AÇÃO DE FORMAÇÃO:

Aplicações da biotecnologia na determinação

da filogenia e no melhoramento de plantas

Formadoras: Professora Doutora Maria Susana Pereira

Professora Doutora Maria João Balça

Formanda: Maria de Fátima Ferreira da Silva Henriques

junho de 2013

FORMAÇÃO CONTÍNUA DE PROFESSORES

INTRODUÇÃO

O Tema Central do Programa de Biologia do 12º ano é “ A Biologia e os desafios da

atualidade”. A Unidade 2 é centrada no estudo dos genes e das possibilidades de intervenção

biotecnológica ao nível dos mesmos.

No âmbito desta intervenção são abordadas diversas técnicas de Engenharia Genética,

muitas das quais não podem ser postas em prática nas Escolas por falta de materiais e

equipamentos. A situação é especialmente preocupante considerando a importância atribuída

pelo próprio Programa ao trabalho laboratorial.

Na Escola onde exerço funções, o material existente para o trabalho laboratorial na área da

Engenharia Genética limita-se a duas tinas de eletroforese e alguns materiais que as

acompanhavam em Kits Biogénius, já utilizados. Daí a opção pela realização de um trabalho de

eletroforese de corantes alimentares. Os únicos materiais a adquirir serão os corantes

alimentares, de fácil aquisição.

Apesar da simplicidade do trabalho a desenvolver, este permitirá um primeiro contacto dos

alunos com uma das técnicas de Engenharia Genética estudadas e pode ser explorado sob

diferentes perspetivas, como por exemplo: assumindo que os corantes e as misturas dos

mesmos correspondem a produtos de PCR (polymerase chain reaction), que após separação

eletroforética revelam uma ou duas bandas, podem ser identificados indivíduos homozigóticos e

heterozigóticos relativamente a um determinado locus; assumindo que foi utilizada a técnica

RFLP (restriction fragment length polymorphism) podem-se identificar mutações num gene;

podem também ser realizadas simulações de testes de paternidade; podem ser criados

cenários de resolução de crimes, ou proceder à avaliação do efeito da concentração do gel em

agar na deslocação de fragmentos de DNA numa eletroforese.

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PLANO DE AULA

Disciplina: Biologia Ano: 12º Duração: 90+90

Sumário: Realização da atividade laboratorial: CSI na sala de aula

Unidade 2: Património genético

Fundamentos de engenharia genética

Conteúdos/Objetivos:

Conhecer técnicas utilizadas na Biotecnologia e na Biologia Molecular.

Compreender os princípios e características básicas da eletroforese.

Desenvolver competências metodológicas.

Desenvolver competências e raciocínio científico.

Incentivar o interesse pela Biotecnologia.

Desenvolver atitudes positivas face à Ciência.

Conceitos: Eletroforese / Polimorfismos / DNA / PCR / DNA fingerprint

Estratégias:

Análise das potencialidades das técnicas de PCR e eletroforese (já abordadas em aulas

anteriores) e a sua aplicação às ciências forenses;

Apresentação da situação problema;

Realização da atividade laboratorial de acordo com o protocolo experimental.

Recursos: Guião da atividade “Os peixes roubados - CSI na sala de aula”.

Avaliação:

Avaliação formativa- Participação na aula, atitudes e conhecimentos demonstrados na

concretização das atividades.

Questões de discussão da atividade, incluídas no protocolo experimental.

Os peixes roubados - CSI na sala de aula

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Na escola, os alunos e professores têm no laboratório um aquário repleto de peixes exóticos.

Numa noite a escola foi assaltada e, para surpresa de todos, os peixes foram roubados! Mas o ladrão foi desastrado e bateu numa esquina do aquário que se partiu e o magoou tendo ficado sangue no vidro.

Nessa noite, o guarda durante as rondas viu e identificou à volta da escola quatro indivíduos. São por isso os principais suspeitos do assalto.

Como descobrir qual deles roubou os peixes?

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que

envolve a migração de partículas num determinado gel, durante a aplicação de

uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com a sua

carga e com o seu tamanho. Assim, as de carga negativa irão migrar para o

pólo positivo e as de carga positiva para o pólo negativo e as de menor massa irão migrar mais

rapidamente do que as de maior massa.

Na preparação do gel para a eletroforese, pode ser utilizada a agarose, polissacarídeo que

forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Pode igualmente ser utilizado o

agar, mistura de polissacarídeos, mais acessível do ponto de vista económico. Dependendo da

concentração do gel, obtêm-se diferenças no gradiente de separação.

A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

Neste trabalho vamos proceder à separação de moléculas constituintes de corantes

alimentares, que simulam produtos de PCR, resultantes da amplificação de um marcador

genético a partir do DNA recolhido na cena de crime e dos quatro suspeitos desse crime. O

referido marcador genético é um dos utilizados na técnica de DNA fingerprint.

Material necessário:Para a tina de electroforese Para as soluções Para as amostras

Tina (com tampa)

Tabuleiro

Pente

Elétrodos( fio vermelho e fio

preto)

5 pilhas de 9 V

Fita cola

Tampão TBE (10x )

Agar

Água destilada

Gobele

Balança

Placa de aquecimento

Proveta de 50 e 250 ml

Suporte para tubos

Micropipeta e pontas amarelas

Corantes alimentares:

Amostra 1 – DNA recolhido na

cena do crime

Amostra 2 – DNA do suspeito 1

Amostra 3 – DNA do suspeito 2

Amostra 4 – DNA do suspeito 3

Amostra 5 – DNA do suspeito 4

Procedimento:

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I. Preparação do gel de agar a 0,8 % em TBE 1X

1. Prepare 150ml de solução tampão TBE 1X, a partir da solução tampão TBE 10X fornecida.

2. Coloque 50 ml da solução tampão TBE 1X num gobelé. Será este o volume utilizado para a

preparação do gel.

3. Proceda à pesagem do agar necessário para a preparação do gel e coloque-o no gobelé

com os 50ml de solução tampão TBE 1X e agite para diluir um pouco.

4. Coloque o gobelé com a solução sobre a placa de aquecimento até à ebulição. Deve agitar

de vez em quando e terminar o aquecimento assim que a solução fique transparente.

5. Deixe arrefecer até aos 60ºC, aproximadamente (até conseguir segurar o gobelé nas mãos,

sem se queimar).

6. Vede com fita-cola os dois lados abertos do tabuleiro do gel que vem dentro da tina.

7. Coloque o tabuleiro numa bancada plana e verta com cuidado a solução de agar já

arrefecida.

8. Coloque imediatamente o pente a cerca de 3 cm de distância do fundo do tabuleiro e

paralelo ao mesmo.

9. Aguarde cerca de 30 min, até o gel estar totalmente solidificado.

10. Remova o pente para cima, perpendicularmente para não destruir os poços.

11. Retire cuidadosamente a fita-cola e coloque o tabuleiro com o gel dentro da tina, com os

poços para o lado do elétrodo preto (pólo negativo).

12. Verta, cuidadosamente, tampão TBE 1X para dentro da tina até cobrir todo o gel e o

nível deste atingir cerca de 1 mm acima do gel. Todos os poços devem ficar cheios de

tampão.

II. Preparação da corrida eletroforética

1. Carregue cada um dos poços do gel com uma das amostras de corante, utilizando a

seringa e uma ponta diferente para cada amostra. Identifique cada poço tendo em conta a

amostra de corante utilizada.

2. Ligue os cabos, colocando o cabo vermelho no terminal vermelho da tina (pólo positivo) e o

cabo preto no terminal preto (pólo negativo). Ligue a outra extremidade dos cabos às pilhas

e verifique se há passagem de corrente (nos elétrodos deverão começar a libertar-se

pequenas bolhas principalmente do lado dos poços).

3. Deixe a eletroforese decorrer até que os corantes cheguem a aproximadamente 2 cm do

final do gel. Deverá demorar 4 a 5 horas.

4. Desligue os elétrodos, retire o tabuleiro com o gel da tina e observe os resultados.

III. Registo e discussão de resultados

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1. Registe os resultados obtidos no esquema abaixo.

2. Identifique a carga das moléculas presentes em cada uma das amostras.

3. Das amostras (de corantes) utilizadas indique a(s) que apresenta(m) as moléculas…3.1. de menor tamanho.3.2. de maior tamanho.

4. Se em vez de corantes alimentares tivéssemos realizado a eletroforese de DNA, o pente deveria ser colocado mais perto do pólo negativo. Justifique este procedimento.

5. A separação dos produtos de PCR dos quatro indivíduos revelou para alguns, uma banda e para outros, duas bandas. Refira o que se pode concluir com base nestes resultados.

6. Indique, de acordo com os resultados obtidos, qual dos suspeitos poderia ser o criminoso.

7. Avalie, justificando, o grau de fiabilidade da resposta anterior.

8. Explique o que é um marcador genético.

9. Os marcadores genéticos utilizados na técnica de DNA fingerprint dizem respeito a zonas codificantes do genoma com grande variabilidade. Comente a afirmação.

10. De que forma se poderia estimar o tamanho dos fragmentos de DNA?

11. Se tivéssemos utilizado DNA, qual o procedimento adicional a realizar para se proceder à observação das bandas?

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pólo -

pólo +

Amostras

CONCLUSÃO

O trabalho apresentado revela-se de grande importância para a compreensão de algumas

técnicas usadas na Biologia Molecular, bem como das suas aplicações em diferentes áreas.

Apesar de ser uma simulação, utilizando corantes e não DNA, as amostras de corantes

utilizadas são misturas de corantes com diferentes cores, apresentando as amostras 1 e 4 a

mesma combinação de corantes, surgindo assim o mesmo padrão de bandas na eletroforese, à

semelhança do que poderia acontecer numa situação real.

Em contexto de sala de aula, a situação ideal, no entanto, seria explorar com os alunos a

situação problema de modo a que eles próprios elaborassem o desenho experimental, uma vez

que o próprio Programa atribui especial importância ao desenvolvimento de atividades que

impliquem os alunos na planificação de percursos experimentais (com manipulação e controlo

de variáveis e decisão sobre a utilização de réplicas).

O trabalho realizado apesar de simples é pertinente pelas conclusões a que permite chegar

e revela-se útil no desenvolvimento de competências diversificadas, contribuindo para integrar

as dimensões teórica e prática da Biologia, assim como o trabalho cooperativo entre os alunos.

Caberá ao professor decidir o grau de abertura das tarefas, ponderando as competências

que os alunos já possuem, o tempo e os recursos disponíveis.

Esta ação revelou-se de grande importância na medida em que me familiarizei com as

novas tecnologias na área da Genética Molecular e com as possibilidades de implementação

das mesmas na sala de aula, apesar dos reduzidos recursos existentes na Escola.

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