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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS PARA O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IGY REATIVOS
PARA A PROTEÍNA NS1 RECOMBINANTE DO DENGUE VIRUS E
SUA CONJUGAÇÃO COM PEROXIDASE DE RABANETE.
Camila Cavadas Barbosa
Ouro Branco
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS
PARA O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IGY REATIVOS
PARA A PROTEÍNA NS1 RECOMBINANTE DO DENGUE VIRUS
E SUA CONJUGAÇÃO COM PEROXIDASE DE RABANETE.
Camila Cavadas Barbosa
Ouro Branco
2015
Dissertação apresentada como requisito para
obtenção do grau de mestre em Ciências com
ênfase em: Tecnologias para o Desenvolvimento
Sustentável.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Helvécio Tótola.
Ficha catalográfica elaborada pela Divisão de Biblioteca da UFSJ
Barbosa, Camila Cavadas
B238p Produção e purificação de anticorpos IgY reativos para a proteína NS1 recombinante do Dengue virus e sua conjugação
com peroxidase de rabanete. [manuscrito] / Camila Cavadas Barbosa. - 2015
58 f. : il.
Orientador: Antônio Helvécio Tótola.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de São João del-Rei. Mestrado em Tecnologias para o
Desenvolvimento Sustentável.
Referências: f. 52-58.
1. Dengue – Teses 2. IgY – Teses 3. IgY – Purificação – Teses 4. NS1 – Teses I. Tótola, Antônio Helvécio
(Orientador) II. Universidade Federal de São João del-Rei. III. Mestrado em Tecnologias para o Desenvolvimento
Sustentável IV. Título
CDU 616.98
“A persistência é o caminho do êxito”
Charles Darwin
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus pelo dom da vida e por ter me guiado todos os
dias nesta caminhada.
À minha mãe, minha irmã e meu pai (in memorian) pelo apoio, o amor e o carinho de
sempre e que muitas vezes entenderam a minha ausência.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Antônio Helvécio Tótola, pela confiança que me foi dada
em realizar um projeto tão importante e sério, uma pessoa que ele não conhecia.
Muito obrigada pela oportunidade de trabalhar com alguém inteligente e comprometido
com seus projetos e alunos.
Ao LABICEM, às mestras Juliana e Tatiana pela amizade e companheirismo ao longo
desses dois anos. Ao aluno de iniciação científica Leonardo, pela ajuda nos diversos
experimentos realizados. À Manoélle e à Tayse pelos momentos de descontração.
À Cássia, Márcia e Kaio, companheiros de mestrado, obrigado pela amizade e apoio
nos momentos difíceis, pelas risadas e por muitas vezes tornar a jornada mais leve. À
Barbara, pelos conselhos e otimismo de sempre, muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Eduardo Sarquis, obrigada pelas longas conversas dos mais variados
assuntos que tínhamos nos corredores do CAP, que sempre me fizeram ver a Ciência
com outro olhar.
Aos amigos mais próximos e outros mais distantes, obrigada pelos momentos de
descontração, por cada palavra de apoio e incentivo.
Ao Prof. Dr. Luiz Gustavo, pela colaboração nas análises estatísticas.
À UFSJ - PPGTDS pela oportunidade de cursar o mestrado
Às agências FAPEMIG, FINEP e CNPQ no desenvolvimento deste trabalho.
RESUMO
A dengue é uma doença infecciosa causada por um Flavivírus representado por quatro
sorotipos distintos DENV 1-4 e atinge principalmente os países tropicais e
subtropicais. As manifestações clínicas variam desde um quadro assintomático, até
quadros de hemorragias e choque, podendo evoluir para o óbito. Com isso torna-se
essencial o desenvolvimento de diagnósticos rápidos, práticos e de baixo custo para
detecção dos casos de Dengue, além de ser uma ferramenta importante no manejo
clínico e epidemiológico em áreas endêmicas. Atualmente a confirmação do Dengue
virus é realizada através de ensaios sorológicos para detecção de anticorpos
específicos e detecção da proteína NS1 no soro de pacientes infectados. Anticorpos
policlonais dos ovos de galinhas, a imunoglobulina Y, têm sido utilizados para a
captura de antígenos devido à alta sensibilidade e baixo custo, além de ser um método
que visa o bem-estar animal. Assim, o presente trabalho teve como objetivo a
Produção e purificação de anticorpos IgY reativos para a proteína NS1 recombinante
do Dengue vIrus e sua conjugação com peroxidase de rabanete. Foram imunizadas
onze galinhas com antígeno NS1 recombinante e os anticorpos IgY anti-NS1, obtidos
a partir da gema do ovo. Os anticorpos foram purificados através do método de
precipitação com polietileno-glicol 6000, posteriormente, dialisados. As proteínas foram
quantificadas segundo o método do ácido bicinconínico. A capacidade de
reconhecimento dos anticorpos purificados foi avaliada pelos métodos de Dot blot e
ELISA. Logo em seguida, a IgY reativa para NS1 foi conjugada com peroxidase de
rabanete. Os resultados obtidos pelos métodos de Dot blot, ELISA e a conjugação com
peroxidase de rabanete demostraram a que o anticorpo IgY purificado pelo método
desenvolvido no LABICEM é reativo para a proteína recombinante NS1 do Dengue
virus. Portanto, a partir dos resultados alcançados, conclui-se que a produção de
anticorpo IgY anti-NS1 é uma alternativa viável para confirmação ou diagnóstico
precoce da doença sem a necessidade de equipamentos laboratoriais especializados.
Ressaltamos ainda que os resultados satisfatórios obtidos pelo método de purificação
desenvolvido no LABICEM é uma alternativa viável e fácil na rotina laboratorial.
Palavras chaves: Dengue, IgY, purificação, NS1.
ABSTRACT
Dengue is an infectious disease caused by a Flavivirus represented by four distinct
serotypes DENV 1-4 and affects mainly the tropical and subtropical countries. Clinical
manifestations range from an asymptomatic form, until two forms of illness, both the
Hemorrhagic fever and shock, and may progress to death. Thus comes to be essential
the development of rapid, practical and inexpensive diagnostics for detection of dengue
cases, and in addition of this, it is an important tool in clinical and epidemiological
management in endemic areas. Nowadays, Dengue virus confirmation is performed by
serological assays for detection of specific antibodies and detection of the NS1 protein
in the infected patient’s serum. The use of polyclonal antibodies from hen eggs
immunoglobulin Y has been applied to capture antigens due to high sensitivity, low
cost, besides being a method that aims the animal welfare. So, the present study
aimed the production and purification IgY antibodies to the NS1 recombinant protein of
the dengue virus and conjunction (with radish peroxidase). Eleven hens were
immunized with NS1 recombinant antigen and the IgY anti-NS1 antibody obtained from
the egg yolk. The antibodies were purified, both using polyethylene glycol, and
subsequently dialyzed. The proteins were quantified according to the bicinchoninic acid
method. The recognition capacity of purified antibodies was evaluated by Dot blot and
ELISA methods. Shortly after, the reactive IgY for NS1 was conjugated to radish
peroxidase. The results obtained by Dot blot and ELISA methods and the conjugation
with radish peroxidase demonstrate the efficiency of purification developed at
LABICEM and demonstrates that the IgY antibody is reactive for the Dengue virus NS1
recombinant protein. Therefore, from the results obtained it is concluded that the
production of IgY antibody anti-NS1 is a viable alternative for early diagnosis or
confirmation of disease without the need for specialized laboratory equipment. We also
emphasize that the satisfactory results obtained by the purification method developed
at LABICEM is a viable and easy alternative for laboratory routine.
Keywords: Dengue, IgY, purification, NS1.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................................17
2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................................. 19
2.1 EPIDEMIOLOGIA................................................................................................................. 19
2.1.2 Agente Etiológico: O Dengue virus................................................................................... 20
2.1.3 Transmissão e Ciclo viral................................................................................................ 22
2.1.4 Manifestações Clínicas da doença................................................................................. 23
2.1.5 Diagnóstico..................................................................................................................... 24
2.1.5.1 Isolamento Viral........................................................................................................... 25
2.1.5.2 Detecção do Genoma Viral ........................................................................................... 25
2.1.5.3 Detecção de Anticorpos................................................................................................ 25
2.2 IMUNOGLOBULINAS........................................................................................................... 27
2.2.1 Uso de animais na experimentação
científica...................................................................................................................................... 29
2.2.2 Imunoglobulina Y (IgY)...................................................................................................... 30
2.2.3 Estrutura da Imunoglobulina Y......................................................................................... 31
3 OBJETIVOS............................................................................................................................ 33
3.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................................... 33
3.2 OBEJTIVOS ESPECÍFICOS................................................................................................ 33
4 JUSTIFICATIVA...................................................................................................................... 34
5 MATERAIS E MÉTODOS........................................................................................................35
5.1 PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE NS1......................................................... 35
5.2 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS.......................................................................................... 35
5.2.1 Aspectos Éticos................................................................................................................. 35
5.2.2 Imunização de Galinhas.................................................................................................... 35
5.2.3 Purificação de Anticorpos IgY........................................................................................... 36
5.2.3.1 Método descrito por Pauly et al. (2011).......................................................................... 37
5.2.3.2 Método desenvolvido no LABICEM................................................................................ 37
5.2.4 Diálise................................................................................................................................ 38
5.3 QUANTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS IGY PURIFICADOS........... 38
5.3.1 Quantificação de proteínas totais purificadas................................................................... 38
5.3.2 Eficiência da purificação dos anticorpos
IgY...............................................................................................................................................38
5.3.3 Cromatografia de Exclusão Molecular dos anticorpos IgY
purificados................................................................................................................................. 39
5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE IGY ANTI-NS1................................................................. 39
5.4.1 Detecção por Dot Blot....................................................................................................... 39
5.4.2 Detecção pelo método de ELISA...................................................................................... 40
5.5 CONJUGAÇÃO COM PEROXIDASE DE RABANETE (HRP)............................................. 41
5.5.1 Conjugação das IgYs purificadas com Peroxidase de Rabanete ..................................... 41
5.5.2 Detecção por Dot Blot........................................................................................................ 42
5.6 ANÁLISE ESTATISTICA ......................................................................................................42
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................... 43
6.1 IMUNIZAÇÕES DE GALINHAS........................................................................................... 43
6.2 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS PURIFICADAS............................................ 43
6.3 EFICIÊNCIA DA PURIFICAÇÃO DOS ANTICORPOS IGY
.................................................................................................................................................... 44
6.4 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR DOS ANTICORPOS IGY
PURIFICADOS........................................................................................................................... 45
6.5 AVALIAÇÂO DA ATIVIDADE DOS ANTICORPOS PURIFICADOS................................... 47
6.5.1 Capacidade de detecção por Dot Blot............................................................................... 47
6.5.2 Detecção pelo método de ELISA...................................................................................... 48
6.6 CONJUGAÇÃO DAS IGYS PURIFICADAS COM PEROXIDASE DE
RABANETE.................................................................................................................................49
7 CONCLUSÃO......................................................................................................................... 51
8 REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 52
ANEXOS................................................................................................................................... 55
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Transmissores do Dengue virus. A: Aedes aegypti; B: Aedes
albopictus................................................................................................................................. 19
Figura 2. Representação esquemática do genoma do Dengue virus..................................... 21
Figura 3. Ciclo da replicação viral do Dengue virus................................................................ 23
Figura 4. Níveis de anticorpos IgM e IgG durante a infecção primária e secundária ao Dengue
virus............................................................................................................................................ 26
Figura 5. Estrutura básica de uma Imunoglobulina.................................................................. 28
Figura 6. Estrutura da imunoglobulina Y e imunoglobulina G.................................................. 30
Figura 7. Quantificação de proteínas totais pelo método de BCA ............................................ 43
Figura 8. A. Padrão de peso molecular (10 kDa – 170 kDa) B. Eletroforese SDS-PAGE 10%
das amostras de IgY purificadas pelo método descrita por Pauly et al., (2011), e método
desenvolvido pelo LABICEM...................................................................................................... 44
Figura 9. Amostra 01 purificada pelo método desenvlvido no
LABICEM.................................................................................................................................... 45
Figura 10. Amostra 01 purificada pelo método de Pauly et al., (2011)...................................... 45
Figura 11. Teste de Dot Blot em amostras de IgY (anti-NS1) purificadas. Amostra 1, 2 e 3
controle positivo e controle negativo.......................................................................................... 47
Figura 12. Ensaio de ELISA em diferentes diluições: 1:100; 1:200; 1:400;
1:800........................................................................................................................................... 48
Figura 13. Dot Blot da IgY (anti-NS1) conjugada com HRP CN: controle negativo CP: controle
positivo........................................................................................................................................ 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros da corrida....................................................................................... 45
Tabela 2. Parâmetros da corrida...................................................................................... 45
LISTA DE ANEXOS
Certificado – Comissão de Ética no Uso de Animais UFSJ – CEUA/UFSJ
Protocolos de soluções para ELISA Protocolos de soluções para Dot Blot
Cromatogramas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – Celsius
BCA – Ácido Bicinconínico
BSA – Albumina
C – Proteína de Capsídeo
C2H7NO – Etanolamina
CAP – Campus Alto Paraopeba
CAP – Resíduo 7-metil-guanosina ligado a um trifosfato
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CH – Cadeia pesada
CL – Cadeia leve
CN – Controle Negativo
CP – Controle Positivo
DAB – 3,3 – Diaminobenzidina
DENV – Dengue virus
DENV1 – Dengue virus 1
DENV2 – Dengue virus 2
DENV3 – Dengue virus 3
DENV4 – Dengue virus 4
E – Proteína de Envelope
ELISA – Ensaio imunoenzimático
FC – Fixação do Complemento
FD – Febre do Dengue
FHD – Febre hemorrágica da Dengue
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
H2SO4 – Ácido sulfúrico
HRP – peroxidase de rabanete
Ig – Imunoglobulinas
IgA – Imunoglobulina A
IgD – Imunoglobulina D
IgE – Imunoglobulina E
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
IgY – Imunoglobulina Y
IgY anti-NS1 – Imunoglobulina Y anti-NS1
IH – Inibição de Hemaglutinação
INCT - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia
IPTG – Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo
Kb – Kilobase
KDa – Quilodalton
LABICEM – Laboratório de Bioquímica e Imunologia Celular e Molecular
LB – Meio Luria Broth
M – Proteína de Membrana
m/v – Massa por volume
mg – miligrama
mL – mililitro
MS – Ministério da Saúde
N – Teste de Neutralização
NaBH3CN – Cianoborohidrito de sódio
NaCl – Cloreto de Sódio
nm – nanômetros
NS – Proteína não estrutural
NS1 – Proteína não estrutural 1 de Dengue virus
NS2a – Proteína não estrutural 2a de Dengue virus
NS2b – Proteína não estrutural 2b de Dengue virus
NS3 – Proteína não estrutural 3 de Dengue virus
NS4a – Proteína não estrutural 4a de Dengue virus
NS4b – Proteína não estrutural 4b de Dengue virus
NS5 – Proteína não estrutural 5 de Dengue virus
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS – Tampão fosfato salino
PBS-T – Tampão fosfato salino Tween® 20
PBS-T BSA – Tampão fosfato salino Tween® 20 Albumina
PEG – Polietilenoglicol
Poli-A – Cauda poliadenilada
prM – Proteína precursora de membrana
RC – Região Constante
RNA – Ácido ribonucleico
RT - PCR – Transcrição reversa seguida de reação em cadeia de polimerase
SCD – Síndrome do Choque da Dengue
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS – PAGE – Gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
TMB – 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina
UFSJ – Universidade Federal de São João Del-Rei
UTR – Região não traduzida
V – Região Variável
V – Volts
VH – Cadeia pesada
VL – Cadeia leve
xg – Força de gravidade
μg - microgramas
μl – microlitros
17
1 INTRODUÇÃO
A dengue é uma doença febril causada pelo Dengue virus (DENV), pertencente
à família Flaviviridae, gênero Flavivírus, que possui quatro sorotipos distintos: DENV-1,
DENV-2, DENV-3 e DENV-4.
O Dengue virus possui sete proteínas não estruturais (NS): NS1, NS2a, NS2b,
NS3, NS4a, NS4b e NS5, que estão relacionadas com replicação viral e virulência,
sendo a NS1 comum aos quatro sorotipos e sendo de grande importância em
diagnósticos sorológicos (CHUANG et al., 2013).
A transmissão da doença ocorre através da picada de mosquitos do gênero
Aedes, principalmente pela espécie Aedes aegypti e secundariamente pela espécie
Aedes albopictus (LIGON, 2004).
As condições socioambientais em nosso país favorecem a disseminação do
transmissor e anualmente presenciamos o aumento no número de casos da doença
atingindo milhares de brasileiros e elevando significativamente os gastos no combate a
ela (MONDINI; CHIARAVALLOTI, 2007).
A doença pode manifestar-se desde a forma assintomática, dengue clássica,
até formas mais graves, como a febre hemorrágica da dengue e a síndrome de
choque do dengue (NUNES, 2011; MELO, 2012).
O diagnóstico da Dengue é difícil, uma vez que as manifestações clínicas da
doença são similares às encontradas em outras enfermidades (DINIZ, 2012).
A confirmação da Dengue é realizada através de ensaios sorológicos, no
entanto os testes enfrentam duas barreiras: a produção de anticorpos tem custo
elevado e, normalmente, implica no sofrimento e estresse de animais, uma vez que
são necessárias sucessivas sangrias para obtenção de anticorpos e posterior sacrifício
dos mesmos para aquisição de volumes maiores de soro (STOCKWIN et al., 2003).
Uma alternativa ao uso destes animais é a produção de anticorpos em
galinhas. As aves apresentam a vantagem de maior facilidade na coleta e o maior
rendimento dos anticorpos quando comparado com anticorpos obtidos de outras
fontes. Além disso, outro benefício na utilização de anticorpos de galinha é o bem-
estar do animal, pois a obtenção desse tipo de anticorpo é menos invasiva e ainda
elimina a necessidade de sacrificar os animais em laboratório (GUIMARÃES, 2005;
RIBEIRO et al., 2007).
Assim, a produção de anticorpos de galinhas para a confirmação da Dengue
vem ao encontro dos interesses públicos, uma vez que o diagnóstico precoce da
18
doença, bem como a caracterização da gravidade da mesma, permite a instalação de
um tratamento mais efetivo, a localização rápida de focos endêmicos e a prevenção da
expansão destes focos.
Logo, este trabalho propõe a produção e purificação de anticorpos IgY reativos
para a proteína NS1 recombinante do Dengue virus e sua conjugação com peroxidase
de rabanete.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 EPIDEMIOLOGIA
A dengue é uma doença infecciosa re-emergente, um sério problema de saúde
pública mundial, e é considerada a mais importante das doenças virais transmitidas
por artrópodes (RIBEIRO et al., 2006; BRAGA, VALLE, 2007).
Seu agente etiológico pertence ao gênero Flavivírus, família Flaviviridae e
apresenta quatro sorotipos distintos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 (RIBEIRO
et al., 2006; BARRETO, TEIXEIRA, 2008; JOHANSEN, CARMOS, 2012).
Os principais vetores do Dengue virus pertencem ao gênero Aedes e ao
subgênero Stegomya, sendo o Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) o principal vetor. Este
é encontrado principalmente no meio urbano, antropofílico, possui hábitos diurnos e
deposita seus ovos em poças de água limpa (TAUIL, 2002; MALAVIGE et al., 2004).
Os ovos do A. aegypti têm uma alta capacidade de resistir a longos períodos de
dissecação, dificultando a erradicação do mosquito (FUNASA, 2001, TAUIL, 2002).
Outra característica é a capacidade de adaptação a diferentes locais considerados
desfavoráveis à sobrevivência, como elevadas altitudes e água poluída (TAUIL, 2002).
(FIGURA 1).
Outro vetor transmissor da doença é o Aedes albopictus (Skuse, 1894),
associado à transmissão no meio rural (TAUIL, 2002), sendo responsável pelos casos
de dengue no continente Asiático. (Figura 1).
Figura 1. Transmissores do Dengue virus. A: Aedes aegypti; B: Aedes albopictus. Fonte: Florida Medical Entomology Laboratory University of Florida, 1999.
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20
A doença é endêmica em regiões tropicais e subtropicais do planeta, com
maior incidência nos países da Ásia, África e Américas Central e do Sul (MALAVIGE et
al., 2004).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2009), três bilhões de pessoas
vivem em regiões nas quais a doença se propaga. Anualmente, há de 50 a 100
milhões de casos de infecção em todo o mundo. Além disso, 2,5 bilhões de pessoas
estão sob o risco constante de contrair o vírus (TAUIL, 2002; BRICKS, 2004).
No Brasil, já foram notificados os quatro sorotipos virais, o DENV-1, DENV-2,
DENV-3 e DENV-4 (BRASIL, 2015), situação que aumenta o risco de ocorrência das
formas graves da doença que em alguns casos, leva ao óbito (BRASIL, 2009). A
evolução para a forma grave da doença ocorre após uma infecção secundária por um
sorotipo viral diferente da infecção primária (SINGHI et al., 2007).
De acordo com dados da Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da
Saúde (SVS/MS), no ano de 2014 foram registrados 572.308 casos de dengue em
todo o território nacional. A SVS/MS destaca que nos três primeiros meses de 2015
foram 224.101 casos notificados de dengue no país, com 102 casos de dengue grave
e 52 casos de óbitos. Em Minas Gerais, no mesmo período foram notificados 13.690
casos de dengue, sendo três casos graves e um caso de óbito (BRASIL, 2015).
Segundo Tirado et al. (1999); Tauil (2002); Claro et al. (2004) e Brasil (2009),
fatores como condições climáticas, fluxo migratório rural-urbano, crescimento
desordenado nas cidades, condições inadequadas de saneamento, destinação
incorreta do lixo, má distribuição de renda, baixa escolaridade e deterioração dos
sistemas de saúde contribuem para a proliferação do vetor.
A principal maneira de prevenção da doença ocorre através da remoção dos
criadouros do mosquito e pelo uso de inseticidas (BARRERA et al., 2011). Porém,
essas medidas não têm sido eficazes para combater os vetores da dengue (GUZMAN
et al., 2010).
O controle da doença é um desafio no Brasil e no mundo, uma vez que não
existe um tratamento adequado e tampouco uma vacina eficaz (TAUIL, 2006).
2.1.2 Agente Etiológico: O Dengue virus
O genoma do Dengue virus é formado por uma fita simples de ácido
ribonucleico (RNA), contendo aproximadamente 11 kilobases (Kb) e polaridade
positiva (LODEIRO et al., 2009; ZOU et al., 2011). O genoma contém uma região 5’,
21
apresenta um cap (m7G5’ppp5’ A) e não possui a cauda poliadenilada (poli-A) na
extremidade 3’ (CHAMBERS et al., 1990; PINHO, 2013).
A sequência genômica codifica três proteínas estruturais – proteína C
(capsídeo), proteína M (membrana) e proteína E (envelope) e sete proteínas não
estruturais (NS, sigla do inglês): NS1, NS2a, Ns2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5
(MALAVIGE et al., 2004). (Figura 2).
Figura 2. Representação esquemática do genoma do Dengue virus.
Fonte: http://www.nature.com/scitable/content/dengue-virus-genome.
A proteína de capsídeo (C) está envolvida no processo de montagem da
partícula viral, porém o mecanismo pelo qual ocorre a formação do capsídeo não está
totalmente esclarecido (MA et al., 2004; WEAVER; VASILAKIS, 2009).
A proteína precursora de membrana (prM) faz parte da estrutura viral imatura,
sendo clivada posteriormente pela enzima furina que dá origem à proteína de
membrana (M). Esta está associada à proteína de envelope, formando a estrutura
externa da partícula viral madura (WEAVER; VASILAKIS, 2009).
Por sua vez, o genoma é envolvido por uma membrana lipídica, recoberta pela
proteína do envelope (proteína E), que está envolvida nas principais propriedades
biológicas do Dengue virus (BRICKS, 2004). Essa proteína possibilita o primeiro
contato entre o vírus e a célula hospedeira (PERERA; KUHN, 2008), além da
capacidade de hemaglutinar eritrócitos e de induzir anticorpos neutralizantes da
resposta imunitária protetora (BRICKS, 2004; MALAVIGE et al., 2004).
As proteínas não estruturais NS1, NS2a, Ns2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 estão
envolvidas na replicação do RNA viral (PERERA; KUHN, 2008).
A NS1 é uma glicoproteína expressa sob três formas distintas: associada ao
retículo endoplasmático, ancorada à membrana ou livre no meio extracelular (CLYDE
et al., 2006). A mesma circula em elevadas concentrações nas amostras de sangue de
pacientes infectados tanto na infecção primária como na secundária (LIBRARY, 2002).
22
Segundo afirma Alcon et al. (2002), a detecção do antígeno NS1 pode ser um alvo
importante para o diagnóstico da dengue.
As proteínas NS2a, NS4a e NS4b são pouco caracterizadas. A NS3 possui
atividade de helicase e protease e a NS5 possui atividade semelhante à RNA
polimerase (CLYDE et al., 2006).
2.1.3 Transmissão e Ciclo viral
A transmissão da doença ocorre através da picada de fêmeas do A. aegypti
contaminadas (SINGHI et al., 2007). O mosquito é infectado com o Dengue virus após
se alimentar do sangue de um indivíduo doente durante a fase virêmica, que começa
um dia antes do surgimento da febre e vai até o sexto dia da doença (DIAS et al.,
2010).
Segundo Singhi et al. (2007); Dias et al. (2010) e Nunes (2011), após um
período de 8-10 dias de incubação, o vetor torna-se apto a transmitir o vírus. Uma vez
infectada, a fêmea do mosquito, ao picar um hospedeiro, inocula o vírus junto com a
saliva. Outra forma de disseminação da doença ocorre através da transmissão
transovariana, quando as fêmeas são capazes de transmitir o vírus para a sua prole.
O vírus entra nas células dendríticas por meio de endocitose mediada por
receptores. Em seguida, ocorre a acidificação do endossoma que estimula mudanças
conformacionais na proteína E. Assim, o endossoma promove a fusão das membranas
virais e celulares. Após essa fusão, o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma
(LOZACH et al., 2005; CLYDE et al., 2006).
Uma vez no citoplasma ocorre a replicação do genoma viral em associação
com as membranas do retículo endoplasmático rugoso (RER). Primeiramente, o
genoma do vírus atua como RNA mensageiro e utiliza fatores ainda desconhecidos da
célula hospedeira para traduzir a poliproteína viral (HEINZ; STIASNY, 2012).
Como resultado da tradução ocorre a produção de partículas virais e subvirais
imaturas, não infecciosas. Ambas são transportadas pelo complexo de golgi. Essas
serão clivadas por proteases do tipo furina, resultando na formação de partículas virais
maduras e infecciosas que serão liberadas por exocitose (CLYDE et al., 2006;
NUNES, 2011; HEINZ; STIASNY, 2012) (Figura 3).
23
Figura 3. Ciclo da replicação viral do Dengue virus.
Fonte: Adaptado de CLYDE et al., 2006.
A replicação viral estimula diretamente os monócitos e, indiretamente, os
linfócitos a produzir citocinas. Algumas delas serão responsáveis pelo aparecimento
de sintomas, como a febre resultante do efeito pró-inflamatório. Outras, porém,
estimulam a produção de anticorpos que se ligam aos antígenos formando, assim, os
imunocomplexos (FONSECA et al., 2002).
2.1.4 Manifestações clínicas da doença
Na sua forma clássica, a dengue é uma doença febril não fatal. Seu período de
incubação dura em média sete dias. As características clínicas incluem febre seguida
de cefaleia (dor de cabeça), mialgia (dor nos músculos), artralgia (dor nas
articulações), anorexia (perda de apetite), astenia (debilidade), prurido (coceira na
pele), náuseas e vômitos (CORDEIRO et al., 2008).
No homem, cada um dos quatro sorotipos (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e
DENV-4) manifesta-se como uma doença febril aguda sob duas formas principais: a
dengue clássica, também chamada Febre da Dengue (FD), podendo evoluir para um
quadro hemorrágico seguido ou não de choques, conhecidos como Febre
Hemorrágica da Dengue (FHD) ou Síndrome do Choque da Dengue (SCD) (DUARTE,
FRANÇA, 2006; SÁ, ZAGNE, 2008).
24
Segundo Singhi et al. (2007); Organização Mundial da Saúde (2009), durante a
fase febril (virêmica), que pode levar de 2 a 10 dias, as partículas virais circulam no
sangue periférico do homem, podendo ser transmitidas a mosquitos não infectados.
Após a fase virêmica, o paciente pode se recuperar ou avançar para a forma crítica da
doença, a Febre Hemorrágica da Dengue, e/ou à Síndrome do Choque da Dengue.
Na Febre Hemorrágica da Dengue, os sintomas são semelhantes a FD, porém
ocorre uma evolução do quadro clínico com o aparecimento de manifestações
hemorrágicas, como petéquias (manchas vermelhas na pele), epistaxe (hemorragias
nasais), gengivorragia (hemorragia nas gengivas), hematúria (sangue na urina) e
insuficiência circulatória (CATÃO, GUIMARÃES, 2011).
No caso da Síndrome do Choque da Dengue, os sintomas ocorrem entre o
terceiro e o sétimo dia da doença, geralmente precedidos por dores abdominais. Sua
duração é curta, podendo levar ao óbito em 12 a 24 horas ou, em alguns casos, à
recuperação rápida após assistência clínica apropriada (CASALI et al., 2004).
Estudos afirmam que não é possível associar nenhum dos quatro sorotipos a
um quadro clínico em particular. Porém, pode-se observar a evolução para a forma
mais grave da doença após uma infecção secundária por um sorotipo viral diferente da
infecção primária (SINGHI et al., 2007; MOTA, 2012).
2.1.5 Diagnóstico
O diagnóstico clínico da doença é difícil de ser realizado, uma vez que os
sintomas iniciais, que são febre, cefaleia e mialgia, são semelhantes a outras
patologias (SHU, HUANG, 2004; DUTRA et al., 2009). Portanto, o diagnóstico através
dos sintomas clínicos torna-se inviável para a confirmação da doença (OMS, 2009). A
confirmação definitiva dos pacientes com suspeita da dengue só pode ser realizada
por meio do exame laboratorial (ANVISA, 2005).
O diagnóstico laboratorial da dengue pode ser feito através da detecção do
vírus, de antígeno NS1 ou anticorpos IgM e IgG presentes no soro de pacientes. Os
principais métodos utilizados são o isolamento viral e detecção do genoma ou
antígeno viral por meio de técnicas de biologia molecular ou testes sorológicos para a
confirmação de anticorpos específicos ou antígenos virais (POERSCH, 2003; SHU,
HUANG, 2004).
25
2.1.5.1 Isolamento Viral
O isolamento viral é o método mais específico para identificar o sorotipo do
vírus, realizado na primeira semana da doença, durante a fase de viremia (GUZMAN,
KOURI, 2010; LUPI et al., 2004). A identificação do vírus circulante torna-se uma
ferramenta importante em estudos epidemiológicos e pesquisas (SHU, HUANG, 2004).
São utilizadas rotineiramente três metodologias: inoculação intracerebral de
camundongos neonatos, inoculação em cultura de células de mamíferos e inoculação
intratorácica em mosquitos adultos (PAULA, FONSECA, 2004).
A inoculação intracerebral de camundongos e cultura de células de mamíferos
apresentam algumas desvantagens como alto custo, baixa sensibilidade e demora na
obtenção de resultados (PHILIP, TYAGI, 2006). Em contrapartida, a inoculação em
mosquitos adultos é um método rápido, econômico e apresenta alta sensibilidade
(PAULA; FONSECA, 2004; G M O R , 2010).
2.1.5.2 Detecção do Genoma Viral
A detecção do genoma viral é feita através da transcrição reversa seguida de
reação em cadeia de polimerase (RT-PCR). É amplamente utilizada para a detecção
dos genes virais e identificação do sorotipo viral em amostras de soro, durante a fase
de viremia (XAVIER et al., 2014). Possui um alto grau de especificidade e
sensibilidade, porém necessita de equipamentos com alto custo, além de mão de obra
especializada (SHU, HUANG, 2004).
2.1.5.3 Detecção de Anticorpos
O diagnóstico sorológico é o mais usado na rotina laboratorial e essencial na
diferenciação das infecções primária e secundária (ARAUJO et al., 2002).
A relação antígeno-anticorpo pode ser demonstrada em ensaio
imunoenzimático Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), inibição da
hemaglutinação (IH), fixação do complemento (FC) e teste de neutralização (N)
(PAULA, FONSECA, 2004).
Dentre estes ensaios, o ELISA é o principal método de diagnóstico-padrão
recomendado pela OMS e adotado pelo Ministério da Saúde (MS), devido à sua alta
sensibilidade e praticidade (BRASIL, 2009). A técnica permite a detecção de
26
anticorpos IgM e IgG e antígeno NS1, assim como o tipo de infecção primária ou
secundária através da relação IgM/IgG (SHU; HUANG, 2004; SAMUEL; TYAGI, 2006).
A infecção primária ocorre em pacientes que nunca tiveram contato com o
Dengue virus ou outro Flavivírus. O anticorpo IgM é encontrado em maiores
concentração, em média a partir do quinto dia após o início da febre, permanecendo
detectável por dois a três meses após a infecção. Já o anticorpo IgG apresenta baixa
concentração na infecção primária e, após o décimo dia de infecção, apresenta títulos
elevados e permanece detectável durante toda a vida do indivíduo (LUPI et al., 2004;
SHU, HUANG, 2004).
Durante a infecção secundária, o anticorpo de memória IgG é encontrado
precocemente com títulos altos, já a produção de anticorpo IgM é baixa. A razão entre
os títulos IgM/IgG pode ser usada para diferenciar uma infecção primária ou
secundária (PAULA, FONSECA, 2004; G M , O R , 2010), de acordo com a
figura 4.
Figura 4. Níveis de anticorpos IgM e IgG durante a infecção primária e secundária ao Dengue
virus. Fonte: Pan Bio Diagnostic, 2014.
Apesar de ser um teste sensível, o ELISA não identifica a forma viral infectante,
uma vez que ocorrem reações cruzadas entre os diferentes sorotipos e outros
Flavivírus. Além disso, o método detecta os anticorpos em média a partir do quinto dia
após o aparecimento dos sintomas. Outro fator limitante está relacionado com a
diferenciação da infecção primária e secundária, já que uma única coleta em um
27
paciente é insuficiente para a confirmação da doença, sendo necessária uma segunda
coleta em um intervalo de sete dias após a primeira para a comparação dos níveis de
anticorpos e, assim, diagnosticar a doença. Com isso, a técnica torna-se inviável para
a proposta de diagnóstico precoce de anticorpos IgM/IgG (BALMASEDA et al., 2006;
G M , O R , 2010; DÍAZ-QUIJANO et al., 2006).
Os demais testes sorológicos de inibição da hemaglutinação (IH), fixação do
complemento (FC) e teste de neutralização (N) não são capazes de diferenciar
anticorpos IgM e IgG, sendo necessária a utilização de amostras pareadas para a
avaliação dos resultados (FERRAZ et al., 2013).
2.2 IMUNOGLOBULINAS
Os anticorpos, também chamados de imunoglobulinas (Ig), estão presentes no
soro sanguíneo de todos os animais, e também na gema do ovo no caso das aves.
São produzidos naturalmente pelos linfócitos B, em resposta aos antígenos estranhos
ao organismo, sendo capazes de neutralizá-los ou eliminá-los (MARANHÃO;
BRÍGIDO, 2001; ANVISA, 2005; ABBAS et al., 2008).
Devido à sua imensa diversidade, as imunoglobulinas dos mamíferos podem
ser agrupadas em cinco classes distintas, de acordo com suas características
imunológicas e físico-químicas: as imunoglobulinas do tipo A, D, E, G e M (IgA, IgD,
IgE, IgG e IgM) (ANVISA, 2005; NUNES, 2005). Além destas imunoglobulinas, ainda
existe a IgY, produzidas pelas aves (SOUSA, 2008).
Todas as imunoglobulinas possuem uma estrutura polipeptídica composta por
duas cadeias pesadas, com massa molecular entre 50-77.000 Daltons e duas cadeias
leves, cuja massa molecular pode variar em torno de 25.000 Daltons. As cadeias
pesadas estão unidas entre si por pontes de dissulfeto. Estas, por sua vez, estão
unidas a uma cadeia leve por interações não covalentes e pontes de dissulfeto
(DAVIE, 1986; NUNES, 2005). A estrutura básica da imunoglobulina é simétrica, ou
seja, cada metade contém uma cadeia leve e outra pesada, resultando em uma forma
de Y, conforme mostra a figura 5:
28
Figura 5. Estrutura básica de uma Imunoglobulina. Fonte: NUNES, 2005.
Nas cadeias pesadas e leves do Fab encontramos uma região variável (V)
representada pela parte amino-terminal, presente na cadeia pesada (VH, sigla do
inglês) e na cadeia leve (VL). A região variável é responsável pelo reconhecimento e
união do antígeno ao anticorpo devido a pontes de hidrogênio, interações
eletrostáticas e hidrofóbicas e forças de Van der Waals (GUIMARÃES, 2005; NUNES;
2005).
Em contrapartida, nos demais domínios, encontramos a região constante (FC),
presente na cadeia pesada (CH, sigla do inglês) e na cadeia leve (CL), responsáveis
pelas principais funções dos anticorpos tais como fagocitose e ativação de linfócitos,
além de definir a classe da imunoglobulina (DAVIE, 1986; ANVISA, 2005;
VASCONCELOS, 2010).
Os anticorpos vêm sendo utilizados em pesquisas, diagnósticos de doenças
infecciosas, com a finalidade de detectar a presença ou quantificar determinadas
partículas, devido à capacidade do organismo de produzir anticorpos contra antígenos
e ambos se fixarem com alto grau de afinidade e especificidade (MIAN, 1991; NARAT,
2003; GUIMARÃES et al., 2008).
Atualmente, a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais requer o uso
de laboratórios especializados e grande quantidade de animais como lagomorfos e
roedores. Ela envolve duas etapas que causam estresse aos animais: a imunização e
a coleta de sangue, a qual requer tempo e apresenta um alto custo, além de muitas
29
vezes o sacrifício dos mesmos para obtenção dos anticorpos (CHACANA et al., 2004;
KARLSSON et al., 2004).
Diante disso, umas das principais necessidades da saúde pública é a geração
de anticorpos específicos a antígenos de forma rápida, menos invasiva e com elevada
relação custo-benefício (STOCKWIN et al., 2003).
Logo, é necessário o desenvolvimento de métodos alternativos de produção de
anticorpos que possam ser utilizados no diagnóstico e terapia das doenças (SHIN et
al., 2003).
2.2.1 Uso de animais na pesquisa experimental
O uso disseminado de animais tem sido motivo de diversas discussões,
principalmente em função do grande número de espécies requeridas e do sofrimento
causado durante alguns tipos de experimento (MEYER, 2003).
O questionamento da utilização de animais na pesquisa experimental está
relacionado aos seus aspectos técnicos, éticos e jurídicos.
Do ponto de vista técnico, a adequação dos modelos animais às metodologias
utilizadas em pesquisa, assim como os benefícios resultado da utilização desses em
relação ao estudo de determinadas doenças humanas, têm sido questionado. Sob o
aspecto ético, a relação entre os homens e os animais é vista como uma questão de
moralidade. Sob o ponto de vista jurídico a regulamentação de leis que dizem respeito
à experimentação animal (PAIXÃO, 2001).
Diante desse cenário, surge uma nova tendência mundial, a reavaliação da
utilização de animais nos experimentos, com objetivo de desenvolver e validar novos
métodos, implementar testes alternativos em diversos países, a fim de legalizar e
harmonizar o uso dos mesmos (SCHECHTMAN, 2002).
No ano de 1959, o zoologista Willian Russell e o microbiologista Rex Burch,
publicaram dos Princípios das Técnicas Experimentais Humanas (The principles of
Humane Experimental Technique) (PAIVA et al., 2005), onde preconizam que
pesquisa com animais deveria seguir os 3Rs (Redução, Refinamento e Substituição).
De acordo com Paixão (2001); Stephens et al., (2001), o objetivo dos 3Rs são:
O 1º “R” ou “reduction” (redução): indica desenvolver novos protocolos com
menor número de animais por experimento; obter o maior número possível de
informações relevantes em um pequeno número de animais.
30
O 2º “R” ou “refinement” (refinamento): sugere minimizar ao máximo a
quantidade de desconforto ou sofrimento animal.
O 3º “R” ou “replacement” (substituição): preconiza desenvolver métodos
alternativos à experimentação animal, como ensaios in vitro, o que pode incluir
plantas, microrganismos, entre outros.
2.2.2 Imunoglobulina Y (IgY)
As aves possuem três classes de imunoglobulinas, IgA, IgM e IgY
(CARLANDER, 2002; CHACANA et al., 2004).
Sabe-se que as IgA e a IgM são homólogas às de mamíferos e estão
presentes na clara do ovo (TAMBOURGI, 2010), enquanto que a IgY é análoga à IgG
dos mamíferos e encontra-se na gema do ovo (KARLOSSON et al., 2004).
Em 1893, Klemperer realizou um experimento no qual demonstrou que a
imunização de uma galinha resulta na transferência de um anticorpo específico para a
gema do ovo (CARLANDER, 2002), por isso a denominação IgY (do inglês
yolk=gema) (KARLOSSON et al., 2004).
Durante décadas os resultados de Klemperer foram abandonados, porém,
quando o bem-estar do animal se tornou uma preocupação para a comunidade
científica, os conhecimentos de anticorpo extraído da gema do ovo ganharam
destaque (SCHADE et al., 2005; GUIMARÃES et al., 2008).
No ano de 1959, diversos trabalhos começaram a ser realizados e publicados
relacionando o uso da IgY como anticorpo secundário para o diagnóstico (SOARES,
2013). Em 1990, a tecnologia IgY foi aprovada pela comunidade europeia como
método alternativo para a produção de anticorpos, a fim de minimizar o sofrimento e a
morte de animais em laboratórios (CHACANA et al., 2004; GUIMARÃES et al., 2008).
A produção de anticorpos IgY contra uma diversidade de antígenos é um
método eficiente e de baixo custo e estudos indicam a utilização para fins de
diagnóstico, uso médico e veterinário (ARAUJO, 2009).
31
2.2.2 Estrutura da Imunoglobulina Y
A imunoglobulina Y é continuamente sintetizada e secretada para o sangue das
galinhas. Ao passar para o ovário, é transportada através do epitélio do folículo
ovariano para a gema em quantidades iguais às detectadas no soro da galinha,
conferindo proteção aos descendentes (DAVISON et al., 2008).
Estruturalmente é composta por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas
semelhantes à imunoglobulina G de mamíferos. A imunoglobulina Y possui massa
molecular entre 180-200 kDa. Por sua vez, a cadeia leve possui massa molecular de
18 kDa, enquanto que a cadeia pesada está entre 65 -105 kDa (SUN et al., 2001). Já a
imunoglobulina G possui massa molecular, em média, de 160 kDa. Outra diferença
está relacionada à cadeia leve da imunoglobulina Y, que possui massa molecular
menor que a imunoglobulina G. Entretanto, a cadeia pesada da imunoglobulina Y
possui massa molecular maior que a da IgG (ARAUJO, 2007).
A cadeia pesada da imunoglobulina G contém um domínio variável e três
domínios constantes, já a imunoglobulina Y possui quatro regiões constantes e uma
região variável. A imunoglobulina G apresenta, entre a cadeia variável e a constante,
uma ligação dissulfeto ausente na imunoglobulina Y (WILBER; GUTIERREZ, 2009),
como mostra a figura 6.
Figura 6. Estrutura da imunoglobulina Y e imunoglobulina G. Fonte: llusimmunotech.com/about-
igy/structure-function-and-physicochemical-properties-of-igy, 2014.
32
A produção da imunoglobulina Y caracteriza-se por ser um método econômico
e eficiente para obtenção de anticorpos policlonais, uma vez que apresenta fácil
manipulação. A nutrição de galinhas é feita de maneira simples, apresenta baixo custo
e não requer o sacrifício do animal (GUIMARÃES et al., 2008). Outras vantagens de
sua utilização é não apresentar reações cruzadas com os fatores reumatoides do soro
humano, e necessitar de pequenas quantidades de antígenos para a estimulação da
resposta, reduzindo ainda mais o custo da produção (CARROL et al., 1992; LARSSON
et al., 1998).
A obtenção de anticorpos em galinhas está mais adequada aos padrões de
bem-estar animal, pois a coleta de ovos é um método simples e não invasivo,
diferentemente do que ocorre durante a coleta do soro em mamíferos, em que são
necessárias sucessivas sangrias para obtenção de anticorpos, e muitas vezes o
sacrifício dos mesmos (TAVARES et al., 2013).
33
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Produção e purificação de anticorpos IgY reativos para a proteína NS1
recombinante do Dengue vIrus e sua conjugação com peroxidase de rabanete.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Produzir e purificar anticorpos IgY reativos para a proteína NS1.
Otimizar o processo de purificação de anticorpos IgY.
Conjugar anticorpos IgY reativos para a proteína NS1 do Dengue virus, com a
peroxidase de rabanete.
34
4 JUSTIFICATIVA
No Brasil, as condições socioambientais favorecem a disseminação do Dengue
virus e, consequentemente, a um aumento no número de casos da doença, atingindo
milhares de brasileiros anualmente e elevando significativamente os gastos no
combate a ela (MONDINI; CHIARAVALLOTI, 2007).
Uma vez que a doença apresenta um quadro clínico variável, podendo ser
confundida com outras doenças, a identificação precoce dos casos desta doença é de
vital importância para a tomada de decisão e de medidas de controle com a finalidade
de minimizar a expansão da dengue no momento oportuno.
A OMS aponta como estratégia essencial no controle de epidemias o
desenvolvimento de diagnósticos rápidos, práticos, específicos e de baixo custo para
detecção dos casos de Dengue (SHU; HUANG, 2004).
Logo, torna-se essencial a disponibilidade de produtos para realização de
testes clínicos laboratoriais que apresentem desempenho satisfatório para o
rastreamento e/ou confirmação da presença do vírus em casos de epidemia.
O desenvolvimento de reativos com tecnologia nacional de forma sustentável
permitirá a diminuição dos custos e viabilizará a oferta destes ensaios a preços mais
acessíveis que os observados no nosso país. A utilização desta tecnologia gerará a
diminuição de gastos com tratamentos e controle de epidemias, e o acesso da
população a diagnósticos mais rápidos e precisos que facilitam a identificação e o
tratamento de indivíduos infectados pelo Dengue virus.
35
5 MATERAIS E MÉTODOS
5.1 PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE NS1
Bactérias da espécie Escherichia coli (E. coli) cepa XL1-Blue expressando a
proteína NS1 do sorotipo viral de DENV 2 foram cedidas ao laboratório pelo Instituto
Nacional de Ciência e Tecnologia – INCT em Dengue. As bactérias foram cultivadas
em meio Luria Broth – LB (Affymetrix®) contendo antibiótico canamicina (25 µg/mL e
sua expressão foi induzida com a adição de IPTG (isopropil β-D-1-
tiogalactopiranosideo) a 1 µg/mL. A purificação da proteína NS1 foi realizada em duas
etapas, sendo uma em condição desnaturante e a outra por cromatografia de afinidade
em coluna de níquel.
5.2 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
5.2.1 Aspectos Éticos
O protocolo nº 25/2012, para uso de animais para experimentação neste
trabalho, está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal,
dispostos na Lei Federal nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, e foi aprovado pela
Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA – UFSJ no dia 31 de outubro de 2012.
5.2.2 Imunização de Galinhas
Em um total de doze galinhas da espécie Gallus domesticus, onze foram
imunizadas, e uma foi utilizada como controle negativo. As mesmas foram alocadas
em um galinheiro aonde receberam água e comida diariamente.
A imunização das galinhas foi realizada injetando-se 200μg de S1
recombinante, produzido no Laboratório de Bioquímica e Imunologia Celular e
Molecular (LABICEM), membro do INCT em Dengue, situado no Campus Alto
Paraopeba (CAP) da UFSJ, diluído na proporção de 1:1 com adjuvante completo
36
Freund’s (Sigma-Aldrich®) que aplicou-se no músculo peitoral das aves via
intramuscular.
Aplicaram-se 13 reforços com intervalos de 21 dias, utilizando 100 μg de
proteína NS1 recombinante diluído na proporção de 1:1 com adjuvante incompleto
Freund’s (Sigma-Aldrich®), totalizando quatorze imunizações.
5.2.3 Purificação de Anticorpos IgY
Neste trabalho, desenvolvemos um novo procedimento para purificação dos
anticorpos IgY com o objetivo de facilitar a purificação destes anticorpos a partir de
quantidades maiores de ovos. Para isso, preparamos três soluções com
concentrações diferentes de PEG, utilizando tampão PBS para solubilização. As
soluções preparadas foram:
Solução A: PBS 1X + PEG 6000 a 5,25%;
Solução B: PBS 1X + PEG 6000 a 42,5%;
Solução C: PBS 1X + PEG 6000 a 24%.
As proporções finais de PEG 6000 e PBS 1X utilizadas no método de Pauly et
al. (2011) foram mantidas no método desenvolvido no LABICEM.
Inicialmente os ovos foram coletados diariamente desde a primeira postura.
Foram utilizados treze ovos de galinhas imunizadas, dos quais foi separada a gema da
clara com auxílio de papel filtro; transferiu-se as gemas dos ovos para um béquer e as
amostras foram homogeneizadas cuidadosamente.
Posteriormente, adicionou-se em cada tubo Falcon 10 mL de gema. Em cinco
amostras realizou-se o método de purificação descrito por Pauly et al. (2011) e as
demais pelo método de purificação desenvolvido no LABICEM. Em ambos os métodos
de purificação, realizou-se a extração pelo método de precipitação com polietileno-
glicol 6000 (PEG 6000, Sigma®) e o tempo foi cronometrado.
37
5.2.3.1 Método descrito por Pauly et al. (2011)
Pesaram-se 3,5% (m/v) de PEG 6000 do volume de 10 mL de gema. Em
seguida adicionou-se no tubo Falcon o tampão fosfato salino (PBS) 1 X na proporção
2:1 e o PEG 6000 anteriormente pesado. Agitou-se a mistura em vórtex e, depois, ela
foi mantida sob agitação mecânica durante 10 minutos a 37 ºC. Centrifugou-se a
mistura a 4 ºC por 30 minutos a 3950 xg.
Em seguida, filtrou-se o sobrenadante obtido com auxílio de um funil e algodão
em um novo tubo Falcon. Pesou-se 8,5% de (m/v) PEG 6000 de acordo com o volume
obtido. Logo em seguida, adicionou-se o PEG 6000 ao sobrenadante e agitou a
mistura em vórtex, e novamente submeteu-se à agitação mecânica durante 10 minutos
a 37 ºC. Adiante, centrifugou-se a 4 ºC por 30 minutos a 3950 xg.
Posteriormente descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o precipitado
obtido em 1 mL de PBS 1X. Em seguida, adicionou-se ao precipitado PBS 1X para um
volume final de 10 mL. Pesou-se 12% (m/v) de PEG 6000 e adicionou-se ao
precipitado que foi dissolvido anteriormente e repetiram-se as etapas de agitação e
centrifugação.
Novamente descartou-se o sobrenadante e dissolveu-se o precipitado
cuidadosamente em 3 mL de PBS 1X.
5.2.3.2 Método desenvolvido no LABICEM
Adicionou-se uma solução A PBS 1X + PEG 6000 a 5,25% (m/v) na proporção
2:1 para um volume de 10 mL de gema. Deixou-se a mistura em agitação mecânica
durante 10 minutos a 37 ºC. Logo em seguida, centrifugou-se a mistura a 4 ºC por 30
minutos a 3950 xg.
Filtrou-se o sobrenadante obtido com auxílio de um funil e algodão para um
novo tubo Falcon. Nessa etapa, adicionou-se à solução B PBS 1X + PEG 6000 a
42,5% (m/v) na proporção 1:4. Repetiram-se as etapas de agitação mecânica e
centrifugação.
Posteriormente descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o precipitado
cuidadosamente com 5 mL de PBS 1X e adicionou-se à solução C PBS 1X + PEG
6000 a 24% (m/v) na proporção 1:1. As etapas de agitação mecânica e centrifugação
foram, então, repetidas.
38
Novamente descartou-se o sobrenadante e dissolveu-se o precipitado
cuidadosamente em 3 mL de PBS 1X.
5.2.4 Diálise
Dialisou-se a solução utilizando membranas de diálise Spectra/Por® com
tamanho de corte de 12-14,000 kDa, para que todos os resíduos de PEG fossem
eliminados. Transferiu-se cada amostra obtida na purificação para as membranas de
diálise com auxílio de uma pipeta de Pasteur. Logo depois, dialisou-se as amostras
obtidas na purificação contra solução de cloreto de sódio (NaCl 0,01 M), sob agitação
magnética e refrigeração durante 12 horas. Posteriormente, substituiu-se a solução
salina por uma solução PBS 1X pH 7,4, a qual foi dialisada durante três horas. Logo
depois retirou-se as amostras da diálise e as mesmas foram armazenadas em tubo
Falcon para um volume final de 10 mL em solução de PBS 1X pH 7,4 e armazenou-se
em freezer a - 20 °C.
5.3 QUANTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS IGY PURIFICADOS
5.3.1 Quantificação de proteínas totais purificadas
As amostras obtidas pelo método de purificação descrito por Pauly et al. (2011)
e as amostras purificadas pelo método desenvolvido no LABICEM foram quantificadas
utilizando o Kit de Ácido Bicinconínico® (BCA – Sigma).
Realizou-se o teste em uma placa de poliestireno de 96 poços (Becton,
Dickinson and Company®). Preparou-se a curva padrão com concentração inicial de
25 µg/µl de BSA (soro albumina) com diluição seriada com água Mili Q. Aplicou-se as
amostras em triplicata na placa.
Em seguida, adicionou-se 200 µl do reagente de trabalho em cada poço e
incubou-se por 30 minutos a 37ºC. Logo depois, analisaram-se as amostras a 562 nm
em leitora de microplaca Sinergy/HT(Biotek®) e determinou-se as concentrações de
proteína a partir dos valores obtidos através da curva-padrão.
5.3.2 Eficiência da purificação dos anticorpos IgY
Para avaliar a eficiência do método de purificação, as amostras de proteínas
purificadas de IgY foram analisadas através do ensaio de eletroforese em gel de
poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a 10%. Adicionou-se 50 µl
39
das amostras purificadas com 50 µl em tampão de amostras para eletroforese
desnaturante (dodecil sulfato de sódio (SDS) 4% glicerol 20%, β-mercaptoetanol 12%,
Tris 50 mM, pH 6,8; azul de bromofenol 0,05%). Logo em seguida, submeteu-se as
amostras à fervura de 95°C por cinco minutos. Aplicou-se 5 µl das amostras e 5 µl
padrão de massa molecular (10 kDa – 170 kDa; ThermoScientific Page Ruler) nas
canaletas do gel de poliacrilamida e a corrida foi realizada a 90 Volts (V).
Posteriormente o gel foi corado em solução de Comassie Blue 1%.
5.3.3 Cromatografia de Exclusão Molecular dos anticorpos IgY purificados
Para a confirmação do grau de pureza dos anticorpos IgY, as amostras
purificadas de acordo com o método descrito por Pauly et al. (2011) e pelo método
desenvolvido no LABICEM foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular
em aparelho NGC_Plus_Full (BIORAD-USA), em coluna de exclusão molecular ENrich
SEC 650, 10/300 mm (BIORAD-USA).
Inicialmente equilibrou-se a coluna com três vezes o volume da mesma com
tampão PBS 1X, pH 7,0. Aplicou-se 200µl de IgYs purificadas pelos dois métodos, na
concentração de 1 mg/mL, e iniciou-se a eluição das proteínas aplicadas com PBS,
com fluxo contínuo de 1 mL/minuto durante 30 minutos. As cromatografias foram
acompanhadas pela medição da absorbância das amostras durante as corridas a 280
nm uma vez que as proteínas são detectáveis nesse comprimento de onda e as
frações correspondentes aos picos foram coletadas em tubos de 2 mL.
5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE IGY ANTI-NS1 A capacidade de reconhecimento do anticorpo purificado pelo método
desenvolvido no LABICEM foi avaliada pelo método de Dot Blot e ELISA.
5.4.1 Detecção por Dot Blot
Para o teste de Dot Blot, a membrana de nitrocelulose (Westran® General
Electric – GE) foi imersa em metanol (SIGMA-Aldrich®) e com auxílio de uma
micropipeta foram aplicados 2 μl da proteína S1 recombinante na concentração de 1
mg/mL em vários pontos de membrana. A membrana foi seca por uma hora em estufa
a 37°C e cortada e acondicionada em placas em 24 poços.
40
Os sítios inespecíficos foram bloqueados pela imersão da membrana em uma
solução de tampão fosfato salino PBS contendo 5% de albumina (I.D. Bio®) e
polissorbato (Tween-20 SIGMA-Aldrich®) 0,05% (PBS-T-BSA). Logo em seguida, a
membrana foi incubada na solução por uma hora a 37ºC mantendo-se uma leve
agitação mecânica. Em seguida, a membrana foi lavada por três vezes durante cinco
minutos com PBS-T 0,05%.
Posteriormente, o anticorpo primário (IgY anti-NS1) na concentração de
1mg/mL foi diluído para 1:250 em solução de PBS-T-BSA e aplicado sobre as
membranas, que foram em seguida incubadas com a solução por uma hora a 37ºC,
mantendo-se leve agitação. Após o período de incubação, a membrana foi novamente
lavada por três vezes durante cinco minutos com PBS-T 0,05%.
Logo depois, o anticorpo secundário (Anti-IgY conjugado com peroxidase de
rabanete – HRP, SIGMA-Aldrich®) foi diluído na proporção de 1:5000 em solução de
PBS-T-BSA, aplicado sobre as membranas e incubado novamente por uma hora a
37ºC, mantendo-se leve agitação. Então, a membrana foi lavada por mais três vezes
durante cinco minutos com PBS-T 0,05%.
O reagente para revelação do teste foi preparado com 3,3’ - Diaminobenzidina
(DAB - SIGMA-Aldrich®) com adição de 40 μl peróxido de hidrogênio (H2O2) a 10% ao
volume final de 15 mL de solução tampão Tris-NaCl (50 mM de Tris-Cl, 150 mM NaCl,
pH 7,6) e, em seguida, foi aplicado sobre as membranas até o aparecimento de cor
nas áreas onde foram aplicadas amostras de NS1. A reação de revelação foi parada
com a adição de água Mili-Q® (Millipore Corporation).
5.4.2 Detecção pelo método de ELISA
Realizou-se o teste em uma placa de poliestireno de 96 poços (Becton,
Dickinson and Company®), na qual aplicou-se 100 μl do antígeno S1 diluído em
tampão carbonato/bicarbonato 0,05 M pH 9,6 na concentração final de 2 µg por poço
e incubou-se durante duas horas a 37°C.
Em seguida, lavou-se a placa com PBS-T 0,05% por cinco vezes na lavadora
de microplaca ELX 50 (Biotek), aplicou-se 300 μl de solução de bloqueio contendo
PBS-T 0,05% BSA 5% em cada poço e incubou-se durante 12 horas na temperatura
de 4°C.
41
Novamente, lavou-se a placa durante cinco vezes com PBS-T 0,05% na
lavadora de microplaca ELX 50. Adicionou-se o anticorpo primário (IgY) na diluição
1:100; 1:200; 1:400 e 1:800 em PBS-T 0,05% e incubou-se por duas horas na estufa à
temperatura de 37 °C.
Posteriormente, lavou-se a placa com PBS-T 0,05% na lavadora de microplaca
durante cinco vezes. Nesse momento, aplicou-se o anticorpo secundário conjugado
com HRP (anti-IgY, Sigma®) na diluição 1:5000 em PBS-T 0,05% e incubou-se na
estufa à temperatura de 37 °C durante duas horas.
Decorrido o tempo de incubação, lavou-se a placa como descrito anteriormente
e adicionaram-se 100 μl de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) em cada poço.
Incubou-se a placa por 30 minutos em temperatura ambiente. A reação de revelação
foi interrompida adicionando-se 100 μl de ácido sulfúrico (H2SO4 1M).
Logo depois, analisou-se a leitura das absorbâncias em 480 nm na leitora de
microplaca Sinergy/HT(Biotek®).
5.5 CONJUGAÇÃO COM PEROXIDASE DE RABANETE (HRP, sigla do inglês)
5.5.1 Conjugação das IgYs purificadas com Peroxidase de Rabanete
Após a confirmação da reatividade dos anticorpos purificados, os mesmos
foram conjugados com peroxidase de rabanete, seguindo o protocolo do fabricante do
kit de marcação ThermoScientific, cat. Nr. 31487.
Para a conjugação foram preparadas as soluções de Cianoborohidrito de
sódio (NaBH3CN) 5M, Etanolamina (C2H7NO) 3M em tampão Carbonato-
Bicarbonato 0,2M, pH 9,0 e tampão Carbonato-Bicarbonato 0,2M, pH 9,4. Para a
marcação das amostras de IgY, as mesmas foram dialisadas contra tampão
Carbonato-Bicarbonato 0,2M, pH 9,4.
Logo em seguida, as concentrações das proteínas foram ajustadas para 2
mg/mL. Posteriormente, 500μl das amostras de IgY foram adicionados ao frasco
contendo peroxidase ativada e a reação foi incubada durante uma hora a 37 °C.
Decorrido o tempo de incubação em uma capela de exaustão, foram adicionados ao
recipiente 10 μl de Cianoborohidrito de sódio (NaBH3CN) 5M e incubou-se durante 15
minutos a 37°C. Em seguida, adicionou-se 20 μl de Etanolamina (C2H7NO) 3M em
tampão Carbonato-Bicarbonato 0,2M, pH 9,0 e incubou-se por mais 15 minutos a
42
37°C. Após este tempo, as amostras foram divididas em alíquotas de 50 μl e
armazenadas em freezer a -20°C.
5.5.2 Detecção por Dot Blot
Para testar a eficiência da marcação, foi realizado um Dot Blot direto.
Incialmente, a membrana de nitrocelulose (Westran® General Electric – GE) foi imersa
em metanol (SIGMA-Aldrich®) e com auxílio de uma pipeta foram aplicados 2 μl da
proteína NS1 recombinante na concentração de 1 mg/mL, em vários pontos da
membrana. A membrana foi seca por uma hora em estufa a 37 °C e cortada e
acondicionada em placas em 24 poços.
Os sítios inespecíficos foram bloqueados pela imersão da membrana em uma
solução de tampão fosfato salino PBS contendo 5% de albumina (I.D. Bio®) e
polissorbato (Tween-20 SIGMA-Aldrich®) 0,05% (PBS-T-BSA). Logo em seguida, a
membrana foi incubada na solução por uma hora a 37ºC, mantendo-se uma leve
agitação mecânica. Em seguida, a membrana foi lavada por três vezes durante cinco
minutos com PBS-T 0,05%.
Logo depois, incubaram-se as membranas com anticorpo IgY não marcado
(controle negativo) e IgY conjugado com peroxidase (controle positivo) diluídos 1:100
em de PBS-T-BSA, durante uma hora a 37ºC, mantendo-se leve agitação.
Posteriormente a membrana foi lavada por três vezes durante cinco minutos com PBS-
T 0,05%.
O reagente para revelação do teste foi preparado com 3,3’-Diaminobenzidina
(DAB - SIGMA-Aldrich®) com adição de 40 μl peróxido de hidrogênio (H2O2) a 10% ao
volume final de 15 mL de solução tampão Tris-NaCl (50 mM de Tris-Cl, 150 mM NaCl,
pH 7,6) e, em seguida, foi aplicado sobre as membranas até o aparecimento de cor
nas áreas onde foram aplicadas amostras de NS1. A reação de revelação foi parada
com a adição de água Mili-Q® (Millipore Corporation).
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Comparou-se as concentrações das purificações e os títulos de anticorpos IgY
reativos para a proteína recombinante NS1 utilizando o software Statistica 8.0, aonde
foi realizado o teste t de Student (teste t).
43
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, comparou-se as concentrações das proteínas totais obtidas a
partir de ovos de galinhas purificadas a partir do método desenvolvido no LABICEM e
o método de purificação descrita por Pauly et al. (2011). A pureza obtida das proteínas
pelos diferentes métodos de purificação através da eletroforese e cromatografia por
exclusão molecular e posteriormente a reatividade do anticorpo obtido através de Dot
Blot e ELISA.
6.1 IMUNIZAÇÕES DE GALINHAS
As aves utilizadas no experimento permaneceram saudáveis durante todo o
processo de imunização, não apresentando nenhuma anomalia em seu
desenvolvimento.
6.2 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS PURIFICADAS
A concentração média das proteínas totais obtidas pelo método de purificação
descrita por Pauly et al. (2011) e desenvolvido no LABICEM, através do método de
BCA está representada na figura 7.
Figura 7. Quantificação de proteínas totais através do método de BCA.
44
1
No método desenvolvido no LABICEM a concentração máxima obtida foi de
4,47 mg/mL e o valor mínimo 3,32 mg/mL uma média de 3,91 mg/mL de proteínas
totais das amostras purificadas.
Em contrapartida a concentração máxima obtida no método de Pauly et al.
(2011), foi de 4,88 mg/mL e o valor mínimo de 4,10 mg/mL uma média de 4,58 mg/mL
de proteínas totais.
Comparando-se os valores das concentrações dos diferentes métodos de
purificação, o método de Pauly et al. (2011), apresentou um rendimento maior de
proteínas totais.
6.3 EFICIÊNCIA DA PURIFICAÇÃO DOS ANTICORPOS IGY
A eficiência da purificação dos anticorpos IgY foi confirmada por meio de
eletroforese SDS-PAGE a 10%. As canaletas 1 e 2 correspondem as amostras obtidas
pelo método de purificação descrita por Pauly et al. (2011), as canaletas 3 e 4
correspondem amostras obtidas pelo método de purificação desenvolvido pelo
LABICEM, a canaleta A corresponde ao padrão de peso molecular (10 kDa - 170 kDa).
Foi possível verificar a presença de duas bandas, a banda correspondente a cadeia
pesada (60 - 55 kDa) indicado pela seta 1 e a banda representando a cadeia leve (25
kDa), indicado pela seta 2. É possível observar nas canaletas 1 e 2, bandas
inespecíficas, resultado do processo de purificação.
Figura 8. A. Padrão de peso molecular (10 kDa - 170 kDa). B. Eletroforese SDS- PAGE 10% das amostras de IgY purificadas pelo método descrita por Pauly et al. (2011), e
o método desenvolvido pelo LABICEM.
2
A B
45
6.4 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR DOS ANTICORPOS IGY PURIFICADOS
As amostras purificadas obtidas pelos dois métodos de purificação foram
submetidas à cromatografia de exclusão molecular e os resultados estão mostrados
na figura 9 e 10:
Figura 9. Amostra 01 purificada pelo método desenvolvido no LABICEM
Tabela 1. Parâmetros da corrida
Figura 10. Amostra 01 purificada pelo método de Pauly et al. (2011)
Tabela 2. Parâmetros da corrida
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (mL) Altura (mAU) Área (mL mAU) Área Relativa (%)
9.10 9.10 6,02 6.81 7.56
12.33 12.33 95.95 82.31 91.34
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (mL) Altura (mAU) Área (mLl mAU) Área Relativa (%)
9.18 9.18 3.73 5.02 6.51
12.33 12.33 71.21 59.27 76.86
13.83 13.83 12.27 11.89 15.41
46
A figura 9 apresenta uma área de 82,31 mL com uma área relativa de 91,34%
correspondendo ao pico da IgY, em contrapartida a figura 10 apresenta uma área de
59,27 mL com uma área de 76,86% correspondendo ao pico da IgY e um segundo
pico com uma área de 15,41%.
A escolha de um método de purificação eficiente é influenciada pela escala de
purificação (laboratorial ou industrial), relação custo-eficácia, a tecnologia
(equipamentos de laboratório), e o impacto sobre o meio ambiente (gestão de
resíduos) (PAULY et al., 2011).
Segundo Schade et al. (2005), há três tipos de métodos de isolamento e
purificação de IgY descritos: precipitação, cromatografia e filtração. A pureza de uma
purificação de IgY pode ser aumentada através de uma associação desses
procedimentos.
A extração de IgY da gema a partir da gema a partir de PEG-6000, tem como
vantagem a manipulação em temperatura ambiente sem risco de desnaturação do
anticorpo, apesar de ser considerada uma técnica laboriosa (AKITA; NAKAI, 1993).
A cromatografia de exclusão molecular baseia-se na separação de proteínas
de acordo com sua massa molecular o que permite a remoção de contaminantes de
alta ou baixa massa moleular (PESSOA; KILIKIAN, 2005).
As concentrações médias de proteínas totais obtidas através do método
desenvolvido no LABICEM foi de 3,91 mg/mL. A média obtida nesse experimento foi
similar aos valores encontrados por Pauly et al. (2011) em que obteve 2,98 mg/mL de
proteínas totais, usando PEG 6000.
O rendimento médio das amostras obtidas pelo método de purificação
desenvolvido no LABICEM pode ainda ser comparado com q técnica de precipitação
onde Garcia et al. (2005) obteve uma média de 4,6 mg/mL quando utilizou sais de
sódio.
Baseado no resultado de caracterização de eletroforese em gel de
poliacrilamida 10% o método desenvolvido no LABICEM identificou cadeias pesadas e
cadeias leves com massa molecular similar aos descritos na literatura (GARCIA et al.
2005; PAULY et al. (2011); MENDOZA et al. (2012); SAMPAIO et al. (2014).
De acordo com os dados obtidos, o método de purificação desenvolvido no
LABICEM, não alterou a capacidade de rendimento, visto que os resultados de
quantificação de proteínas e reatividade dos anticorpos foram muito semelhantes aos
encontrados por Garcia et al. (2005); Pauly et al. (2011); Mendoza et al. (2012);
Sampaio et al. (2014).
47
A vantagem do novo método é a utilização de solução PEG - 6000 para cada
etapa de purificação, ao invés do mesmo ser pesado em cada etapa, tornando a
purificação de anticorpos a partir da gema do ovo menos trabalhoso. Outra vantagem
deste método é o tempo de execução, sendo 27% menor quando comparado com o
método de Pauly et al. (2011).
Ao compararmos os resultados obtidos nos diversos cromatogramas verificou-
se que o método desenvolvido no LABICEM apresenta dois picos sendo o maior pico
correspondente ao anticorpo eluído e apresenta uma área relativa maior do que no
método de Pauly et al. (2011) que apresenta dois picos consecutivos sendo o primeiro
pico correspondente ao anticorpo eluído e um segundo pico que corresponde,
provavelmente, a cadeias leves e pesadas de IgY dissociadas durante o processo de
purificação.
Com isso a metodologia proposta torna-se viável na rotina laboratorial uma vez
que apresenta eficiência, facilidade de manejo e baixo custo.
6.5. AVALIAÇÂO DA ATIVIDADE DOS ANTICORPOS PURIFICADOS
6.5.1 Capacidade de detecção por Dot Blot
A técnica de Dot Blot permite a detecção, análise e identificação de proteínas.
As proteínas reconhecidas são vistas em pontos circulares sobre a membrana após a
aplicação do substrato de revelação e o aparecimento da cor.
O princípio do Dot Blot é similar ao método de ELISA, porém no Dot Blot utiliza-
se a membrana de nitrocelulose ao invés de placas de polietileno.
Os anticorpos purificados (IgY anti-NS1) pelo método desenvolvido no
LABICEM foram utilizados como anticorpos primários e foram capazes de detectar o
antígeno (proteína recombinante NS1) conforme mostra a figura 11.
Figura 11. Teste de Dot Blot em amostras de IgY (anti-NS1) purificadas. Amostra
1, 2 e 3 controle positivo e o controle negativo.
Amostra 02
Amostra 03
Controle Negativo
Amostra 01
48
O controle negativo utilizado neste teste foi obtido a partir de um ovo de uma
galinha não imunizada. Como podemos verificar o controle negativo não reconheceu a
proteína, demostrando que não reage inespecificamente com o antígeno.
6.5.2 Detecção pelo método de ELISA
O método de ELISA do tipo direto permite a detecção de anticorpos
específicos. Portanto as amostras purificadas (IgY anti-NS1) foram avaliadas para a
confirmação da reatividade das mesmas com o antígeno NS1, conforme mostra a
figura 12.
Figura 12. Ensaio de ELISA com diferentes diluições: 1:100; 1:200; 1:400 e 1:800.
Podemos verificar que as médias de absorbância obtida pelo método do
LABICEM em todas as diluições são superiores ao obtidas pelo método de Pauly et al.
(2011).
Observamos ainda, que a média obtida foram significativamente maiores para
as IgY purificadas a partir de ovos de galinhas imunizadas, quando comparadas com a
média obtida a partir de ovos de galinhas não imunizadas (controle negativo).
De acordo com o teste t, considerando p < 0,05%, os anticorpos obtidos pelo
método LABICEM apresentam diferença estatisticamente significativas quando
comparado ao método de Pauly et al. (2011) nas diluições 1:400 e 1:800.
49
No teste de ELISA verificou-se que o anticorpo purificado foi capaz de
reconhecer a proteína NS1 recombinante adsorvida na placa.
Descrições de resultados semelhantes por Tavares et al. (2013), onde o
anticorpo IgY foi capaz de reconhecer o antígeno de Leptospira, assim como
Contreras et al. (2005), que descreve a viabilidade do modelo aviário para produzir
anticorpos altamente específicos para o Trypanosoma cruzi e Ferreira Junior et al.
(2012), onde o anticorpo IgY foi capaz de reconhecer o Toxoplasma gondii.
Diante disso as aves, representam uma boa opção para produção de
anticorpos IgY - anti NS1, uma vez que os resultados foram significativos em relação à
interação dos anticorpos produzidos com antígenos utilizados na imunização.
Logo, os anticorpos produzidos pelo estímulo do antígeno NS1, demonstram
que a tecnologia de produção de IgY é uma excelente alternativa para a produção de
anticorpos.
6.6 CONJUGAÇÃO DAS IGYS PURIFICADAS COM PEROXIDASE DE RABANETE
Após a confirmação da pureza e da reatividade dos anticorpos purificados (IgY
anti-NS1), os mesmos foram conjugadas com a enzima peroxidase de rabanete e a
eficiência da conjugação foi avaliada através de Dot Blot direto. Os resultados são
apresentados na figura 13.
Figura 13. Dot Blot da IgY anti-NS1 conjugada com HRP
CN: controle negativo CP: controle positivo.
A conjugação de anticorpos para utilização em testes de ELISA pode ser feita
com uma série de sistemas de detecção, dependendo das necessidades do ensaio a
50
ser desenvolvido. Os anticorpos podem ser conjugados com enzimas tais como
Peroxidase de Rabanete, Fosfatase Alcalina ou Biotina-Avidina.
Como podemos observar a presença de forte marcação na amostra conjugada
com peroxidase de rabanete (CP) e a inexistência de marcação no controle negativo
(CN). Os resultados demostram que fomos capazes de purificar e marcar IgY anti-
NS1 com HRP.
51
7 CONCLUSÃO
A imunização das aves com o a proteína NS1 recombinante foi eficaz,
resultando na produção de anticorpos;
O método de purificação desenvolvido no LABICEM utilizando PEG – 6000,
para obtenção do anticorpo IgY mostra-se uma alternativa promissora visto que
é menos trabalhosa e com um tempo de execução menor quando comparado
ao método de Pauly et al. (2011), sendo uma alternativa viável na rotina
laboratorial. Podemos observar ainda que a nova metodologia empregada na
purificação de IgY não alterou sua eficiência, sendo confirmada pela
cromatografia de exclusão molecular e eletroforese.
O anticorpo purificado através do método desenvolvido no LABICEM foi capaz
de reconhecer a proteína NS1 nos testes de Dot Blot e ELISA.
O resultado obtido com a conjugação com peroxidase de rabanete, para
utilização em ensaios de ELISA.
Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que a obtenção de
anticorpos IgY – específicos a partir da gema do ovo é um método mais adequado aos
padrões de bem-estar animal uma vez que reduz o número de animais utilizados, já
que essas produzem maior quantidade de anticorpos quando comparados aos animais
utilizados em laboratório (camundongos e coelhos); as sucessivas sangrias são
substituídas pela extração do anticorpo a partir da gema do ovo, minimizando assim o
sofrimento animal. A produção de anticorpos foi eficaz e o método alternativo de
purificação desenvolvido neste trabalho, ao eliminar as sucessivas etapas de
pesagem, facilita a purificação dos anticorpos a partir de uma grande quantidade de
ovos.
52
8 REFERÊNCIAS
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59
ANEXOS
60
PROTOCOLOS DE SOLUÇÕES
1. PBS 10X
NaCl 80 g
KCl 2 g
Na2HPO4 11,52 g
KH2PO4 2,4 g
H20 1000 mL
Ajustar pH para 7,4
Protocolos de soluções para ELISA
1. PBS Tween 0,05%
PBS 1x 1000 mL
Tween 20 0,5 mL
2. Tampão carbonato-bicarbonato 50mM
Na2CO3 0,795 g
NaHCO3 1,465 g
H2O 500 mL
Ajustar o pH para 9,6.
Protocolos de soluções para Dot Blot
1. PBS Tween 0,05%
PBS 1x 1000 mL
Tween 20 0,5 m.
2. 5% de Albumina em PBS-T
Adicionar 5 g de albumina em 100 mL de PBS-T.
Dissolver com agitação mecânica e estocar a 4°C.
61
CROMATOGRAMAS
Figura 14: Amostra 02 purificada pelo método desenvolvido no LABICEM
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.23 9.24 6.27 8.82 11.16
12.32 12.32 83.72 69.16 87.49
Tabela 3: Parâmetros da corrida
Figura 15: Amostra 02 purificada pelo método de Pauly et al., (2011)
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.27 9.27 4.03 4.97 6.76
12.31 12.31 74.60 59.54 80.91
13.81 13.81 8.50 8.24 11.20
Tabela 4: Parâmetros da corrida
62
Figura 16: Amostra 03 purificada pelo método desenvolvido no LABICEM
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.21 9.21 3.30 3.89 4.37
12.36 12.36 101.25 83.74 93.95
Tabela 5: Parâmetros da corrida
Figura 17: Amostra 03 purificada pelo método de Pauly et al., (2011)
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.25 9.25 5.04 6.91 7.91
12.36 12.36 88.07 69.12 79.17
13.88 13.88 11.73 10.47 11.99
Tabela 6: Parâmetros da corrida
63
Figura 18: Amostra 04 purificada pelo método desenvolvido no LABICEM
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.25 9.25 3.74 4.37 4.96
12.36 12.36 106.90 82.30 93.37
Tabela 7: Parâmetros da corrida
Figura 19: Amostra 04 purificada pelo método de Pauly et al., (2011)
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.26 9.26 5.40 7.27 8.44
12.35 12.35 92.55 70.03 81.37
13.89 13.89 8.49 7.64 8.87
Tabela 8: Parâmetros da corrida
64
Figura 20: Amostra 05 purificada pelo método desenvolvido no LABICEM
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.19 9.19 3.02 3.43 3.84
12.33 12.33 110.38 85.59 95.68
Tabela 9: Parâmetros da corrida
Figura 21: Amostra 05 purificada pelo método de Pauly et al., (2011)
Tempo de retenção (min.) Volume de retenção (ml) Altura (mAU) Área (ml mAU) Área Relativa (%)
9.25 9.25 5.04 6.15 7.10
12.26 12.26 88.07 69.12 79.86
13.88 13.88 11.73 10.47 12.10
Tabela 10: Parâmetros da corrida
![ANTICORPOS - MEUS SOLDADINHOS, MEUS PROTETORES · 2020. 8. 10. · anticorpos - meus soldadinhos, meus protedores, por joão josé da costa [ 2] anticorpos - meus soldadinhos, meus](https://img.document.onl/doc/110x75/607bc6fd4f65ba4ee03efbb8/anticorpos-meus-soldadinhos-meus-protetores-2020-8-10-anticorpos-meus.jpg)
