C neoformans e linfócitos B

Adila Regina Trubat Santos Rodrigues

Orientadora: Dra. Lígia Maria Torres Peçanha

Laboratório de Imunoparasitologia

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes

Estudo da resposta de linfócitos B murinos induzida por polissacarídeos de formas MAT alfa e MAT a

de Cryptococcus neoformans.

Universidade do Brasil -UFRJ

Cryptococccus neoformans

• Animais

Phascolarctos cinereus Tursiops truncatusColumba livia

• Ambiental - árvores e solo

Eucalyptus calmulidensis Araucaria augustifolia

Patógeno oportunista

•Infecção por inalação de esporos ou leveduras

•Meningoencefalite

•Lesões de pele

Anfotericina B e fluconazol

Fatores de virulência

NENHUMA INTERVENÇÃO TERAPÊUTICA BASEADA NA INTERFERÊNCIA DOS FATORES DE VIRULÊNCIA FOI ATÉ

AGORA DESCRITA

Produção de cápsula

Prototrofia - fenoloxidase e produção de melanina

Conjugação

Produção de cápsula

Composição da cápsula

GXM é o componente em maior abundância na cápsula, compreende um polímero de aproximadamente 1 milhão de daltons

e é composto por um esqueleto de manose, com substituições de ácido glucorônico e xilose

A galactoxilomanana é um polímero que consiste em um esqueleto de galactose com cadeias laterais trímeras de galactose e manose. Cada cadeia lateral da GalXM

sustenta entre um e três resíduos de xilose



Manoproteína – xilose, galactose e manose

Atividades Imunobiológicas

Glucoronoxilomanana (GXM)

•Antifagocítica - Anti opsonizante

•Cápsula aumenta a produção de IL 10

•Decréscimo da expressão de MHC II e B7

•Aumento da produção de óxido nítrico na presença de Ac

•Ativa complemento

•Suprime Ac

•Produção de TNF alfa (GalXM)

Atividades Imunobiológicas

Manoproteína

•Induz TNF por macrófagos

•Induz IL 12

•Induz IFNγ

•Componente protetor










Kuong-Chung et al, Mycology, 1992, 60:602-605

Mat α é mais virulento que Mat a

Imunidade ao fungo

Imunidade ao fungo

Th1 X Th2

•Liga C3 nos não encapsulados

•Presença de IgG e IgM em níveis normais não são suficientes para iniciar ativação

•Importante na opsonização

Complemento

Papel Protetor dos Anticorpos

Administração de mAbs para cápsula prolonga a sobrevivência:

•Eficiência de isotipos:

•IgG2a>IgG1>IgM

•IgA>IgG2b>>IgG3

•IgG3 não protetor ou potencia a doença;

•Mudança de IgG3 para IgG1 confere proteção

Células B

Linhagens de camundongos que montam respostas de anticorpos mais intensas são mais resistentes à infecção

com C. neoformans

Linhagens de camundongos deficientes de células B (como a CBA/N) são mais susceptíveis à infecção com o fungo.

Neuville et al. 2000; 68: 3724-3726.

Dromer et al. Immunogenetics 1988; 28: 417-424.

Marquis et al. Infect Immun. 1985. 47(1):288-93

Objetivos

•Verificar o efeito imunomodulador de polissacarídeos sobre a resposta de linfócitos B in vivo e in vitro.

•Caracterizar a resposta in vivo induzida por polissacarídeos purificados de C. neoformans em relação aos isotipos induzidos e a seu efeito imunizante e protetor.

•Comparar da resposta induzida in vivo por polissacarídeos isolados de amostras MAT alfa e MAT a.

Metodologia

e

Resultados

Metodologia

B-3501 - WT, tipo conjugativo alfa (MAT alfa )

C.neoformans var. neoformans - sorotipo D

B-3502 - WT, tipo conjugativo a (MAT a)

Os fungos

Kuong-Chung et al, Mycology, 1992, 60:602-605

Os animais

BALB/c - Th1C57Bl/6 - Th2

Metodologia

ELISA paraavaliação da

produção de IgM

Medida da proliferação de linfócitos B por incorporação

de timidina

Linfócitos B em cultura estimulados ou não com polissacarídeos de C. neoformans MAT a e MAT alfa , LPS e anti-IgD-Dextrana

Isolamento de linfócitos B de baços de camundongos normais

C57Bl/6 e BALB/c

0 1 10 0 1 100

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

LPSMeio

Dose do conjugado 3501 (Mat alfa)0 1 10 0 1 10

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

DEXMeio

Dose do conjugado 3501 (Mat alfa)

0 1 10 0 1 100

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

LPS

Meio

Dose do conjugado 3502 (Mat a)0 1 10 0 1 10

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

DEX

Meio

Dose do conjugado 3502 (Mat a)

Inco

rpo

raçã

o d

e T

imid

ina

Trit

iad

a (c

pm)

Medida da proliferação de linfócitos B por incorporação de timidina

BALB/c

0 10 1 1 10 10

5000

10000

15000

20000

25000

LPS

Meio

Dose polissacarídeo 3501 (Mat alfa)0 10 1 0 10 1

0

5000

10000

15000

20000

25000

DEX

Meio

Dose do polissacarídeo 3501 (Mat alfa)

0 10 1 0 10 10

5000

10000

15000

20000

25000

LPS

Meio

Dose do polissacarídeo 3502 (Mat a)0 10 1 0 10 1

0

5000

10000

15000

20000

25000

DEX

Meio

Dose do polissacarídeo 3502 (Mat a)

Inco

rpor

ação

de

Tim

idin

a Tr

itiad

a (c

pm)

Medida da proliferação de linfócitos B em cultura por incorporação de timidina

C57Bl/6

0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

LPSMeio

Dose do Conjugado 3501(Mat alfa)

0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

LPSMeio

Dose do Conjugado 3502(Mat a)

0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

DEXMeio


0 1 10 0 1 100

10002000

3000400050006000

70008000

900010000

1100012000

130001400015000

DEXMeio


Co

ncen

traç

ão d

e Ig

M n

o s

obr

enad

ante

de

cultu

ra (

ng/m

l)

Produção de IgM em sobrenadante de cultura de linfócitos B

BALB/c

0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

LPSMeio


0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

LPSMeio


0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

DEXMeio


0 1 10 0 1 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

DEXMeio


Co

ncen

traç

ão d

e Ig

M n

o s

obr

enad

ante

de

cultu

ra (

ng/m

l)

Produção de IgM em sobrenadante de cultura de linfócitos B

C57Bl/6

Imunização de camundongos C57Bl/6 e BALB/C com polissacarídeos de C. neoformans de Mat alfa e Mat a (50µg/animal i.p.)

Obtenção de soros

Realização de testes ELISA: cinética de produção de IgM específica para as frações da

cápsula de C. neoformans

Metodologia

Realização de testes ELISA: mapeamento da produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações da cápsula de C.

neoformans

14 dias7,14 e 21 dias

3501 3502

BALB/c

C57Bl/6

Cinética de produção de IgM em animais imunizados

8 15 210

20

40

60

80

100

8 15 210

20

40

60

80

100

8 15 210

20

40

60

80

100

8 15 210

20

40

60

80

100

BA

C D

ND

Dias após a imunização

(34)

(9)(19)

(<10)

(<10) (<10) (<10)

(14)

(69)

(19) (18)

Produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações de cápsula de C. neoformans

BALB/c

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

700

IgM

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

IgG1

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

IgG2b

imune 01 imune 020

150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

IgG3

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

700

Tít

ulo

sé

rico

de

ant

ico

rpo

s an

ti-p

olis

saca

ríd

eo

A B C D

E F G H

Tipo de Antígeno usado na imunização

(21) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10)

(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)

(41)

Produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações de cápsula de C. neoformans

C57Bl/6IgM

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

IgG1

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

IgG2b

imune 01 imune 020

150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

IgG3

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

700

IgG2a

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

Títu

los

séric

os d

e an

ticor

pos

anti-

polis

saca

ríde

o

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

700

imune 01 imune 020

150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500F

A B C D E

JIHG

Tipo de Antígeno usado na imunização

ND

ND

ND

ND

(>10) (>10)(>10)

(39) (50) (31) (34) (16) (13) (11) (<10)

(100) (54)(32) (20) (>10)

Infecção de camundongos C57BL/6 e BALB/C com C. neoformans MAT alfa e MAT a (1x105 leveduras/animal i.v.)

Avaliação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias nos pulmões, baço

cérebro e sangue.

Avaliação de isotipos de

imunoglobulinas

Metodologia

Perfil de infecção com cepas 3501 (MAT alfa) ou 3502 (MAT a) de C. neoformans – BALB/c

Cérebro Pulmão Baço Sangue0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000


500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000


500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000


500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Nú

mer

o d

e C

olô

nia

s

A B

C

D

(0)(10,7) (7,2) (0,25) (7,7) (0) (0) (0)

(1,7) (23,2) (0) (0) (1,0) (0,25) (0) (0)

D

C D

A B

(0)(2,3)(0,4)(0,6)

(0)(2,2)(0,7)(23,7)(220,8) (3,2) (10,5) (0)

(1814)

(46,9) (2,4) (0)

Perfil de infecção com cepas 3501 (MAT alfa) ou 3502 (MAT a) de C. neoformans – C57Bl/6


1000

2000

3000

4000

5000


1000

2000

3000

4000

5000


1000

2000

3000

4000

5000


1000

2000

3000

4000

5000

Núm

ero

de

Co

lôni

as

infect alfa infect a0

50

100

150

200

250

300

350


100

200

300

400

500

600


100

200

300

400

500

600

700


150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

IgM


50

100

150

200

250

300

350

IgG1


100

200

300

400

500

600

IgG2b


150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

IgG3


100

200

300

400

500

600

700

Títu

los

séri

cos

de

antic

orpo

s an

ti-po

lissa

carí

deo

A B C D

E F G H

Tipo de forma conjugativa do fungo usada na infecção

(>10)

(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)

(>10) (>10) (>10) (>10)

(27)

(40) (34)

(50)

(17)

Produção de imunoglobulinas em animais infectados – BALB/c

A B C D E

F G H I J

IgM


50

100

150

200

250

300

350

IgG1


100

200

300

400

500

600

IgG2b


150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

IgG3


100

200

300

400

500

600

700

IgG2a


50

100

150

200

250

300

Títu

los

séri

cos

de a

ntic

orpo

s an

ti-po

lissa

carí

deo


50

100

150

200

250

300

350


100

200

300

400

500

600


50

100

150

200

250

300


150

300

450

600

750


150

300

450

600

750

900

1050

1200

1350

1500

Tipo de forma conjugativa do fungo usada na infecção

(37) (>10) (>10) (>10)

(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)

(61) (24) (24) (50) (39) (75)

(48) (14) (21) (18)

Produção de imunoglobulinas em animais infectados – C57Bl/6

Imunização de camundongos C57/B6 e BALB/C com polissacarídeos de C. neoformans de Mat alfa e Mat a (50µg/animal i.p.)

Desafio com C. neoformans Mat alfa e Mat a (105 leveduras i. v.)

Avaliação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias nos

pulmões, baço e cérebro.

Avaliação de isotipos de imunoglobulinas

Metodologia

15 dias

21 dias


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Núm

ero

de

Co

lôni

as

CBA

FED

(0)(0)(3,3)(6,3)

(0) (0) (0) (0)

(0) (0) (0)(1)(0)(0)(23,5)(1,7)

(0)(0)(0,6)(1) (0,6)(0)(0)(0,25)(1)

Carga fúngica em camundongos BALB/c imunizados com polissacarídeos e posteriormente infectados


1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000


1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000


1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000


1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000


1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000


1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000Núm

ero

de

Co

lôni

as

CBA

FED

(0)

(0) (0) (0) (0) (0)

(0)(0)(0)(0)(0) (0,5)(0,5)(0,4) (2,3)(0)

(1808)

(46,9) (2,4) (0) (371,3) (121,7) (7,3)

(3,5)

Carga fúngica em camundongos C57Bl/6 imunizados com polissacarídeos e posteriormente infectados

Produção de isotipos de imunoglobulinas em animais imunizados e posteriormente infectados

com C. neoformans

BALB/c

IgM

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

IgG1

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

IgG2b

imune 01 imune 020

1503004506007509001050120013501500

IgG2b

IgG3

imune 01 imune 020

100200300400500600700

IgG3

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

100200300400500600700

imune 01 imune 020

1503004506007509001050120013501500

Título

s sé

ricos

de a

ntic

orp

os

anti-

polis

sacarí

deo

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

1503004506007509001050120013501500

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

700

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

100200300400500600700

imune 01 imune 020

1503004506007509001050120013501500

Tipo de antígeno usado na imunização

BA C D

HGFE

I J K L

PONM

(>10)

(15) (14) (>10) (>10) (>10) (>10) (27) (>10)

(23) (>10) (>10) (45) (102)

(359)

(54)

(>10)(20) (>10) (>10) (>10) (>10) (66) (>10)

(10)(>10) (>10) (>10) (14) (25) (282) (70)

Produção de isotipos de imunoglobulinas em animais imunizados e posteriormente infectados

com C. neoformans

C57Bl/6

IgM

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

IgG1

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

IgG2b

imune 01 imune 020

150300450600750900

1050120013501500

IgG3

imune 01 imune 020

100200300400500600700

IgG2a

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

imune 01 imune 020

100

200300400

500600

700

imune 01 imune 020

150300450600750900

1050120013501500

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

150300450600750900

1050120013501500

imune 01 imune 020

100200

300400500

600700

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

Títu

los

séri

cos

de a

ntic

orpo

s an

ti-po

lissa

carí

deos

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

350

imune 01 imune 020

100

200

300

400

500

600

imune 01 imune 020

50

100

150

200

250

300

imune 01 imune 020

100200300400500600700

imune 01 imune 020

150300450600750900

1050120013501500

F JG H I

A EB C D

KOL M N

P TQ R S

Tipo de antígeno usado na imunização

(79)(171)(72)(532)(56)

(111)(167)(104)

(93)

(101)

(<10)(40)(16)(21)(10)

(37)

(26)(14)(50)(58)

(<10)(<10)(59)(<10)(51)(19) (<10)(86) (<10)(<10)

(46)(<10)(46)(<10)(17)(<10)(<10)(<10)(35)(26)

Perfil de tamanho e granulosidade – 10 dias de infecção

( x = 1,51)

( x = 3,36)

( x = 2,58)

Perfil de tamanho e granulosidade – 17 dias de infecção

( x = 0,96)

( x = 1,74)

( x = 0,73)

CONCLUSÕES

Proliferação de Linfócitos B em Cultura

• Os polissacarídeos de cápsula não induzem isoladamente a proliferação de células B de camundongos BALB/c e C57BL/6;

• Os polissacarídeos aumentam a resposta proliferativa de células de camundongos BALB/c induzida por LPS, mas não por anti-IgD-Dextrana.

Produção de IgM em Cultura

• Os polissacarídeos parecem potenciar a produção de IgM em C57Bl/6 estimulados por LPS. Efeito semelhante ocorre em BALB/c, porém em menor magnitude.

Cinética da produção de IgM Sérica na imunização

• Animais BALB/c imunizados apresentam uma cinética de produção de IgM mais lenta ao 3501, e não respondem ao 3502;

• Animais C57BL/B6 imunizados com polissacarídeos de 3501 ou 3502 têm uma resposta mais rápida para o polissacarídeo de 3502

Isotipos de imunoglobulinas séricas na imunização

• C57BL/B6 imunizados respondem mais fortemente que BALB/c aos polissacarídeos de 3501 e 3502 (IgM, IgG2a e IgG2b);

Perfil de infecção

• BALB/c tem maior resistência à infecção tanto para as formas MAT alfa, quanto para as formas MAT a;

• C57Bl/6 infectados com MAT alfa apresentam infecção maciça do tecido cerebral.

Isotipos de imunoglobulinas séricas na infecção

• BALB/c praticamente não produzem anticorpos reativos contra as cepas 3501 e 3502;

• C57Bl/6 produzem títulos baixos de anticorpos contra 3501

Isotipos de imunoglobulinas séricas na imunização e posterior infecção

• BALB/c produzem resposta muito baixa, sendo detectável IgG3 contra 3501 (imunização e infecção)

• C57Bl/6 produzem títulos mais altos, principalmente contra 3501, independente do polissacarídeo da imunização prévia.

Perfil de granulosidade e tamanho de células esplênicas

• Foi detectado no baço de animais infectados com a forma MAT alfa o aparecimento de uma população de alta granulosidade.

Não parece haver correlação entre a resistência de BALB/c e a produção de anticorpos

O aumento da resistência de C57Bl/6 ocorre paralelamente a uma maior produção de

anticorpos

Education

C neoformans e linfócitos B