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Patogênese microbiana-base para o desenvolvimento de uma vacina

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCentro de Desenvolvimento Tecnológico

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Vacinologia e Engenharia de Vacinas Como desenvolver novas vacinas?

• Que conhecimento preciso ter para isso?

• Vacinologia experimental:

– Qual a resposta imune a ser induzida?

– Quais adjuvantes/moduladores usar?

– Qual a melhor estratégia para combater a infecção?

– Qual imunógeno?

Características de um imunógeno

• Imunógeno X antígeno X hapteno

• Requerimentos:

– Ser estranho;

– Alto peso molecular;

– Complexidade química;

– Degradabilidade;

Outras moléculasLipídeosCarboidratosProteínas

Quero pesquisar e produzir novas vacinas!

• Que conhecimento preciso ter para isso?

• Vacinologia experimental:

–Qual a resposta imune a ser induzida?

–Quais adjuvantes/moduladores usar?

–Qual a melhor estratégia para combater a infecção?

– Qual imunógeno?

Compreender a patogenicidade microbiana como base para o desenvolvimento de uma vacina

Patógenos bacterianos utilizam uma série de moléculas para causar infecção

Fatores de virulência

Potenciais alvos para vacina, mas compreender a base molecular da patogenicidade é

requerida para o desenvolvimento racional de vacinas

Patogenicidade e Virulência

• Patogenicidade:

– Capacidade de causar doença;

• Virulência:

– Medida quantitativa da habilidade de causar doença;

• Patogênico – refere-se às características genotípicas expressas ou não;

• Virulento –refere-se às características fenotípicas que induzem alterações patológicas no hospedeiro;

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Patogênese microbiana:

a presença de microrganismo nem

sempre leva à doença.

Infecção

Suscetibilidade do hospedeiro Mecanismos de patogenicidade

Imunocomprometido/imunocompetenteimunizações

idadetraumas

predisposição genéticaterapia antimicrobiana

Secreção de fatores (toxinas)

Manipulação direta das células do hospedeiro

Defesas do hospedeiroBarreiras naturais

Microbiota residente – afetada por dieta, antibióticos, exclusãocompetitiva

pH – inibe o crescimento

Mucina – glicoproteínas viscosas (barreira, armadilhas…)

Resposta imune inata

PRR - (pattern recognition receptor – receptor de reconhecimento de padrão)

Células: Macrófagos, PMNs, células dendríticas, cel. NK, mastócitos, basófilos,eosinófilos;

Resposta imune adquirida

B-cells – produção de anticorpos – patógenos extracelulares

T- cells – resposta citotóxica – patógenos intracelulares

Portas de entrada

• Membranas mucosas;

– Trato respiratório, gastrointestinal, genito-urinário e conjuntiva;

• Pele;

– Intacta = barreira; fissuras, arranhões...

• Parenteral;

– microrganismos são depositados em tecidos abaixo da pele e mucosas;

Porta de entrada preferencial

• A patogenicidade depende de uma porta de entrada preferencial:

• Streptococcus pneumoniae– Se inalado pode causar pneumonia;

– Se entrar pelo trato G.I. não causará doença;

• Salmonella typhi– Se entra pelo trato G.I. pode causar a febre tifóide;

– Na pele não causa doença alguma;

Número de microrganismos infectantes

• Importante pois são necessários microrganismos que resistam ao sistema imune do hospedeiro para estabelecer a infecção;

• Depende essencialmente do hospedeiro, do patógeno e da via de infecção;

• Fundamental para o desenvolvimento de vacinas...

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Medidas de doses infectantes

• DL50– dose de microrganismos ou toxina que será letal para 50% dos

animais experimentalmente inoculados;

• DI50– dose infectante requerida para causar doença em 50% dos

animais experimentalmente inoculados;

• DLmin– a menor dose letal;

• DL100– dose letal para todos os animais em experimentação;

2 vezes a DL50 é a DL100?

DL50 numa população heterogênea

1

2

3

4

5

6

7

Dose

Animaisn = 10

DL50

2 X DL50

DL100

Exs.:Vibrio cholerea: 108 célulasLeptospira interrogans: 10 células

Medidas de virulência

Fatores de virulência bacterianos

• Aderência– Pili– Motilidade (flagelo), quimiotaxia– Proteínas de membrana externa

• Processo infeccioso– Exotoxinas, endotoxinas– Sist. secreção dos tipos III e IV– Crescimento intracelular

• Proteção contra as defesas do organismo– Capsula, parede celular, membrana externa– Inibição da ativação do complemento– Variação antigênica– Formação de biofilme

AdesãoCrucial para o patógeno resistir à tentativa de remoção

mecânica pelo hospedeiro;

Permite o estabelecimento da infecção;

• Fatores de adesão (adesinas):– Proteinas;

• Pili ou fímbrias;

• Não fimbriais;

– Carboidratos;

• Receptores;

Fatores de adesão fimbriais

• Arranjo polimérico helicoidal e protuberante com afinidade à algum receptor do hospedeiro;

• Muito comum em Gram-negativas:

– E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa, Neisseria spp.

Pili tipo IV↓

Motilidade twitching

Fatores de adesão

• Adesinas protéicas não fimbriais:

– Não possuem a estrutura longa e polimérica da fímbria;

– Contato íntimo ao hospedeiro;

– Proteínas de membrana externa expostas na superfície;

– Gram negativas:

• Yersinia pseudotuberculosis, E. coli enteropatogênica, Neisseriaspp., ...

– Gram positivas:

• Staphylococcus spp., Streptococcus spp.;

– Micobacterias;

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Adesão por polissacarídeos

• Polissacarídeos que compõem a membrana externa, parede celular ou cápsula;

– Ex.: Ácido teicóico serve de adesinas para Staphylococcus spp. e Streptococcus spp;

Fatores de motilidade

• A motilidade é um fator essencial à virulência de diversos microrganismos;

• Permite a difusão pelos tecidos do hospedeiro em busca de locais preferenciais para o estabelecimento da infecção, bem como fuga do sistema imune;

• Proporcionado por flagelo ou pili;

Adesão e movimento

• Anticorpos contra adesinas ou flagelo normalmente bloqueiam a adesão do patógeno ao hospedeiro ou sua motilidade, permitindo a lise pelo sistema complemento;

Potenciais alvos para desenvolvimento de vacinas de subunidade

Proteínas de membrana externa

• Proteínas de membrana expostas na superfície bacteriana que proporcionam adesão ou invasão de células do hospedeiro;

• Alvos potenciais para vacinas;

(Prasadarao et al, Infect. Immun. 1999)

E. coli invasion

E. coli - OmpA facilita adesão e invasão

Anticorpos contra OmpAbloqueiam a invasão

Invasão

• Uma vez aderidos, diversos patógenos penetram em determinados locais do hospedeiro;

• Invasão extracelular e invasão intracelular;

• A invasão extracelular permite o acesso dos patógenos a nichos em tecidos onde possam proliferar, disseminar a outros sítios, expressar toxinas...

Invasão extracelular

• Streptococcus β-hemolítico e Staphylococcus aureussecretam enzimas que degradam moléculas do hospedeiro:

– Hialuronidase: clivam proteoglicanos intracelulares;

– Streptoquinase e stafiloquinase: desmancham coágulos;

– Lipases: degradam lipídeos acumulados;

– Hemolisinas: degradam hemácias e outras células;

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Invasão intracelular

• O patógeno entra nas células do hospedeiro e sobrevive neste ambiente;

• Alguns patógenos injetam proteínas (efetores) por meio de sistemas de secreção do tipo III (T3SS) dentro da célula do hospedeiro;

– Estas proteínas induzem modificações na célula, facilitando a invasão bacteriana;

– Salmonella spp.

– Shigella spp.

– Yersinia spp.

Invasão intracelular

• Salmonella spp. e Shigella spp.

Pedestal de actina

Estratégias intracelularesBactérias

intracelulares obrigatóriasBactéria

intracelulares facultativas

Chlamydia spp.Rickettsia spp

Coxiella burnetiiMycobacterium spp

Salmonella spp.Legionella pneumophila

Brucella spp.

Francisella tularensis

Shigella spp.

Listeria monocytogenes

Yersinia spp.

A invasão pode ocorrer em células fagocíticas ou não. Quando invadem células fagocíticas as bactérias sobrevivem

à ação enzimática do lisossomo.

Listeria monocytogenesMovimento mediado por actina

Sobrevivência intracelular

• Patógenos invasores desenvolvem mecanismos parasobreviver intracelularmente

• Acidificação do vacúolo

• Fusão fagossomo-lisossomo

• Lise da membrana vacuolar e localização no citoplasma

• Maquinaria para recrutamento de actina;

Patógenos intracelulares requerem indução de resposta imune celular

Estratégias para evasão do sistema imune

• Anti-fagocitose

• Exemplos:

- Yersinia (tirosina fosfatase,

serina-treonina quinase, inibidores de actina)

- E. coli EPEC (fosfatidil inositol-3 quinase)

Vacina pode ser desenhada para neutralizar estes fatores, tornando os patógenos susceptíveis a

fagocitose e morte intracelular

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Estratégias para evasão do sistema imune

• Variação antigênica;

Neisseria gonorrhoeaeVariação antigênica do pili

Estratégias para evasão do sistema imune

• Cápsula bacteriana: polissacarídeos expostos de alto peso molecular;

• Inibem fagocitose por dificultar ligação de anticorpos e/ou componentes do complemento;

• Aumentam virulência;– Bacillus anthracis

– Streptococcus pneumoniae

– Klebsiella pneumoniae

– Streptococcus mutans

Biofilmes

• Agregado microbiano em que as células se aderem umas às outras em uma superfície sólida.

– Substâncias poliméricas extracelulares;

Biofilmes

• Funções:

– Resistência a fagócitos, dessecação, antibióticos, detergentes e estresses mecânicos;

– Ligação e sequestro de nutrientes;

– Formação de comunidades microbianas interdependentes;

(www.math.utah.edu/.../ quorum_talk.html)

Bacterial biofilm - magnified 7,000x

S. Typhi – colonização crônica

• Mary Mallon conhecido como

– Typhoid Mary

• Portador assintomático

• Isolado por força

– 3 decadas isolado até morreu

Parede celular bacteriana

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LPS

• Principal responsável por choque séptico;

• Ativa sistema imune inato via TLR4;

• Endotoxina!

Toxinas

• Protéicas ou não-protéicas (LPS);

• Endotoxinas (LPS) ou exotoxinas;

• Fatores de virulência melhor caracterizados;

• Fáceis de purificar (sobrenadante);

• Utilizados como toxóides em vacinas;

• Ótimos adjuvantes;

EXOTOXINAS x ENDOTOXINAS Exotoxinas protéicas

• Secretadas para o meio externo ou injetadas diretamente na célula do hospedeiro por T3SS;

• A maioria dos genes para exotoxinas está em plasmídeos ou fagos;

1. Toxinas A-B;

2. Toxinas proteolíticas;

3. Toxinas formadoras de poros;

Outras...

Toxinas A-B

Subunidade A:

Atividade enzimática, tóxica;

Subunidade B:

Ligação a receptor e internalizaçãoda toxina;

Toxinas A-B

• P. aeruginosa, E. coli, V. cholerae, C. diphtheriae e B. pertussis;

• Atividades da subunidade A:

– Proteolítica: toxina tetânica e botulínica;

– Atua em adenilato ciclase (eleva cAMP): toxina colérica, diftérica, pertussis, exotoxina A de P. aeruginosa e toxina termolábil de E. coli;

• Subunidade B: excelente adjuvante;

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Toxinas A-B Toxinas proteolíticas

• Clivam proteínas específicas do hospedeiro levando à manifestações características da doença;

• Toxina botulínica e toxina tetânica – atuam em neurotransmissores;– Botulínica: ingerida – paralisia flácida;

– Tetânica: feridas – paralisia espasmica;

• P. aeruginosa: toxinas que degradam matriz extracelular– Elastase: degrada fibras de elastina.

Toxinas formadoras de poros

• Levam à lise celular;

• Toxinas da família RTX (motivos repetitivos arginina [R] treonina [T]) – Gram-negativas secretam por T1SS;

– Leucotoxinas e hemolisinas;

Toxinas formadoras de poros

• Muitas Gram-positivas secretam citolisinas ativadas por sulfidril;

– A melhor caracterizada é a listeriolisina O, utilizada por Listeria monocytogenes para escapar do fagolisossomo;

Outras toxinas

• IgA-proteases ;

– Neisseria spp. e Haemophilus influenzae;

• Toxinas termo-estáveis que ativam guanilato ciclase(eleva níveis de cGMP);

– Enterotoxina termo-estável de E. coli enterotoxigênica;

• Toxinas que modificam o citoesqueleto;

– Rho GTPases (Clostridium difficile, Salmonella, Shigella);

E os vírus?

• Vacinas baseadas em peptídeos de superfície;

• As disponíveis são vacinas atenuadas replicantes ou inativadas;

– Preocupam pois podem propagar-se no organismo;

• Recombinação e origem de novos vírus;

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Vacinas virais

• Resposta de anticorpos IgM e IgG aglutinantes e neutralizantes;

– Extracelular;

• Resposta Th1 – células citotóxicas; NK e macrófagos;

– Intracelular;

• DNA de fita simples – TLR8;

• DNA de fita dupla – TLR3;

Desafios na produção de vacinas virais

• Dificuldade de produção;

• Curta vida de prateleira dos produtos;

• Imunidade curta;

• Necessidade de dezenas de antígenos para abranger a

diversidade antigênica viral;

• Laboratório nível três;

• Alumínio como adjuvante;

• Inativação incompleta no uso de formaldeído;

E os parasitas?

• Taenia solium – mais de 3m – Th2 IgE

Vacinas contra parasitas

Leishmania spp.

protozoário invade macrófagos

Plasmodium spp.

protozoário invade hepatócitos e

eritrócitos

Evasão do sistema imune

• Tegumento: barreira física contra anticorpos e células de defesa;

• Proteínas antioxidantes: expressam superóxidos dismutasesque convertem superóxido em H2O e O2;

• Proteínas do tegumento bloqueiam a formação do complexo de ataque à membrana;

Eosinófilos atraídos por IgE ligado à larva de Schistosoma mansoni

E os fungos?

• Possuem fatores de virulência semelhante aos bacterianos;

– A maioria das infecções ocorre em depressão imunológica;

• Destacam-se a produção de micotoxinas, como a aflatoxina de Aspergillus spp.

– Interfere na síntese de proteínas e seus metabólitos podem se intercalar no DNA – cancerígenos;

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Dúvidas...