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30/07/12
1
MicroRNAs e células-‐tronco
Katlin B. Massirer Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças Humanas
Rio-‐Julho 2012
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Gené5ca
Graduação -‐ Farmácia -‐ Análises Clínicas
Mestrado -‐ Farmácia -‐ Biologia Molecular-‐RNA
Doutorado -‐ Biologia/Bioinformá5ca C. elegans miRNAs Pós – doc -‐ Med Regenera5va CTE, RBP, Bioinformá5ca
Lab: RBP, miRNA Doenças humanas
Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças
Humanas
RBP
poliA RBP
RBP
Quais os componentes de complexos que ligam RNA? Quais os alvos e RBPs?
Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças
Humanas
RBP
CTE
neurônios
neurônios
neurô
nios
neurô
nios
poliA RBP
RBP
Quais os componentes de complexos que ligam RNA? Quais os alvos e RBPs?
eIF4E
Sam68
Sarcomas
TET EWS
Translocação
QKI
Ataxias
ATXN2
PEM/SN
FXS
FMRP
TLS/FUS
hnRNP A2
FXTAS
DM
MBNL
SMN
SMA
OPMD PABN1
CUGBP1
FOX3
Argonautes
NOVA
Auto-imunidade
POMA
LIN28 FOX2
Câncer
Doenças neurológicas
Atrofias musculares
Células-tronco
ALS
TDP-43
hnRNP A1 SF2/ASF hnRNP K
DMPK
Proteínas de ligação a RNA e processos celulares
Figure 7-‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
“Central Dogma”
Figure 7-‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
“Central Dogma” – passos de regulação
Figure 7-‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
“Central Dogma”-‐ expandido
Transcrição Reversa
RNA polimerase Dependente de RNA
RNAs não-‐codificantes
Estrutura gênica
hYp://nitro.biosci.arizona.edu/courses/eeb600a-‐2003/lectures/lecture24/lecture24.html
7-‐methylguanylate cap
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Regulação de mRNAs-‐alvo específicos
~22nt - miRNAs!3’UTR
5’ 3’ seed
microRNAs: Descoberta e regulação Descoberta dos miRNAs em C. elegans
Regulação de mRNAs-‐alvo específicos
~22nt - miRNAs!3’UTR
Nature, 2000!
Cell, December 1993!
5’ 3’ seed
microRNAs: Descoberta e regulação
Processamento em miRNA precursor
RNaseIII! RNaseIII!
Drosha/DGCR8!
núcleo
citoplasma
Biogênese e processamento de microRNAs
miRNA primário CAP poliA
miRNA primário
Processamento em miRNA precursor
RNaseIII! RNaseIII!
Ago-RISC!!
RNaseIII! RNaseIII!
Dicer!
Maturação em miRNAs 22nt
Regulação específica de mRNAs-‐alvo
~22nt miRNAs!5’ 3’ seed
3’UTR
núcleo
citoplasma
CAP poliA
Biogênese e processamento de microRNAs
Drosha/DGCR8!
let-7 miRNA!
Nív
el P
rote
ico
Proteína!LIN-41!
Desenvolvimento larval!
L3! L4!L2! L1!
5’UUAUACAACC CUACCUCA3’ 5’UUAUACAACC CUGCCUC3’!GUU! A!
AU!
AUU!
AU!
lin-41 3’ UTR!let-7 RNA! 3’UUGAUAUGUUGG GAUGGAGU5’ 3’UUGAUAUGUUGG GAUGGAGU5’!
Slack et al., 2000; Reinhart et al., 2000!
miRNAs inicialmente descrito: regulação por inibição da tradução
miRNAs exercendo: regulação por degradação de mRNAs-‐alvo
Bagga et al., Cell 2005!
Organismo: C. elegans
Northern acrilamida-‐ microRNA sonda seq complementar a let-‐7 ~22nt
Northern agarose-‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-‐14
Northern acrilamida-‐ controle no gel rRNA de ~120nt
Northern agarose-‐ controle membrana sonda seq complementar a eg-‐2
Northern agarose-‐controle no gel
Northern agarose-‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-‐28
stages of larval!Development-!
Larva:!
stages of larval!Development-!
Larva:!
miRNAs exercendo: regulação por degradação de mRNAs-‐alvo
Organismo: C. elegans
Northern acrilamida-‐ microRNA sonda seq complementar a let-‐7 ~22nt
Northern agarose-‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-‐14
Northern acrilamida-‐ controle no gel rRNA de ~120nt
Northern agarose-‐ controle membrana sonda seq complementar a eg-‐2
Northern agarose-‐controle no gel
Northern agarose-‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-‐28
Bagga et al., Cell 2005!
miRNAs exercendo regulação por degradação de mRNAs-‐alvo
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Células tronco!hematopoiética!
miR-181!
miR-142!miR-223!
Célula B!
Célula T!
Células - CTE!
Células diferenciadas!!
!miRNAs!
específicos!
Pluripotência de células-tronco! Hematopoiese!
(Houbaviy et al., 2003; Suh et al., 2004, 2011)! (Chen et al., 2004)!
let-7!
Funções dos microRNAs
let-7!
LIN-‐28 é altamente expressa em CTE (proteína de ligação a RNA)
LIN-‐28 inibe let-‐7 em CTE
Gregory, 2008!
LIN-‐28 inibe let-‐7 em CTE
Gregory; 2008!
Perfil de miRNA CTE X iPSCs (reprogramação não é perfeita)
Chin et al, 2009
CTE
neurônios
neurônios
neurônios
neurônios
CTE – diferenciação neuronal
Shi et al., 2007
Perfil de miRNAs em CTE e céls derivadas qPCR miRNA • hYp://www.systembio.com/microrna-‐research/expression-‐profiling/stem-‐cell-‐collec5on/technical-‐details • Biocat
Perfil de miRNAs
Morissey et al, 2011
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Expressão de miRNAs gerando teratoma (miR-‐302/miR307)
Morrisey 2011 Morrisey 2011
Supressão de Hdac2 por VPA é essencial para a reprogramação por miRNAs
Resumo: Reprogramação em iPSCs por miRNAs
Chang & Gregory 2011
Banco público de miRNAs: miRBase.org
miRBase.org informação detalhada sobre cada miRNA
Predição de alvos de miRNAs
Exemplo: TargetScan
Predição de alvos de miRNAs
Exemplo: TargetScan – conservação da ligação de let-‐7
Perfil esperado de um profissional no lab
• Tenha iniciativa- seja pró-ativo
• Seja responsável
• Apaixone-se pelo que faz
• Saiba do que está falando – leia artigos, estude os protocolos, entenda ferramentas de bioinformática
• Seja crítico: biologia molecular, celular, embriologia, • bioquímica, epigenética • Saiba inglês - muito bem
• Aproveite seu tempo!
Stem Cell Core Lab (UCSD) Muotri Lab (UCSD) – CTE e iPSC
Adriana Franco Paes Leme Pasquinelli Lab (UCSD)- microRNA Yeo Lab (UCSD)-CLIP/sequenciamento
Agradecimento/Colaborações
Anete Pereira de Souza Ana Maria Azeredo-Espin
Lab: Ricardo Paixão (bioinformática)