filamentosas

Page 31: Apostila Micologia

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Micromorfologia dos fungos de interesse em micologia médica

4b. Rotina de Identificação de Leveduras

l - ISOLAMENTO

1 - Princípio:

Freqüentemente as leveduras crescem com bactérias em cultura, ou pode haver o

desenvolvimento de mais de uma espécie de levedura no mesmo cultivo. Para a correta

identificação das leveduras é essencial utilizar culturas puras. O primeiro passo portanto,

consiste na purificação dos cultivos.

2 - Material utilizado:

- água destilada esterilizado

- alça de platina

- cultivo de levedura a ser identificada

- placas de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol

3 - Técnica:

Preparar uma suspensão da colônia em água destilada esterilizada de acordo com o

no 3 da escala de MacFarland. Com o auxílio de uma alça de platina semear em estrias em

placa de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol.

Incubar a 37°C por 48 horas. A cultura isolada será utilizada para as provas de

identificação.

OBS: Quando não houver crescimento ideal nesta temperatura, proceder o

isolamento em outra placa e incubar à temperatura ambiente.

Page 32: Apostila Micologia

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ll - Prova do tubo germinativo

1 - Princípio:

Esta é uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo é formado

dentro de 2 horas por C. albicans, mas outras espécies, como Candida tropicalis podem

produzi-lo após 3 horas. Aproximadamente 95% das amostras de C. albicans são positivas.

O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por não ser septado, apresentar paredes

paralelas e não possuir constrição na sua extremidade “abaulada”.

2 - Material utilizado:

- 0,5 mL de soro humano, de cavalo, de carneiro, etc.

- pipetas Pasteur

- lâminas

- lamínulas

3 - Técnica:

Semear cultivo de 24-48 horas, em tubo contendo 0,5 mL de soro. Incubar a 37°C

durante duas horas. Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina e

cobrir com lamínula. Examinar ao microscópio com objetivas de 10 x e 40x.

4 - Estruturas observadas ao microscópio:

Page 33: Apostila Micologia

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lll - Prova do clamidoconídio (microcultivo)

1 - Princípio:

Observar a existência ou não de filamentação, a produção de clamidoconídios,

blastoconídios e de artroconídios, assim como a disposição destes elementos no micélio. C.

albicans produz clamidoconídios arredondados em posição intercalar ou terminal em

relação à pseudohifa. De modo geral, a maioria das espécies do gênero Candida formam

pseudohifas bem desenvolvidas. Já as leveduras dos gêneros Torulopsis, Rhodotorula e

Cryptococcus não produzem pseudohifas. Algumas leveduras ascosporadas apresentam

pseudohifas rudimentares ou não as formam. A presença de artroconídios é sugestiva de

Geotrichum spp. ou Trichosporon spp, este último associado a blastoconídios.

2 - Material utilizado:

- Cultivos de 24-48 horas

- Ágar fubá

- Placas de Petri (90x15 mm)

- Alça de platina com extremidade retilínea

- Lamínulas esterilizadas

3 - Técnica:

Fundir o meio de ágar fubá e verter sobre placa de Petri. Após a solidificação, com

o auxílio de uma alça de platina, fazer 3 estrias finas, paralelas na superfície da placa e

cobrir com lamínula esterilizada. Incubar a 25°C, durante 48-96 horas. Examinar ao

microscópio, com objetivas de 10 x e 40x.

4 - Observação ao Microscópio:

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IV - Prova de assimilação de fontes de C e N (auxanograma)

1- Princípio

O teste de assimilação indica a habilidade de uma levedura para utilizar um

composto na presença de oxigênio. Cada espécie possui seu padrão próprio de assimilação.

Essas provas são muito sensíveis e úteis para a identificação das leveduras. Estão

condicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimáticos que catalisam a

degradação dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervêm na redução do

nitrato.

2- Material utilizado

- Cultivo de 24-48 horas

- Meio C

- Meio N

- Placas de Petri 150 x15 mm esterilizadas

- Placas de Petri 90 x 15 mm esterilizadas

- Fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose,

melibiose, L-arabinose, celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina,

inositol)

- Fontes de nitrogênio (peptona e KNO3)

3- Técnica

Preparar suspensão da levedura ajustando a turbidez de acordo com o padrão 5 da

escala de MacFarland. Fundir os meios C e N e estabilizá-los em banho Maria a 50°C

durante a realização da prova. Para verificar a assimilação de fontes de carbono, misturar 2

mL da suspensão com 40 mL do meio C e verter em placa de Petri de 150 x 15 mm. Para

observar a assimilação de fontes de nitrogênio, misturar 1 ml da suspensão com 20 ml do

meio N, e verter em placa de Petri de 90 x 15 mm. Após a solidificação dos meios,

distribuir equidistantemente as fontes de carbono (meio C) ou nitrogênio (meio N) sobre o

Page 35: Apostila Micologia

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ágar. Incubar a 30°C durante 24-48 horas. Realizar leitura e observar surgimento de halo de

crescimento na área correspondente a cada fonte.

4- Leitura

Gli Gal Mal Sac Lac Raf Tre Mel Ram Dul Ino Cel Inu Man Xil KN

O3 Pep

V - Prova de fermentação de Açúcares (zimograma)

1- Princípio

A habilidade de uma levedura para fermentar um determinado açúcar dependerá da

presença ou ausência de um sistema de transporte que permitirá a absorção do açúcar a

baixas tensões de O2 e da presença de um sistema enzimático que atuará na degradação

glicolítica do açúcar com a formação de etanol e anidrido carbônico. A fermentação

positiva ou negativa de um determinado açúcar é um dado complementar para diferenciar

as espécies.

2- Material

- Cultivos de 24-48 horas

- Água destilada esterilizada (4ml)

- Meio de cultivo para a fermentação de açúcares: dextrose, maltose, sacarose,

lactose, galactose, e trealose

- Bateria de meios para fermentação (tubos de rosca com tubos de Durhan)

- Pipeta automática calibrada para 200 microlitros

Page 36: Apostila Micologia

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3. Técnica

Preparar uma suspensão de leveduras (turbidez de acordo com o padrão 5 da escala

de MacFarland). Inocular 200µl da suspensão em tubos de ensaio contendo os respectivos

carboidratos. Incubar a 37°C por 24-72 horas. Realizar leitura observando a produção de

ácido (mudança de cor do meio) e gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan).

A observação da prova é válida até 20 dias após a realização da mesma.

4- Leitura

Açúcar Dex Malt Sac Lac Galac Treal Gás

Page 37: Apostila Micologia

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VI - Produção de Urease

1- Princípio

É prova complementar de grande utilidade para confirmar a identificação de

algumas leveduras. Por exemplo, Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp.

O dermatófito T. mentagrophytes são urease positivos.

2- Material

-Cultivo de 24-48 horas

-Meio de uréia de Christensen

3- Técnica

Semear cultivos de 24-48 horas na superfície do meio de uréia de Christensen.

Incubar à temperatura de 30°C durante 24-48 horas e observar a viragem do indicador.

4- Leitura

Vermelho = positivo

Amarelo = negativo

II - Produção de Cápsula

1- Princípio

A formação de cápsula é observada em espécies de Cryptococcus, embora possa

ocorrer em outras espécies de leveduras. A observação de cápsula no exame direto de uma

levedura necessita complementação posterior da identificação através de outras técnicas

(prova da urease, cultivo em meio niger, auxanograma, etc.).

Page 38: Apostila Micologia

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2- Material

-Cultivo da levedura-problema

-Lâmina

-Lamínula

-Água destilada esterilizada

-Tinta da China

3- Técnica

Após homogeneizar a levedura com uma gota de água destilada e uma gota de tinta

da China sobre uma lâmina, sobrepor uma lamínula e observar ao microscópio.

4- Leitura

As preparações positivas irão mostrar a presença de uma área clara, a cápsula, em

torno da célula leveduriforme, sobre um fundo negro.

VIII - Produção de pigmento no ágar-niger

1- Princípio

Quando Cryptococcus neoformans é semeado num meio contendo extrato de

semente de niger, girassol ou alpiste, as colônias tornam-se negras ou marrons devido a

atividade de fenol oxidase da levedura. Colônias de outras leveduras, incluindo outras

espécies de Cryptococcus irão manter sua cor original. Esse meio deve ser utilizado na

triagem para isolamento de C. neoformans.

2- Material

-Meio de ágar-niger

-Alça de platina

-Cultivo da levedura-problema

Page 39: Apostila Micologia

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3- Técnica

Semear a levedura-problema em placa contendo meio de ágar-niger, pelo método do

esgotamento. Observar o crescimento da levedura na placa incubada a 37oC.

4- Leitura

A colônia de C. neoformans apresenta coloração marrom ou negra.

IX - Produção de ascosporos (Eugenio Reyes Arenas)

1- Princípio

Algumas espécies de leveduras formam ascos, que alojam esporos sexuados, as

ascosporas. A observação dessas estruturas é importante para a identificação da levedura.

Para estimular a produção de ascosporas é necessário cultivar o isolado em meios especiais

2- Material

-Cultivo da levedura-problema

-Placa contendo meio de Gesso, ou V-8.

-Alça de platina

-Bateria de Ziehl Nielsen

-Lâmina

3- Técnica

Semear a levedura-problema em meio de apropriado e incubar a 37°C ou à

temperatura ambiente, de acordo com a exigência do isolado. Após 5-7 dias, realizar

esfregaço em lâmina, corar pela técnica de Ziehl Nielsen e observar ao microscópio com

objetiva de 100 x.

Page 40: Apostila Micologia

40

4- Leitura

Examinar a forma e tamanho dos ascos e ascosporas e o número de ascosporas em

cada asco.

Principais estruturas microscópicas dos fungos

Hifa: Estruturas tubulares, constituídas de talo filamentoso (Segundo a cor, podem ser classificadas como hialina ou demácea)

� Septada; dividida em compartimentos

celulares através de septos parciais, completos ou perfurados.

� Cenocítica; filamento contínuo não sendo

“aparentemente” dividida por septos.

2. Blastoconídio: Organismo unicelular globoso,

ovóide ou elipsóide denominado levedura. Se origina quando a célula mãe gera um ou mais indivíduos por um processo denominado brotamento ou gemulação.

3. Pseudohifa: Constituída pela sequência de

brotamentos de leveduras sem separação entre as células filhas gerando uma estrutura alongada, de paredes não paralelas, sem septo mas com ponto de contrição entre uma célula e outra. Podem existir brotamentos laterais múltiplos que nascem a partir do ponto de contricção, formando assim o pseudomicélio.

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4. Artroconídios: São elementos retangulares de paredes grossas formados por fragmentação das formas cilíndricas dos fungos previa divisão do material genético.

5. Clamidoconídios: Estrutura de resistência

produzida pelo fungo como resposta frente às

condições adversas do meio. Células geralmente

globosas ou ovóides, de volume aumentado,

parede dupla e espessa. A localização no micélio

pode ser intercalar, apical ou terminal. Os conídeos

também podem apresentar esta estrutura.

Os fungos têm ciclos de reprodução assexual e sexual, onde os elementos de frutificação

podem ter uma disposição interna ou externa.

1. Zygomycota: Esporos sexuados-zigosporas. Esporos endógenos assexuados-

esporangiósporos, contidos em esporângios.

3. Ascomycotina: Em algum estágio da vida, produzem esporos endógenos sexuados-

ascosporos dentro de estruturas em forma de saco denominados ascos. Segundo a

morfologia do asco adquire a denominação de peritécio, apotécio ou cleistotécio.

4. Basidiomycotina: Esporos sexuados- basidiósporos situados externamente sobre a

célula mãe-baside.

5. Chytridiomycota:

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Reprodução Disposição Estruturas

Assexuada Externa Conídios, picnidioconídios

Interna Esporangiósporos

Sexuada Externa Basidiósporos

Interna Ascos simples, ascostroma, peritécio, cleistotécio,

apotécio.

Observe e descreva os caracteres microscópicos dos seguintes exemplos de reprodução dos

fungos.

Reprodução assexuada externa Reprodução assexuada interna Reprodução sexuada interna

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2.- Observe e desenhe as seguintes estruturas microscópicas dos seguintes fungos filamentosos: Trichophyton rubrum T. mentagrophytes T. tonsurans

Microsporum gypseum Microsporum canis Epidermophyton floccosum Aspergillus spp Penicillium spp Paecilomyces spp

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Fusarium spp Rhizopus spp Mucor spp

Phialophora spp Cladosporium spp Fonsecaea pedrosoi

Alternaria spp Curvularia spp Nattrassia mangiferae

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Sporothrix schenkii Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis

25°°°° 25°°°° 25°°°°

37°°°° 37°°°° 37°°°°

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6.- Referências bibliográficas

Arango M.; Castañeda E. Micosis Humanas Procedimentos Diagnósticos Exámenes

directos. 1995.

Ellis D.H. Clinical Mycology. The human opportunistic Mycoses. P. Fazer Inc. Guillinham

Printers Pty. Ltd. Australia 1994.

Hoog G.S. et al Atlas of clinical fungi. Contraolbureau oor Schimmelcultures,

Netherlands/Universitat Rovira Virgili , Spain. 2000.

Kern M. A. Medical Mycology. A Self-Instructional Text. F. A. Davis Company.

Philadelphia, 3 er ed 1988.

Lacaz C.Z.; Porto E.; Martin J. C. Micología Médica: Fungos, actinomicetos e algas de

interese médico 7 de. São Paulo: Sarvier, 1984.

Richardson M.D. & Warnock D.W. Fungal Infection. Diagnosis and managment.

Blockwell Scientific publication, london. 1er ed 1993.

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Autores

Agenor Messias Junior

Arnaldo Lopes Colombo

Eugenio Reyes Arenas

Olga Fischman Gompertz

Patrício Godoy Martinez

Victor Silva Vargas

Colaboradores

Cledja Soares deAmorim

Edméa Helena de Oliveira

Fabiane Camargo G. Nunes

Leila Paula de Almeida

Luis Zaror Cornejo

Marly Forjaz

Zelinda Maria Nakagawa