roteiro de aulas práticas de micologia

Roteiro para aulas práticas de Micologia – 2o Medicina – 2016

Departamento de Microbiologia e Imunologia – IBB/ UNESP

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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA – IBB/UNESP

CURSO DE MEDICINA HUMANA

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE MICOLOGIA

PROFESSORES

EDUARDO BAGAGLI

SANDRA BOSCO

APOIO ACADÊMICO

IVANA GIOVANNETTI CASTILHO

LARISSA RAGOZO C. DE OLIVEIRA

LUIZ ALQUATI

2016



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ASPECTOS GERAIS DA CARACTERIZAÇÃO MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA

DAS COLÔNIAS FÚNGICAS

A cultura de um micro-organismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na observação das características culturais de determinado fungo, pode-se considerar alguns aspectos, resumidos abaixo, os quais podem também ser encontrados

no livro de SIDRIM, JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais

de fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In: SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica ‘a luz de autores contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p. 83-86). São estes:

a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando cultivadas a 35

oC. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento

muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa de Petri.

b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura.

c) textura: é, talvez, o mais importante achado utilizado na caracterização de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos tipos:

colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão,

colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de substância farinácea espalhada em uma superfície,

colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam estruturas que lembram penas de aves dispersas na superfície do meio,

colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia de praia,

colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado,

colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à superfície do meio de cultura, recobrindo-o como uma película,

colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não algodonosa,



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colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual cremoso, sendo comumente observados no grupo das leveduras e da maioria das colônias bacterianas.

d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser:

colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, fazendo circunvoluções que lembram as observadas no cérebro,

colônias rugosas: nada mais são do que variações da cerebriforme, porém as pregas topográficas são menos evidentes, sendo as vezes radiais partindo do centro da colônia,

colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma saliência na parte central lembrando um pequeno cume,

colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio de cultura, assumindo o aspecto de cratera.

e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários: - se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no reverso,

- se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso da colônia, - se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura, - se o pigmento está presaente apenas nos esporos e ausente nas hifas, como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecaea pedrosoi). Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho até ao preto. Importante ressaltar que esta caracterização fenotípica da colônia visando a auxiliar na identificação de determinada espécie fúngica apresenta algumas limitações, principalmente devido à ocorrência de variações destas características dentro de uma mesma espécie, devido tanto a efeito ambiental, como também da subjetividade do observador. Dessa forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo, considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica. Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco precisos ou errôneos.

Os aspectos microscópicos são observados em materiais fúngicos (fragmentos de cultura, esfregaços, raspados, etc) sobre lâmina, com ou sem lamínula e coloração. As lâminas são inicialmente observadas no menor aumento e a seguir nos aumentos

maiores, sem necessariamente empregar a objetiva de imersão.



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PRÁTICA 1

ASPECTOS MACROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas

b) fundamento: Os estudos macroscópicos devem ser baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura, relevo (na frente e verso da colônia) e pigmentação

Exemplo:

Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme), de textura

(algodonosa, aveludada, pulverulenta, glabra, cremosa, etc), de relevo

(cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado, liso) de coloração (...), com bordos

(regulares ou irregulares).

Verso: (presença ou ausências) de fendas ou dobras, e (ausência ou presença) de

pigmento difusível no meio de cultura.

Descrever as características coloniais das culturas de Aspergillus sp. e Saccharomyces sp., conforme o modelo que segue. Aspergillus sp.

Saccharomyces sp.



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PRÁTICA 2

ASPECTOS MICROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS -

COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL ALGODÃO

a) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras.

b) técnica:

1. Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina.

2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de levedura, utilizando alça ou fio de platina.

3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura sobre a gota de lactofenol.e homogeneizar.

4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas de 10 e 40 vezes.

Desenhar as estruturas observadas: Aspergillus sp. Saccharomyces sp.

c) interpretação

Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que existem dois

tipos morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos (bolores ou micélios). As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, circular,

naveta, etc) e se reproduzem por brotamento (únicos ou múltiplos) ou por fissão (mais raro).

Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou cenocíticas. Na sua reprodução assexuada, é possível visualizar no micélio vegetativo os



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clamidósporos e artrósporos, e no micélio reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios (estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também denominados simplesmente conídios ou conídias) em conidióforos.

A vantagem desta técnica é de ser fácil e rápida a sua preparação, e a desvantagem é que em muitos fungos não se observa os órgãos de frutificação.

PRÁTICA 3

1 - PESQUISA DE Malassezia sp. E OUTRAS LEVEDURAS NO COURO

CABELUDO E MÃOS, POR CULTURA EM MEIOS DE SABOURAUD COM

CLORANFENICOL ADICIONADO OU NÃO DE 1% DE AZEITE DE OLIVA.

a) Finalidade: este meio enriquecido com substrato lipídico é utilizado para pesquisar o fungo Malassezia furfur ou outras espécies de leveduras lipofílicas, normalmente associadas ao couro cabeludo e envolvidas na etiologia Pitiríase Versicolor. Pesquisa de portadores assintomáticos (couro cabeludo).

b) Procedimentos de coleta da amostra: umedecer o swab em solução salina estéril e a seguir friccionar no couro cabeludo, girando o swab em todos os lados.

c) Cultura do Material Clínico

1. Abrir cuidadosamente a placa próximo ao bico de Bunsen;

2. Friccionar suavemente o swab sobre a superfície do meio de cultura, pela técnica de esgotamento previamente explicada na lousa;

3. identificar as placas com o número do grupo e data;

4. Vedar as placas com filme plástico;

5. Incubar as placas em estufa à 35ºC, por 7 dias.

d) Interpretação (a ser feita na próxima aula)

Observar as placas semeadas com o material a 35ºC, por 7-14 dias e verificar se houve o crescimento de microrganismos. Selecione uma colônia e faça a descrição macroscópica e preparação de lâminas com Lactofenol azul algodão. Observar ao microscópio e desenhar. Discutir o significado clínico dos achados micológicos dos demais grupos.



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PRÁTICA 4

OBSERVAÇÃO DE CULTURAS E LÂMINAS DE FUNGOS CAUSADORES DE

MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS

1. Examinar ao microscópio material raspado de pele de pacientes com Pitiriase versicolor: Desenhar as estruturas observadas.

2. Observar os pêlos infectados com as Piedras (Branca e Preta) e desenhar as estruturas: Piedra Preta Piedra Branca



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3. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Trichosporon sp.

Hortae werneckii

Microsporum canis

Microsporum gypseum



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Trichophyton mentagrophytes

Epidermophyton flocosum

4 – Quiz micológico:

4.1 – Quais os agentes etiológicos das Piedras Branca e Preta? __________________________________________________________________

4.2 – Hortea werneckii é um fungo hialino ou dematiáceo? __________________________________________________________________

4.3 – Quais os tipos de conídios observados nos 3 gêneros de fungos dermatófitos? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________



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PRÁTICA 5

FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUBCUTÂNEAS

1 – Observar as lâminas de cortes histológicos de pacientes com Cromoblastomicose e Lacaziose. Desenhar as estruturas fúngicas observadas.

Cromoblastomicose Lacaziose coloração: HE coloração GMS

2. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Sporothrix spp. (Fase Micelial)

Sporothrix spp. (Fase Leveduriforme)



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Pythium insidosum

Coloração com LFAA produção de esporângio

em material vegetal

Phialophora verrucosa

Cladophialophora carrionii



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Fonsecaea pedrosoi


3.1 – Quais fungos observados são dematiáceos? __________________________________________________________________

3.2 – Quais os tipos de corpos frutificação observados nos agentes de cromoblastomicose?

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3.3 – Qual a estrutura patognomônica da cromoblastomicose?

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3.4 – Qual dos fungos, estudados hoje, não é cultivável? ________________________________________________________________

3.5 – Qual dos fungos, estudados na aula de hoje, não é um fungo verdadeiro? __________________________________________________________________



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PRÁTICA 6

FUNGOS DIMÓRFICOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS

1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos:

Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Micelial)

Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Leveduriforme)



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Histoplasma capsulatum (Fase Micelial)

Histoplasma capsulatum (Fase Leveduriforme)


2.1 – Quais são as estruturas infectantes de P. brasiliensis e H. capsulatum? __________________________________________________________________

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2.2 – Qual a semelhança (morfológica) e diferença (de função e fase) entre leveduras de P. brasiliensis e macroconídias de H. capsulatum? __________________________________________________________________

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PRÁTICA 7

FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES OPORTUNISTAS

1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas das espécies de Aspergillus:

Aspergillus flavus

Aspergillus fumigatus

Aspergillus niger



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2. Observar ao microscópio e desenhar as estruturas visualizadas de esfregaço de secreção vaginal de paciente com vulvovaginite por C. albicans corado pelo método de Gram ou Giemsa.

3. Descrever as características coloniais de cultura de Candida albicans cultivada em agar Sabouraud, observar e desenhar as estruturas microscópicas: esfregaço de cultura corado com LFAA, clamidósporo e formação de Tubo Germinativo.

Candida albicans

esfregaço de cultura filamentação e clamidoconídio tubo germinativo



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4. Diferenciação de Candida albicans de outras espécies de Candida pelo meio CHROMagar-Candida®. Observar o crescimento das colônias e diferenciá-las pela coloração: Candida albicans – cor:_______________________

Candida tropicalis – cor:_______________________

Candida spp. – cor: __________________________

5 – Descrever as características coloniais de Cryptococcus neoformans cultivado em agar Sabouraud (SAB) e Agar Semente de Niger (NSA). Observar as características microscópicas de esfregaço de cultura corado pelo Nankin.

Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Sabouraud)

Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Semente de Niger)

coloração pela tinta da China (Nankin)



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6 – Diferenciação entre C. neoformans e C. gattii pelo método de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol)

Teste CGB positivo Teste CGB negativo

Cor:____________________ Cor: _________________

Espécie: ________________ Espécie: ______________

7 – Quis micológico:

7.1 – Diferencie as três espécies de Aspegillus pelo aspecto macroscópico

(coloração) e microscópico (tipo de corpo de frutificação).

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7.2 – Como diferenciar se Candida albicans está em condição de comensalismo ou

parasitismo?

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7.3 – Cite dois fatores de virulência de Cryptococcus neoformans observados na

aula prática de hoje.

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