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ELISAELISA
Um dos métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar antígenos e anticorpos, apresenta grande sensibilidade e especificidade, tornou-se uma das técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas mais utilizadas.
ELISAELISAuma enzima que está ligada ao Ac que formou um uma enzima que está ligada ao Ac que formou um
imunocomplexo com seu respectivo Ag, reage com um imunocomplexo com seu respectivo Ag, reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido.substrato incolor para produzir um produto colorido.
Se o Ag estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá Se o Ag estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação.
A presença de produto colorido indica que o Ac encontrou A presença de produto colorido indica que o Ac encontrou e se ligou ao Ag. e se ligou ao Ag.
É um método eficiente pois permite detectar quantidades É um método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).
ELISAELISA
O ELISA constitui a base do teste para infecção por O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV e diversos outros diagnósticos por sorologia. HIV e diversos outros diagnósticos por sorologia.
Nesse teste, proteínas virais (Ag) são adsorvidas aos Nesse teste, proteínas virais (Ag) são adsorvidas aos “poços” (wells) da placa de ELISA. “poços” (wells) da placa de ELISA.
Em seguida, é adicionado soro do paciente, que se Em seguida, é adicionado soro do paciente, que se contiver Ac, estes se ligarão aos Ag.contiver Ac, estes se ligarão aos Ag.
Finalmente, Ac marcados com uma enzima ligam-se Finalmente, Ac marcados com uma enzima ligam-se aos Ac humanos (complexo Ag-Ac), propiciando a aos Ac humanos (complexo Ag-Ac), propiciando a reação enzimática com mudança de cor. reação enzimática com mudança de cor.
ELISAELISAIndiretoIndireto
ELISAELISA
http://www.positivehealth.com/permit/Articles/Colon%20Health/abraham62.htm
http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.jpg
ELISAELISASanduícheSanduíche
O Ac contra um Ag particular é adsorvido no well.O Ac contra um Ag particular é adsorvido no well.
Depois, o Ag (soro, urina ou outra amostra) é Depois, o Ag (soro, urina ou outra amostra) é adicionado e se liga ao anticorpo. adicionado e se liga ao anticorpo.
Finalmente, um segundo e diferente Ac ligado à Finalmente, um segundo e diferente Ac ligado à enzima é adicionado. enzima é adicionado.
Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de Ag presente. Logo, permite quantidade de Ag presente. Logo, permite mensurar até pequenas quantidades de antígeno.mensurar até pequenas quantidades de antígeno.
ELISAELISASanduícheSanduíche
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]
ELISAELISA
EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:PLACA DE ELISA (material permite adsorção do PLACA DE ELISA (material permite adsorção do
Ag ou Ac e tem fundo chato, podem ter tiras Ag ou Ac e tem fundo chato, podem ter tiras removíveis).removíveis).
ELISAELISA
Micropipetas (comuns ou multicanal)Micropipetas (comuns ou multicanal)
http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.jpg
http://pandora.labgeminis.com:8909/images/8x200_ul.jpg
ELISAELISA
Leitor de Elisa (espectrofotometro p/ placas)Leitor de Elisa (espectrofotometro p/ placas)
Leitor de tiras ELISA
http://www.rclcomercial.com.br/drake/i004.jpg
ELISAELISAPROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:
Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o primeiro Ac com concentração conhecida e suficiente para primeiro Ac com concentração conhecida e suficiente para adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. adsorver nos “poços” (“wells”) da placa.
Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.
Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na placa (sítios inespecíficos).placa (sítios inespecíficos).
Realiza-se nova lavagem e a etapa de Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃOSENSIBILIZAÇÃO da placa está cumprida.da placa está cumprida.
ELISAELISA
Incubação com as amostras (soluções teste com Ag em Incubação com as amostras (soluções teste com Ag em concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)
Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo previamente aderido à placa também permanecerá aderido.previamente aderido à placa também permanecerá aderido.
Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.
Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.
Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma enzima, como a uma enzima, como a peroxidase. peroxidase. Segue-se outra lavagem.Segue-se outra lavagem.
ELISAELISAAdição de substrato para revelação. É um substrato incolor Adição de substrato para revelação. É um substrato incolor
que, quando ativado pela enzima ligada ao sistema Ac-Ag, que, quando ativado pela enzima ligada ao sistema Ac-Ag, produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser lida diretamente em aparelho apropriado. lida diretamente em aparelho apropriado.
Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA.detectada pelo leitor de ELISA.
1O ANTICORPO2O ANTICORPOANTÍGENO DA
AMOSTRAANTICORPO
LIGADOMUDANÇA DE
COR
ELISAELISA
Leitura placaLeitura placa
http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg
ELISA - Curva padrãoELISA - Curva padrão
CURVA PADRÃO, CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira preenchendo 8 “poços” de uma fileira com concentrações crescentes e conhecidas de com concentrações crescentes e conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de comparação antígeno. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura de ELISA.para a leitura de ELISA. EXEMPLO DE CURVA PADRÃO
ELISA - ControlesELISA - ControlesUm outro controle feito é o Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, TESTE BRANCO, que consiste na adição que consiste na adição
somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação durante o experimento.durante o experimento.
O teste deve ser feito em O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATADUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo de , servindo de controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser repetido.repetido.
PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue, deve-se se a amostra for sangue, deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar. centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar.
Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH adequado, substância detergente (para lisar a membrana) e inibidores adequado, substância detergente (para lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.análise.
Hemaglutinação Indireta - HAIHemaglutinação Indireta - HAIex: Diagnóstico de Chagasex: Diagnóstico de Chagas
A doença de Chagas é causada por um protozoário o Trypanosoma cruzi, e transmitida ao homem por um inseto, o triatomíneo. Imunologicamente, 3 estágios podem ser considerados: agudo, latente ou indeterminado e crônico.
Na fase intermediária ou latente não há sintomas, as informações prestadas pelo laboratório clínico tornam-se decisivas no diagnóstico etiológico.
Reação de hemaglutinação indireta (HAI) Princípio do método:
Eritrócitos de aves sensibilizados com componentesantigênicos do T. cruzi, altamente purificados, mostram
aglutinação quando reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.
HEMAGLUTINAÇÃOHEMAGLUTINAÇÃOProcedimentoProcedimento
Pipetar 50 microlitros do soro controle positivo, negativo e de cada amostra nas respectivas cavidades da placa.
Adicionar 25 microlitros da suspensão homogênea de hemácias em cada cavidade.
Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo, com os dedos, nas bordas da placa por 3 a 4 minutos.
Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente,em local livre de vibrações (IMPORTANTE).
Fazer leitura.
HEMAGLUTINAÇÃO EM PlacaHEMAGLUTINAÇÃO EM Placa
LEITURANEGATIVO: quando as hemácias se depositam no
fundo da cavidade formando um botão.
POSITIVO: quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, as vezes com bordas irregulares.
Os soros que mostram reação positiva no teste qualitativo devem ser titulados.
