PCR Em Tempo Real

Protocolos – Sandro R. Valentini

PCR em Tempo Real (qRT-PCR) O termociclador de PCR em Tempo Real (“7500 Real Time PCR System” –

Applied Biosystems) é um equipamento que deve ser calibrado corretamente,

seguindo as instruções do fabricante. As calibrações mensais são: “Background” e

“Optical”; já as calibrações semestrais são: “ROI” e “Pure Spectra”.

Todas as etapas a seguir estão descritas para utilização do kit “Power SYBR®

Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems), cujo fluoróforo é intercalante de DNA.

OTIMIZAÇÃO DOS PRIMERS 1) Desenhar os primers para a reação de PCR em Tempo Real utilizando o Primer3

ou Primer Expressv3.0.

2) Fazer 4 mix (um para cada concentração), o mix é para 5 reações (triplicata +

branco + erro).

Após a síntese do par de primers, é necessário determinar a concentração ideal de

uso destes. Fazer alíquotas dos primers diluídos para 10 µM. Para isto, devemos

utilizar uma concentração fixa de cDNA (20 ng) e variar as concentrações de primers

nas reações.

Gradiente da concentração dos primers: 0,25 µM; 0,4 µM; 0,5 µM e 0,7 µM.

[primer]= 0,25 µM [primer]= 0,4 µM [primer]= 0,5 µM [primer]= 0,7 µM

Reagente Volume Volume Volume Volume Power SYBR®

Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems)

50 µL 50 µL 50 µL 50 µL

Primer F (10 µM)

2,5 µL 4,0 µL 5,0 µL 7,0 µL

Primer R (10 µM)

2,5 µL 4,0 µL 5,0 µL 7,0 µL

H20 Milli-Q 40 µL 37 µL 35 µL 31 µL 3) Pipetar 19 µL do mix em um poço da placa de 96 well, esta será a reação de

branco (um branco por mix).


4) Ao restante do mix, adicionar 4 µL de cDNA (referente a 80 ng de RNA total

convertido em cDNA), homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as

triplicatas da reação (20 µL cada). Realizar este procedimento para todos os mix.

5) Selar a placa com adesivo óptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4ºC.

6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no “7500 Real Time PCR

System”, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa. Em

“Instrument” colocar volume final 20 µL, adicionar “Curva de dissociação” e iniciar a

corrida.

7) Após o término da reação de PCR, analisar a “Curva de dissociação” para cada

par de primers, esta deve ter apenas um pico mostrando a especificidade do par de

primers. Na “Amplification plot” é possível verificar qual a melhor concentração dos

primers a ser utilizada (menor concentração de primers que gera a máxima

amplificação).

Caso não seja possível determinar esta concentração, ou seja, caso não

existam pelo menos duas concentrações de primers que sejam coincidentes com

relação à máxima amplificação obtida, realizar novamente esta etapa com outras

concentrações.

VALIDAÇÃO DOS PRIMERS 1) Com a concentração dos primers fixa, deve-se variar a concentração de cDNA,

afim de determinar os valores de “slope” e de “R2” para calcular a eficiência deste

par de primers.

Gradiente da concentração do cDNA: 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng.

2) Fazer 5 Mix para 5 reações (triplicata + branco + erro), um para cada

concentração de cDNA:

Exemplo para um par de primes com concentração ideal de 0,25 µM:


[primer]= 0,25 µM Reagente Volume

Power SYBR® Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems)

50 µL

Primer F (10 µM) 2,5 µL Primer R (10 µM) 2,5 µL

H20 Milli-Q 40 µL 3) Pipetar 19 µL do mix em um poço da placa de 96 well, esta será a reação de

branco (um branco para cada um dos 5 mix diferentes).

4) Ao restante do mix, adicionar 4 µL de cDNA (nas diferentes concentrações),

homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reação (20 µL

cada). Realizar este procedimento para todos os mix.



System”, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa. Em

“Instrument” colocar volume final 20 µL, adicionar “Curva de dissociação” e iniciar a

corrida.

7) Após o término da reação de PCR, novamente analisar a “Curva de dissociação”

para cada par de primers, a qual deve ter apenas um pico. Verificar na “Curva

padrão de amplificação” quais os valores de “slope” e de “R2”, podendo ajustar a

linha do Ct (manual ou auto).

Caso não seja possível validar o par de primers com este gradiente de

concentrações de cDNA, realizar novamente esta etapa com outras concentrações,

de maneira que os valores de Ct estejam entre 5 e 25. Calcular a eficiência deste

par de primers pela fórmula:

[Eficiência = 10(-1/slope) – 1].

Uma vez que a concentração ideal dos primers (Otimi zação) for determinada, e

estes estiverem validados (Validação) não é necessá rio repetir estas etapas.


ANÁLISE POR PCR EM TEMPO REAL 1) O RNA extraído que foi convertido em cDNA deverá ser utilizado (vide protocolos

“Extração de RNA” e “Transcrição reversa”). Diluir sua amostra para uma quantidade

referente a 80 ng de RNA total transcrito reversamente em cDNA. Devemos sempre

realizar as reações com os pares de primers do gene de interesse e do controle

endógeno na mesma placa.

2) Mix para 5 reações (triplicata + branco + erro), exemplo para um par de primes

com concentração ideal de 0,25 µM:

[primer]= 0,25 µM

Reagente Volume Power SYBR® Green

PCR Master Mix (Applied Biosystems)

50 µL

Primer F (10 µM) 2,5 µL Primer R (10 µM) 2,5 µL

H20 Milli-Q 40 µL 3) Pipetar 19 µL do mix em um poço da placa de 96 well, esta será a reação de

branco (um branco para cada mix diferente).

4) Ao restante do mix, adicionar 4 µL de cDNA (~20 ng/µL), homogeneizar bem, e

pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reação (20 µL cada). Realizar este

procedimento para todos os mix.



System”, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa colocando o

tipo de análise desejada. Em “Instrument” colocar volume final 20 µL, adicionar

“Curva de dissociação” e iniciar a corrida.

7) Após o término da reação de PCR, novamente analisar a “Curva de dissociação”

para cada par de primers, a qual deve ter apenas um pico. Realizar a análise

desejada com os dados (valores de Ct) obtidos.

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