BIOTECNOLOGIA

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1BIOTECNOLOGIA

Prof. Dr. Jos Gilberto JardineAtualizada em agosto 2011

CENTRO DE CINCIAS DA VIDAFACULDADE DE CINCIAS BILGICAS

Se um dia tudo lhe parecer perdido, lembre-se de que voc nasceu sem nada, e que tudo que conseguiu foi atravs de esforos e os esforos nunca se perdem, somente dignificam as pessoasCharlie Chaplin

2BIOTECNOLOGIA resultado da interseco entre reas do conhecimentoEngenharia(Engenh. Qumica) Qumica BiologiaEngenhariaBioqumicaQumica IndustriaBiotecnologiaBioqumicaBiologia molecularBIOTECNOLOGIA Conceito e definio3BIOTECNOLOGIA Conceito e definio1. O QUE BIOTECONOLOGIA?Biotecnologia "a aplicao dos princpios cientficos e da Engenharia ao processamento de materiais, atravs de agentes biolgicos , para prover bens e assegurar servios."CONHECIMENTO: Microbiologia, Bioqumica, Gentica, Engenharia, Qumica, Informtica.AGENTES BIOLGICOS: Microrganismos, Clulas e Molculas (Enzimas, Anticorpos, DNA, etc.).BENS: Alimentos, Bebidas, Produtos Qumicos, Energia, Produtos Farmacuticos, Pesticidas, etc.SERVIOS: Purificao da gua, Tratamentos de resduos, Controle de poluio, etc.4Assim, Biotecnologia o conjunto de tcnicas que permite Indstria Farmacutica cultivar microrganismos para produzir os antibiticos que sero comprados na Farmcia. Como Biotecnologia o saber que permite cultivar clulas de morango para obter mudas comerciais. E tambm Biotecnologia o processo que permite o tratamento de despejos sanitrios pela ao de microorganismos em fossas spticas.

Hoje, enquadram-se tambm dentro da biotecnologia as tcnicas de cultivo de clulas e tecidos, "in vitro", visando a micropropagao, a limpeza clonal, a produo de frmacos, enzimas, hormnios, vacinas e de outros produtos qumicos bioconvertidos. Alm disso, h quem inclua, ainda, as tcnicas de sequenciamento do DNA e as de clonagem de seres vivos, objetivando a "cpia" de indivduos identificados como portadores de caractersticas que devem ser perpetuadas (exemplo: animais considerados excepcionais no que tange a sua capacidade produtiva - de ovos, de carne ou de leite).

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio52. BIOTECNOLOGIA: PASSADO E FUTURO J na Antigidade o homem fazia po e bebidas fermentadas; uma das fontes de alimentos dos Astecas eram as algas que eles cultivavam nos lagos. Por que criar uma palavra nova para uma atividade to antiga? Porque as atividades biotecnolgicas de hoje diferem muito daquelas artesanais.

A partir do sculo XIX, com o progresso da tcnica e da cincia, especialmente a Microbiologia, assistimos a grandes avanos na tecnologia das fermentaes. No incio do sculo XX desenvolveram-se as tcnicas de cultura de tecidos e a partir de meados do sculo surgem novos horizontes com a Biologia Molecular e com a Informtica que permite a automatizao e o controle das plantas industriais.BIOTECNOLOGIA Conceito e definio6No final da dcada de 70 a Engenharia Gentica revoluciona a Biotecnologia "clssica" dando origem ao que denominamos "nova" Biotecnologia. Agora, torna-se possvel "convencer " uma clula a fazer algo para o qual ela no estava programada.

Esta tecnologia implica na modificao direta do genoma do organismo alvo pela introduo intencional de fragmentos de DNA exgenos (genes exgenos) que possuem uma funo conhecida. Sendo assim, por meio de engenharia gentica, o gene (DNA) que contm a informao para sntese de uma definida protena de interesse pode ser transferido para outro organismo que ento produzir grandes quantidades da substncia. BIOTECNOLOGIA Conceito e definio7Estes conceitos tm definido e delimitado o que se denomina biotecnologia moderna, diferenciando-a da biotecnologia antiga. Exemplos de substncias ou produtos que tm sido produzidos por meio da biotecnologia moderna ou engenharia gentica incluem interferon humano (substncia natural sintetizada no organismo humano para defesa contra vrus), insulina humana, hormnios de crescimento humano, plantas resistentes a vrus, plantas tolerantes a insetos e plantas resistentes a herbicidas. Outro uso importante da biotecnologia implica na produo de bactrias, utilizadas para biodegradao de vazamentos de leos ou lixos txicos.A nova Biotecnologia j tem lanado vrios produtos no mercado mundial. Em alguns casos, como os da insulina e do hormnio do crescimento, a inovao consiste em substituir os mtodos de obteno tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais, trata-se de produtos inteiramente novos.BIOTECNOLOGIA Conceito e definio8POTENCIALIDADES

A exemplo do que ocorreu com a chamada Indstria da Informao, no demorou muito para que bilogos recm-egressos das universidades criassem as primeiras Empresas de Engenharia Gentica, visando a transformao de bactrias em fbricas de protenas. Selecionaram como genes a serem introduzidos os da insulina (protena que controla o metabolismo dos acares no organismo humano) e do interferon (protena usada no combate a alguns tipos de cancer). Escolheram como hospedeiro a bactria Escherichia coli, organismo fcil de ser mantido e multiplicado em Laboratrio e que vive inofensivamente no intestino de seres humanos. Os tanques onde se cultivavam a bactria modificada para produzir, em quantidades industriais, as protenas acima mencionadas foram denominados de BIORREATORES.

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio9Como era de se esperar, surgiram inmeras idias para produo de frmacos, enzimas, hormnios, vacinas e de outros produtos qumicos bioconvertidos. Algumas Empresas, baseadas em biorreatores, funcionaram e prosperaram, enquanto que outras fracassaram.

Outra rea de sucesso quase que imediato foi a da aplicao das tcnicas de cultura de clulas e tecidos vegetais, in vitro, visando a produo de "mudas" (micropropagao).

Como a tcnica de Engenharia Gentica "relativamente simples", ela foi quase que imediatamente aplicada, visando a produo comercial de indivduos transgnicos.

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio10As iniciativas mais conhecidas foram:

1. produo de uma linhagem de bactrias da espcie Pseudomonas syringae que foi geneticamente modificada para impedir a formao de gelo na superfcie das plantas (combate a geada em morango);

2. produo de soja geneticamente modificada para resistir ao herbicida glifosato;

3. produo de soja, batata, algodo e milho, geneticamente modificados para resistir ao ataque de insetos (plantas com genes da bactria Bacillus thuringiensis; da o nome de "plantas Bt");

4. produo de tomateiros geneticamente modificados para retardar o processo de amolecimento dos frutos e em conseqncia melhor resistir ao transporte;BIOTECNOLOGIA Conceito e definio115. produo do arroz dourado: arroz geneticamente modificado que produz -caroteno (precursor da vitamina A) em grandes quantidade;

6. produo de milho geneticamente modificado, com gros contendo hormnio do crescimento humano (hGH).

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio

12BIOTECNOLOGIA Conceito e definioA Engenharia Gentica, mais apropriadamente chamada de tecnologia do DNA recombinante, um conjunto de tcnicas que possibilitam a manipulao do material gentico, por meio de corte e recombinao das molculas do DNA, alm de incluir processos que realizam a duplicao desse material em grande quantidade.

As ferramentas fundamentais da Engenharia Gentica so as enzimas de restrio ou endonucleases. So, normalmente, produzidas por bactrias, que as utilizam para fragmentar o DNA em pequenos pedaos.

Os fragmentos de DNA obtidos a partir do uso das enzimas de restrio podem ser unidos por enzimas denominadas ligases.

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14Nanotecnologia a utilizao de partculas que so medidas na ordem de nanmetros em vrias cincias

Nanobiotecnologia a aplicao da nanotecnologia na Biologia

Perspectivas: Superfcies nanofabricadas com padres estruturais poderiam fazer crescer artificialmente ilhas pancreticas e reverter os efeitos da diabetes. Nanodispositivos poderiam funcionar como kits de reparo de neurnios para pessoas com mal de Parkinson ou doena de Alzheimer. Destruir vrus ou clulas cancerosas. Descoberta acelerada de drogas, com menor custo.

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio15

16A idia que muitos leigos tm a de que "esta nova cincia" ir fornecer as respostas para a maioria de seus problemas. At que ponto esta concepo correta? no estariam alguns membros da comunidade cientfica "vendendo uma mercadoria" que ainda no possuem no estoque?

A mdia trata a Biotecnologia ora como a grande soluo para os problemas atuais e futuros (viso otimista), ora como causadora de problemas, no s de "sade", mas tambm de "natureza ambiental" ou at mesmo "ticos" (viso pessimista); quem estaria com a razo: os "otimistas" ou os "pessimistas"?

Estas questes merecem ser discutidas de maneira mais racional, mas, infelizmente, ainda no se chegou a nenhum consenso. Na maioria das vezes, quando um grupo decide discuti-las as posies se polarizam entre os fundamentalistas da Biotecnologia versus os fundamentalistas que se opem a ela.

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio17Fazendo uma analogia com a CONSTRUO DE UM PRDIO, diria que o Edifcio da Biotecnologia ainda est em construo: poucos de seus apartamentos j esto prontos e podem ser habitados, outros necessitam finalizar o acabamento e, finalmente, existem aqueles que ainda esto sem portas, janelas e at sem paredes externas. A insistncia em habitar estes ltimos resulta, muitas vezes, em acidentes graves, que podem, inclusive, redundar em morte do condmino.

BIOTECNOLOGIA Conceito e definio18BIOTECNOLOGIA BIOPROCESSOS CATALISADOS POR ENZIMAS19BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas3. BIOPROCESSOS CATALISADOS POR ENZIMAS

ENZIMA uma protena sintetizada na clula viva que catalisa uma reao termodinamicamente possvel.

As enzimas so de ocorrncia universal nos materiais biolgicos. Grande crescimento nos ltimos anos devido sua importncia nas reas : farmacologia, tecnologia de alimentos, toxicologia, medicina, engenharia qumica, biotecnologia, etc. As enzimas so hidrossolveis. A enzima no modifica a constante de equilbrio de uma reao pois atua em concentraes muito baixas que no guardam proporo com a mudana catalisada. Natureza de especificidade. Origens: Humana : pepsina (estmago), amilases (saliva), proteases, amilases, lipases ( pncreas ) renina ( estmago de ruminantes); Vegetal : papaina ( mamo ), bromelina ( abacaxi ), ficina ( figo ); Microbianas ( bactrias, leveduras, fungos ). Presena indesejvel : escurecimento de vegetais; clarificao; rancificao, etc.

20BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas 3.1 Cintica enzimtica Do ponto de vista termodinmico, uma enzima um catalisador que acelera uma reao porque diminui a energia de ativao. Isto acontece porque a enzima aumenta o nmero de molculas ativas, capazes de reagir. dF de reaoCoordenadas de reaoCoordenadas de energia Ane Ae Ea para reao no enzimticaEa para reao enzimtica21BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas Influncia da Concentrao de Enzima, Concentrao de Substrato,Temperatura, pH, na cintica de reaes catalisadas por enzimas. (rever bioqumica) 3.2 Extremozimas H cerca de 30 anos, os cientistas pensavam que s existia vida em um nmero muito limitado de habitats. Hoje, porm, no resta dvida de que at mesmo os ambientes mais extremos so colonizados por microorganismos especiais, muito bem adaptados a esses ninhos ecolgicos. Esses organismos, os extremfilos, esto presentes em bitipos onde outras criaturas no conseguem sobreviver.

Os extremfilos so encontrados em altas temperaturas (termfilos), sob condies de frio extremo, como geleiras (organismos psicroflicos), em lagos de elevada salinidade (halfilos) e em ambientes extremamente cidos (acidfilos) ou alcalinos (alcalinfilos), nas altas presses do fundo do mar ou na abundncia de metais txicos (metalfilos) A descoberta de organismos extremfilos abre novas oportunidades para o desenvolvimento de enzimas que apresentam atividade sob as circunstncias extremas (as extremozimas), encontradas com freqncia em processos industriais.22BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas3.3 Classificao das enzimas

OXIDO-REDUTASES : catalisam as reaes de xido-reduo. Os nomes comuns para muitas dessa enzimas so: desidrogenases, oxidases, peroxidades.

HIDROLASES : catalisam as reaes de hidrlise. H um grande nmero dessas enzimas.

TRANSFERASES : catalisam a transferncia de grupos. Alguns nomes comuns: transaminases quinases, transacetilases.

ISOMERASES : catalisam diferentes tipos de isomerisao. So divididas em: racemases, epimerases, cis-trans isomerase, cetol isomerases intramoleculares, mutases ou transferases intramoleculares.

LIGASES : catalisam reaes que unem duas molculas conjugadamente com o rompimento de uma ligao pirofosfrica.

LIASES : catalisam reversivelmente a remoo de grupos do substrato no hidroliticamente. A fumarase catalisa a remoo de gua de malato de modo reversvel dando fumarato.

23BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas3.4 Hidrolases/Carbohidrases Alfa amilase: uma endoenzima que catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) do amido internamente, de forma desordenada.

O produto da hidrlise so oligossacardeos de mdio P.M. (dextrinas).

Origem das -amilases: suco pancretico, saliva; durante germinao de cereais; fngica ou bacteriana.

Beta amilase: uma exoenzima que catalisa a reao de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) de duas em duas unidades de glicose a partir da extremidade no redutora das molculas do amido.

Os produtos da hidrlise so maltose e beta limite dextrina.

Origem das beta amilases: cereais como a cevada, soja, batata doce; microbiana bactrias. A batata doce crua tem gosto de amido. Aps cozimento tem sabor adocicado. Porque? Malteao da cevada para fabricao de cerveja e wisk.

24BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas Amiloglicosidase: uma exoenzima que catalisa a reao de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) e -(1-6) de uma em uma unidade de glicose a partir da extremidade no redutora. O produto da hidrlise a glicose.

Desramificantes: uma endoenzima que catalisa a reao de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-6). Transforma amilopectina em amilose.

Ciclodextrina-glicosil-transferase ( CGTase): catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) e em seguida catalisa a ciclizao do oligossacardeo. O produto so ciclodextrinas formadas principalmente por seis unidades de glicose (-ciclodextrina); sete unidades de glicose (-ciclodextrinas) e oito unidades de glicose (-ciclodextrinas), podendo chegar a at 12 unidades.

As ciclodextrinas possuem uma superfcie exterior polar e uma cavidade apolar. Dado o carter hidrfilo da superfcie exterior, as ciclodextrinas podem dissolver-se na gua, ao mesmo tempo que disponibilizam uma cavidade apolar (hidrfoba) capaz de formar complexos de incluso com vrios tipos de molculas hspedes.

25 Dextram sacarase: Catalisa a reao de hidrlise da sacarose e em seguida catalisa a polimerizao das unidades de glicose atravs de ligaes glicosdicas -(1-6) e -(1-3). O polmero que se forma denominado de Dextrano. O dextrano reduz o rendimento industrial de sacarose porque: aumenta a viscosidade do caldo dificultando a clarificao deste; reduz a velocidade de cristalizao da sacarose; causa entupimento dos filtros; perda de sacarose que se transforma em dextrano.

Na indstria farmacutica essa enzima empregada justamente para se obter o dextrano utilizado como substituto do plasma sanguneo.

Nas indstrias qumica e de alimentos o dextrano utilizado como espessante em processos tecnolgicos.

Invertase: Catalisa a reao de hidrlise da sacarose produzindo acar invertido glicose mais frutose.

Glicose 70% da doura da sacarose Frutose 50% mais doce que a sacarose

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas26 -galactosidase ou lactase: Catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) dos oligossacardeos que possuem a galactose na estrutura molecular. Os seres humanos sintetizam essa enzima, principalmente na infncia quando o consumo de lactose maior. A falta de lactase no organismo causa flatulncia e diarreia pois a lactose no pode ser hidrolisada e absorvida no trato digestivo, sendo fermentada por microorganismos. (Lactose um dissacardeo formado por galactose e glicose unidas por ligaes glicosdicas -(1-4). BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas273.5 Processo de produo de dextrinas ( Liquefao do amido)A liquefao do amido consiste na obteno de suspenses com alta concentrao de oligossacardeos de pesos moleculares variados. Liquefao cida Liquefao enzimtica3.6 Processo de produo de glicose, frutose.....3.7 Hidrolases/PectinasesSubstncias pecticas: so polmeros do cido D-galacturnico unidos por ligaes glicosdicas -(1-4) e se constituem basicamente em protopectinas, cido pcticos, cido pctinicos e pectinas.Pectina: polmero de cido galacturnico interligados por ligaes glicosdicas -(1-4), metoxilados em diversos graus (baixo mdio e alto). Formam solues altamente viscosas mesmo em baixas concentraes. Formam gis com sacarose e cidos. Pectinas naturais possuem cerca de 50% dos grupos carboxilas metoxilados

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas28 Pectina metil esteraze: catalisa a remoo de grupos metoxila esterificados nas substncias pcticas. Polimetil galacturanase: catalisa a hidrlise das ligaes glicosdicas dos cidos galacturnicos metoxilados. A forma endo catalisa a hidrlise de forma desordenada enquanto que a forma exo remove unidades a partir das extremidades.3.8 Aplicaes das pectinases Extrao Clarificao

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas293.9 Hidrolases/Proteases Proteases ou enzimas proteolticas: catalisam reaes de hidrlise das ligaes peptdicas das protenas. Exopeptidases; catalisam as reaes de hidrlise dos aminocidos das extremidades das cadeias proticas. So encontradas as carboxipeptidases e as aminopeptidases Endopeptidases: catalisam as reaes de hidrlise das ligaes peptidicas internas s molculas de protenas. So encontradas as: Serina protease: no centro ativo da enzima h uma serina. SH protease: centro ativo contem grupo sulfidrila. Metalo protease: centro ativo contem metais - Mg, Zn, Co, Fe, Cu, Ni, Cd. Protease cida: possui pH timo de atividade em torno de 2 a 5. Em geral, seu centro ativo possui grupo carboxila.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas303.10 Aplicaes de proteases

3.11 Hidrolases/Lipases Lipases ou enzimas lipolticas: catalisam reaes de hidrlise de lipdeos a glicerol, mono ou diglicerdeos. So encontradas no pncreas, plasma sangneo, saliva, suco pancretico, leite e plantas oleaginosas. H vrios microorganismos produtores de lipases, fungos leveduras e bactrias. Tecnologicamente muito importante no apenas a funo cataltica de hidrlise mas tambm as funes catalticas em reverso em reaes de transesterificao e de esterificao, dependendo das condies de reao.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas313.12 Oxiredutases So enzimas que catalisam reaes de oxidao e de reduo. Dehidrogenases: catalisam reaes de oxidao provocando a eliminao de hidrognio do substrato. Oxigenases: catalisam reaes de oxidao, incorporando oxignio molecular ao substrato pela ativao do oxignio. Peroxidases: utilizam o perxido de hidrognio como oxidante para provocar a oxidao do substrato. Fenolases: catalisam a oxidao de compostos fenlicos. Principal enzima a polifenoloxidase.Catalase: catalisa especificamente a decomposio da gua oxigenada em oxignio molecular e gua. Lipoxigenase: encontrada apenas em vegetais, particularmente em leguminosas. Catalisam reaes de degradao e oxidao de cidos graxos insaturados, dando origem ao rano lipoltco-enzimtico. Os radicais livres originrios da degradao dos cidos graxos, destroem protenas e vitaminas.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas32 cido ascrbico oxidase: catalisa a reao de oxidao do cido L-ascrbico a L-dehidroascrbico. A reao pode ser revertida utilizando-se a enzima cido ascrbico redutase.

3.13 IsomerasesCatalisam diferentes tipos de isomerisao. So divididas em: racemases, epimerases, cis-trans isomerase, cetol isomerases intramoleculares, mutases ou transferases intramoleculares. Glicose isomerase: catalisa a interconverso entre aldose e cetose.GlicoseFrutoseBIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas333.14 Outras Aplicaes de Biocatalisadores lcool Etlico No Brasil o lcool combustvel produzido facilmente a partir de cana de acar, um substrato diretamente fermentvel que dispensa pr-tratamento e hidrlise. O lcool combustvel pode se obtido a partir de amido de milho, sendo um dos grandes objetivos da biotecnologia americana e de muitos pases europeus a viabilizao econmica do lcool de materiais lignocelulsicos e principalmente de resduos da agroindstria. A produo de etanol de mandioca e de resduos da agroindstria, chamados de biomassa, envolve a hidrlise destes materiais acares fermentveis. Rao animalAs enzimas para rao animal, adicionadas rao de sunos e aves domsticas, destinam-se a reduzir a excreo de produtos residuais e melhorar a digestibilidade de matrias-primas.

As xilanases e as fitases encontram-se entre as enzimas de rao animal mais conhecidas, sendo ambas produzidas por meio de microorganismos modificados pela engenharia gentica.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas34A xilanase hidrolisa as hemiceluloses presentes no trigo e no milho, facilitando a digesto de todos os nutrientes e reduzindo a excreo de estrume, nitrognio e fsforo.

A fitase decompe o fitato, composto fosforoso presente nos gros de rao animal. Os animais requerem fosfatos para seu adequado crescimento esqueltico, mas no so capazes de digerir o fitato. Costuma-se, portanto, acrescentar fsforo (inorgnico) rao, o que leva excreo de grandes volumes de fsforo e poluio do meio ambiente.

O fitato pode ser digerido pela adio de fitase rao animal. Reduz-se assim a necessidade de usar suplementos de fosfato inorgnico com vantagens econmicas e ambientais.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas35 AlimentosCervejaClarificao de cervejaMalteaoSucos de Frutas ExtraoClarificaoVinhosExtraoPanificaoProteasesAmilasesBIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas36CarnesAmaciamentoLeiteDeslactaoSorvete/Doce de leite Papel Couros Tecelagem Detergentes Medicamentos

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas373.15 Reatores com clulas ou enzimas Imobilizadas

Os sistemas com agentes imobilizados tm como principal caracterstica o uso de algumas estruturas fsicas de confinamento que obrigas os agentes do bioprocesso a permanecerem em uma regio particular do biorreator.A opo entre as formas solvel e imobilizada de uso de uma enzima ou clula depende da natureza do processo de converso e da estabilidade operacional das duas formas.

No caso das clulas imobilizadas h que considerar dois tipos de bioprocessos.

O primeiro aquele que utiliza uma ou algumas enzimas contidas nas clula, no havendo necessidade de coenzimas e vias anablicas presentes na replicao celular. As clulas no necessitam estar vivas quando imobilizadas; somente deve estar ativo o sistema enzimtico envolvido na converso bioqumica requerida.

O segundo tipo de processo que utiliza clulas imobilizada aquele em que se impe a necessidade de manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos a serem formados requerem mltiplos passos de transformaes, regenerao de coenzimas, presena de cadeia respiratria, vias metablicas geradoras de intermedirios e outros mecanismos inerentes s clulas vivas.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas38As principais vantagens da utilizao de agentes biotecnolgicos imobilizados so:- possibilidade de utilizao de altas concentraes do agente no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento;- operao de sistemas contnuos vazo especfica de alimentao;- maior proteo ao sistema biolgico em relao ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentraes de substrato, pH e cisalhamento;- reuso do agente de bioprocesso;- reduo do investimento fixo nas instalaes;- reduo do custo operacional.

Processos que utilizam clulas imobilizadas

Produo de cido actico (vinagre)Produo de etanol Produo de antibiticosTratamento de resduosProduo de metablitos utilizando clulas animais ou vegetais

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas39 Mtodos de Imobilizao de biocatalisadoresEnzimas ImobilizadasLigao a suporte *EntrelaamentoAdsorsofsicaLigaoinicaLigaocovalentematrizesmicrocpsula* Com ligao cruzada ou noBIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Enzimas40BIOPROCESSOS CONDUZIDOS COM MICRORGANISMOSBIOTECNOLOGIA41

As caractersticas essenciais de um bioprocesso microbiolgico industriaisMICRORGANISMOSVrusBactriasFungosAlgasProtozoriosSubstratoAdicionados no meio de culturaRecuperao e Purificao do ProdutoProdutos do metabolismoClula microbianasFrao das clulasRESIDUO OU MATERIAL DE EXCREO++42Microrganismo selecionado

Preparo inoculo: etapa de laboratrio

Preparo inoculo: etapa industrialArCompressorEsterilizao do arMeio de cultura selecionadoEsterilizaoMatrias-primasClulasSeparao das clulasCaldo fermentado Recuperao ProdutoProduto

Tratamento efluentesBiorreatorEsquema geral de um bioprocesso43BIORREMEDIAOTecnologia que utiliza agentes biolgicos, particularmente os microrganismos, para remover poluentes txicos do ambiente, principalmente do solo e da gua. Os poluentes so decompostos em substancias atxicas por meio do metabolismos microbiano.

44BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

4. BIOPROCESSOS COM MICROORGANISMOS

4.1 Substrato

Uma grande variedade de matrias-primas, geralmente provenientes da agroindstria, so utilizadas como fonte(s) de substrato(s) e outros nutrientes. De uma forma geral, as matrias-primas de bioconverses podem ser agrupadas em funo da estrutura e da complexidade molecular dos substratos.

A matria-prima um dos componentes mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em que pode representar at 75% do custo total, sendo esta uma das razes pelo crescente interesse no aproveitamento de resduos agroindustriais.

A escolha dos nutrientes adequados gerao do produto de interesse est relacionada atividade metablica desenvolvida pelos microrganismos. Nesse ponto, destaca-se a importncia das informaes obtidas sobre as exigncias nutricionais da populao microbiana envolvida no processo. 45BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

As condies que permitem a produo mxima de massa molecular no so necessariamente as mesmas que permitem a mxima produo de um determinado produto. Aspergillus niger , por exemplo , d melhores rendimentos de cido ctrico, quando seu crescimento restringido , por concentraes de semi-inanio de nitrognio, fsforo, porem com alta concentrao de acar.

Agrupamento das fontes de substrato em funo da estrutura e da complexidade molecular dos substratos.

Substratos solveis que podem ser facilmente extrados produto(s) como por exemplo, sacarose, glicose, frutose e lactose, provenientes de cana-de-acar, beterraba, melao, soro de leite, etc.

Substratos insolveis, que precisam de tratamento moderado para solubilizao e hidrlise, antes da converso em produto(s) como por exemplo, amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata, etc.

Substratos insolveis muito resistentes, que necessitam de pr-tratamento fsico, seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzir substratos na forma monomrica a ser convertidos em produto(s) como, por exemplo, celulose e hemicelulose.


4.1.1 Fonte de energia: A adenosina-trifosfato (ATP) o composto mais importante nas transformaes de energia das clulas. As bactrias e as algas fotossintticas podem utilizar a energia da luz para formao de ATP; as bactrias autotrficas podem gerar ATP pela oxidao de compostos inorgnicos; ao passo que as bactrias, leveduras e fungos heterotrficos formam ATP oxidando compostos orgnicos. Nas indstrias de fermentao, a fonte mais comum de energia amido ou melao.

4.1.2 Fonte de carbono: As necessidades de carbono so supridas com a fonte de energia, porm as bactrias autotrficas e fotossintticas utilizam dixido de carbono. A via pela qual os heterotrficos metabolizam carbono de substrato importante para se determinar a quantidade de carbono convertido em material celular. Verifica-se que os organismos facultativos incorporam cerca de 10% do carbono do substrato quando metabolizam anaerobiamente, porm 50 - 55% com metabolismo completamente aerbio.

4.1.3 Fonte de nitrognio: O nitrognio pode ser suprido maioria dos organismos industrialmente importantes por meio de amnia ou de seus sais, embora o crescimento seja mais rpido quando se utiliza nitrognio orgnico. Os compostos orgnicos nitrogenados mais utilizados industrialmente so: farelo de soja, farelo de amendoim, farinhas de peixe ou carne, as borras de cerveja, extrato de levedura, soro de leite.

4.1.4 Fonte de minerais: fsforo e magnsio so constituintes particularmente importantes no meio de cultura, pois so relacionados com todas as reaes de transferncia de energia envolvendo ATP. Tambm so indispensveis para o bom desenvolvimento da cultura, o clcio, potssio, enxofre e sdio, assim como os micronutrientes: ferro, cobalto, cobre e zinco.


4.2 Esterilizao de equipamentos e substrato

Esterilizao o processo fsico ou qumico que destri ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrganismos incluindo bactrias, fungos - tanto em suas formas vegetativas como esporuladas - e viros. O termo esterilizao possui um significado absoluto e no relativo, ou seja, uma substncia ou material no pode ser parcialmente estril. Um material estril totalmente isento de qualquer organismo ativo.

Em alguns processos biotecnolgicos industriais, a eliminao parcial da populao microbiana dos equipamentos e meios de crescimento suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde inibidores de crescimento so produzidos (fermentao alcolica, produo de vinagre, cido lctico, antibiticos e outro biocidas), o teor de inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vrios microorganismos.

Existem, tambm, bioprocessos em que se prescinde totalmente de assepsia, como o caso dos biotratamentos, nos quais a microbiota nativa, atuando de forma consorciada extremamente desejvel, para que haja reduo da carga orgnica poluidora.Na prtica, considera-se que uma esterilizao foi realizada com sucesso quando estiver garantida a assepsia adequada.


A esterilizao pode ser pela destruio ou pela retirada dos microrganismos do meio A destruio feita pela aplicao de calor , produtos qumicos ou radiao . A retirada feita por processo de filtrao .

4.2.1 Calor: De todos os processos empregados para a destruio de microrganismo, o calor , sem dvida, o mais eficiente e econmico. Pode ser empregado de duas maneiras: seco ou mido.Calor seco age promovendo uma oxidao violenta de compostos do protoplasma. Sua eficincia relativamente baixa, pois tem pouca capacidade de penetrao. Nem todo tipo de material pode ser submetido s temperaturas necessrias para esterilizao pelo calor seco (160 a 180 oC) durante um tempo mnimo de uma ou duas horas.Calor mido muito mais eficiente. Age promovendo a destruio de protenas e dissoluo de lipdeos. Tem alta capacidade de penetrao e pode ser utilizado para uma grande variedade de materiais . A forma mais comum de emprego do calor mido consiste na utilizao de vapor de gua superaquecido sob presso.

A esterilizao com calor pode ser descontnua (batelada) ou contnua.


Na esterilizao em batelada, o tempo total de esterilizao relativamente grande, podendo dar origem a decomposio de nutrientes termo-sensveis, como vitaminas, ou provocar reaes indesejveis entre os constituintes do meio, como, por exemplo, reaes entre aminocidos e acares redutores (reao de Maillard). Esta modalidade de esterilizao vem sendo substituda, sempre que possvel, pela esterilizao contnua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes do meio, j que o aquecimento e o resfriamento so praticamente instantneos. Obviamente, a esterilizao contnua essencial para sistemas contnuos de fermentao.

Esterilizao em batelada , com vapor (descontnua) - Todo contedo do biorreator esterilizado em uma s operao . Pode ser de duas maneiras :

- em uma autoclave. Aquecimento da gua contida na autoclave. Injeo de vapor - no prprio biorreator. Circulao de vapor. Injeo direta de vapor

50BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/MicrorganismosaquecimentoresfriamentoTempoTemperatura 12010050esterilizaoEsterilizao em batelada , com vapor (descontnua) 51 Esterilizao contnua com vapor - As vantagens com relao esterilizao em batelada so : - Ciclos de esterilizao mais curtos; - Melhor utilizao de energia; - Reduo da perda de nutrientes; - Facilidade de conduo do processo; BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos


4.2.2 Esterilizao qumica: um mtodo menos importante que os anteriores. utilizado para a esterilizao de superfcies. Para a esterilizao de equipamentos muito utilizado o xido de etileno. Ele destroe tanto clulas vegetativas, como esporos, mas s efetivo em presena de gua. utilizado em mistura com dixido de carbono ou nitrognio, na forma gasosa (2-50% de concentrao). Dois grupos:- Desinfetantes: so substncias que agem diretamente sobre estruturas microbianas, causando a morte do microrganismo. Agem tanto sobre microrganismos como sobre seres superiores. So portanto, txicos gerais, sem especificidade;

- Agentes quimioterpicos: So substncias que interferem em determinadas vias metablicas. So portanto especficos aos microrganismos que possuem a via metablica sensvel. Podem ser sintticos como as sulfas e cloranfenicol ou naturais como os antibiticos.

4.2.3 Esterilizao por irradiao de luz ultravioleta: A radiao UV absorvida por muitas substncias celulares, mas de modo mais significativo por cidos nucleicos, onde geralmente ocorrem as leses. A regio do espectro de UV com ao esterilizaste de 220 a 300 nm, muitas vezes chamada de regio abitica.


4.3 Agentes de fermentao: microrganismos

O meio preparado e esterilizado deve sofrer a ao dos biocatalisadores, pela inoculao de uma suspenso suficientemente concentrada de clulas ativadas ou recicladas ao processo.

Bactrias: As bactrias so onipresentes na natureza, em ambientes aerbios e anaerbios contendo gua. Entre os gneros, as habilidades sintticas variam desde quelas das espcies autotrficas, que requerem apenas compostos inorgnicos para o crescimento, quelas das espcies heterotrficas. Igualmente h uma enorme amplitude de habilidade degradativa. Por causa dessas capacidades diversas, as bactrias tem sido exploradas industrialmente para acumular produtos intermedirios e finais do metabolismo. So uma rica fonte de produo de enzimas.

Vrus: Os vrus so os menores microrganismos. Os vrus parasitos de bactrias so denominados bacterifagos. A cultura de vrus para testar drogas antivirais e para a produo de vacinas um importante empreendimento industrial.


Fungos: Os fungos so amplamente espalhados na natureza em ambientes de umidade mais baixa do que aquela que favorece as bactrias. O metabolismo de fungos essencialmente aerbio. Do ponto de vista morfolgico os fungos so divididos em dois grandes grupos: os bolores e as leveduras.

Bolores: caracterizam-se por formarem um miclio que um conjunto de estruturas filamentosas denominadas hifas. Leveduras: so fungos geralmente unicelulares de forma e tamanho muito variados, indo desde elementos esfricos at clulas elpticas, quase filamentosas.

Para todos os microrganismos existem trs temperaturas cardeais: temperatura mnima abaixo da qual no h crescimento; temperatura mxima acima da qual no h crescimento; temperatura tima, onde o crescimento mximo. A temperatura tima de crescimento microbiano varia com o tipo de microrganismo . A faixa de crescimento mais comum situa-se entre 25 e 45 C .

Termfilas: em torno de 60 0CCrifilas: em torno de 10 0CMesfilas: entre 20 e 40 0C


Fontes de microrganismos de interesse Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:compra em colees de cultura;isolamento a partir de recursos naturais;obteno de mutantes naturais;obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais;obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de engenharia gentica. Caractersticas desejveis de microrganismosPara uma aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes caractersticas gerais:

elevada eficincia na converso do substrato em produto;permitir o acmulo de produto no meio para se ter elevada concentrao do produto no substrato;no produzir substncias incompatveis com o produto;apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico;no ser patognico;no exigir condies de processo muito complexas;no exigir substratos dispendiosos;permitir a rpida liberao do produto para o meio.


4.3.1 Desenvolvimento dos agentes de bioprocessos e a exigncia de oxignio

Muitas clulas vivas necessitam de oxignio para manuteno de seu metabolismo. Nos bioprocessos conduzidos com microrganismos aerbios, (Bioprocessos aerbicos) o oxignio suprido ao biorreator, via de regra, como bolhas de ar, atravs de um compressor, como ser visto mais adiante.

Nos bioprocessos anaerbios, os microrganismos obtm o oxignio metablico atravs de substncias que contm oxignio ligado molecularmente.

Nos primeiros, o suprimento adequado de oxignio para atender a demanda da clula imperativo, assim como a manuteno de condies anaerbias estritas no segundo caso. Se essas exigncias no forem atendidas o processo ter seu potencial limitado, podendo haver desvios no metabolismo celular ou mesmo sua interrupo, com a conseqente morte da clula.

Fungos algas e algumas bactrias so aerbicos obrigatrios ; Algumas bactrias so anaerbias estritas ;Leveduras e muitas bactrias podem desenvolver-se em ambas as condies, so aerbicas facultativas.

574.3.2 Desenvolvimento dos agentes de fermentao e estado fsico do substrato- Substrato lquido superfcie profundidade (submerso) - Substrato slido ou semi-slido. 4.3.2.1 Fermentao em estado lquido: o processo que se desenvolve na presena de grande quantidade de gua. O processo de fermentao conduzido em tanques de fermentao com grande variao no tamanho, tipo de material de construo, abertos ou fechados, etc.

O surgimento desse processo permitiu o aumento de escala para muitos produtos limitados pelo processo de fermentao em meio slido.

Vrios produtos so obtidos por esse processo: lcool etlico; bebidas alcolicas; antibiticos vitaminas; vacinas; enzimas; insulina e muitos outros.

A fermentao lquida apresenta uma srie de vantagens operacionais sobre a fermentao em meio slido tais como: - medio e controle de pH, temperatura, oxignio, produto substrato; - separao e purificao do produto; - maior facilidade de se ter um processo contnuo e automatizado.

BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

584.3.2.2 Processos de fermentao em meio lquido e na superfcie

So aqueles em que a biomassa situa-se na superfcie do meio lquido, em contato direto com o ar atmosfrico, que fornece o oxignio necessrio produo microbiana.A diminuio da concentrao de nutrientes nas camadas superficiais faz com que cheguem superfcie, por difuso, os nutrientes das camadas mais profundas.Tambm, por difuso, o(s) produto(s) do metabolismo se dispersa(m) no meio em fermentao.Portanto, a difuso e a relao entre a rea oferecida e o volume de meio desempenham papel importante em bioprocessos operados em superfcie.O meio de cultivo colocado em recipientes rasos, de modo a oferecer grande rea ao desenvolvimento do bioagente. Como as taxas de transferncia de massa de nutrientes so lentas, os tempos de fermentao so consideravelmente longos.Os processos em superfcie so de operao difcil e so considerados antieconmicos, devido ao alto custo de produo resultante da manipulao custosa da esterilizao (incluindo ambiente), enchimento, esvaziamento e limpeza das vrias bandejas necessrias a produo em larga escala. Este tipo de processo limita-se, via de regra, aos fungos filamentosos, que tendem a formar pelcula micelial na superfcie do meio.BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

594.3.2.3 Processos de fermentao em meio lquido submersos So aqueles em que o microrganismo produtor se desenvolve no interior do meio de fermentao, geralmente agitado. No caso de fermentaes aerbias, o oxignio necessrio populao em desenvolvimento suprido, atravs de um compressor, por borbulhamento de ar. A maioria das fermentaes industriais importantes realizada por processo submerso. Pode-se citar que uma determinante reduo no preo de muitos produtos, anteriormente obtidos por processos em superfcie, foi a possibilidade de adapt-los aos processos submersos. Comparados com os processos em superfcie, os processos submersos oferecem uma srie de vantagens: - pode-se manipular, com maior facilidade, maiores volumes de meio; - a massa de microrganismos responsveis pela transformao fica totalmente submersa no meio nutriente de maneira uniforme, o que pode ser ajustado para fornecer as condies ideais de crescimento e produo; - a absoro de nutrientes e excreo de metablitos so executadas com maior eficincia, levando a menores tempos de fermentao e, consequentemente, melhor produtividade; BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

604.3.2.4 Fermentao em estado slido

Processo que refere-se a cultura de microrganismos sobre ou no interior de partculas em matriz slida, onde o contedo de lquido ligado a ela est a um nvel de atividade de gua que, assegure o crescimento e metabolismo das clulas e, por outro lado, no exceda a mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida. A fermentao em estado slido, tambm denominada de Fermentao em meio semi-slido, o mais antigo processo fermentativo.

Evoluo da fermentao semi-slida(estado slido)2.600 a.C. Produo de po pelos egpcios2.500 a.C. Produo de koji no JapoSculo XVIII Produo de vinagre de polpas1.900 -1920 Produo de enzimas fngicas1.920 -1940 Enzimas fngicas, c.ctrico1.940 -1.950 Produo de penicilina1.950 -1.960 Produo de esteris 1.960 -1980 Micotoxinas e alimentos enriquecidos1.990 -.... Vrios outro produtos, enzimas, lcool


61Fermentao em estado slido remete idia de dois tipos de materiais insolveis em gua, sobre os quais os microrganismos iro crescer: quando o suporte slido atua ele prprio como fonte nutrientes e no caso em que os nutrientes so solveis em gua e os microrganismos esto aderidos a uma matriz slida, inerte ou no, que ir absorver o meio de cultura lquido. A maioria dos processos utilizam o princpio em que o suporte slido atua tambm como fonte de nutrientes.

Os Substratos tradicionalmente utilizados so produtos agrcolas como o arroz, o trigo, o paino, a cevada, o milho e a soja, alm de substratos no convencionais como os resduos agro-industriais e florestais, destacando-se: o bagao de cana-de-acar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz.

O grande interesse nesses processos decorre do fato dessas matrias-primas no possurem custos de produo associados diretamente, sendo uma forma de se agregar valor a resduos que se formam em abundncia.

Em linhas gerais, a operao dos bioprocessos em meios semi-slidos, pode ser realizada sem agitao mecnica, com agitao ocasional ou contnua em reatores dos tipos: bandeja; tambor rotativo; esteira rolante; reator tubular horizontal; tubular vertical; sacos plsticos.BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

624.4 Cintica dos bioprocessos

A cintica de um bioprocesso consiste na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema produtivo, em funo do tempo do bioprocesso. Entende-se como componentes, o microrganismo (biomassa), os produtos do processo (metablitos) e os nutrientes ou substratos que compe o meio de cultura.

TempoPSXtX - BiomassaS - SubstratoP - ProdutoBIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos


Fase estacionriaFase de morteFase de transioFase exponencialLog,nmero de clulasTempo [ h ]Fase LAGCurva de crescimento do microrganismo em cultivo descontnuo representado em ordenadas semilogartmica64BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

Fase LAG ( adaptao ) - As clulas que foram inoculadas se adaptam ao novo meio. As clulas sintetizam as enzimas necessrias ao metabolismo dos componentes presentes no meio. No h reproduo celular. A durao dessa fase varia com a concentrao do inoculo, com a idade do microrganismo (tempo de pr cultivo) e com o seu estado fisiolgico. Fase exponencial ou logartmica - Caracterizada por uma grande velocidade de crescimento. A produo de biomassa atinge velocidade mxima.

Fase de transio - A velocidade de crescimento comea a diminuir por motivos como:

a) inibio por produtos da fermentaob) inibio pela alta [ ] de biomassa c) deficincia de oxigniod) inibio por produtos secundrios txicos

Fase estacionria - A taxa de crescimento iguala-se taxa de morte de clulas.

Fase de morte - Caso o processo seja continuado , observa-se uma fase decrescente na curva de desenvolvimento celular porque a taxa de morte de clulas passa a ser maior do que a de crescimento.


4.5 BiorreatoresDenomina-se biorreatores, reatores bioqumicos, reatores biolgicos, os reatores qumicos nos quais ocorre uma srie de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores que podem ser enzimas, ou clulas vivas ( microbianas, animais ou vegetais).

Classificao geral dos biorreatores

I. Reatores em fase aquosa (bioprocesso submerso)I.1 Clulas/enzimas livresReatores agitados mecanicamenteReatores agitados pneumaticamenteColuna de bolhas (bubble column)Reatores air-liftI.2 Clulas/enzimas imobilizadas em suporteReatores com leito fixoReatores com leito fluidizadoOutras concepesI.3 Clulas/enzimas confinadas entre membranasReatores com membranas planasReatores de fibra oca (hollow-fiber)66II. Reatores em fase no-aquosa (bioprocesso semi-slido)Reatores estticos (reatores com bandeja)Reatores com agitao (tambor rotativo)Reatores com leito fixoReatores com leito fluidizado gs-slido

Como se pode verificar, h uma grande variedade de configuraes possveis para os biorreatores, no entanto, os mais amplamente empregados so os reatores agitao mecnica (STR), conhecidos tambm como reatores de mistura, constituindo cerca de 80% do total de reatores utilizados industrialmente. A capacidade dos biorreatores bastante varivel, conforme o processo, podendo-se distinguir trs grandes grupos no que se refere a escala de produo industrial:

Reatores da ordem de algumas centenas de litro at 1 a 2 m3 de capacidade so empregados no cultivo de microrganismos patognicos, ou para o crescimento de clulas animais e vegetais, em geral objetivando a produo de produtos ligados rea da sade. Isto particularmente importante para as companhias farmacuticas, pois diferentes substncias podem ser produzidas no mesmo biorreator durante o seu tempo de vida til.


67Uma escala intermediria , na ordem de dezenas de metros cbicos at 100 a 200 m3 , especialmente empregados na produo de enzimas, antibiticos e vitaminas;

Para processos que exigem poucos ou at mesmo nenhum cuidado de assepsia, como o caso da fermentao alcolica ou do tratamento biolgico de resduos pode-se atingir reatores com alguns milhares de metros cbicos da capacidade.



5. PROCESSO DE OBTENO DE AGUARDENTE E LCOOL DE CANA DE ACAR

5.1 Extrao do caldo de cana: A extrao feita por moendas de ternos mltiplos com embebio do bagao para maior extrao do acar que chega a 96% ou mais. Nas unidades pequenas, onde a extrao feita em apenas um nico terno, um bom rendimento est em torno de 75%. 5.2 Preparo do mosto: Mosto todo lquido aucarado apto a fermentar. No seu preparo, a correo compreende todas as operaes tecnolgicas que visam transformar e corrigir a matria-prima em um lquido aucarado de fcil fermentao. Um mosto ideal deve ter as seguintes caractersticas:- concentrao de acares: a quantidade de acar no mosto calculada para se conseguir vinho com 7 a 8 0GL o que corresponde a 14 a 16% de aucares fermentecveis. Na prtica industrial usa-se o grau Brix. - acidez: Os valores de acidez devem estar entre 2,5 a 3,0g/L. Uma outra medida importante o pH pois a levedura tem atividade tima em pH 4,0 a 4,5.- sais minerais: usa-se enriquecer o mosto de fermentao com 0,2g/L de diamino fosfato (DAP) que fornece o nitrognio e fosfato, indispensvel ao processo fermentativo.


- vitaminas: a levedura alcolica tem a capacidade de sintetizar todas as vitaminas que necessita. Pode-se adicionar vitaminas do complexo B para estimular o processo, atravs da adio de farelo de arroz na proporo de 1g por litro de mosto.

5.3 Processo fermentativo:

A fermentao alcolica um processo que resulta na transformao de acares solveis em etanol e gs carbnico, realizado, principalmente, pelas leveduras e descrita de modo geral pela equao:

C6H12O6+ 2 ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + Energia (54,05 Kcal/Kg Substrato)A equao mostra que 1 mol (180 g) de glicose produz 2 moles (92 g) de etanol, 2 moles de CO2 (88 g) e 2 moles de ATP que pode ser utilizados para a sntese de componentes celulares, alm de energia (57 Kcal/mol de glicose).Desta forma o rendimento terico de etanol a partir de glicose de 0,511 gramas de etanol produzido por grama de glicose consumida.De forma geral os rendimentos reais observados atingem somente 90-95% do rendimento terico uma vez que parte da glicose utilizada para sntese de material celular e para reaes de manuteno do microrganismo.70As leveduras mais utilizadas na fermentao alcolica so Saccharomyces cerevisae (panificao, cervejaria, usina de lcool), Saccharomyces cerevisae var. ellipsoides (vinho) e S. carlsbergensis (cervejaria).

A cultura pura de levedura adquirida de laboratrios especializados na forma liofilizada e no momento do uso deve-se proceder a ativao das clulas. Aps a reativao tem-se a cultura na forma de repique em tubos de cultura. O processo de multiplicao das clulas de levedura feito em duas etapas: (1) laboratorial e (2) industrial.



LaboratrioPlanta industrialTubo deculturaVaso AVaso BPr-fermentadorDornas50.000 lArVapor100ml mosto 5 B+ sais500ml mosto 7 B+ sais2,5l mosto 9 B + sais12,5l mosto 11 B+ sais200 l1.000 l72BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

Descrio do processo de multiplicao das clulas para incio da operao de fermentao

1. Cultura em tubo de cultura, reativada a partir da cultura liofilizada adquirida de laboratrio especializado;

2. Inocula-se a massa de clulas de um tubo de cultura em frasco cnico de 500mL, contendo 100 mL do mosto a 5 0Brix, enriquecido com minerais e esterilizado em autoclave a 121 0C durante 20 minutos. Incuba-se o frasco a 28-30 0C por cerca de 24 horas, sob agitao;

3. Na etapa seguinte, o contedo do frasco transferido para frasco maior de 2L, contendo 500 mL do mosto a 7 0Brix, enriquecido e esterilizado. A incubao por 24 horas a 28-30 0C;

4. Na nova transferncia usa-se um balo de 6l contendo 2,5 L do mosto com 9 0Brix enriquecido e esterilizado. Incubao a 28-30 0C por 24 horas com agitao peridica para evitar a deposio das clulas;


5. A ltima transferncia de laboratrio feita para uma bombona de 20 a 30L contendo 12,5L de mosto a 11 0Brix enriquecido. A esterilizao feita em autoclave grande. A incubao feita a 28-30 0C por 24 a 48 horas;6. Admite-se o mosto no vaso A at atingir cerca de metade de seu volume e adiciona-se os minerais. A esterilizao feita por injeo direta de vapor sob presso de 1g/cm2 por 30 minutos. O resfriamento feito por circulao de gua externa at atingir 30 0C. Inocula-se assepticamente com o fermento proveniente do laboratrio. A incubao feita por 24 horas, arejando-se continuamente com ar esterilizado. A temperatura mantida a 28-30 0C atravs da circulao de gua. Quando a concentrao dos acares se reduzir a metade da inicial, transfere-se todo o contedo para o vaso B;

7. O vaso B prepara da mesma forma que o vaso A. A esterilizao feita por injeo de vapor fluente por 1 hora. A transferncia de fermento do vaso A para o vaso B feita por meio de presso de ar exercida naquele vaso. A fermentao conduzida sob aerao e resfriamento;Terminada a fermentao o contedo pode ser transferido para fermentador industrial ou para um pr-fermentador se necessitar mais uma etapa de multiplicao. 74BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

5.4 Fases da fermentao alcolica: O processo fermentativo inicia logo que a levedura entra em contato com o mosto, e pode ser dividido em trs fases:

Fermentao preliminarCompreende o perodo entre a adio do mosto no p-de-cuba e o incio do desprendimento de gs carbnico. H uma intensa atividade das leveduras para formao de novas clulas. Como conseqncia h um considervel consumo de acar, com pouca ou quase nem uma produo de lcool. Cerca de 1,5 a 2,0 g de sacarose so consumidos para cada grama de massa seca de levedura produzida. O processo conduzido a temperatura de 30 0C sob aerao por um perodo de cerca de 4 a 6 horas. Esse perodo pode ser abreviado pelo uso de elevada concentrao de levedura no p-de-cuba ou pelo uso de processo contnuo com recirculao de clulas.

Fermentao principalInicia-se com o desprendimento intenso de gs carbnico e formao rpida de lcool. H tambm grande desprendimento de calor e responsvel pela maior parte do lcool produzido. Com o desprendimento do gs carbnico h formao de espuma necessitando a adio de anti-espumante. Paralelamente ao desprendimento de gs carbnico h reduo da densidade do mosto e elevao de acidez por causa de alguns sub-produtos formados. 75BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

O desprendimento intenso de gs carbnico, na presena de substncias gomosas, bagacilhos e outros componente, aumenta a reteno de gs, fazendo o volume aparente do lquido aumentar de 50 a 60%. Isso provoca o transbordamento das dornas, reduzindo a produtividade e o rendimento do processo.A atividade bioqumica intensa nessa fase causa um desprendimento intenso de calor que deve ser removido. Nas dornas pequenas, at 30.000 L essa remoo feita pela troca de calor atravs da parede pelo escoamento externo de gua resfriada (dornas de ferro ou ao). Em dornas maiores ou dornas de madeira ou alvenaria h a necessidade do uso de serpentinas internas ou acoplamento de trocador de calor tubular ou placas para resfriamento do mosto.O final da fermentao principal caracterizado pela reduo do desprendimento de gs carbnico, abaixamento da formao de calor, e diminuio na movimentao superficial do mosto. O perodo dessa fase da fermentao de 12 a 16 horas.

Fermentao complementar ou ps-fermentao

Essa fase inicia-se com a diminuio rpida da atividade fermentativa observada pela reduo do gs carbnico desprendido; diminuio no movimento superficial; desaparecimento da espuma; reduo da temperatura; aumento da acidez; formao de lcoois superiores. Essa fase termina com a parada completa de desprendimento de gs carbnico, devendo ser a mais curta possvel para se evitar contaminao do vinho por bactrias. Toda vez que duas ou trs leituras consecutivas de Brix do vinho a cada duas horas apresentarem resultados iguais, o vinho deve ser enviado para destilao.

76BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos 5.5 Processos alternativos para produo de etanol via fermentativa

A fermentao alcolica pode ser conduzida atravs de trs processos distintos: batelada, batelada alimentada e contnuo. As destilarias mais recentes utilizam o processo contnuo.

Vantagens e inconvenientes dos processos contnuos e descontnuos de fermentao alcolica;

Processo DescontnuoProcesso Contnuo(batelada e batelada alimentada)Vantagens- maior controle- maior produtividadesobre contaminao - tempos de residncia reduzidos- maior adaptabilidade ao controle automtico

Inconvenientes- inibio pela concentrao - contaminao e mutaode acar e etanol- menor flexibilidade- tempo de residncia longo- baixa produtividade77BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

5.6 Destilao do vinho

Os componentes lquidos so representados por gua e lcool. O lcool representa de 5 a 10% em volume, dependendo da natureza do mosto. Esto ainda presentes os cidos actico, succnico e lctico, lcoois superiores como amlico, isoamlico, proplico, isoproplico, butlico, isobutlico e glicerol, furfural, aldeidos e steres. Os componentes slidos podem estar em suspenso ou em soluo.

A qualidade da aguardente determinada principalmente pela qualidade e quantidade das impurezas formadas pelos aldedos, cidos, steres, lcoois superiores. A qualidade final depende da qualidade do vinho e do equipamento e processo de destilao. Os componentes volteis possuem diferentes graus de volatilidade, sendo possvel a separao por processo de destilao.

Os componentes mais volteis so recolhidos na primeira frao do condensado denominada de cabea e os menos volteis nas fraes finais cauda. A poro intermediria denominada corao. Essas trs pores constituem o flegma. Flegma de baixo teor alcolico entre 55 e65 GL. Flegma de alto grau entre 90 e 95 GL. A vinhaa ou vinhoto ou restilo, constitui a frao no voltil.


6. PROCESSO PARA PRODUO DE ANTIBITICO POR FERMENTAO

6.1 Procura e isolamento de microrganismos produtores de antibiticos

Ao se procurar isolar um microrganismo para fins industriais, deve-se ter em mente as caractersticas que dever apresentar, quais sejam:

- crescimento rpido em substrato econmico;- produo das substncias desejadas em quantidades e condies econmicas;- conservao das caractersticas biosintticas sem grandes riscos de variao;- baixa produo de substncias que interfiram com a extrao do antibitico;- ausncia de patogenicidade, etc.

cada vez mais difcil encontrar microrganismos capazes de produzir antibiticos novos. De 10.000 amostras de actinomicetos isolados de amostras de terra diferentes, isolam-se 2.500 tipos capazes de produzir antibitico. Destes, apenas 10 fornecem novos antibiticos. E, desses, apenas 1 mostra por suas propriedades, ter utilidade clnica.

6.2 Conservao da cepa produtora

Congelamento e liofilizao so as duas tcnicas usadas preferencialmente na conservao de estoques industriais.


6.3 Processo industrial de produo de penicilina

O primeiro antibitico produzido industrialmente foi a penicilina. De incio, sua produo era feita em superfcie, sendo o meio de cultura esterilizado em camadas delgadas em frascos, garrafas ou bandejas. Ao meio esterilizado inoculava-se uma suspenso de esporos de Penicillium. Os meios inoculados eram incubados a 24 - 28 0C, sem agitao. As desvantagens do mtodo eram:- deficincia na penetrao de oxignio no meio;- parte area do miclio tinha pouco acesso aos nutrientes;- problemas de contaminao constantes;- dificuldades de extrao do antibitico do meio.Selecionando-se amostras de Penicillium, reformulando-se o meio de fermentao, e adaptando-se o microrganismo para o desenvolvimento em profundidade em caldo aerado, possvel produzir o antibitico em larga escala economicamente.

6.3.1 controles operacionais:

A produo de espuma reduz a capacidade til do equipamento, dificulta as trocas gasosas entre o meio de fermentao e o ar e pode causar, por efeito de flotao, exausto de alguns dos componentes do meio de fermentao. No caso de antibiticos produzidos por meio de bactrias, poderia ocasionar concentrao de clulas na espuma.


Controle fisiolgico

No caso de produo de penicilina o pH deve ser mantido em limites estreitos. Por isso,o meio de produo contm Ca, Mg e fosfato como tampo; alm disso, cido sulfurico e hidrxido de sdio devem ser adicionados durante a fermentao para se manter o pH prximo a neutralidade.

Alm do pH, controla-se as quantidades de acares e de nitrognio, afim de se manterem condies que favoream as atividades metablicas desejveis do microrganismo.

Caldos fermentados contendo fungos e actomicetos apresentam caractersticas no-newtonianas de fluxo. Comportam-se normalmente como pseudoplsticos. A medida que o caldo apresenta caractersticas no-newtonianas, torna-se difcil dispersar homogeneamente nutrientes no meio e fornecer oxignio s clulas. O aumento da viscosidade do caldo, no decorrer da fermentao, acarreta diminuio da disponibilidade de oxignio. Uma diluio apropriada do meio causa diminuio da viscosidade sem prejudicar a capacidade de produo.

Meios de cultura

Bons rendimentos de antibitico ocorrem quando quantidades relativamente grandes de C e de N so fornecidas para as atividades metablicas do microrganismo.

81O meio de cultura , alm de fornecer nutrientes, em condies adequadas para o desenvolvimento do microrganismo e formao do antibitico, deve:- ter capacidade de tamponamento;- permitir o mnimo de formao de espuma;- dificultar o crescimento de contaminantes;- contribuir para a estabilidade gentica do agente de fermentao;- permitir aerao e agitao vigorosa;- permitir fcil recuperao do produto;- ser passvel de esterilizao;- conter precursores necessrios formao do antibitico;- ser economicamente exeqvel.

As fontes de energia e carbono mais utilizadas so o melao, o acar e o amido de milho e leos vegetais, particularmente os de milho, girassol e soja.

A gua de milho, subproduto da fabricao de amido de milho, a fonte de nitrognio muito utilizada em indstrias de fermentao, por exemplo na produo de penicilina. Alm de nitrognio, a gua de milho fornece cido lctico, glicose, aminocidos e vitaminas. Tambm se utiliza industrialmente como fonte de N, o levedo de cerveja, que alm de fornecer N orgnico fonte de vitaminas e fatores de crescimento, a torta de amendoim, a farinha de peixe, extratos de carne, casena, etc.


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Caldo fermentadoMicliosClulasResduos slidosAntibiticobrutoRetirada deslidosFracionamentoouExtraoConcentraoPurificao doAntibiticoRecuperao desolventeA extrao de antibitico dificultada pela baixa concentrao de produto (1 a 2%), sensibilidade ao pH, temperatura, e a presena de diferentes materiais dissolvidos ou em suspenso no caldo fermentado.6.3.2 Extrao de antibiticos aps a fermentaoBIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

83- Retirada dos slidos no caldo fermentado

A primeira dificuldade na retirada de slidos de um caldo fermentado deve-se presena de partculas em suspenso coloidal. Essa dificuldade pode ser superada:

a) variando-se o pH.b) adicionando-se agentes floculantes.c) usando-se colides de carga contrria.d) usando-se enzimas clarificantes.e) controlando-se as condies de fermentao.

- Processos de extrao

Na extrao de antibiticos, os processos mais empregados so: a precipitao, a extraocom solventes e a adsorso por meio de resinas de troca inica

A precipitao pode ser usada para recuperao de vrios antibiticos ou ainda na concentrao e purificao dos mesmos. No caso de tetraciclinas, pode-se fazer a precipitao com gua de cal e separar o produto por filtrao ou centrifugao.


84A extrao por solventes feita, pelo menos, em duas etapas: mistura do solvente com o caldo, e separao das fases aquosa e orgnica. A mistura deve ser feita em alta turbulncia, permitindo o maior contato possvel entre o caldo e o solvente. O tempo de contato deve ser suficiente para permitir o estabelecimento de equilbrio na partio do antibitico entre o caldo e o solvente. O pH e a temperatura devem ser ajustados de modo a favorecerem a transferncia do antibitico da fase aquosa para o solvente. As duas fases, aquosa e orgnica, so normalmente separadas por centrifugao.

- Concentrao e Purificao de antibiticos

Depois que o antibitico extrado do caldo, pode ser ressolubilizado . submetido ento a uma cristalizao (controlando-se pH e temperatura), precipitao ou reextrao com um solvente aquoso, como se faz com a penicilina.

Na purificao da penicilina por exemplo, pode-se depois de filtrado o caldo, resfri-lo e acertar o pH a 2,2 +/- 0,2, com cido sulfrico ou fosfrico. Faz-se a extrao com hidrocarbonetos. Eleva-se o pH a 6,7 +/- 0,2 e reextrai com tampo aquoso. O processo repetido, de modo a se obter uma purificao do antibitico, que submetido, finalmente a um processo de cristalizao ou liofilizao.A concentrao e purificao de antibiticos pode ser ainda por: Resinas lquidas; Membranas.


857. PROCESSO BIOTECNOLGICO DE OBTENO DE VITAMINAS: CIDO ASCRBICO

Trata-se da vitamina que se obtm em maior quantidade biotecnologicamente. O processo completo inclui uma sntese mista qumica-biotecnolgica:1. D-glicose se transforma por reduo cataltica em D-sorbitol;2. Em processo fermentativo com Acetobacter suboxidan o C2 do sorbitol oxidado originando L-sorbosa com rendimento quase estequiomtrico;3. Por tratamento com hidrxido sdico obtem-se o sal de sdio na forma enlica do cido 2-oxo-L-glucnico, que se transforma por acidificao diretamente em cido L-ascrbico.A transformao biotecnolgica de D-sorbitol em L-sorbosa ocorre em tanques de fermentao com cultivo de Acetobacter suboxidans. Condies do processo fermentativo:Substrato Soluo de D-sorbitol a 20% e 0,5% de extrato de levedura ou 0,3% de extrato de gros de milho.



InoculoO inoculo Acetobacter suboxidan representa 3% do substrato.Fermentao A fermentao transcorre a 30-35 0C com aerao e agitao vigorosas e termina aps 2 a 3 dias. O processo ento interrompido elevando-se a temperatura a 50 0C. Separao purificao e concentraoA soluo contendo L-sorbosa separada das clulas mediante sucessivas filtraes. A descolorao do filtrado se processa em filtros de carvo ativo e a concentrao feita lentamente at que ocorra a cristalizao. Assim procedendo se consegue cristais de L-sorbosa muito puros que aps transformao qumica se obtm o cido L-ascrbico.


7.1. PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA OBTENO DE COBALAMINA (Vit. B12)Em um tanque de mistura os componentes do substrato so misturados com gua, esterilizado e resfriado.O substrato esterilizado adicionado asceticamente ao fermentador que est esterilizado e aerado em maior ou menor grau dependendo da espcie de bactria a ser utilizada. Se inocula e incuba a temperatura de 18 a 21 0C. A durao do processo de fermentao depende do microrganismo. As bactrias do cido propinico fermentam primeiramente 3 dias anaerobicamente, depois 3-4 dias aerobicamente e assim se obtm rendimento de 19 a 23 mg/L.As fermentaes com Bacillus megaterium, Pseudomonas denitrificans e Streptomices olivaceus duram 6 horas, 2, 3 e 4 dias respectivamente com uma produo de 15 mg/LAo final da fermentao o caldo de cultivo pode ser empregado para a obteno de concentrado ou cristais de vitamina B12 O concentrado obtido por evaporao. Para a obteno de preparados puros se acidifica o caldo de cultivo com H2SO4 e Na2 SO3 a um pH 5,0 para estabilizar a cobalamina e separ-la das clulas. Depois a soluo filtrada e se purifica a soluo com carvo ativo.O passo seguinte consiste na concentrao por evaporao seguido da adio de solventes orgnicos, cristalizao e purificao.

88 8. PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA OBTENO DE POLISSACARDEOS: DEXTRANA As dextranas que se utiliza como substitutos do plasma tem que ter um peso molecular mdio de 40.000 a 80.000. Uma soluo 6% de dextrano com esse peso molecular, tem a viscosidade e presso osmtica muito prximas ao plasma sangneo. Na maioria das vezes os dextranos se formam com peso molecular elevado. Com o cultivo bacteriano ou solues enzimticas obtem-se dextranos de elevado peso molecular e a partir destes por hidrlise o peso molecular desejado. O melhor estabelecer as condies de processo de modo a se obter dextranos de peso molecular na faixa desejada.Os substratos preparados com sais inorgnicos, 2% de extrato de milho, 10% de sacarose e pH de 6,5 a 7,0 filtrado, esterilizado, resfriado, adicionado ao fermentador sob agitao e inoculado com Leuconostoc ou Xanthomonas. Aps 2-4 dias a 25 0C o processo est concludo com a formao de uma massa gelatinosa com o pH baixando para 4,0 devido formao de cido lctico.O contedo do fermentador ento bombeado tanques de precipitao e resfriado a 1,0 0C. Os dextranos se precipitam pela adio de metanol que se recupera por destilao apartir da soluo resultante.A frao precipitada de elevado peso molecular hidrolisada com cido clordrico a 100 0C, controlando se a viscosidade e se resfria gradativamente at se obter as cadeias de PM desejada, e se neutraliza com NaOH. BIOTECNOLOGIA Bioprocessos/Microrganismos

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