Trabalho de Citologia – Assunto: Técnicas de Preparação Citológica – 1º anos

Realizar um trabalho sobre:

Técnicas de preparação citológica para observação no microscópio óptico, dando ênfase

ao objetivo e importância de cada técnica (esfregaço, esmagamento, corte manual,

inclusão e corte com o micrótomo).

E as técnicas de preparação citológica para observação no microscópio eletrônico (de transmissão e de varredura), destacando suas diferenças e o objetivo e importância de cada técnica utilizada

técnicas citológicas (microscopia)

Processos utilizados na preparação de material para observação ao microscópio.

Na microscopia ótica podem-se utilizar dois tipos de preparações: as temporárias ou

extemporâneas, usadas para a observação imediata do material, e as definitivas,

preparações que podem ser guardadas e observadas várias vezes.

A preparação do material a observar ao microscópio engloba várias técnicas. Inicia-

se com a colheita do material, que deve ocorrer em condições em que o objeto de

estudo não seja danificado.

A fixação, inclusão, corte, coloração e montagem são algumas das técnicas

utilizadas na preparação do material para observação em microscopia ótica.

Na microscopia eletrónica, são utilizadas técnicas de inclusão, corte, fixação e

contraste para a preparação do material a observar.http://www.infopedia.pt/$tecnicas-citologicas-(microscopia)

TÉCNICAS CITOLÓGICASINTRODUÇÃO:Entende-se por técnicas citológicas o conjunto de operações a que é preciso submeter omaterial biológico para ficar em condições de ser observado ao microscópio. Estas técnicaspodem ser divididas em dois grandes grupos de preparações: para microscopia óptica e paramicroscopia electrónica.Microscopia óptica

São variados os métodos de preparação de material citológico para ser observado aomicroscópio óptico. Podemos considerar 3 grandes tipos de preparações:I. Preparações a fresco ou extemporâneasII. Preparações definitivas sem inclusãoIII. Preparações definitivas com inclusão (inclusão é uma das etapas da técnica, que consisteem colocar a peça citológica num bloco constituído por uma substância protectora e desuporte, que permita efectuar facilmente o corte)I - Preparações a frescoÉ um tipo de preparação que pode ser utilizada a qualquer momento, porque permite umaobservação rápida e imediata. Também é designada por preparação extemporânea.A este tipo de preparação se devem as primeiras descobertas científicas, pois permite aobservação de peças ou microorganismos em condições de vida, apesar de ser por um curtoperíodo. Habitualmente, uma preparação é constituída por uma lâmina de vidro na qual secoloca o material biológico a observar, sobrepondo-se a este uma lamela de vidro.Por vezes usam-se outros tipos de lâminas na observação de preparações a fresco, como aslâminas escavadas, que têm no centro uma cavidade. O material fica, assim, rodeado de maiorquantidade de líquido e ao mesmo tempo não há compressão da lamela sobre as estruturas aobservar.

Observação in vivo e in vitroA observação in vivo corresponde ao estudo das células no seu próprio meio. É um métodomuito utilizado para o estudo dos seres vivos de pequenas dimensões (protozoários e bactérias).A observação in vitro permite o estudo das células vivas, sendo estas previamente retiradas domeio natural em que vivem e colocadas em soluções com composição química bem definida, deforma a que se processe sem qualquer alteração o metabolismo celular.A – Líquidos fisiológicosQuando há a preocupação de se observar todas as manifestações vitais do material em estudo,procura-se rodear a peça de líquidos favoráveis à sua vivência, cuja osmolaridade deve igualaraquela em que o ser vivo habitualmente vive. Esses líquidos ou meios denominam-sefisiológicos ou isotónicos e os mais usados são:Líquido fisiológico (artificial) – Solução aquosa de cloreto de sódio a 9 /1000, para células de

mamíferos e a 7/1000 para células de animais poiquilotérmicos.Líquido fisiológico do tecido sanguíneo (plasma sanguíneo) – obtido por coagulação do sangue,seguida de centrifugação, adição anticoagulante, centrifugação e colheita do sobrenadante –plasma sanguíneo.Líquido de Ringer – geralmente utilizado para exame de células de vertebradospoiquilotérmicos e invertebrados. Além da isotonia, visa fornecer às células os elementosminerais existentes nos meios em que vivem e cuja iria prejudicar o seu metabolismo eestrutura. Esta solução pode apresentar diferentes composições quantitativas, nomeadamentequando são utilizadas em células de animais homeotérmicos (mamíferos e aves) oupoiquilotérmicos.Água do mar ou do rio – natural e filtrada ou artificial.B – Coloração vitalQuando há necessidade de pôr em evidência certas estruturas celulares, procede-se à suacoloração. Os corantes são substâncias que aumentam o contraste e permitem distinguir regiõescom igual índice de refracção. Porém, tem de haver uma precaução se queremos que oprotoplasma não morra. Para isso são usadas soluções muito diluídas de corantes vitais, taiscomo: azul de metileno, vermelho neutro, azul do Nilo, vermelho do Congo, azul brilhante decresilo, verde Janus, castanho de Bismark, azur I, azur II, etc., em concentrações da ordem de1/10.000 a 1/50.000.Com as colorações vitais não só observamos as células e microorganismos como tambémgranulações de secreção, vacúolos digestivos, grânulos, organelos citoplasmáticos e ainda partesdo núcleo como, por exemplo, o nucléolo e cromossomas.

Muitos corantes coram certas estruturas celulares de uma cor diferente da sua. Estes corantesreveladores de reacções químicas são chamados metacromáticos. Por exemplo: o vermelhoneutro, solúvel em água destilada com cor vermelho-violácea, vira para vermelho-cereja sob ainfluência de vestígios de ácidos e para amarelo-acastanhado ou alaranjado pela acção dasbases. Alguns corantes vitais podem mesmo indicar o grupo químico a que pertence umdeterminado elemento da célula, o que se utiliza em técnicas de histoquímica. Por exemplo, o

Sudão III cora as granulações de gordura nas células vivas.Limitações do exame a fresco• Só se aplica a materiais suficientemente transparentes• A nutrição das células não é suficiente e, dentro de horas, as células começam a mostrarsinais de degenerescência, acabando por morrer.• As observações têm, assim, uma duração muito limitada sendo, portanto, preparaçõesefémeras que não se podem conservar.II e III - Preparações definitivasFixadoresSão substâncias ou agentes que induzem precipitação (cloreto de mercúrio e ácido pícrico) oucoagulação (aldeído fórmico, tetróxido de ósmio e glutaraldeído) das proteínas, tornando-asinsolúveis. Estes agentes são utilizados em técnicas citológicas para inibir a actividadeenzimática da célula, para impedir a actividade e a proliferação das bactérias, para endurecer ascélulas de modo a que resistam melhor às etapas seguintes da técnica citológica e para aumentara afinidade das estruturas celulares pelos corantes citológicos, tornando-as assim maisfacilmente coráveis, mantendo-lhes, tanto quanto possível, a sua morfologia e estrutura.Submergindo um pedaço de tecido num líquido fixador, a morte da célula não ocorreinstantaneamente. O fixador penetra na peça por difusão, de tal maneira que a maioria dascélulas periféricas fixa mais rapidamente e melhor do que as centrais. A rapidez da fixaçãodepende da barreira proteica que se origina na periferia do tecido.Tipos de fixadoresAgentes físicos usados como agentes fixadores: Pelo calor seco (chama, ex.: bactérias) ouhúmido (fervura). De um modo geral, são métodos grosseiros e violentos que alteramprofundamente a estrutura das células. Dessecação à temperatura ambiente – em que há umarápida evaporação da água das células e dos líquidos intersticiais.

Agentes químicos usados como agentes fixadores: Metanol, etanol, acetona, ácido sulfúrico,ácido clorídrico, ácido tricloroacético, ácido pícrico, tetróxido de ósmio, ácido acético,formaldeído, cloreto de mercúrio, etc.Misturas de fixadores mais usados em microscopia óptica• Líquido de Bouin (ácido pícrico + formol + ácido acético)• Líquido de Carnoy (etanol + clorofórmio + ácido acético)

• Líquido de Fleming (trióxido de crómio + tetróxido de ósmio + ácido acético + águadestilada)ColoraçãoConsiste em corar a totalidade da peça ou algumas partes específicas, dando-lhes tonalidadesdiferentes. Usam-se soluções de corantes naturais ou artificiais.Corantes naturais - Hematoxilina (extraída de uma leguminosa), Carmin (extraído do ovárioda fêmea de um hemíptero), anil (extraído de uma leguminosa), etc.Corantes artificiais – Azul de metileno, azul de toluidina, Azur I e II, Sudão, vermelho neutro.Os corantes são geralmente constituídos por misturas de sais, que podem apresentar um pHácido (pH = 0 – 6,9), neutro (pH = 7,0) ou alcalino (pH = 7,1 – 14). Os diversos métodos decoloração assentam na afinidade particular que certos elementos ou estruturas possuem emrelação a determinados corantes que sobre eles se fixam electivamente.Tipos de corantes artificiais:• Ácidos – eosina, fucsina ácida, vermelho do Congo• Básicos – vermelho neutro, verde de metilo, azul de metileno• Neutros – eosinato de azur de metilenoConsoante a afinidade de determinadas estruturas das células ou tecidos para com um dado tipode corantes as estruturas podem ser designadas por:• Acidófilas – se coram com um corante ácido (citoplasma)• Basófilas – se coram com um corante básico (cromatina)

Protocolo a efectuar na 6ª aula prática laboratorial (1ª parte)I - Observação de fenómenos de isotonia, turgidez celular, lise celular, plasmólise edesplasmólisePara que a morfologia das células permaneça intacta, devem ser utilizadas soluções isotónicasna observação de células a fresco. Uma solução isotónica é aquela cuja concentração é igual àdo meio no qual as células vivem.Quando se utiliza uma solução hipotónica (menos concentrada), a água do meio difunde para ointerior das células, aumentando o seu tamanho e provocando turgidez celular. Se esta soluçãofor muito hipotónica, as células podem mesmo sofrer lise celular, uma ruptura em certospontos da membrana (apenas no caso das células animais).Se, pelo contrário, se utilizar uma solução hipertónica, a água migra do interior das células para

o meio extracelular, originando células desidratadas e de menor tamanho, que se dizemplasmolisadas.I A - Observação em células epidérmicas de Allium cepa (n. v. cebola)1. Cortar uma cebola e, com uma pinça, puxar um pedaço de uma escama delgada etransparente do interior do bolbo.2. Deitar uma gota de água sobre a lâmina e colocar nela um fragmento da escama de cebola.Cobrir com uma lamela.3. Observar com a obj. de 10x que não se verificam alterações nas células e seleccionar ocampo de observação mais favorável.4. Após ter verificado este fenómeno de isotonização, fazer penetrar por difusão uma soluçãode sacarose 1 M (solução hipertónica) com o auxílio de papel de filtro e de uma pipeta (nãoesquecer que a imagem final obtida no microscópio é invertida). Lentamente, verifica-seuma exosmose e dá-se o fenómeno de plasmólise; observar também com a obj. de 40x.5. Em seguida, pelo mesmo processo de difusão, retirar a solução de sacarose e fazer penetrarágua (sol. hipotónica). Verifica-se uma endosmose e dá-se o fenómeno de desplasmólise.I B - Observação em eritrócitos humanos in vitro1. Limpar a polpa do dedo indicador com algodão embebido em álcool; deixar secar ao aragitando o dedo; colocar o dedo para baixo e garroteá-lo com a outra mão, de modo aaumentar a quantidade de sangue na polpa do dedo.

2. Utilizando uma lanceta estéril, fazer a colheita de uma gota de sangue, a qual sem perda detempo, se coloca entre lâmina e lamela numa gota de sol. de NaCl 0,9% (soro fisiológico).3. Focar primeiro com as obj. de 4x e de 10x e observar com a obj. de 40x.4. Repetir 2 e 3 utilizando uma solução de NaCl 1,5% (sol. hipertónica). Os glóbulosvermelhos tornam-se globosos e eriçados – plasmólise (Fig. 11)Fig. 11 - Eritrócitos na presença de diferentes concentrações de NaCl.5. Repetir o procedimento utilizando NaCl 0,6%. A célula aumenta de volume devido a umaendosmose, mas a pressão exercida no interior da célula não é suficiente para a fazerrebentar, verificando-se o fenómeno de turgidez celular (Fig. 11).6. Com uma solução de NaCl 0,4%, a quantidade de água que penetra no interior da célulaexerce uma pressão que faz romper a membrana celular, libertando a hemoglobina e ficando

a célula mais pálida e transparente, designada vulgarmente por fantasma. (O meio que arodeia apresenta-se com uma tonalidade avermelhada.) Contudo, a célula mantém a suaforma circular, devido à presença do citosqueleto submembranar, que é responsável pelaforma dos glóbulos. O fenómeno de lise celular em glóbulos vermelhos designa-se porhemólise (Fig. 11).Nota: Na célula vegetal não se verifica a lise celular pelo facto de possuir uma parede celularque, não só confere protecção à célula, como faz com que ela suporte pressões elevadas.

6ª aula prática laboratorial (II – parte)III - Preparações definitivas com inclusãoInclusão é uma das etapas da técnica, que consiste em colocar a peça citológica num blococonstituído por uma substância protectora e de suporte, que permita efectuar facilmente o corte.Preparações definitivas com inclusão (técnica usual de microscopia óptica)Etapas:1. Colheita – Cortar em pequenos pedaços, com o auxílio de material de dissecção, o materialbiológico a fixar.2. Fixação - Depois da colheita, a peça deve rapidamente ser colocada no fixador para seevitar a autólise e aí permanecer durante algumas horas e, em certos casos, alguns dias ousemanas (em formol, as peças são preservadas indefinidamente). Se necessário, efectua-seuma descalcificação - é a dissolução dos sais de cálcio que se encontram, por exemplo, nosossos e no exosqueleto de muitos animais.3. Desidratação - Consiste em substituir a água das células e dos espaços extracelulares de umtecido por um solvente miscível com o solvente do meio de inclusão. Em MO compreendeuma passagem pela série ascendente dos álcoois (por ex., 50°, 70°, 90°, 95°, 100°I, 100°II,xilol I e xilol II), cujo tempo de passagem varia, de igual modo, com vários factores.Vulgarmente, usa-se 30 a 60 minutos em cada passo. Como nos passos seguintes se utiliza aparafina, que é insolúvel em água mas solúvel em certos compostos orgânicos, é necessárioterminar a desidratação com 2 banhos de xilol para substituir o etanol por este solvente daparafina.

4. Impregnação - A impregnação consiste em impregnar os espaços intra- e extracelulares comparafina. Para isso, inicia-se a impregnação com um banho de 1 a 2 horas de duração numamistura de xilol/parafina (1:1) à temperatura de 55°C (a parafina só fica líquida a estatemperatura). De seguida, a peça histológica é imersa em parafina pura, à mesmatemperatura, efectuando-se dois banhos de 1 a 2 horas cada.5. Inclusão - Nesta etapa é habitual efectuar-se o registo do material processado, ao qual éatribuído um número para posterior identificação. Para se incluir a peça histológica numbloco de parafina utilizam-se moldes especiais, os moldes de Leuckart, que se enchem comparafina líquida, nos quais se introduz a peça histológica e, por último, uma etiqueta. Aparafina à temperatura ambiente solidifica e a peça fica assim totalmente incluída naparafina. Nesta etapa procede-se à separação do molde e o bloco fica em condições depermanecer armazenado (até por anos, se for caso disso) até se proceder à etapa seguinte, ocorte.6. Corte - É efectuado por meio de uma faca de aço ou de uma lâmina colocada num aparelhoespecial chamado micrótomo de Minot, no qual se regula a espessura do corte, de acordocom a natureza do tecido e do estudo que se pretende realizar. Na maior parte dos casosutiliza-se o corte com 7 a 8 μm de espessura.7. Colagem - As secções são coladas numa lâmina de vidro lavada e desengordurada. Acolagem efectua-se numa platina aquecida entre 40° e 50°C, utilizando-se água albuminadacomo cola.8. Secagem - De seguida as lâminas são colocadas na estufa a 40°C durante 1 a 2 dias paracompletarem a secagem.9. Desparafinação - Como os corantes são, de um modo geral, hidrossolúveis, as secções têmde sofrer uma sequência de tratamentos que culmina na sua hidratação. O passo inicialconsiste em retirar a parafina. Para este efeito, as lâminas são mergulhadas numa tina deranhuras com xilol, durante 10 minutos.10. Rehidratação - Os cortes são transferidos de tina em tina, percorrendo a série descendentedos álcoois até ao álcool a 50°, durante 3 minutos em cada passo. Por fim, são colocados emágua destilada durante 5 minutos.

11. Coloração - Depois de o material estar bem rehidratado, procede-se à coloração por meio decorantes aquosos. Se o corante for alcoólico deve-se proceder à rehidratação até ao grau daescala do álcool correspondente à riqueza alcoólica do corante.Geralmente, utiliza-se a associação de dois corantes aquosos: as lâminas contendo os cortessão colocadas em tinas de ranhuras contendo hemalúmen (de cor azul arroxeada) durante10 a 15 minutos. Segue-se uma lavagem em água corrente durante cerca 5 minutos. Depoiscoram-se nas mesmas condições com a eosina (de cor avermelhada) durante 2 a 3 minutos,seguindo-se uma lavagem durante cerca de 5 minutos.12. Desidratação - Uma vez corados os cortes, estes têm de sofrer um determinado tratamentoque lhes permita serem conservados indefinidamente, o que se consegue através da adiçãode uma resina transparente. Esta substância é hidrofóbica, logo os cortes têm de serdesidratados (série ascendente dos álcoois) até ao álcool a 100°, durante 1 minuto em cadapassagem. Por fim, os cortes são diafanizados, o que significa conferir transparência, comxilol durante 3 minutos.13. Montagem - Após a diafanização, os cortes são cobertos com uma gota do meio demontagem (resina) podendo ser bálsamo do Canadá ou DPX e, por fim, coloca-se umalamela. O índice de refracção do meio de montagem tem de ser igual ao do vidro.

14. Secagem, Lutagem e Etiquetagem – Para a preparação histológica secar mais rapidamente écolocada na estufa a 40°C, durante 24 horas, para que o meio de montagem endureça. Alutagem é uma etapa muitas vezes não efectuada, que consiste em cobrir os bordos dalamela com um meio totalmente impermeável ao ar. Usa-se geralmente verniz ou betume.Para finalizar, coloca-se num dos lados uma etiqueta, na qual se identifica o material, afixação e a coloração utilizadas. As preparações devem ser guardadas ao abrigo dahumidade e da luz.As etapas da técnica usual da MO irão ser observadas e explicadas através de um filme.Numa das aulas práticas serão executadas as etapas 7 a 14.

CITOLOGIA CLÍNICA 

O exame citológico é uma das grandes ferramentas para auxiliar o médico veterinário no diagnóstico, prognóstico e na tomada de decisões frente a casos clínicos.A citologia oferece inúmeras vantagens, uma vez que as técnicas de obtenção do material são muito simples, de baixo custo e muitas vezes proporciona resposta diagnóstica rápida, porém como toda técnica, nem sempre o parecer é definitivo.A grande maioria dos exames citológicos deve ser confirmada por exame histopatológico, devido à possibilidade do material colhido ser pouco representativo e também há restrições quanto à avaliação prognóstica, pois tal exame avalia somente as características de células isoladas ou em blocos, ao passo que o exame histopatológico permite avaliar a arquitetura do tecido como um todo, ou seja, a inter-relação entre células, demonstrando grau de invasividade e avaliação de margens cirúrgicas, para exemplificar: obtenção de amostra somente do componente inflamatório de uma neoplasia infectada por bactérias.

 

 

Há três grandes modalidades de obtenção de material para exame citológico:

Citologia Esfoliativa:Consiste em remover as células mais superficiais da lesão através de esfoliação (raspagem), sendo indicada para avaliação do processo de maturação (diferenciação) de epitélios, para caracterização de tipos de exsudatos ou para visualização de agentes infecciosos ou mesmo parasitários. Esta técnica é usada, por exemplo, na determinação da fase do ciclo estral de cadelas, de processos inflamatórios uterinos, habronemoses, etc.

Citologia por Decalque ("imprint"):Tal modalidade também baseia-se na remoção de células superficiais de uma lesão ou da superfície de corte de um órgão, através do contado da superfície em questão com a de uma lâmina de microscopia. É uma técnica muito utilizada em sala de necrópsia para confirmação diagnóstica de suspeitas levantadas à macroscopia, com resposta rápida.

Citologia Aspirativa por Agulha Fina:Neste método há remoção das células da lesão pela avulsão promovida através da utilização de uma agulha fina (30 mm x 0,7 mm ou 22G). Com esta técnica podemos obter células de vários planos do tecido.A citologia aspirativa por agulha fina é, sem dúvida, mais interessante que as técnicas anteriores, pois recolhe material muito mais representativo de lesões profundas.

Devemos seguir algumas regras básicas para obtenção de bons resultados através da citologia:

Histórico detalhado: Estas informações são muito importantes, pois indicam o tempo de instalação do processo, como foi o início da lesão, etc.... Estes dados são muitas vezes fundamentais para determinação de diagnósticos diferenciais ou para comentários relativos aos possíveis diagnósticos.

Descrição da lesão: Uma boa descrição da lesão, como localização precisa do processo e tipo de lesão (nodular, ulcerativa, etc.), auxilia sobejamente o sucesso diagnóstico e permite correlacionar achados citológicos com a lesão macroscópica;

Técnica de colheita: Este é um dos passos mais importantes para realização da citologia diagnóstica e freqüentemente desconhecido. Uma técnica de colheita inadequada pode impedir a conclusão do caso, pois a amostra colhida deve necessariamente possuir células características da lesão em questão.

Extensões adequadas: No exame citológico as extensões devem ser feitas seguindo-se os seguites cuidados:a) não comprima o material - especialmente no caso de suspeitas de tumores, pois as células neoplásicas são muito frágeis;b) produza extensões delgadas, evitando sobreposição de várias camadas de células, pois a sobreposição impossibilita a coloração e visualização adequada do material;c) No caso de extensões que serão coradas por corantes hematológicos, desidrate o material, por movimentação ao ar (abane), o mais rápido possível. Não guarde as lâminas úmidas, pois isto causa degeneração celular inviabilizando o resultado.

Técnica de obtenção de material por Citologia Aspirativa com agulha fina:

Material Necessário:a) Anti-séptico;b) Seringa plástica descartável de 10 a 20 ml;c) Agulhas 30 mm x 0,7 mm ou 22 G;d) Lâminas para microscopia limpas e desengorduradas com álcool;e) Porta lâminas;f) Ficha de solicitação de exames. 

Preparo do paciente:Tratando-se de lesões palpáveis não há necessidade de preparos especiais para o paciente, sendo a antissepsia o único procedimento necessário.Lembre-se que a antissepsia é um processo requerido na citologia aspirativa e deve ser ponderado na citologia por esfoliação, pois se deseja-se visualizar o tipo de exsudato ou agente infeccioso, estes poderão ser removidos durante a limpeza do local.Em muitos casos de suspeita de neoplasias ou processos inflamatórios crônicos não há necessidade de sedação uma vez que os pacientes freqüentemente não demonstram qualquer incômodo durante ou após o procedimento. A dor pode ocorrer nos processos inflamatórios agudos, onde os anestésicos locais não surtem efeito e como a técnica para obtenção do material é relativamente rápida, geralmente uma contenção física eficaz traz ótimos resultados.

Obtenção do material:A. Realize a contenção física do paciente de maneira adequada e promova a antissepsia;B. Acople a agulha à seringa;C. Fixe a lesão com os dedos indicador e médio;D. Mantenha o êmbolo da seringa na posição ZERO.E. Introduza a agulha na lesão;

  

  F. Promova uma forte pressão negativa no interior da seringa e mantenha-a;G. Promova com a agulha movimentos de "vai e vem" na lesão e em

diversos planos diferentes, mantendo a pressão negativa;  

  CUIDADO: Se por acaso, a agulha sair da lesão, descarte esta agulha e recomece o procedimento escolhendo outro ponto para punção.

ATENÇÃO: Sangue no canhão da agulha ou na seringa não deve ser encarado como sinônimo de boa colheita, pois elementos sangüíneos podem diluir as células que representam o processo.

H. Solte o êmbolo da seringa desfazendo a pressão negativa;I. Retire a seringa e agulha da lesão;

  

  J. Desacople a agulha da seringa;K. Preencha a seringa de ar e acople novamente a agulha;L. Com o orifício do bisel da agulha voltado para lâmina de microscopia, empurre o êmbolo depositando o conteúdo contido na agulha contra esta. Faça isto na porção central ou em um dos quartos da lâmina;  

  ATENÇÃO: O material contido na agulha é suficiente para o diagnóstico. A presença de sangue no material causa diluição da amostra, muitas vezes tornando o exame inconclusivo.

M. Promova a extensão encostando uma lâmina extensora a 45º;

 

  N. Não estenda o material até o final da lâmina.  

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EsfregaçoOrigem: Wikipédia, a enciclopédia livre.

Esfregaço é uma leve camada de matéria orgânica sobre uma lâmina de vidro, para

exame microscópico.

A técnica do esfregaço que é utilizada para material que se encontra formado por

células isoladas, como por exemplo as células da mucosa bucal. Esta consiste em

espalhar uma gota do material biológico a observar sobre uma lâmina de vidro

formando uma fina película para uma melhor observação ao microscópio, que mais

tarde pode ser submetida a uma coloração para evidenciar alguns constituintes desse

material a ser visualizado.

Este artigo sobre Biologia é um esboço. Você pode ajudar a Wikipédia expandindo-o.

Esfregaço é um material que pode ser papel filtro ou não tecido, usado para realizar

amostragens de contaminações radioativas em superficies de áreas ou locais onde se

manipularam fontes radioativas, e que por algum motivo ou devido a suas grandes

dimensões, não podem ser medidas diretamente com detector de radiação. O

esgregaço é utilizado como uma medida indireta, e após realizado em uma área de

aproximadamente 100 cm2, é levado para um detector de radiação, onde o nível de

contaminação presente é considerado com sendo em média 10% da contaminação

presente na área amostrada.

Técnicas de colheita de material para exame citopatológico

1. ImpressãoTécnica: remover o excesso de secreção, sangue ou fluido com papel

absorvente. Tocar a lâmina com o tecido a ser examinado, várias vezes em locais diferentes da lâmina. Ser rápido em todos os passos (é

fundamental) Secar imediatamente (secador, agitação), corar e examinar. Fazer mais de uma lâmina. 

Indicações: É indicada para lesões ulceradas e tecidos obtidos de cirurgias e necropsias.

Vantagens: técnica fácil e que necessita de equipamento mínimo.Desvantagens: a amostra obtida é pouco celular (relativamente), obtém

apenas as células superficiais e pode exibir elevada contaminação bacteriana e celular.

2. Suabe (“swab”)Técnica: umedecer o suabe com soro fisiológico (ou não, se a lesão for

muito úmida). Esfregar o suabe sobre a região a ser examinada. Rolar (não esfregar) o suabe sobre a lâmina. Secar imediatamente, corar e

examinar.Indicações: É indicado para superfícies epiteliais, tratos fistulosos e onde

as outras técnicas não se aplicam.

3. RaspagemTécnica: remover o excesso de sangue e fluido. Raspar a lesão com a lâmina do bisturi perpendicular à lesão até obter material suficiente.

Espalhar o material na lâmina pela técnica do esfregaço ou do deslizamento. Secar imediatamente, corar e examinar

Indicações: É indicada para lesões externas de pele e mucosas e tecidos excisados (lesões firmes).

Vantagens: obtenção de grande quantidade de células (maior probabilidade de diagnóstico preciso)

Desvantagens: obtenção somente de células superficiais, é mais difícil que outras técnicas e existe grande contaminação bacteriana e celular

4. Biópsia aspirativa por agulha finaIndicações: Indicada para qualquer tipo de lesão, órgão ou tecido que

possa ser atingido por uma agulha introduzida desde a superfície.Vantagens: não há contaminação superficial, são colhidas células de vários locais da lesão (maior representatividade), permite colheita

asséptica (para microbiologia) e é praticamente indolorDesvantagens: necessita maior contenção (física ou química) do paciente,

existe risco de hemorragia local e existe risco de induzir metástases (teoricamente – ainda não foi comprovado)

Técnica: utilizar seringa de 10 ml com agulha 30 x 7.

1- Colocar 2 ml de ar na seringa. 2- Introduzir a agulha na lesão, puxar e segurar o êmbolo e movimentar a agulha para frente e para a traz, várias vezes (10-12) no interior da lesão, rapidamente e em várias direções, enquanto se mantém a pressão negativa na seringa e sem removê-la do tecido. 3-Soltar o êmbolo, remover a agulha do tecido e expelir o conteúdo na lâmina. 4- Espalhar o material, secar imediatamente, corar e examinar.

Nota 1 : a rapidez em todos os passos é ESSENCIAL

Nota 2: para coloração citológica Papanicolau ( uma das melhores colorações citológicas) é necessário que, imediatamente após espalhar o

material obtido sobre a lâmina de vidro, a amostra seja fixada com fixador citológico ou com álcool 70 – 90%.

Muito importante: após fixado com álcool ou o fixador citológico o material contido na lâmina dura até cinco dias sem coloração. Dessa

maneira o clínico/proprietário terão maior prazo de tempo para enviar o material ao laboratório.

5. Aspirados de fluidos cavitáriosTécnica: a colheita do líquido não requer técnica especial. Espalhar o material colhido pela técnica do esfregaço. Secar, corar e examinar.

Indicações: É indicado para coleções de fluidos em cavidades naturais ou neoformadas.

Vantagens: é muito representativa.Desvantagens: pode ser muito pobre em células (neste caso, centrifugar) e

pode coagular (usar seringa com anticoagulante).

Técnicas para espalhar (fazer a extensão) o material colhido nas lâminas:Pontos muito importantes a considerar: o maior interessado no resultado

do exame é o clínico. Uma lâmina mal feita é irreparável e pode impossibilitar o diagnóstico. A limpeza das lâminas é muito importante

(cuidado com lâminas engorduradas!). Sempre manusear as lâminas pelas bordas (evitar marcas de dedos – células epiteliais), muitas vezes os

dedos estão sujos de manusear o próprio paciente. A rapidez é ESSENCIAL (os artefatos ocorrem muito rapidamente).

1- Técnica do esfregaço: exatamente igual ao esfregaço sangüíneo. Coloca-se uma segunda lâmina em ângulo de 45° sobre o material

expelido na primeira lâmina e desliza a lâmina inclinada sobre a outra rapidamente. O material a ser examinado concentra-se nas bordas do

esfregaço

2- Técnica do deslizamento das lâminas: colocar uma segunda lâmina longitudinal ou transversalmente sobre a primeira. Caso existam grumos, bastam pequenos toques com o dedo sobre a lâmina para comprimi-los.

Afastar uma lâmina da outra em direções contrárias (resultam duas amostras). Não comprimir ao espalhar o material (só o peso da lâmina é o

suficiente). O material a ser examinado espalha-se uniformemente pela lâmina.

3- Técnica do esmagamento: usada apenas para material que contenha grumos (secreções de tratos fistulosos com infecção por certos fungos ou

certas bactérias). Colocar uma segunda lâmina sobre a primeira contendo o material. Usar pressão suficiente para desfazer os grumos. Espalhar o

material pela técnica do deslizamento.

4- Outras formas (alça, agulha e suabe): Utilizando alça de microbiologia (ou qualquer outro instrumento similar): o material é espalhado com

movimentos circulares. A distribuição do material é proporcional em toda a lâmina.

Utilizando a própria agulha de biopsia: utilizar a extremidade ou a lateral da agulha e arrastar o material do centro para a periferia.

Utilizando o Suabe: rolar o suabe sobre a lâmina

Técnicas de coloração para exame citológico1. Colorações tipo Romanowsky (Panóptico, Diff-Quick, Wright, May-

Grumwald-Giemsa (MGG) ): são baratas, fáceis de preparar, guardar e usar. Coram bem microorganismos e o citoplasma. Coram mal os

núcleos, mas o suficiente para avaliar critérios de malignidade. Particularidades: Panóptico Diff-Quick: não cora bem grânulos de

mastócitos (problema)May-Grunwald-Giemsa: é a melhor delas (é um pouco mais complicada)

TODAS necessitam fixação ao ar (rápida!!!)2. Papanicolaou: é demorada e complicada, mas é a rainha das colorações

para citologia. Ótima coloração de núcleos e citoplasma. Ótima para avaliar critérios de malignidade. Permite enxergar os núcleos mesmo em

grumos grandes de células. Necessita fixação com álcool 70 a 90% ou fixador citológico !!!!

3. Novo Azul de Metileno: muito fácil de utilizar. Cora mal o citoplasma, mas cora muito bem o núcleo e permite avaliar detalhes nucleares. Cora

bem grânulos de mastócitos

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http://www.werner.vet.br/html/recom-02.htm

http://pt.wikipedia.org/wiki/Esfrega%C3%A7o

PRÁTICA DA UTILIZAÇÃO DO MICRÓTOMO

Alexandre Pereira

1

, Aline Helena Araujo Machado

2

, Fernanda Maria Prado

Braga

3

, Gabriela de Barros Ferreira

4

, Karina Carvalho de Oliveira

5

, Renato

Amaro Zângaro

6

, Marcos Tadeu Tavares Pacheco

7

.

1-5 Faculdade de Ciências da Saúde (FCS)

Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Brasil, 12244-000

Fone: +55 12 3947 9999, Fax: +55 12 3947 9999

6-7 Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D),

Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Brasil, 12244-000

Fone: +55 12 3947 9999, Fax: +55 12 3947 9999

alexhh@bol.com.br, alineharaujo@aol.com, fefelelezinha@ig.com.br, bibigabi02@yahoo.com.br,

kakacoliveira@bol.com.br, zângaro@univap.br, mtadeu@univap.br

Palavras-chave: micrótomo, cortes histológicos, citologia, histologia.

Área do Conhecimento: Ciências biológicas.

Resumo - O projeto visa o conhecimento da prática da microtomia, que consiste basicamente em

obter cortes sucessivos dos blocos de parafina contendo fragmentos de órgão. Quando o

micrótomo está regulado e com todas as etapas de histologia realizadas de forma adequada,

ocorrem cortes com exata precisão. O conhecimento prático da utilização do micrótomo é

importante para identificar as falhas que comumente ocorrem na obtenção dos cortes histológicos.

Introdução

Micrótomo é um aparelho destinado

a cortar blocos de tecido. A Microtomia

consiste basicamente em obter cortes

sucessivos dos blocos de parafina contendo

fragmentos de órgão. É extremamente

importante na microtomia que a faca esteja

muito bem afiada. Existe também a opção de

utilizar para a microtomia lâminas

descartáveis em vez de facas.

Os micrótomos tem um mecanismo

pelo qual se pode controlar a espessura dos

cortes a serem obtido. Com raras exceções,

quanto mais fino o corte, melhor os

resultados. Em geral trabalha-se com cortes

entre 5 µm e 7 µm.

Ocasionalmente algumas técnicas exigem

cortes entre 10 µm à 15 µm. Os cortes assim

obtidos são dispostos em lâminas de vidro.

Há micrótomos para cortes de blocos

de parafina, de congelação e criostático.

Micrótomo de Parafina (Rotativo)

É um aparelho destinado a cortar

blocos de tecido incluídos em parafina ou

celoidina.

Os cortes poderão ter espessura

mínima de 1 µm, sendo que na prática

diária, são cortados com 5 µm de espessura.

Aplicações

A correta observação do material

biológico, em microscopia fotodinâmica,

implica uma série de procedimentos técnicos

prévios.

Estes procedimentos denominam-s e

técnicas histológicas, que são as seguintes:

Fixação

É o processo empregado com a

finalidade de se evitar que as células sejam

destruídas por suas próprias enzimas ou pela

ação das enzimas de bactérias

decompositoras. As substâncias que

executam o processo de fixação são

denominadas fixadores, e têm como principal

função desnaturar as proteínas e insolubilizá-

las, de modo a tornarem o tecido a ser

estudado mais rígido e com as suas

características estruturais preservadas.

Inclusão e corteVIII Encontro Latino Americano de Iniciação Cientifica e

IV Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba

180

Denomina-se inclusão ao

procedimento que tem como finalidade

impregnar os tecidos com uma substância de

consistência firme que permita, em etapa

posterior cortá-los em fatias finas para depois

corá-los, possibilitando assim a sua

visualização no microscópio.

Pelo fato de ser mais simples e dar

bons resultados, a quase totalidade das

inclusões é feita em parafina. A inclusão

conta de várias etapas: desidratação.

diafanização e impregnação.

Desidratação

A desidratação visa à substituição da

água ou do solvente aquoso do fixador por

um solvente não polar.

Diafanização

A clarificação tem como objetivo

remover o álcool, que substituíra a água no

interior dos tecidos, por um solvente que

seja, ao mesmo tempo miscível com álcool e

com a parafina.

Impregnação, Coloração e

Montagem

O xilol é substituído por parafina

fundida a 60°C.

A coloração tem por finalidade

aumentar o contraste entre os diferentes

elementos constituintes do tecido. A maioria

dos corantes comporta-se como base ou

ácido.

Objetivo

Conhecer a prática da utilização do

micrótomo, a identificação de suas limitações

e realizar cortes histológicos.

Materiais

Inclusora;

Banho-Maria;

Microscópio;

Parafina;

Amostra tecidual (fígado de rato);

Micrótomo.

Metodologia

Coletou-se uma amostra do material

a ser analisado.

Foram-se obtidos fragmentos do

tecido colhido, onde foram aparados para a

fixação.

Após a fixação do material, o mesmo

foi submetido a um processo de desidratação

crescente de álcool.

Realizou-se o processo de inclusão

em parafina e após um certo tempo obtevese blocos de parafina.

A seguir, esses blocos foram

colocados no micrótomo e obteve-se cortes

histológicos sucessivos.

Logo após, esses cortes foram

colocados em banho-maria a 37°C e

distendidos em lâminas para secagem.

Retirou-se a parafina do material com

o auxílio do Xilol, onde a amostra foi

submetida à hidratação em concentrações

decrescente de álcool.

O material submeteu-se a coloração

por hematoxilina.

Após desidratação em concentrações

crescente de álcool, o material está pronto

para ser analisado.

Resultados

Num total de 100 secções obtivemos

10 lâminas que apresentaram resultados

satisfatórios para sua posterior observação

microscópica. Utilizamos como material de

análise fígado de rato onde foi submetido a

cortes com espessuras que variam de 3 µm à

5 µm, onde o tamanho ideal para corte neste

tipo de tecido é de 3 µm devido sua

característica de coloração.

A espessura de corte e o tipo de

coloração varia conforme o tipo de tecido e

para qual finalidade ele está sendo

analisado.

Conclusão

Podemos concluir que quando o

micrótomo está regulado e com todas as

etapas de histologia realizadas de forma

adequada, ocorrem cortes com exata

precisão. Das 100 secções realizadas 10

lâminas foram preparadas onde seus cortes

variaram de 3 µm à 5 µm .

O micrótomo é útil para obtenção dos

cortes histológicos, porém, algumas

limitações são encontradas no

desenvolvimento desta técnica que

atribuímos ao aparelho, a parafina, com

http://www.inicepg.univap.br/cd/INIC_2004/trabalhos/inic/pdf/IC2-28.pdf