UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ DISCIPLINA: Genética Molecular PROFº. Ronan Xavier.

Leonny da Silva Santos - 200811134

Pesquisa complementar

O que é a PCR?Em 1985, foi descrita a metodologia da reação em cadeia da polimerase (PCR,

de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A sigla como demonstrada, significa "polymerase chain reaction", que em português seria reação em cadeia da polimerase. Então, a base da técnica é a ação in vitro da DNA ´polimerase. Para compreendermos como funciona a técnica, que é na verdade bem simples, precisamos recordar que, para iniciar a síntese de uma fita nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e de precursores de síntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP).

A idéia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de DNA feitos em laboratório, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro, que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distância entre os sítios de pareamento dos dois primers não podia ser muito grande, e foram escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reação era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais, até 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequência alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e outro na cópia recém sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4 cópias do alvo. É claro que a repetição do processo geraria um número de cópias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2.

Na verdade, a coisa não foi tão fácil assim: a DNA pol era termoinstável (como a maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94oC. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão. Além disso, a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de pareamentos espúrios (sem sentido, errôneos) no sistema, gerando ao final produtos de PCR inesperados.

A solução foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituída por uma DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta extraordinariamente útil na genética molecular. Que propriedades têm a Taq polimerase que a fazem tão útil? Ela é termoestável e sua temperatura ótima de funcionamento é 72 oC. Com isto três problemas ficaram automaticamente resolvidos:a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.

b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridização, que podia ser mantida acima de 50 oC, evitando hibridizações espúrias.c) o DNA molde não se renaturava por completo, permitindo uma rápida desnaturação ao se iniciar um novo ciclo.

Os eventos ligados às três temperaturas mencionadas, 94 oC, 50 oC e 72 oC, estão esquematizados na figura abaixo. Observe que, a 94 oC, os primers e as fitas simples de DNA alvo estão misturados, mas não podem parear. Quando a temperatura é reduzida os primers rapidamente alcançam seus sítios de complementariedade, pois são moléculas pequenas e, portanto, muito móveis, e porque estão em concentração muito mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde tende a renaturar, mas logo a temperatura é novamente elevada para 72 oC, que permite a extensão das novas fitas a partir dos primers, sem desparear os primers outra vez. Por fim, a temperatura volta a 94 oC, que desnatura todas as fitas, inclusive as recém sintetizadas, recomeçando o processo.

Figura 1. Eventos relacionados às três temperaturas básicas da PCR: Desnaturação a 94 oC, pareamento dos primers a 50 oC e extensão de novas fitas a 72 oC, supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estável.

  O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento variável, obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um vírus ou plasmídeo), e outra, de comprimento determinado, que é obtida sempre que um DNA previamente copiado é empregado como molde em sua síntese.

Esta situação está claramente representada na figura abaixo, que mostra os três primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a fita estendida a partir de um primer hibridizado com o DNA molde original não tem comprimento fixo, porque o molde é muito longo. Seu comprimento final vai ser determinado  pelo instante em que o primer hibridizar com o sítio de complementariedade e pela tempo de extensão total, à temperatura de 72 oC. As duas primeiras fitas estendidas estão indicadas com a letra e à sua direita. Já as fitas que são produzidas a partir de primers que hibridizaram em fitas previamente copiadas têm fatalmente ser comprimento definido, já que inicia, no primer e terminam ao fim do DNA molde, que é exatamente a e extremidade 5´do primer já incorporado na fita molde. As fitas de comprimento definido aumentam de número exponencialmente, formando aos poucos um imenso número d fita duplas de comprimento definido, enquanto as fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo, por alvo). Uma inspeção da figura a seguir esclarecerá o leitor sobre esta questão.

Figura 2.  Produção de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Após hibridização dos primers a 56 oC, as fitas novas são sintetizadas a 72 oC, dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo). Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação.

A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de poliacrilamida, que corre verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação UV, "corando" previamente o DNA com brometo de etídio (esta substância se intercala entre as fitas de DNA e nestas condições absorve o UV e fluoresce com cor alaranjada).  O produto de PCR será sempre um DNA fita dupla e o que distingue um do outro, no gel, será apenas o comprimento relativo. Esta situação está representada no esquema da figura seguinte.

Figura 3.  Visualização de três reações de PCR. Em a e b dois produtos são gerados, a partir de dois pares de primers diferentes. Os dois produtos têm comprimentos de 400 e 360 pb. A migração das bandas na eletroforese é de cima para baixo. O fragmento menor migra

mais rápido e produz a banda em vermelho. O maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. A coluna c é um controle negativo, essencial em qualquer reação de PCR. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA -  DNA ladder - de 100 pb). Na transiluminação ou na coloração por prata, evidentemente, todas as bandas têm a mesma cor.

Figura 4.  Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (número total de pares de bases) (colunas 2 a 5). Na coluna 1 estão os marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido, obtidos por digestão por enzima de restrição de um DNA conhecido ou sintetizados por máquinas. A coluna 6 é um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel é apenas a fronteira da eletroforese.

RAPD - uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer DNA!Uma limitação séria na PCR convencional é a necessidade de se conhecer

previamente a sequência que se quer amplificar ou, pelo menos, suas extremidades, para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se, contudo, baixarmos a temperatura de hibridização (pareamento) para menos de 45 oC, poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos sítios do DNA. Em verdade, não precisamos sequer de dois primers, basta um.

Uma PCR feita com um só primer e empregando uma temperatura de hibridização (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera, muitas vezes, um número considerável de bandas em muitos diferentes DNAs, através do pareamento com baixa estringência do primer (em geral ele também, pequeno, com 10 a 15 bases, o que facilita os pareamentos). O curioso é que, se repetirmos o experimento nas mesmas condições experimentais, obteremos as mesmas bandas mais uma vez. As bandas, então, não são uma amplificação completamente aleatória de trechos de DNA, mas sim de trechos flanqueados por sequências que pareiam com o primer com baixa estringência, o que é muito diferente. Apesar disso, a técnica de PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato é rápida, mas o nome - randomly amplified polymorphic DNA - DNA polimórfico amplificado aleatoriamente - dá margem a certa confusão. Se, por um lado, o pareamento não é aleatório completamente, por outro a existência das sequências com homologia é de fato aleatória, pois não sabemos de antemão se um DNA terá regiões com complementariedade para o primer escolhido.

Idealmente um RAPD deve gerar um número de bandas superior a 4, e estas bandas devem ser polimórficas (isto é, com diferentes migrações) para indivíduos diferentes, ao menos entr grupos distintos. Isto, contudo, nem sempre ocorre. Ainda assim, o RAPD é uma técnica extremamente poderosa porque os marcadores são bastante polimórficos e porque se pode testar um grande número de primers em cada situação. Além disso, a técnica é rápida e de baixo custo.

Uso do PCR: Eis os principais! PCR na investigação de PaternidadeUma das aplicações mais conhecidas da PCR é a investigação de paternidade.

Técnicas bioquímicas ou moleculares (voltadas ao DNA) já existiam muito antes da

descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnósticos baseados em PCR que a investigação de paternidade alcançou o mercado com mais abrangência, pela redução dos custos do exame e democratização dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties).

Quando um STR - small tandem repeats e sua amplificação por PCR é analisado em gel de agarose, duas bandas serão visíveis se o indivíduo for heterozigoto para aquele STR. No caso de investigação de paternidade, o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da mãe. Isto que dizer que, para um sistema qualquer, o filho terá um STR (e uma banda) materno e outro paterno. A figura abaixo retrata a situação onde um casal avalia a paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem claramente uma banda de origem materna e a segunda banda está na mesma altura da banda paterna. Portanto, o marido não pode ser excluído de ser o pai. No segundo caso, contudo, a criança tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda paterna. Esta situação exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. 2).

Fig. 5.  Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação de paternidade. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o resultado da amplificação de um sistema para o suposto pai, a mãe e dois filhos. A banda materna de cada filho está indicada e a banda paterna de um deles está contornada com uma elipse. O teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo filho.

PCR na investigação de crimesOutro campo fértil para o uso da PCR é a criminalística. A possibilidade de

amplificar um pequeno trecho de DNA milhões de vezes permite, em muitos casos, amplificar de uma pequena amostra biológica (mancha de sangue, bulbo de cabelo, fragmentos de pele), mesmo em um estado de conservação, suficiente DNA para uma análise de STRs como a descrita acima. Um caso clássico é a investigação da procedência de uma mancha de sangue no casaco da vítima (ou resto de pele sob as unhas da vítima). Supondo, para fins deste exemplo, que o material não contivesse restos de células da própria vítima, o procedimento para análise do caso estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo.

Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com duas bandas (aparecerá apenas uma se o indivíduo for "homozigoto" para aquele STR). Na

amostra as duas bandas do suspeito 2 estão claramente visíveis. O suspeito um tem apenas uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O teste exclui dois indivíduos, mas não prova, como na paternidade, que o outro é o "dono" da amostra. A inclusão do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de não exclusão (como no caso de paternidade) para 99,99999999%. Isto quer dizer que não podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de 99,99999999%. 

Fig. 6.  Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação criminal. Três suspeitos estão sendo investigados e uma amostra de sangue está disponível.  A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificação de um sistema para os possíveis criminosos. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra. O padrão de duas bandas é idêntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.

Enfim, as aplicações forenses (na justiça) da PCR são ilimitadas. 

PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas e na identificação de portadores sãos de alelos mutantes.

Doenças genéticas podem, algumas vezes, ser difíceis de diagnosticar. Adicionalmente, no aconselhamento genético de casais é importante determinar inequivocamente se um indivíduo é portador de um alelo mutante (portador são). A identificação de mutações em genes pode ser feita também por PCR, em geral com a manipulação posterior do produto de amplificação.

Referência Eletrônica:

Portal de informação em genética e biologia molecular e áreas afins: PCR - Uma técnica de mil e uma utilidades. UFPE. <http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htm> Acesso em 31 de abril de 2011, as 17h30min.