células-tronco

Existem dois tipos de células-tronco: as embrionárias e as adultas.

Para que uma célula seja considerada “células-tronco”, necessita possuir três

fatores principais: 1 – Auto-renovação; 2 - Uma única célula deve ter a

capacidade de diferenciar-se em diferentes tipos de tecidos; 3 – As células que

a constitui devem reconstituir um determinado tecido in vivo.

Baseado-se na mitologia grega, se recorda da História de Prometeu,

pois, esse foi acorrentado no monte Cáucaso pelo o Pai dos deuses – Zeus -

por ter entregado o fogo a humanidade. Além disso, todos os dias uma águia

comiam o seu fígado, era como se fosse uma alusão a essa futura tecnologia

das células-tronco, porque o fígado dele sempre se regenerava, uma

multiplicação celular.

1.1 Visão Geral

As células-tronco podem ser definidas como células indiferenciadas

capazes de auto-renovação, e de se diferenciar originando progenitores

maduros, compreendendo tanto progenitores que não se renovam quanto

células efetoras - categorias de linfócitos (células do sistema imunológico),

essas células já estão preparadas para atuar na defesa do organismo e as

células de memória ficam de prontidão à espera que haja nova invasão pelo

mesmo antígeno - que são completamente diferenciadas. É importante

restringir esta definição de células únicas que, uma vez desenvolvidas, se auto-

renovam por toda a vida de um organismo, a fim de distinguir as células-tronco

dos muitos tipos de células progenitoras (com auto-renovação limitada). Assim,

funcionalmente, as células-tronco são células multipotentes localizadas no topo

da hierarquia das linhagens.

Até pouco tempo acreditava-se que apenas as células-tronco

embrionárias eram capazes de se diferenciar em células de origem

2

ectodérmica, endodérmica e mesodérmica. Em 1999, vários estudos

surpreenderam os cientistas mostrando que as células-tronco de um tecido,

como o encéfalo, poderiam se transformar em outras, como células

sanguíneas. Esses estudos revelam o poder inesperado das células-tronco de

adultos.

A classificação das células-tronco tem sido feita com base no seu

potencial de desenvolvimento. São chamadas de totipotentes as células

capazes de gerar todos os tipos celulares embrionários e extra-embrionários,

pluripotentes as que podem originar todas as células que formam um embrião

(propriamente dito), multipotentes quando originam um subgrupo de linhagens

celulares, oligopotentes são capazes de gerar células mais restritas a uma

linhagem do que as multipotentes e, por final, as unipotentes podem contribuir

originando apenas um único tipo celular maduro (WAGERS AND WEISSMAN,

2004).

As células-tronco, por poderem, teoricamente, ser induzidas a se

diferenciar em qualquer tipo celular do corpo, revelam possibilidades nunca

antes imaginadas, como tecidos originados em laboratório e até substituição de

órgãos e células para tratar uma gama de distúrbios humanos.

Segundo Verfaillie, (SCIENCE, 2000), além das fronteiras resultantes

dos dilemas éticos ao redor de pesquisas usando células-tronco embrionárias e

fetais, as células provenientes de adultos possuem uma vantagem adicional:

elas são mais fáceis de manipular. As células-tronco embrionárias tendem a se

diferenciar espontaneamente em todos os tipos de tecidos. Quando injetadas

sob a pele de um camundongo imunossuprimido, por exemplo, elas podem

crescer dando origem a teratomas. Ao contrário, as células-tronco de adultos

não se diferenciam espontaneamente, mas podem ser induzidas por meio da

administração de fatores de crescimento apropriados ou outros sinais externos.

Os fatores mitogênicos necessários para a indução da proliferação dessas

células ainda não são completamente conhecidos.

No entanto, as células-tronco adultas parecem ter uma desvantagem

no que se refere à perda de sua capacidade de se dividir e se diferenciar após

certo tempo em cultura, o que as torna inadequadas para algumas aplicações

terapêuticas. Já as células-tronco embrionárias parecem ter capacidade infinita

de se dividir e não perdem sua potencialidade.

3

O grande interesse em estudar as células-tronco vem da sua

capacidade em originar diversos tipos de células que constituem o corpo e

talvez forneçam substituições para tecidos lesados pela idade, por trauma ou

doença. Sendo assim, as células-tronco possuem uma gama de aplicações em

terapias para diversas doenças consideradas até então incuráveis e outras

para as quais não há tratamento farmacológico eficaz. Dentre essas doenças

podem-se destacar as doenças neurodegenerativas como Parkinson,

Alzheimer, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, retinopatias e

muitas outras como diabetes tipo II, acidentes vasculares (incluindo AVC),

cardiopatias e câncer.

Os resultados obtidos até o momento com terapias celulares utilizando

as células-tronco têm sido animadores. Já existem estudos em andamento na

fase clínica que revelam perspectivas nunca antes imaginadas, dando

esperança para os pacientes. Apesar da aparente promessa de serem capazes

de curar todo tipo de doença, o conhecimento científico por trás das aplicações

terapêuticas das células-tronco deve estar bastante sólido antes de ser

utilizado pela comunidade médica.

1.2 Obtenção e cultivo de células-tronco:

As amostras de medula óssea são obtidas a partir de fêmures de ratos

adultos (250 g) da linhagem Wistar. Para cada período de cultivo (cultura nova

e antiga) foi utilizado um rato. Os animais são sacrificados por overdose de

anestésico (tiopental sódico - Cristália; 3,5 mL/animal ) e têm os dois fêmures

dissecados, eliminando os tecidos muscular e conjuntivo associados. Em

seguida são feitos dois cortes na região das epífises, removendo-as,

possibilitando a entrada da agulha na cavidade medular, onde são injetados 10

mL de DMEM (Dulbeco´s Modified Eagle Medium - GibcoBRL) sem soro.

O material obtido é ressuspenso e centrifugado a 1.500 rpm durante

10 minutos. O pellet é ressuspenso em DMEM sem soro, num volume de cerca

de 4 mL e transferido para um outro tubo de 15 mL contendo 4 mL de Ficoll-

Paque (densidade 1.077 g/mL - Amersham Biosciences; diluição Ficoll:meio de

1:1), evitando que as duas fases líquidas se misturem. Centrifuga-se a 2.000

4

rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, coleta-se o anel de

células na interface Ficoll-células e as ressuspende em solução BSS

respeitando a diluição 1:5 (células: BSS). Centrifuga-se novamente a 1.500 rpm

durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezando o sobrenadante.

Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes a fim de retirar o

excesso de Ficoll, que é tóxico para as células.

Após a última lavagem, o pellet é ressuspenso em 1 mL de DMEM

com 20% de soro fetal bovino (SFB – StemCell Technology) e então as células

são contadas, utilizando Trypan Blue (GibcoBRL) para acessar a viabilidade

das células extraídas. Por final as células são plaqueadas em frascos canted

neck com filtro (Corning), de 25 cm2, com 5 mL de meio de cultura composto

por DMEM 20% SFB acrescido de 1% de penicilina e estreptomicina (StemCell

Technology) e de 4% de L-glutamina (GibcoBRL).

São plaqueadas 1x106 células na cultura mais antiga e 3x106 células

na cultura considerada nova. As células foram mantidas em estufa a 37 oC em

5% de CO2 e umidade de 95%. O meio de cultura é trocado a cada 3 ou 4 dias,

retirando-se 4 mL do meio acondicionado e substituindo-se por 4 mL de meio

fresco.

Quando as células em cultivo alcançavam confluência de

aproximadamente 80%, era feita a passagem. Removendo o meio de cultura

do frasco, as células mesenquimais aderentes permanecem aderidas ao

frasco. Essas células devem ser lavadas com DMEM sem soro para remover o

SFB residual e depois incubadas com 1 mL de tripsina e EDTA (StemCell

Technology), a 37 ºC até se destacarem (cerca de 4 minutos). Às células já

soltas, adiciona-se meio de cultura com 20% de SFB para neutralizar a ação da

tripsina. As células são centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, então o

sobrenadante é removido e o pellet é ressuspenso em meio de cultura

completo (DMEM + 20% SFB). Essas células podem agora ser divididas em

novos frascos de 25 cm2 para cultura. A cultura de células antiga sofreu 4

passagens, sendo que na primeira a concentração foi de 1:4, na segunda,

terceira e quarta passagens foi de 1:10. Já a cultura nova permaneceu na

passagem até a realização dos experimentos.

 

1.3 Indução de diferenciação

5

O protocolo de indução da diferenciação das células-tronco

mesenquimais em células neurais consiste nas seguintes etapas:

Pré-indução: o meio de cultura é substituído pelo meio pré-indutor,

composto por DMEM / 20% SFB e 1 mM de b-mercaptoetanol (Sigma), sendo

as células incubadas nessa solução durante 24h.

Indução: posteriormente recebem tratamento com os indutores neurais

butil-hidroxi-anizol (BHA / butylated hydroxyanisole - Sigma) (200 mM) e

dimetil-sulfóxido (DMSO - Sigma) (2%) em DMEM. A solução de BHA deve ser

feita em álcool 70%.  Para posterior realização da imunocitoquímica foram

adotados dois intervalos de tempo para a indução neural: 24 e 72 horas, após

os quais as células são fixadas.

1.4 Obtenção e cultivo das células-tronco neurais

As células-tronco neurais são obtidas a partir de encéfalo de embrião

E14 e da zona subventricular (SVZ) de adulto, ambos de camundongos da

linhagem balb/c. Os animais utilizados são sacrificados por deslocamento

cervical.

Tanto os embriões de camundongo E14 quanto o encéfalo de

camundongo adulto são depositados em uma placa de Petri contendo PBS

com 2% de glicose. A dissecação é feita em uma lupa e o material obtido é

transferido para um tubo adicionando-se em seguida 5 mL do meio de cultura

suplementado. A seguir o tecido é triturado passando pela pipeta com ponteira

de 1.000 mL seguido pela ponteira de 200 mL, até obter-se uma suspensão de

células únicas. As células obtidas são quantificadas e a viabilidade avaliada

usando Trypan Blue (GibcoBRL).

As células são plaqueadas em frascos T-25 canted neck (Corning) na

densidade de 2x105 células por mL em 10 mL de meio de cultura completo. O

meio de cultura para as células tronco neurais é composto por 10% de

NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements (StemCell Technology) e 90% de

NeuroCultTM NSC Basal Medium (StemCell Technologies), específicos para

murinos. Além disso, também deve ser adicionado hEGF (20 ng/mL), FGF-2

(20 ng/mL) e heparina (5 mg/mL). As neuroesferas são centrifugadas a 1.200

6

rpm por 5 minutos e metade do meio de cultura de cada frasco é trocado a

cada 3 ou 4 dias, substituindo por meio de cultura fresco. As neuroesferas

formadas são mantidas numa estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior

que 95%) e da proporção de CO2 (5%) no ar.

1.5 Indução de diferenciação

Primeiramente as neuroesferas devem ser dissociadas

mecanicamente – passando-se pelas ponteiras de 1.000 mL e de 200 mL – e

plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-lisina e laminina, que

promovem a adesão das células. Após terem aderido, permanecem em poços

(Multiwell de 12) contendo 1 mL de meio de cultura composto por NeuroCultTM

NSC Basal Medium, NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements e 2% de soro

fetal bovino (SFB) (StemCell Technology), sem fatores de crescimento. As

células são mantidas nesse meio de cultura em estufa (37 ºC, 5% CO2,

umidade > 95%) por 1 dia, quando inicia-se o tratamento com o meio de

indução de diferenciação.

Cada poço recebe uma combinação específica de compostos,

adicionados ao meio de cultivo descrito acima (volume final = 1 mL), que

induzem diferenciação em determinado tipo celular, como segue adiante:

a) Diferenciação neuronal: adiciona-se ácido-retinóico all-trans (RA)

(Sigma) e forscolina em concentração final de 0,1 mM e 5 mM,

respectivamente.

b) Diferenciação em astrócito: adiciona-se 50 ng/mL de proteína

morfogenética de osso-2 (BMP-2 - R&D System), 50 ng/mL de fator inibitório de

leucemia (LIF - Sigma) e 1% de soro fetal bovino (StemCell Technology).

c) Diferenciação em oligodendrócito: adiciona-se 500 ng/mL de IGF-1

(insulin-like growth factor-1 - R&D System).

As células permanecem no meio indutor de diferenciação por 5 dias,

que é substituído no terceiro dia.

2 Cientistas convertem células da pele em células

tronco

7

A hipótese de utilizar células-tronco para tratar de doenças antes

incuráveis é um sonho da medicina. Ela parece mais perto da realidade após

cientistas norte-americanos e japoneses anunciarem ter convertido células da

pele em células-tronco embrionárias. Mas o caminho para o uso em larga

escala dessa panacéia inventada pela engenharia genética ainda é longo e

tortuoso.

A notícia causou estardalhaço no fim de novembro: pesquisadores norte-americanos e japoneses transformaram células da pele em equivalentes de células-tronco embrionárias humanas, sem recorrer à clonagem ou à produção de embriões. A técnica representaria, assim, um caminho desimpedido nessa que é uma das mais promissoras fronteiras de pesquisa na medicina. Ela não enfrentaria, em princípio, as questões éticas e religiosas em que as outras alternativas se enredam. Tanto é que recebeu apoio praticamente imediato do presidente norte-americano, George W. Bush – interessado no apoio dos cristãos fundamentalistas integrantes de sua base eleitoral – e de outros segmentos religiosos conservadores.

Células-tronco são, numa definição simples, células primitivas, produzidas enquanto o organismo se desenvolve e capazes de originar outros tipos de células. As pesquisas com elas têm animado os cientistas ao redor do mundo pela possibilidade que oferecem de trazer cura para problemas hoje incontornáveis pela medicina.

À maneira de curingas do baralho, elas poderiam ser introduzidas no

corpo do paciente para fazer as funções das células e tecidos lesionados.

Alguns tratamentos experimentais nessa área, como os realizados na

Faculdade de Medicina da USP em Ribeirão Preto (SP), têm obtido resultados

estimulantes. Mas as pesquisas ainda estão no início, e o que se sobressai por

enquanto é a polêmica sobre como conseguir essas células.

8

A primeira pesquisa envolvendo o uso de células-tronco embrionárias

humanas foi divulgada em 1998 pela equipe do professor James Thomson, da

Universidade de Wisconsin (Estados Unidos). Dois anos antes, a equipe do

cientista britânico Ian Wilmut havia divulgado o nascimento da ovelha Dolly, a

primeira clonagem bem-sucedida da história – e um caminho natural para a

obtenção de células-tronco.

Não demorou em surgir uma feroz oposição a essas linhas de

pesquisa, principalmente vinda de segmentos religiosos. A idéia de clones

humanos – mesmo que em princípio destinados a finalidades terapêuticas –

ainda é fortemente rejeitada e, para muitos, usar embriões em estudos como

esses significa liquidar possibilidades de vida. Não adiantou muito o fato de os

cientistas dizerem que usam em seus experimentos embriões descartados em

clínicas de fertilização, os quais teriam o lixo como destino certo. Para os

opositores da idéia, empregar embriões com essa finalidade é um assassinato

e ponto final.

É por isso que a possibilidade de obter células-tronco a partir de

células da pele atrai tanto. Em tese, essa alternativa elimina as objeções

políticas, religiosas e éticas, além de contornar o risco de rejeição por parte do

paciente.

Os estudos a esse respeito foram conduzidos, além da equipe de

Thomson, por pesquisadores liderados por Shinya Yamanaka, das

9

universidades de Kyoto e San Francisco (Califórnia, Estados Unidos). Por

processos semelhantes, segundo relataram respectivamente nas revistas

Science e Cell, os dois grupos induziram células cutâneas a voltar ao estágio

de embrionárias e, a partir daí, a se transformar em neurônios e em células

cardíacas. As novas estrelas dessa área receberam o nome de células-tronco

pluripotentes induzidas, ou iPS.

A chave para o sucesso foi à descoberta, por essas equipes, de que,

entre mais de mil genes capazes de reprogramar as células, quatro deles,

quando combinados, podem “ligar” ou “desligar” funções celulares – o que

permite que uma célula adulta se torne uma embrionária. Foi um grande

esforço de tentativa e erro: no caso dos japoneses, a proporção foi de uma

célula-tronco embrionária obtida para cinco mil células da pele inoculadas, ante

uma para dez mil nos experimentos norte-americanos.

2.1 Células-tronco embrionárias (CTE)

A primeira vez descrita foi no ano de 1981, através da realização de

testes em camundongos, como mencionado logo a cima. Já no ano de 1994 foi

iniciada a primeira vez pesquisa sobre CTE humanas, pelo isolamento dessas

células. No ano de 1998, há um grande avanço científico no desenvolvimento

de métodos para cultivo e manutenção das mesmas.

BLASTÓCITO DE CINCO DIAS

10

2.2 Cultura de células-tronco embrionárias humanas (CTEh

Células-tronco Embrionárias (CTE) apresentam vantagens e

desvantagens, a primeiras são: alta platicidade, elevada capacidade

proliferativa (diferenciação de celular rápida), alta telômeros/ telomerase. A

segunda, deve-se considerar a discussão ética e teratomas - é um tumor misto,

formado por resíduos fetais e tecidos embrionários. Um tipo de tumor de

células germinais derivado de células pluripotentes e constituído de elementos

de diferentes tipos de tecido de uma ou mais das três camadas de células

germinais; mais freqüentemente encontrado no ovário ou no testículo em

adultos e na região sacrococcígea em crianças. Os teratomas variam de

benignos (maturo, dermóide e cístico) a maligno (imaturo e sólido).

(DORLAND, 28ª ED)

3 AS FONTES E OS DIFERENTES TIPOS DE CÉLULAS-

TRONCO ADULTAS:

(A) CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOÉTICA (CTH):

Elas são encontradas principalmente em: Medula óssea, Sangue

periférico (aférese), Sangue de Cordão Umbilical e Placentário (SCUP). Está

presente em cerca de 1% das células nucleadas da medula óssea e do SCUP.

Principais características: Auto-renovação, Diferenciação, Mobilização,

Homing. Quando em um adulto normal, a medula óssea produz por hora: 10¹º

eritrócitos e 10( dez elevada oitava) - 10 (dez elevada a nona) leucócito ou

seja: 3 milhões de células por segundo.

B) CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAL (CTM)

Artigos descrevem sua presença em: Tecido Adiposo, Pâncreas,

Medula Óssea, Fígado, Sistema Periférico Fetal, Tendão, Membrana Sinovial,

Líquido, Amniótico, Sangue Periférico pós-natal - Sangue de cordão umbilical,

Quantidades de CTM na Medula Óssea: 1 CTM para 10.000 a 100.000 células

11

da medula óssea. Suas duas funções: Dar suporte à hematopoese, formar

microambiente medular (estroma).

DIFERENCIAÇÃO CELULAR

3.1

DIFERENCIAÇÃO CELULAR

Uma chance de cura

As possíveis perspectivas terapêuticas – uma segunda chance a

muitos: Doenças do sistema nervoso central (doenças de Alzheimer e

Parkinson e reconstituição da medula espinhal de pacientes paraplégicos e

tetraplégicos); Insuficiência cardíaca e tratamento de pacientes que sofreram

infarto do miocárdio (tratamento do infarto do miocárdio, isquemia crônica,

miocardiopatia dilatada e doença de Chagas), diabetes; doenças

hematológicas, como leucemias e aplasias de medula; doenças genéticas;

doenças auto-imune: artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose

múltipla, esclerose. Sistêmica, esclerose lateral amiotrófica; acidente vascular

cerebral; doenças hepáticas (cirrose), doenças renais (insuficiência renal),

12

reconstituição óssea (traumas ou cirurgias com perda óssea), agressões

oftalmológicas com perda da visão (queimaduras por produtos químicos, calor

ou outros); transplante de órgãos como coração, rins, fígado, pâncreas

poderão, no futuro, ser substituídos pela terapia com células-tronco.

3.2 Vantagens da terapia com células-tronco:

Maior facilidade de obter células-tronco do que de encontrar um

doador de órgãos; o implante de células é um procedimento menos evasivo e

agressivo para o paciente do que é o transplante de órgãos; Custos do

tratamento deverão diminuir consideravelmente; a terapia com células-tronco

tem sido vista como uma ótima ferramenta para o futuro tratamento do câncer e

na terapia gênica.

3.3 Incidência de algumas doenças que poderão, no futuro,

serem tratadas com células-tronco:

Doenças genéticas: Cerca de 3% das crianças nascem com alguma

doença genética. Diabetes: no Brasil há 10 milhões de diabéticos, que

correspondem 6 % da população, 10% destes possuem Diabetes tipo 1,

numericamente são 1 milhão brasileiros.

Doenças do SNC:

Doença de Parkinson: atinge uma média de 10 a 13 pacientes entre

100.000 habitantes, doença de Alzheimer: atinge: 5% dos homens e 6% das

mulheres com mais de 60 anos. Acidente Vascular Cerebral (AVC): maior

causa de óbito e morbidade do mundo Lesão de medula espinhal, Brasil, 50

casos novos / milhão de habitantes / ano 9.500 pacientes tornam-se lesados

medulares anualmente no Senso de 2000: 934 mil brasileiros paraplégicos ou

tetraplégicos Em São Paulo: 300 mil pessoas em cadeira de rodas.

Doenças Cardíacas:

13

(Insuficiência cardíaca no Brasil 6,5 milhões pacientes Insuficiência

Cardíaca (IC) 1,2 milhão de internações no SUS em 2001 260 mil mortes

(2001)80 mil por doença isquêmica do coração (2003) 2.2) Doença de

Chagas:Importante causa de insuficiência cardíaca na América Latina:16 - 18

milhões de pessoas infectadas Brasil: 6 milhões de pessoas afetadas 30%

indivíduos infectados progridem p/ fase crônica Incidência de algumas doenças

que poderão, no futuro, serem tratadas com células-tronco:

4 Transplante de células-tronco (TCT)

Histórico

1939: Primeiro relato do uso de transplante de medula óssea (MO)

realizado em mulher com anemia aplástica. Doador: irmão com grupo

sangüíneo idêntico. Paciente morreu 5 dias mais tarde.

1968: Primeiro transplante de MO realizado com sucesso em criança

com imudeficiência grave. Avaliação da histocompatiblidade.

1988: Paris: Primeiro relato de uso de células de sangue de cordão

umbilical e placentário (SCUP) em transplante realizado por Dr Eliane

Gluckman.

1993: Primeiro banco público de sangue de cordão umbilical humano

estabelecido no New York Blood Center pelo Dr. Pablo Rubinstein, em New

York.

4.1 Sangue de Cordão Umbilical e Placentário (SCUP):

Vantagens do TCT usando SCUP sobre TMO e aférese: oferta

ilimitada, disponibilidade imediata, menor incidência de DECH, menor risco de

14

doenças infecciosas, CMV, EBV, etc, Desvantagem do SCUP: volume limitado

principalmente quando usado em crianças.

Placentas em suporte para coleta

Sangue de Cordão Umbilical com volume reduzido para congelamento

Há 100 Bancos públicos de sangue de cordão umbilical de SCUP no

mundo. Destes 40 % estão na Europa, 30 % nos EUA, 20% Ásia e 10 % na

Austrália. Segundo NetCord há: 115.272 unidades congeladas e 4.519

pacientes receberam TCTH com SCUP no mundo. Destes 2.653 são crianças e

1.855 adultos (principalmente EUA e Europa).

15

4.2 Lei de Biossegurança

A Lei 11.105 de 24 / 03 / 2005 menciona a respeito das Células-tronco

Embrionárias que é PROIBIDO: A) Engenharia Genética de Embriões, B)

Clonagem Reprodutiva ou Terapêutica, C) produção de Embriões humanos

para outros fins que não a reprodução, D) Comercialização de embriões

Humanos. É PERMITIDO: Obter células–tronco a partir de embriões desde

que, cumulativamente, esses embriões: sejam excedentes, foram produzidos

para reprodução por fertilização “in vitro”, estejam congelados por mais de três

anos ou que serão descartados por serem inviáveis (inadequados para a

reprodução).

16