Protocolos em Psicofarmacologia Comportamental

protocolos em psicofarmacologia comportamental

Presidente Ruth Guinsburg Conselho Editorial Benjamin Kopelman (representante da Fap) Cynthia A. Sarti (campus Guarulhos) Durval Rosa Borges (presidente da Fap) Erwin Doescher (campus São José dos Campos) Marcia Thereza Couto (representante externo) Mauro Aquiles La Scalea (campus Diadema) Nildo Alves Batista (campus Baixada Santista) Plinio Martins Filho (editor) Ruth Guinsburg (campus Vila Clementino) Editora-assistente Adriana Garcia

Um guia para a pesquisa de drogas com ação sobre o SNC, com ênfase nas plantas medicinais

Elisaldo A. Carlini e Fúlvio R. Mendes (organizadores)

protocolos em psicofarmacologia comportamental

Todos os direitos desta edição reservados à

Editora Fap-Unifesp

Fundação de Apoio à Universidade Federal de São PauloRua José de Magalhães, 80 – Vila Clementino04026-090 – São Paulo – sp – Brasil(11) [email protected]

Impresso no Brasil 2011

Foi feito o depósito legal

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central da Unifesp

Protocolos em Psicofarmacologia Comportamental: um Guia para a Pesquisa de Drogas com Ação sobre o SNC, com Ênfase nas Plantas Medicinais / or-ganizadores Elisaldo A. Carlini e Fúlvio R. Mendes. -- São Paulo: Editora Fap-Unifesp, 2011.

400 p. ; 18 x 25,5 cm

ISBN 978-85-61673-31-4

1. Psicofarmacologia 2. Psicoterapia 3. Uso de drogas I. Elisaldo, Elisaldo A. II Mendes, Fúlvio R.

CDD-615.78

Copyright © 2011 by Organizadores

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Apresentação ..................................................................................... 9Prefácio ............................................................................................ 11

PARTE 1. Noções Básicas de Laboratório e Seleção de Potenciais Bioativos

1. Procedimentos Básicos de Laboratório e Ética em Experimentação AnimalFúlvio Rieli Mendes e Monica Levy Andersen .................................................. 17

2. Estratégias Utilizadas para a Seleção de Plantas com Potencial Bioativo com Ênfase nos Métodos de Etnobotânica e EtnofarmacologiaEliana Rodrigues e Rafaela D. Otsuka ........................................................... 39

3. Ensaios Fitoquímicos em Plantas Medicinais: Propriedades, Extração, Caracterização e Quantificação de Princípios AtivosGiuseppina Negri e Joaquim Maurício Duarte-Almeida ...................................... 65

4. Química Medicinal e Síntese de PsicofármacosRogério Corrêa, Fátima de Campos Buzzi e Valdir Cechinel Filho ........................ 107

sumário

8 Protocolos em Psicofarmacologia Comportamental

PARTE 2. Modelos Animais em Psicofarmacologia

5. Testes Iniciais para Estudo de Drogas e Extratos com Efeito CentralElisaldo A. Carlini ................................................................................. 131

6. Modelos Animais para o Estudo de Drogas AnsiolíticasRicardo Tabach ............................................................................... 159

7. Modelos Animais para Estudo de Drogas AnalgésicasNara L. M. Quintão, Maria Martha Campos e João B. Calixto ............................ 183

8. Modelos Animais para o Estudo de Drogas NeurolépticasElisaldo A. Carlini ................................................................................. 217

9. Modelos Animais para o Estudo de Drogas Antiepilépticas e Uso da Imuno-histoquímica como Técnica ComplementarMaria José da Silva Fernandes, Fernanda Elisa Rosim e Daniele Suzete Persike ...... 231

10. Modelos Animais para o Estudo de Drogas AntidepressivasReinaldo Nóbrega de Almeida, Franklin Ferreira de Farias Nóbrega, João Euclides Fernandes

Braga, Leandra Eugênia Gomes de Oliveira e Rita de Cássia da Silveira e Sá ............. 267

11. Modelos Comportamentais para o Estudo da Aprendizagem e Memória em RoedoresJuliana Carlota Kramer Soares, Suzana Maria Pereira Galvão, Karin Di Monteiro Moreira e

Tatiana Lima Ferreira ............................................................................. 293

12. Modelos Animais para Avaliação de Plantas AdaptógenasFúlvio Rieli Mendes .......................................................................... 323

13. Modelos in vivo e in vitro para o Estudo de Drogas Neuroprotetoras, com Ênfase em Processos Isquêmicos Cerebrais e Doença de ParkinsonGeanne Matos de Andrade, Silvânia Maria Mendes Vasconcelos, Francisca Cléa Florenço

de Sousa e Glauce Socorro de Barros Viana ................................................. 355

Autores e Revisores ....................................................................... 389Índice Remissivo ............................................................................ 397

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O livro Protocolos em Psicofarmacologia Comportamental. Um Guia para a Pesquisa de Dro-gas com Ação sobre o SNC, com Ênfase nas Plantas Medicinais foi imaginado como um livro prático, que sirva de material de apoio e para auxiliar o planejamento e execução de um estudo de psicofarmadologia. Este livro não tem a pretensão de abordar todos os métodos e técnicas em psicofarmacologia ou neurofarmacologia, nem tampouco substitui livros didá-ticos teóricos sobre o assunto.

Os modelos experimentais aqui apresentados foram escolhidos pelos autores por tra-tarem de abordagens bastante úteis para o estudo da psicofarmacologia e para a avaliação de drogas com atividade sobre o sistema nervoso central, incluindo métodos clássicos, bas-tante conhecidos, e outros mais recentes. Entretanto, é importante deixar claro que existem muitos outros modelos experimentais não abordados neste livro, e o aluno ou pesquisador deverá procurar aqueles mais adequados ao trabalho que deseja realizar. Também é impor-tante frisar que os protocolos aqui descritos não significam que os mesmos experimentos não posssam ser conduzidos com pequenas modificações. Trata-se de sugestões de proto-colos que levam em consideração a experiência dos autores, e, como será notado, muitas vezes são apresentadas variações destes protocolos. Alterações e ajustes visando a adap-tação dos protocolos ao laboratório do pesquisador e aos objetivos do estudo são sempre possíveis e viáveis. Neste sentido, este livro é apenas um guia, com o objetivo de auxiliar no planejamento de um estudo e permitir ao pesquisador entender a metodologia utilizada, suas limitações e possibilidades.

apresentação


O estudante ou pesquisador deve ainda ter em mente a importância de dominar as técnicas e saber interpretar os dados obtidos. Isto é particularmente importante em estudos que envolvem a observação do comportamento animal. Somente com a prática e experiên-cia o investigador estará apto a conduzir e interpretar um experimento de psicofarmacolo-gia de forma correta.

SobRE A ESTRUTURA DESTE LIvRo Este livro pretende ser útil para todos aqueles que trabalham com psicofarmacologia, em especial aqueles à procura de novos agentes farmacológicos. Um enfoque especial é dado na pesquisa de produtos de origem natural, incluindo alguns capítulos específicos sobre o tema.

O livro está dividido em duas partes. A Parte 1 tem um capítulo inicial que traz noções básicas de laboratório, enquanto os demais capítulos abordam possíveis estratégias para obtenção de produtos naturais; sua análise fitoquímica; e considerações sobre química medicinal e desenvolvimento de fármacos. A Parte 2 refere-se aos estudos psicofarmacoló-gicos propriamente ditos, com ênfase em testes comportamentais, os chamados “modelos animais” para o estudo de patologias do SNC e de drogas que atuam nestas desordens. Ao longo dos capítulos o leitor encontrará, após uma breve introdução de cada assunto, discussões sobre os diversos modelos experimentais, protocolos sugeridos destes modelos e quadros-resumos. Ao fim de cada capítulo, um quadro comparativo ajuda a analisar as vantagens e desvantagens de cada modelo. A bibliografia traz uma seleção de trabalhos consultados e recomendados pelos autores, em que o leitor poderá obter mais informações sobre os assuntos.

Esperamos que este livro cumpra a sua missão, ou seja, ser útil ao estudante e pequi-sador que realiza seus estudos em psicofarmacologia e áreas afins.

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E. A. Carlini

Este livro representa a concretização de um desejo com pelo menos trinta anos de sonho. De fato, no fim da década de 1960 até início de 1980, comecei a pensar que seria útil para o nosso meio científico ter um manual sobre técnicas comportamentais na área da psico-farmacologia, praticamente inexistente aqui, e ao mesmo tempo prescindindo do uso de equipamento sofisticado necessitando de importação. Junto com meus colegas da época (todos meus ex-alunos de pós-graduação) começamos então a pôr a “mão na massa”. Em 1984 chegamos a completar cerca de 60% do livro. Redigi então uma introdução, da qual reproduzo alguns trechos:

Por que resolvemos escrever um livro sobre avaliação de efeitos de drogas psicoativas?Primeiramente, talvez a razão principal, porque é o que sabemos fazer. Uma outra razão, a simpli-

cidade de muitas técnicas utilizadas em psicofarmacologia, teve também seu papel na decisão de escrever o livro. Realmente, para vários dos testes psicofarmacológicos empregados prescinde-se de equipamento sofis-ticado, de difícil importação e difícil manutenção. E isto é importante porque às vezes nos faltam meios para adquiri-los e mantê-los e consequentemente acabamos por ficar paralisados. Na realidade, muitas vezes não é necessário equipamento algum: bons animais de laboratório, pesquisador experiente, as seringas e pronto; a observação comportamental direta dos animais em caixas apropriadas é suficiente. E para que não digam que isto é coisa de subdesenvolvido, alguns exemplos do exterior ilustram este fato. Jonhs e colaboradores (1979) do laboratório de pesquisas de Roussel Ltda. , na Inglaterra, pesquisaram as ações hipnótica, anticonvulsi-vante e ansiolítica de um composto empregando quinze métodos; destes, dez não utilizaram equipamentos, quatro apenas com equipamento muito simples (caixa com assoalho eletrificado, fonte para eletrochoque,

prefácio


caixas para movimentação e rota rod, que podem ser fabricados sem dificuldade no nosso meio e são baratos) e apenas um método exigiu equipamento sofisticado (eletroencefalógrafo). Kaneko e colaboradores (1981) do departamento de Farmacologia do Laboratório Eisai, Japão, utilizaram quinze métodos para estudo de um composto, sendo nove destes à base de observação comportamental e, portanto, sem equipamento e quatro com equipamentos simples. Ongini e colaboradores (1982) dos laboratórios de pesquisas Essex, Itália, empregaram nove testes para estudo de novo hipnótico; destes, seis prescindiam de equipamento.

Portanto, para pesquisa tipo “peneiragem” (screening) em psicofarmacologia, o fator limitante não é a inexistência de laboratório ultrassofisticado. Este livro procura exatamente mostrar esse ponto, sempre que possível ilustrando os capítulos com exemplos obtidos nos laboratórios do Departamento de Psico-

biologia da Escola Paulista de Medicina (E. A. Carlini, maio 1984).

Entretanto, foram tantos os compromissos que assumimos naquela época, que a obra foi deixando de ser prioritária. Mas nunca deixou de existir e o sonho continuava.

Passados quase trinta anos éramos agora no Cebrid em número de cinco, todos vete-ranos doutores em ciência, com larga experiência, estudando efeitos de extratos de plantas com possíveis efeitos no sistema nervoso central. E, durante todo este tempo, técnicas com-portamentais simples continuaram a ser empregadas, conforme pode ser visto em várias referências bibliográficas mais recentes (Amos et al., 2004; Xu et al., 2005; Schellekens et al., 2009; Tabach et al., 2009; Hosseinzadeh, 2009).

Fúlvio Rieli Mendes, Ricardo Tabach, Giusepina Negri e Joaquim Maurício Duarte- -Almeida fizeram-me ver que este livro teria de sair, dada a sua utilidade certa em nosso meio. E assim fui “docemente constrangido” a juntar-me ao grupo, com meus oitenta anos bem vividos. E digo que, com este “sangue novo” em minha volta, fui tomado novamente de entusiasmo. Fúlvio foi a mola mestra, capataz mesmo, animando a nós todos e convidando competentes colegas de outras instituições a participarem da obra. Sou grato aos colegas do Cebrid e aos demais autores: Daniele Persike (Unifesp), Eliana Rodrigues (Unifesp/Diadema), Fátima Buzzi (Univali), Fernanda Rosim (Unifesp), Francisca Cléa de Souza (UFC), Franklin Nóbrega (UFPB), Geanne de Andrade (UFC), Glauce Viana (FMJ/UFC), João Batista Calixto (UFSC), João Euclides Braga (UFPB), Juliana Soares (Unifesp), Karin Moreira (Unifesp), Leandra Eugênia Oliveira (Uesb), Maria José Fernandes (Unifesp), Maria Martha Campos (PUC-RS), Monica Andersen (Unifesp), Nara Quintão (Univali), Rafaela Otsuka (Unifesp), Reinaldo Nóbrega de Almeida (UFPB), Rita de Cássia Sá (UFPB), Rogério Corrêa (Univali), Silvânia Maria Vasconcelos (UFC), Suzana Galvão (Uespi), Tatiana Ferreira (UFABC), Valdir Cechinel Filho (Univali), bem como aos revisores dos capítulos por esta colaboração. Agra-deço ainda aos representantes da Editora Unifesp, Aristóteles Predebon e Adriana Garcia. E ao Fúlvio, coordenador desta obra, o meu mais profundo reconhecimento.

Prefácio 13

REFERÊNCIAS bIbLIogRáFICAS Amos, S.; Akah, P. A.; Enwerem, N.; Chindo, B. A.; Hussaini, I. M.; Wambebe, C. et al. “Behavioural

Effect of Pavetta Crassipes Extract on Rodents”. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 2004,

vol. 77, pp. 751-759.

Hosseinzadeh, H. & Noraei, N. B. “Anxiolytic and Hypnotic Effect of Crocus Sativus Aqueous Extract and

its Constituents, Crocin and Safranal, in Mice”. Phytotherapy Research, 2009, vol. 23, pp. 768-774.

Johns, T. G.; Piper, D. C. & James, G. W. L. 1979. “The Pharmacological Profile of a Potential Hypnotic

Compound RU 31158”. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie, vol. 240,

pp. 53-65.

Kaneko, T.; Kitahara, A.; Ozaki, S.; Takizawa, K. & Yamatsu, K. “Effects of Azelastine Hydrochloride,

a Novel Anti-allergic Drug, on the Central Nervous System”. Arzneimittel-Forschung/Drug

Research, 1981, vol. 31, pp. 1 206-1 212.

Ongini, E.; Parravicini, L.; Bamonte, F.; Guzzon, V.; Iorio, L. C. & Barnett, A. “Pharmacological

Studies with Quazepam, a New Benzodiazepine Hypnotic”. Arzneimittel-Forschung/Drug Research,

1982, vol. 32, pp. 1 456-1 462.

Schellekens, C.; Moccetti, P. T.; Wullschleger, C. & Heyne, A. “An Extract from Wild Green oat

Improves Rat Behavior”. Phytotherapy Research, 2009, vol. 23, pp. 1 371-1 377.

Tabach, R.; Mattei, R. & Carlini, E. A. “Pharmacological Evaluation of a Phytotherapeutic Product –

CPV (Dry Extract of Crataegus Oxyacantha L., Passiflora incarnata L. and Valeriana offcinalis L.)

in Laboratory Animals”. Revista Brasileira de Farmacognosia, 2009, vol. 19, pp. 255-260.

Xu, Y.; Ku, B. S.; Yao, H. Y.; Lin, Y. H.; Ma, X.; Zhang, Y. H. et al. “The Effects of Curcumin on Depressive-

like Behaviors in Mice”. European Journal of Pharmacology, 2005, vol. 518, pp. 40-46.

NoçõES báSICAS DE LAboRATóRIo E SELEção DE PoTENCIAIS bIoATIvoS

parte 1

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Procedimentos básicos de Laboratório e Ética em Experimentação Animal

Fúlvio Rieli Mendes e Monica Levy Andersen

INTRoDUçãoPara um estudante de iniciação científica realizando seu primeiro estágio, saber como se comportar no laboratório pode ser um grande desafio. De fato, pouco se aprende sobre os procedimentos básicos de conduta durante as aulas teóricas ou mesmo em aulas práticas. A experiência concreta só será adquirida com a vivência diretamente em um laboratório. Infelizmente, nota-se que mesmo alunos de Pós-graduação e pesquisadores há muito tempo vivenciando o laboratório, muitas vezes não seguem boas normas de conduta. A ideia deste capítulo é abordar os principais cuidados que devem ser seguidos no laboratório para uma condução adequada dos experimentos, e ao mesmo tempo dar noções sobre como manipu-lar e utilizar os animais eticamente. Três princípios fundamentais devem ser seguidos por todos aqueles que desejam desenvolver um estudo científico.1. Conhecimento. O experimentador deve saber o que quer investigar, o por quê inves-

tigar e como investigar. Deve possuir o conhecimento mínimo necessário para a realização de qualquer técnica ou procedimento, incluindo o conhecimento sobre aspectos experimentais e éticos.

2. Seriedade. O experimentador deve realizar o experimento de forma séria e criteriosa, analisando os dados dentro das prerrogativas estatísticas e com o devido rigor.

3. Ética. Deve-se seguir os preceitos éticos, tanto no que se refere à experimentação com animais como na conduta em laboratório e na análise científica em si. O res-peito aos colegas e às regras do laboratório são absolutamente imprescindíveis.

capítulo 1


NoçõES gERAIS DE LAboRATóRIoEmbora cada laboratório possa ter suas regras próprias de funcionamento, existem certas normas gerais que são quase universais. Algumas dessas normas de conduta podem ser aprendidas em sala de aula, mas, na maioria das vezes, somente serão aprendidas diaria-mente no laboratório. O ideal seria que todo indivíduo recém-chegado recebesse um treina-mento prévio, em que fossem explicadas as regras do ambiente e realizadas demonstrações práticas. Porém, poucos grupos de pesquisa oferecem este treinamento para os iniciantes.

Existe uma série de normas internacionais denominadas de “Boas Práticas Labo-ratoriais” (BPL) que estabelece como deve ser a conduta em um laboratório, tanto no que ser refere à segurança do experimentador e demais pessoas, como à validação e aceita-ção dos resultados pela comunidade científica (OECD, 1998; Inmetro, 2003; Lissau, 2004). Essas normas, entretanto, são um pouco rígidas e não costumam ser totalmente seguidas, a menos que o laboratório seja credenciado e passe por inspeções periódicas. Ainda assim, procurar seguir as BPL é desejo de muitos laboratórios.

Algumas noções importantes são descritas abaixo.a. Regras de conduta. O estudante deve se informar logo no início sobre regras de rela-

cionamento, vestuário e uso das instalações do laboratório. Saber se pode utilizar os telefones ou computadores, quais as salas de permanência, procedimentos para reserva e uso de salas de experimento e equipamentos etc.

b. Uso de aventais. O uso de avental dentro do laboratório é pressuposto básico. É neces-sário para a higiene e segurança do experimentador. Ressalta-se que o avental deve estar sempre limpo.

c. Registro dos dados. Os protocolos e resultados de experimentos devem ser registra-dos, preferencialmente em cadernos, à caneta, e com o máximo de informações pos-síveis. Esses dados devem ser arquivados e permanecer disponíveis, caso seja neces-sário verificar alguma informação. Recomenda-se manter cópias dos registros no computador e fazer cópias de segurança.

d. Identificar tudo. Qualquer material em uso ou estoque deve ser devidamente identifi-cado. Utilizar reagentes e soluções que não estejam corretamente identificados certa-mente comprometerá o estudo. Frascos contendo soluções devem ser rotulados com etiquetas constando a identificação do material, data de preparação, concentração e pessoa responsável, data de validade etc.

e. Organização. É necessário saber onde ficam todos os equipamentos, materiais e rea-gentes que vai utilizar, assim como a forma correta de utilizá-los. Ao fim do uso, todo o material deve ser guardado em conformidade com normas específicas.

Procedimentos básicos de laboratório e ética em experimentação animal 19

f. Uso de equipamentos. Equipamentos de laboratório costumam ser caros e frágeis. Todos devem passar por um treinamento antes de utilizar qualquer aparelho, e somente devem utilizá-lo quando souberem operá-lo corretamente.

g. Descarte. Existem regras para os diferentes tipos de descarte. O lixo de laboratório deve ser desprezado segundo as normas do laboratório, seguindo as orientações das ins-tâncias reguladoras. Material contaminado, de qualquer espécie, jamais deve ser des-cartado junto com o lixo comum. Deve-se evitar ainda descartar lixo comum (papel toalha, copo descartável etc.) no lixo de laboratório. Isto eleva o volume e custo do processamento deste material.

A importância do caderno de bancadaO caderno de bancada deveria ser considerado como o “esboço da tese”, o “rascunho da monografia”, o “alicerce do manuscrito”. É no caderno de bancada (além do computador) que devem constar todas as informações sobre o estudo que foi feito. O caderno de bancada é considerado tão importante que não pode ser levado do laboratório, e muitas vezes, fica sob a guarda do investigador principal.

Imagine uma situação na qual após dois meses de experimentação, ao finalmente con-cluir um experimento bastante cansativo, os resultados não fazem sentido, e o experimentador postula que talvez tenha errado na preparação de alguma droga. Se as anotações referentes à preparação da droga e demais observações do estudo tiverem sido anotadas, será fácil confe-rir se houve algum erro de procedimento. Do contrário, será impossível saber o que ocorreu.

Um bom caderno de bancada deve conter o máximo possível de informações: data do experimento, horário, pessoal envolvido nas avaliações, cálculos das preparações das soluções, diluentes, e quaisquer informações que sejam relevantes para o experimento em questão. Qualquer anormalidade ou imprevisto deve ser registrado, pois ajudará a inter-pretar eventuais resultados inesperados. O quadro 1 traz uma lista das informações que normalmente devem ser anotadas no caderno de bancada.

Protocolos experimentaisÉ necessário ter muita experiência com os testes (modelos) que se propõe utilizar, do contrá-rio o experimentador corre o risco de não perceber possíveis anormalidades durante a con-dução do experimento, ou de cometer erros que inviabilizarão o estudo. Isto se torna ainda mais crítico em estudos que demandam uma preparação longa, às vezes com protocolos que envolvem múltiplas etapas. O erro, ou um esquecimento, pode ser percebido somente no final, comprometendo todo o estudo.


Quadro 1. informações que devem constar de um caderno de bancada (outras informações podem ser essenciais, dependendo das particularidades do estudo)

INFoRMAçõES gERAIS

Experimento:nome do teste (para facilitar a localização dos resultados e anotações ao se folhear o caderno de bancada).

Projeto:importante na medida em que alguns experimentos poderão ser feitos inúmeras vezes, como parte de diferentes projetos.

Experimentador(es): equipe que esteve envolvida na execução do experimento.

Data:anotar dia, mês e ano. Pode ser que apenas muito tempo mais tarde seja necessário verificar alguma informação, e se a data não tiver sido corretamente marcada, esta informação poderá não ser recuperada.

Horário: anotar horário do início e do fim do experimento.

ANIMAIS

Animais / linhagem: espécie (ex.: rato, camundongo), linhagem (ex.: Wistar, Swiss) e particularidades.

Idade / sexo:colocar a data de nascimento dos animais ou idade média (em dias) e sexo. Caso existam animais com data de nascimento diferente, utilizar apenas aqueles que estejam com idade semelhante.

Peso: peso corporal.

DRogAS / REAgENTES

Droga(s):nome, número de lote e data de validade (anotar estas informações para todas as drogas comerciais que forem utilizadas).

Produto-teste:droga de investigação, princípio ativo, extrato ou fração das preparações a serem testadas (planta medicinal, por exemplo).

Reagentes: nome, data de preparação, concentração etc.

veículo: nome da solução utilizada para solubilização das drogas e concentração do veículo, quando for o caso.

Dispersante:registrar se foi utilizado algum agente para facilitar a solubilização da droga, especificando o nome e concentração/proporção.

Concentração:anotar para todas as soluções (reagentes, drogas, extratos) a concentração da(s) solução(ões).

Doses:anotar as doses empregadas no estudo, incluindo os cálculos da diluição. Importante manter esses cálculos para verificação posterior.

SobRE o EXPERIMENTo

Controle positivo: droga de referência.

Controle negativo: controle experimental das variáveis.

Grupos experimentais: grupos que se pretende avaliar.

Tempos de observação:tempos de medição após a administração da droga ou da manipulação experimental.

Parâmetros avaliados: o que está se avaliando e em que circunstâncias.

observações:registrar desvios do protocolo original, atrasos, ou outros acontecimentos não previstos. O experimentador deve avaliar o quanto estes imprevistos comprometem ou não o experimento.

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