6to-Informe-2015-1 Microbiologia

7/26/2019 6to-Informe-2015-1 Microbiologia

http://slidepdf.com/reader/full/6to-informe-2015-1-microbiologia 1/52

Índice:

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página 1



1 Introducción..................................................................................................4

2 !cnica de ermentación de tubo" m#ltiple"$ a"e pre"unti%a & recuento debacteria" 'eterotrófca"...................................................................................... (

2.1 )b*eti%o:.................................................................................................(

2.2 +undamento eórico...............................................................................(2.2.1 P,-/0 /0C,I)L)GIC0 C)30I30CI)3..........................6

2.2.2 C3IC0 /0C,I)L)GIC0..........................................................5

2.2. C-30 730, 3 PL0C0..........................................................5

2.2.4 C0LI0 L 0G-0 P)0/L...........................................................8

2.2.( C0LI0 0G-0 3) P)0/L...................................................9

2.2.6 ),0 -,0............................................................................9

2.2.5 C3IC0 030,I00 +,30CI)3 3 -/)

-LIPL;3P< C)LI+), )0L.................................................1=2.2.8 +0 P,-3I>0..........................................................................1=

2. Procedimiento:.....................................................................................11

2..1 Procedimiento de 3P para coliorme" ecale"..............................11

2..2 C0LC-L) ? ,GI,) L 3P.....................................................12

2.. P,-/0 P,3CI0 ) 0-3CI0 ;P@0< C)LI+),..........14

2..4 Procedimiento................................................................................16

2..( Procedimiento de fltro de membrana para coliorme" ecale"..... .15

2..6 Procedimiento de incubación retardada para coliorme" ecale".. .18

2.4 Cálculo de la den"idad de coliorme" ecale".......................................19

2.4.1 +a"e pre"unti%a & recuento de bacteria" 'eterotrófca".................21

2.( Conclu"ione"........................................................................................24

2.6 ,ecomendacione"................................................................................24

!cnica de +ermentación de tubo" m#ltiple"$ +a"e confrmati%a$ & Prueba deColiorme" +ecale"............................................................................................24

.1 )b*eti%o"..............................................................................................2(

.2 +undamento eórico.............................................................................2(.2.1 >erde /rillante /ili" 2A Caldo........................................................2(

.2.2 iembra..........................................................................................2(

.2. Incubación......................................................................................26

.2.4 ,e"ultado"......................................................................................26

.2.( 0lmacenamiento:...........................................................................25




. Procedimiento.......................................................................................25

.4 2.4. ,e"ultado".....................................................................................29

.( Conclu"ione"........................................................................................=

4 Identifcación del Grupo Coliorme$ !cnica de +ermentación en tubo"

m#ltiple"B Prueba complementaria................................................................... =4.1 )b*eti%o"..............................................................................................=

4.2 +undamento eórico.............................................................................=

4.2.1 L G,-P) C)LI+),...................................................................=

4.2.2 C3IC0 +IL,0CI)3 P), 3/,030....................................2

4.2. C3IC0 L +IL,) 3/,030 P0,0 I3/,) L G,-P) L) C)LI+),..................................................................................

4.2.4 Procedimiento e"tándar de fltro de membrana para coliorme"totale" 4

4.2.( Procedimiento de fltro de membrana para leb"iella....................5

4.2.6 Procedimiento de incubación retardada para coliorme" totale"....9

4. I)$ ,0CI>) ? P,)CII3)............................................4=

4..1 Prueba del indol.............................................................................41

4..2 Prueba del ro*o de metilo...............................................................41

4.. Prueba de >oge"@Pro"Dauer............................................................42

4..4 I+,3CI0CI)3............................................................................4

4..( I+,3CI0CIE3 /0C,I0 C)LI+),..............................444.4 Procedimiento.......................................................................................46

4.( ,e"ultado"............................................................................................45

4.(.1 Prueba Complementaria.................................................................45

( Conclu"ione"...............................................................................................48

6 ,ecomendacione".......................................................................................48

5 /ibliograFa..................................................................................................49

1 Introducción

l propó"ito de e"te Laboratorio ue el de realiar el análi"i"microbiológico de la" coliorme" como ob*eto de pre%ención de cierta"

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página



enermedade" tran"mi"ible" por el agua$ de"de el punto de %i"ta"anitario.

l grupo coliorme e"tá ormado por toda" la" bacteria" aerobia" &anaerobia" acultati%a"$ Gram negati%a"$ no ormadora" de e"pora" &

con orma de ba"tón Hue

ermentan la lacto"a$ produciendo ga" & acidoen 48 'ora" a ( C

La prueba e"tándar para el grupo coliorme puede realiar"e medianteuna t!cnica de ermentación en tubo" m#ltiple" ;a tra%!" de la" a"e""upue"ta" & confrmatoria" o prueba completa< o por la t!cnica de fltrode membrana ;+< "on aplicable" todo" e"to" m!todo"$ teniendo encuenta la" limitacione" Hue "e e"pecifcan & el propó"ito de e"tudio.

n el ca"o de la t!cnica de ermentación de tubo" m#ltiple"$ lo"re"ultado" del e"tudio de lo" tubo" m#ltiple"$ lo" re"ultado" del e"tudio

de lo" tubo" & la" dilucione" replicado" "e comunican en t!rmino" del3umero á" Probable ;3P< de microorgani"mo" eJi"tente" ."ten#mero ba"ado en determinada" órmula" de probabilidad$ e" un cálculode den"idad media de coliorme" en la mue"tra.

La preci"ión de cada prueba depende del n#mero de tubo" utiliado".e obtiene una inormación má" "ati"actoria cuando el ma&or inoculode mue"tra e"tudiado mue"tra ga" en alguno o en todo" lo" tubo" $ &el má" peHueKo mue"tra ga" en ninguno o en la ma&orFa de lo" tubo".La den"idad bacteriana puede calcular"e mediante la órmulaacilitada o promedio de la tabla Hue utilia el n#mero de tubo" po"iti%o"

en la" dilucione" m#ltiple" .l n#mero de porcione" de la mue"tra depende de la preci"ión reHuerida .La" tabla" de 3P "e ba"an en la'ipóte"i" de una di"tribución de Poi""on ;di"per"ión aleatoria<.inembargo $ "i la mue"tra no "e 'a agitado adecuadamente ante" de'acer la" porcione" o "i eJi"te agrupamiento de bacteria" $ el %alor del3P podrá re"ultar menor Hue el n#mero real de den"idad bacteriana.

in embargo$ el inter!" por la t!cnica de tubo" m#ltiple"$ la" numero"a"in%e"tigacione" realiada" "obre la preci"ión del 3P & la eJpre"ión delo" re"ultado" de la prueba en orma de 3P no deben lle%ar a

con"iderar e"te m!todo como un e*ercicio e"tadF"tico en lugar decomo un medio de %alorar la den"idad de coliorme" en un agua& "ucalidad "anitaria.

La me*or %aloración de la efcacia de un tratamiento de agua o de lacalidad "anitaria de un agua no tratada depende de la interpretación delo" re"ultado" bacteriológico" & de la" re"tante" inormacione"obtenida" mediante encue"ta" "anitaria" o de ingenierFa.




2 Técnica de fermentación de tubos múltiples, fase

presuntiva y recuento de bacterias heterotróficas.

2.1 Objetivo

%idenciar & ob"er%ar la eJi"tencia de coliorme" en la" mue"tra" Hue "eencontraron en lo" dierente" ambiente" de -3I.

2.2 !undamento Teórico

2.2.1 "#$%&'( &')T%#IO*O+I)'( % )O-T'I-')IO-e pre"upone Hue el ob*eti%o de lo" análi"i" rutinario" "on paradeterminar la eJi"tencia de microorgani"mo" patógeno" en el agua .inembargo$ e"to no e" %erdad$ por la" "iguiente" raone"Lo" microorgani"mo" patógeno" llegan al agua en orma e"porádica & no"obre%i%en muc'o tiempo$ por lo tanto$ pueden no e"tar en unamue"tra Hue "e en%i! al laboratorio.i "e encuentran en peHueKa" cantidade" pueden pa"ar de"apercibido"a lo" procedimiento" empleado".e nece"itan 24 'ora" a má" para obtener re"ultado" de lo" eJámene" &

"i "e encuentran microorgani"mo" patógeno"$ muc'a" per"ona" pueden'aber tomado agua ante" de Hue "e conocan re"ultado"$ & a"F 'aber"eeJpue"to a la inección.

e "abe Hue lo" microorgani"mo" patógeno" Hue llegan a lo" depó"ito"de agua$ proceden de la" de"carga" inte"tinale" de 'ombre" & animale"$ademá" cierta" e"pecie" de bacteria"$ particularmente "c'eric'ia coli$ & %ario" microorgani"mo" "imilare"$denominado" coliorme"$ e"treptococo" ecale" ;como "treptococu"aecale"$clo"tridium perringe"$ "on 'abitante" principale" del inte"tinogrue"o & animale"$ & en con"ecuencia "iempre e"tán en lo" de"ec'o"

ecale".

0"F pue" la pre"encia de cualHuiera de e"ta" e"pecie" en el agua e"e%idencia de una contaminación ecal & el camino e"tá abierto a lo"patógeno" &a Hue "e encuentran en la" materia" ecale".

Pue"to Hue lo" eJámene" de laboratorio para encontrar microorgani"mo"patógeno" en el agua tiene la" de"%enta*a" enumerada"$ "e 'an

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página (



de"arrollado t!cnica" para detectarlo" en la" eJcreta"$ particularmentelo" del grupo coliorme. "te propó"ito 'a probado "er "ati"actorio en lapráctica & tiene la" "iguiente" %enta*a":

• Lo" microorgani"mo" coliorme"$ "obre todo . coli$ 'abitan

con"tantemente en el inte"tino 'umano con grande" cantidade".e e"tima Hue una per"ona$ en promedio$ eJcreta al dFa mile" demillone" de e"to" microorgani"mo".

• " to" microorgani"mo" %i%en má" tiempo en general$ no eliminamicroorgani"mo" patógeno"$ pero puede de"arrollár"ele unainección inte"tinal & e"o" microorgani"mo" aparecerán en la"materia" ecale".

• )b%iamente$ una per"ona "ana en general no eliminamicroorgani"mo" patógeno"$ pero puede de"arrollár"ele una

inección inte"tinal & e"o" microorgani"mo" aparecerán en la"materia" ecale". 0"F$ la pre"encia de coliorme" en el agua "e toma como "eKal de alarma$ pue" 'a "ido contaminadapeligro"amente.

2.2.2 T%)-I)'( &')T%#IO*O+I)'(

Lo" m!todo" para el eJamen bacteriológico del agua e"tán de"crito" enel libro tandard et'o" or t'e eJamination o áter and Ma"teater$preparado & publicado en con*unto por la NO0merican Public ealt'0"ociationQQ$ la QQ0merican áter MorD" 0"ociationQQ & laQQ+ederation o "eage and indu"trial Ma"te 0"ociationQ.

Como lo dice el tFtulo del libro$ lo" m!todo" "on tipo e"tablecido & lo"detalle" deben "eguir"e al pie de la letra "i "e Huiere Hue lo" re"ultado"tengan "ignifcado ofcial. " nece"ario cuidar lo" "iguiente" detalle"cuando "e "ometan prueba" de agua a análi"i" bacteriológico":La mue"tra "e tomara en ra"co e"t!ril.

La mue"tra 'a de "er repre"entati%a de la uente original.

e e%itara la contaminación de la mue"tra durante & de"pu!" deobtenerla.

La mue"tra "e analiara lo má" pronto po"ible.

i no e" po"ible eJaminar la mue"tra en "eguida deberá guardar"e enrerigeración entre = & 1= C




Lo" procedimiento" bacteriológico" de rutina "on:• Cuenta en placa para determinar el n#mero de bacteria"

• Prueba" Hue re%elen la pre"encia de bacteria" coliorme".

2.2.3 )$%-T' %(T/-'# %- "*')'

e eect#an cuenta" de colonia" de"pu!" de 'aber "embrado en placacantidade" alFcuota" de la mue"tra. La cuenta e"tándar en placa no "e

recomienda para el ca"o del agua porHue la Hue contiene poca"bacteria" patógena" ob%iamente e" má" peligro"a Hue la Hue contienemuc'a" "aprofta" .in embargo$ lo u"ual e" Hue el agua de buenacalidad tenga cuenta" ba*a"$ meno" de 1== por mililitro. La" cuenta"en placa #tile" para determinar la efciencia de la" operacione" paraeliminar microorgani"mo"$ como la "edimentación$ fltración &cloración .La" cuenta" "e deben 'acer ante" & de"pu!" del tratamientoe"pecFfco. Lo" re"ultado" indicaran la medida en Hue 'a "ido reducida lapoblación microbiana.

Prueba" para determinar la pre"encia de bacteria" coliorme"

>ario" medio" "electi%o" dierenciale" acilitan muc'o el proce"o paraeJaminar mue"tra" de agua en bu"ca de microorgani"mo" coliorme".l eJamen "upone tre" pa"o" "uce"i%o".

a< Prueba de pre"unción o Prueba pre"unti%a

b< Prueba de confrmación

c< Prueba de con"umación

2.2.4 )'*I' %* '+$' "OT'&*%

Cuando "e analia el agua potable para determinar "i "u calidad cumplela" norma" del organi"mo e"tadouniden"e n%iromental Protection0genc& ;P0<$ utilia cinco porcione" de 1= ml .n ca"o de Hue empleenporcione" de 1== ml de mue"tra$ "e inocularan en ( botella" de culti%o.




Para con"eguir un cálculo má" preci"o del n#mero de bacteria" en elagua potable tratada$ Hue no debe contener coliorme" por 1== ml$ "eutiliaran 1= tubo" duplicado" con porcione" de 1= o 1== l de mue"tra.

0l e"tudiar todo tipo de agua" potable"$ agua" naturale" & eRuente"$ "e

realiara la a"e confrmatoria.La prueba completa e" el e"tándar de reerencia Hue "e aplicara enmue"tra" "eleccionada" con carácter e"tacional para controlar lacalidad del agua & debe tener una periodicidad al meno" trime"tral.

n lo" e"tudio" 'abituale" Hue "e lle%an a cabo en la ma&orFa de lo""umini"tro" p#blico" de agua$ "obre todo en lo" Hue e"tánde"inectado"$ el ob*eti%o de la" prueba" de coliorme" con"i"te endeterminar "u grado de adecuación a la" norma" de la P0$ comomedida de efcacia de la planta de tratamiento o de la calidad de agua &

dilu&ente". -na ele%ada proporción de lo" coliorme" Hue eJi"ten enlo" "i"tema" de di"tribución no "e debe a un allo en el tratamiento en laplanta o en la uente$ "ino a un recrecimiento de la" bacteria" en la"conduccione" .ado Hue e" diFcil di"tinguir entre recrecimiento decoliorme" & nue%a" contaminacione"$ "e admite Hue toda" la"aparicione" de coliorme" "on nue%a" contaminacione"$ mientra" no "edemue"tra lo contrario. " de e"perar Hue má" de 9( por 1== de la"mue"tra" e"tudiada" den re"ultado" negati%o". -n re"ultado po"iti%ooca"ional$ a meno" Hue "e repita en el mi"mo punto de toma$ "ueletener un %alor limitado$ aunHue no puede "er ignorado .-n incrementodel n#mero de mue"tra" po"iti%a" durante un determinado periodo o un

bru"co aumento en un periodo corto$ indican la inducción de un cambiode la calidad del agua$ cu&o "ignifcado debe determinar"e mediante une"tudio "anitario. ágan"e rápidamente la" correccione" nece"aria"$teniendo en cuenta el re"ultado del e"tudio "anitario & compru!be"e laefcacia de la" mi"ma" por medio de nue%o" análi"i" bacteriológico".

2.2.5 )'*I' % '+$'( -O "OT'&*%(

Para e"tudiar agua" no potable"$ inoc#le"e una "erie de tubo" conadecuada" dilucione" decimale" de la mue"tra de agua ;m#ltiplo" &"ubm#ltiplo" de a= ml<$ teniendo en cuenta la den"idad probable decoliorme". -tilFce"e la a"e "upue"ta confrmatoria del procedimientode tubo" m#ltiple" .Como control de calidad$ utilFce"e en cadae"tación la prueba completa má" inten"i%a en un mFnimo del 1= por 1==de la" mue"tra" de agua no potable Hue contengan coliorme". lob*eti%o del e"tudio del agua no potable "uele con"i"tir en calcular la




den"idad de contaminación bacteriana$ determinar la uente de lami"ma$ reorar lo" e"tándare" de calidad del agua o ra"trear la"uper%i%encia de lo" microorgani"mo".Cada uno de e"to" ob*eti%o" reHuiere una %aloración num!rica paracomunicar lo" re"ultado" .La !cnica de la ermentación en tubo"

m#ltiple" puede utiliar"e para con"eguir un cálculo e"tadF"ticamente%alido del 3P de den"idad de coliorme". " preci"o e"tudiar unn#mero "ufciente de mue"tra" Hue permita alcanar re"ultado"repre"entati%o" del lugar en Hue "e 'a eectuado la toma.Por lo general$ la media geom!trica o el %alor medio de lo" re"ultado" deun determinado n#mero de mue"tra" pueden proporcionar un %alor en elHue "e reduca al mFnimo el eecto de la %ariación entre mue"tra".Para con"eguir e"te ob*eti%o$ puede "er má" adecuado un recuentodirecto con una t!cnica de fltro de membrana

2.2.6

OT#'( $%(T#'(La t!cnica de ermentación en tubo m#ltiple e" aplicable al análi"i" deagua" o "alobre" & a lodo"$ "edimento" & ango" .!nga"e en cuenta la"precaucione" ante" aludida" "obre el tamaKo de la" porcione" & eln#mero de tubo" por dilución.

Para preparar mue"tra" "olida" o "emi"ólida"$ p!"e"e la mue"tra &aKáda"e el lFHuido de dilución 'a"ta con"eguir una de. Por e*emplo$introd#can"e (= g de la mue"tra en una *arra mecladora e"t!ril$aKáda"e 4(= ml de tampón de o"ato e"t!ril o de agua de dilución

con peptona al 1 por 1== & m!cle"e durante 1 a 2 minuto" a ba*a%elocidad ;8== rpm< .Prepáren"e la" dilucione" decimale"corre"pondiente" del 'omogeneiado re"ultante lo ante" po"ible parareducir al mFnimo la "edimentación.

2.2.7 T%)-I)'( %(T'-'#I0''( % !%#%-T')IO- %-T$&O $*TI"*% -" % )O*I!O#%( TOT'*%(

2.2.8 !'(% "#%($-TI3'

-tilFce"e un medio liHuido de lauril tripto"a en la porción pre"unti%a dela prueba de tubo m#ltiple .Como alternati%a$ puede emplear"e unmedio liHuido de lacto"a$ "iempre Hue "e 'a&a demo"trado Hue no aumenta la recuencia dere"ultado" po"iti%o" al"o" ni enma"cara lo" coliorme" Hue eJi"ten enla" mue"tra" de agua potable .i "e 'a rerigerado al medio de"pu!" de"u e"teriliación$ "e incubara de un dia a otro a ( C ante" de utiliarlo.




,ec'ácen"e lo" tubo" Hue mue"tren crecimiento$ burbu*a" o amba"co"a"

0Kádan"e lo" ingrediente" de"'idratado" al agua de"tilada$ m!cle"ecuidado"a mente & cali!nte"e para di"ol%erlo". l p debe "er 6.8

de"pu!" de la e"teriliación .0nte" de e"teriliarlo$ colóHue"e en tubo"de ermentación con un %ial in%ertido una cantidad "ufciente de mediocomo para Hue cubra e"te$ al meno" parcialmente$ de"pu!" de lae"teriliación. ambi!n e" po"ible pre"cindir del %ial in%ertido & aKadir=$=1 GSL de purpura bromocre"ol al medio pre"unti%o para determinarla producción de ácido$ lo Hue indicarFa un re"ultado po"iti%o en e"taparte de la prueba.

Ci!rren"e lo" tubo" con tapone" de metal o de plá"tico re"i"tente alcalor.

ága"e el medio de lauril tripto"a con uera "ufciente como Huepara Hue al aKadir 1== ml o 1= ml de mue"tra$ la concentración delo" ingrediente" no "ea menor Hue la del medio e"tándar. Ci!rre"e lo"tubo" con tapone" de metal o de plá"tico re"i"tente al calor.

0Kádan"e lo" ingrediente de"'idratado" al agua$ m!cle"ecuidado"amente & cali!nte"e para di"ol%erlo" .l p debe "er de 6.9de"pu!" de la e"teriliación.Pre%iamente colóHue"e la mecla en tubo" de ermentación en una"dimen"ione" Hue permitan Hue el lFHuido$ en el tubo &a inoculado$ cubra

al meno" parcialmente el %ial in%ertido de"pu!" de la e"teriliación. epuede tambi!n pre"cindir del %ial & aKadir =.=1 gSl de purpurabromocre"ol al medio pre"unti%o para determinar la producción deácido$ lo Hue indicarFa un re"ultado po"iti%o en e"a parte de laprueba. Ci!rre"e con tapone" de metal o de plá"tico re"i"tente al calor.

ága"e el medio de lacto"a con uera "ufciente como para Hue $ alaKadir 1== ml o 1= ml de la mue"tra al medio .La concentración conla" directrice" de la tabla anterior.

2.4 "rocedimiento

0gr#pe"e lo" tubo" de ermentación en 'ilera" de cinco en una gradillapara tubo" de en"a&o .l n#mero & el %olumen de lo" tubo" de mue"tra"eleccionado" dependen de la cantidad & de la" caracterF"tica" del aguaHue "e %a&a a e"tudiar.

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página 1=



Para agua potable$ utilFcen"e ( porcione" de 1= ml = 1= porcione" de 1=mlB "i "e trata de agua no potable$ "e utiliaran cinco tubo" por dilución;de 1=$ 1 o =$1 ml$ etc.<

0l 'acer la" dilucione"$ mFdan"e lo" %ol#mene" de mue"tra diluida$

0gFte"e

en!rgicamente la mue"tra & la" dilucione" una" 2( %ece".Inoc#le"e cada tubo con %ol#mene" duplicado" de mue"tra ;endilucione" decimale" creciente"$ "i "e utilian cantidade" decimale" dela mue"tra<.

!clen"e la" porcione" a e"tudiar con el medio mediante agitación"ua%e.Lo" tubo" inoculado" "e incuban a (. ra" 24 agFte"e cada tubo"ua%emente & "e ob"er%a "i "e produce ga" o un crecimiento acido;color amarillo< & $ en ca"o contrario$ re inc#be"e & %u!l%a"e a eJaminaral fnal de 48 'ora". ,egF"tre"e la pre"encia o au"encia de ga" o acido

.ino "e 'a utiliado el %ial$ un crecimiento con acide "ignifca unapre"unta reacción po"iti%a.

2.3.1 "rocedimiento de -" para coliformes fecales

Ji"ten procedimiento" de alta temperatura para "epararmicroorgani"mo" delGrupo coliorme procedente" de uente" ecale" o no ecale". La"

modifcacione" de lo" procedimiento" t!cnico"$ la e"tandariación delo" m!todo" & lo" detallado" e"tudio" de lo" miembro" del grupocoliorme Hue "e encuentran en la" 'ece" de alguno" animale" de"angre caliente comparado" con lo" procedente" de otra" uente"ambientale"$ 'an reafrmado la importancia para determinar lo"coliorme" ecale". La prueba puede 'acer"e con uno de lo" m!todo" detubo" m#ltiple" aHuF de"crito" o por medio de lo" m!todo" de fltro demembrana Hue "e de"criben en el laboratorio #ltimo .l procedimientoen el Hue "e emplea el medio C proporciona una inormación adecuada"obre el origen del grupo coliorme ;ecal o no ecal< cuando "e utilia enla prueba de confrmación .3o debe utiliar"e para el ai"lamiento directo

de coliorme" en el agua$ &a Hue e" nece"ario un enriHuecimiento pre%iode un medio Hue "e pre"uma inectado para con"eguir un ai"lamientoóptimo de coliorme" ecale" .l procedimiento con medio liHuido 0@1 e"un m!todo de un "olo pa"o Hue no reHuiere confrmación.

La prueba para coliorme" ecale" ;con medio C< e" aplicable al e"tudiode la contaminación de corriente" $ agua" naturale" "i"tema" detratamiento de agua" re"iduale" $agua" de baKo$ agua" marina" & para




el control general de la calidad de todo tipo de agua .in embargo$ no"e recomienda como "u"tituto de la prueba completa para coliorme"en el e"tudio de la" agua" potable"$ &a Hue en la" mi"ma" no "e puedentolerar la pre"encia de ning#n tipo de bacteria" coliorme" .La pruebautiliando medio 0@1 e" aplicable al agua de mar & a la" agua"

re"iduale" tratada".

2.3.2 )5lculo y re6istro del nmp

Calc#le"e & regF"tre"e el n#mero de 'allago" po"iti%o" demicroorgani"mo" del grupo coliorme ;&a "ea en la" prueba"confrmatoria" o completa"< n t!rmino" del n#mero má" probable;3P<.La" tabla" indican lo" %alore" del 3P para di"tinta" "erie" de"iembra" & re"ultado" .n e"ta" tabla" $ "e contemplan lFmite" de confana del 9( por 1== para cada %alor del 3P .i lo" %ol#mene" de la

mue"tra utiliado" "on lo" contenido" en la" tabla" $comunFHue"e el%alor corre"pondiente al n#mero de re"ultado" po"iti%o" & negati%o" enla" "erie" de orma de 3PS1== ml.

Lo" %ol#mene" de la mue"tra indicado" en la" tabla" e"tánrelacionado" de orma má" e"pecFfca con la" agua" terminale". n latabla ilu"tra lo" %alore" del 3P para combinacione" de re"ultado"po"iti%o" & negati%o" cuando "e e"tudian %ol#mene" de cinco mue"tra"de 1=$ 1.= & =.1 ml. n ca"o de Hue la" "erie" de dilucione"decimale" "ean di"tinta" de la" de la tabla$ "elecciónen"e lo" %alore" del3P de la tabla 9221:> por la combinación de tubo" po"iti%o".

abla 9221: III Tndice de 3P & Limite" de aceptación del 9( por 1==para di"tinta" combinacione" de re"ultado" po"iti%o" & negati%o" cuando"e emplean cinco porcione" de 1= ml

Numero detubos que

danreacción

positiva de

IndiceNMP/100 ml

Limites deconfanza del

#$P%&I'& IN(%&I'&

0 U 2.2 = 6.=1 2.2 =.1 12.6) (.1 =.( 19.2* 9.2 1.6 29.4+ 16.= . (2.9! V16.= 8.= Infnito




abla 9221: I> Tndice de 3P & lFmite" de aceptación del 9( por 1== paradi"tinta" combinacione" de re"ultado" po"iti%o" & negati%o" cuando "eemplean die porcione" de 1= ml.

Numero de

tubos quedanreacción

positiva deun total de

IndiceNMP/100 ml

Limites de confanza

del ! "

#$P%&I'& IN(%&I'&

0 U 1.1 = .= 1 1.1 =.= (.9 ) 2.2 =.26 8.1 * .6 =.69 1=.6 + (.1 1. 1.4 ! 6.9 2.1 16.8

9.2 .1 21.1 12.= 4. 25.1 16.1 (.9 6.8

2.= 8.1 (9.( 10 U2.= 1.( Infnito

Cuando "e utilicen má" de tre" dilucione" en "erie" de dilucione"decimale"$ "olo "e tomaran lo" re"ultado" de tre" de ella" para calcularel 3P .Para "eleccionar la" tre" dilucione" a utiliar en la determinacióndel Fndice del 3P$ enli*ándo"e la dilución má" alta con re"ultadopo"iti%o entre la" cinco e"tudiada" ;no 'a& ninguna dilución menor Hue'a& dado un re"ultado negati%o< & la" do" "iguiente" dilucione" má"alta". Para calcular el Fndice del 3P$ utilFcen"e lo" re"ultado" de e"to"tre" %ol#mene" .n el e*emplo "iguiente$ lo" re"ultado" de la dilución"ignifcati%a "e orecen en negrita". l numerador repre"enta lo" tubo"po"iti%o" & el denominador$ el total de tubo" e"tudiado"$ lacombinación de po"iti%o" indica #nicamente el n#mero total de tubo"po"iti%o" por dilución:

abla 9221: > Tndice de 3P & lFmite" de aceptación de 9( por 1==para di"tinta" combinacione" de re"ultado" po"iti%o" cuando "e u"ancinco tubo" por dilución ;1= ml$ 1.= ml$ =.1 ml$ etc.<




2ombinacion de

ositiv

Indice

NMP/100

Limitesde

2ombinacion de

ositiv

Indice

NMP/100

Limitesde

#upe In3er #upe In3er04040

040410414004)40

U22

2

4

@

1.=1.=1.=

@

1=1=1

4@2@=

4@2@14@@=4@@14@4@4

22

26254

9.=

12121(16

(6

6(65558=

1404014041141401414114)40

2

4

4

6

6

1.=1.=1.=2.=2.=

111(1(1818

(@=@=(@=@1(@=@2(@1@=(@1@1(@1@2

2=4==(=6=

9.=1=2=1=2==

8611=14=12=1(=18=

)4040)4041)4140)4141)4)40)4*40

4

5

5

9

9

12

1.=2.=2.=.=.=(.=

152=21242(29

(@2@=(@2@1(@2@2(@@=(@@1(@@2

(=5=9=8=11=14=

2==4==4=6=

15=21=2(=2(===6=

*4040*4041*4140*4141*4)40*4)41

8

1111141415

.=4.=4.=6.=6.=5.=

242929((4=

(@@(@4@=(@4@1(@4@2(@4@(@4@4

15=1=15=22=28=(=

8=(=5=1==12=16=

41=9=48=(8=69=82=

+4040+4041+4140

+4141+414)

11515

2126

(.=5.=5.=

9.=12

84(46

((6

(@(@=(@(@1(@(@2

(@(@(@(@4(@(@(

24===(==

9==16==VW16==

1==1==2==

==6==@

94=1==2===

29==(==@




2.3.3 "#$%&' % "#%(%-)I' O '$(%-)I' "7' %)O*I!O#%(

La prueba de pre"encia@au"encia ;P@0< de coliorme" e" una "encillamodifcacióndel procedimiento de tubo" m#ltiple". La "implifcación Hue "e deri%ade utiliar una "ola porción grande ;1== ml< en una "ola botella deculti%o para obtener una inormación cualitati%a "obre la pre"encia oau"encia de coliorme"$ "e *u"tifca por la teorFa de la alta de e"to"microorgani"mo" en una mue"tra de 1== ml de agua potable. Laprueba de P@0 proporciona ademá" una oportunidad opcional para'acer una detección "i"temática po"terior del culti%o & ai"lar otro"indicadore" ;coliorme" ecale"$ 0eromona"$ tap'&lococcu"$P"eudomona"$ e"treptococo" ecale" & Clo"tridium<$ tambi!n de maneracualitati%a. )tra" %enta*a" "on la po"ibilidad de e"tudiar un ma&orn#mero de mue"tra" por unidad de tiempo & 'acer e"tudio"comparati%o" con el procedimiento de fltro de membrana$ Hue indicaHue la prueba de P@0 puede aumentar al máJimo la detección decoliorme" en mue"tra" Hue contiene microorgani"mo" Hue podrFan"obrepa"ar en "u crecimiento al de la" colonia" de coliorme" $pro%ocando problema" para "u detección.

La prueba de P@0 "e recomienda para el e"tudio 'abitual de la" mue"tra"obtenida" en lo" "i"tema" de di"tribución o en la" planta" detratamiento" de agua". n principio$ "e e"tudian alrededor de 1==mue"tra" por lo" m!todo" del fltro de membrana o de lo" tubo"m#ltiple" $ ademá" de la prueba de P@0. -na %e e"tablecido" Hue lo"m!todo" cuantitati%o" "uelen dar re"ultado" negati%o" para coliorme"$"e pueden utiliar #nicamente la prueba de [email protected] una mue"tra produce un re"ultado po"iti%o en e"ta prueba$ "ee"tudiaran la" po"teriore" mue"tra" repetida" mediante un m!todocuantitati%o$ 'a"ta Hue "e %uel%an a obtener re"ultado" negati%o" endo" mue"tra" con"ecuti%a". La" mue"tra" tomada" en localiacione"poco 'abituale"$ como lo" poo" pri%ado"$ "e analiaran con m!todo" detubo" m#ltiple" o de fltro de membrana.

Prueba de P@0 para coliorme"$ 'ága"e la ormula con una uera triple

en ca"o de Hue %a&an a e"tudiar"e mue"tra" de

1== ml .i"u!l%an"elo" ingrediente" del medio de lacto"a & el de lauril tripto"a$ uno tra" otro$en agua de"tilada "in calentar $utiliando un in"trumento de agitación.i"u!l%a"e el p#rpura bromocre"ol en 1= ml de 3a) al =.1 3 &aKáda"e a la "olución del medio.

>i!rtan"e (= ml del medio en una botella de dilución con tapón dero"ca de 2(= ml de %olumen .3o e" nece"ario introducir un tubo de

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página 1(



ermentación .e pa"a 12 minuto" por el autocla%e a 121 C $ limitandoel tiempo total de autocla%e a = minuto" o meno". l p debe "er de6.8 de"pu!" de la e"teriliación.

Procedimiento: 0gFte"e la mue"tra una" 2( %ece" e inoc#le"e 1== ml en

el medio de

culti%o P@0 .!cle"e cuidado"amente$ in%irtiendo labotella cuatro o cinco %ece" para con"eguir una di"tribución uniormedel medio en la totalidad de la mue"tra .Inc#be"e a ( & ob"!r%e"e ala" 24 & 48 'ora" para detectar po"ible" reaccione" acida".Cuando "e producen$ la ermentación de la lacto"a adHuiere un clarocolor amarillo. i tambi!n "e producen ga"$ la "ua%e agitación de labotella producirá e"puma. CualHuier cantidad de ga" acido o ambo"con"titu&en un re"ultado pre"untamente po"iti%o$ Hue reHuiereconfrmación. odo" lo" culti%o" Hue mue"tran reacción acida oormación de ga" "e pa"an a un medio de %erde brillante lacto"a bili";>/L/<$ Hue "e incuba a (

.C< I3,P,0CI)3: La aparición de ga" en el medio >/L/ en 48 'ora"confrma la pre"encia de bacteria" coliorme"$ lo" re"ultado" "ecomunican como prueba de pre"encia@au"encia po"iti%a o negati%a paracoliorme" totale" en 1== ml de mue"tra.

Prueba" opcionale" de p@a$ la detección de coliorme" ecale"$e"treptococo" ecale" u otra" bacteria" indicadore" puede 'acer"emediante una prueba de P@0$ "eleccionando adecuadamente lo"medio" confrmatorio" & el tiempo & temperatura de incubación. ltratamiento del agua & otra" condicione" ambientale" ad%er"a" "uelen

pro%ocar alteracione" en la" bacteria" indicadora"$ ampliando "u a"ede repo"o ante" de Hue "e produca el crecimiento logarFtmico.

i "e amplFa la incubación de la prueba de P@0 a 52 o 96 'ora"$ e"recuente Hue puedan ai"lar"e otro" microorgani"mo" indicadore" .3o "edeben ai"lar bacteria" indicadora" .3o "e deben ai"lar bacteria"indicadora" para regularla" de"pu!" de lo" 'abituale" 48 'ora" deincubación .3o ob"tante$ e"ta inormación podrá "er%ir al laboratoriopara ad%ertir a la planta de tratamiento del agua de Hue e"ta pre"entapotenciale" problema" de calidad.

2.3.4 "rocedimiento

Con"er%ación & tran"porte de la mue"tra: it#e"e una compre"aab"orbente en el "uelo de una placa de Petri e"t!ril & "at#re"e con elmedio de con"er%ación de coliorme" "eleccionado ;%!a"e "ección9222C.2<. ,etFre"e el fltro de membrana de la unidad de fltración pormedio de pina" e"t!rile" & arrólle"e con el lado de la matri 'aciaarriba$ en la "uperfcie del medio de con"er%ación elegido. Prot!*a"e la




membrana de la p!rdida de 'umedad cerrando bien la placa de Petri deplá"tico. %Fte"e la de"'idratación de la membrana durante eltran"porte. ColóHue"e el di"co de culti%o Hue contiene la membrana enun en%a"e adecuado & en%Fe"e al laboratorio para completar el e"tudio.Puede mantener"e la mue"tra "in crecimiento %i"ible durante un

máJimo de 52 'ora" en e"te

medio de con"er%aciónSmantenimiento."te tiempo "uele ba"tar para "u en%Fo por correo o medio detran"porte 'abitual. i la" temperatura" "on ele%ada"$ durante eltra&ecto aparecerá a %ece" crecimiento %i"ible en el medio detran"porte.

ran"erencia: n el laboratorio$ la membrana del di"co de plá"tico enel Hue 'a "ido en%iada "e tran"fere a una "egunda placa de Petri e"t!rilcon medio @ndo o L ndo.

Incubación:

!todo @ndo. ran"f!ra"e la membrana del medio de con"er%ación @ndo a una compre"a & a una placa de Petri con medio @ndo "in lo"reacti%o" in'ibidore" del crecimiento e inc#be"e a ( X =$( YC durante2=@22 'ora".!todo L. ran"f!ra"e la membrana del medio de con"er%ación L+ al agar L ndo ;%!a"e "ección 9222/.2< e inc#be"e a ( X =$( ZCdurante 2=@22 'ora". i en el momento de la tran"erencia "e ob"er%ancolonia" "in nece"idad de aumento$ con"!r%e"e la placa de Petri Huecontiene la membrana tran"erida a ( @1= ZC 'a"ta Hue pueda "er incubada a ( X =$( ZC durante 16 @18 'ora". "ta manipulación deltiempo de incubación permite controlar lo" problema" de crecimiento

eJce"i%o & di"ipación del brillo Hue pue@ den intererir con el recuentode la" colonia" de coliorme".

Cálculo de la den"idad de coliorme"Prec!da"e como "e indica en la anterior "ección 9222/.6. ,egF"tre"e elmomento de la toma de la mue"tra$ de la fltración & del e"tudio en ellaboratorio$ & calc#le"e el inter%alo temporal tran"currido$ Hue con"taráen el inorme *unto con lo" re"ultado".

2.3.5 "rocedimiento de filtro de membrana para coliformes

fecales

La den"idad de bacteria" coliorme" ecale" puede determinar"e por unprocedimiento de tubo" m#ltiple" o por una t!cnica de fltro demembrana ;+<. i "e utilia e"ta #ltima para eRuente" clorado"$ante" de aceptarla como alternati%a %álida 'a& Hue comprobar Hue"umini"tre una inormación comparable a la Hue "e obtiene por elanáli"i" de tubo" m#ltiple".




n la t!cnica de + "e utilian un medio de lacto"a enriHuecido & unatemperatura de incubación de 44$ ( X =$2 ZC para con"eguir"electi%idad$ obteni!ndo"e una eJactitud del 9 por 1== en ladierenciación entre lo" coliorme" Hue "e encuentran en la" 'ece" delo" animale" de "angre caliente & lo" procedente" de tora" uente"

ambientale". ado Hue la temperatura de incubación e" e"encial$"um!r*an"e lo" culti%o" de + a prueba de agua ;metido" en bol"a" deplá"tico< en un baKo de agua para poder incubarlo" a e"ta ele%adatemperatura o utilFce"e una adecuada & eJacta incubadora.

1. ateriale" & medio" de culti%o

a< edio @+C: La nece"aria uniormidad obliga a emplear medio"de"'idratado". 3unca "e preparan medio" a partir de "u"ingrediente" bá"ico"$ "i "e di"pone de medio" de"'idratado"adecuado". Para la re'idratación$ "Fgan"e la" in"truccione" de lo"

abricante". ambi!n pueden utiliar"e medio" comerciale" enorma lFHuida ;ampolla" e"t!rile" u otro"<$ "iempre Hue "e "epaHue "u" re"ultado" "on eHui%alente".

b< edio @+C:5riptosa o biosate 1060 7

Proteosa peptona n8 * o ($= g%-tracto de levadura $= g

2loruro #ódico6 Na2l ($= g

Lactosa 12$( g

#ales biliares n8 * o mezclade sales biliares

1$ ( g

9zul anilina =$1 g

97ua destilada 1 l

,e'idráte"e en agua de"tilada con 1= ml de ácido ro"ólico al 1 por 1==en 3a) al =$2 3. Cali!nte"e 'a"ta ca"i ebullición$ retFre"e rápidamentedel calor & enrFe"e a meno" de (=ZC. 3o "e e"terilia en autocla%e.i%Fda"e en porcione" de (@5 ml & colóHue"e en placa" de Petri de (= J12 mm donde "e de*a "olidifcar "i "e utilia agar. l p fnal debe "er de5$4. Con"!r%e"e el medio preparado a 2@1=ZC$ rec'aándo"e a la" 2"emana" el no utiliado.

Compru!be"e cada lote de medio en unción de "u producti%idad$preparando dilucione" de un culti%o de "c'eric'ia coli ;"ección 9=2=< &fltrando %ol#mene" adecuado" para obtener 2=@8= colonia" por fltro.>eriFHuen"e en cada nue%o lote de medio 1= o má" colonia"




obtenida" a partir de %aria" mue"tra" naturale" con ob*eto de e"tablecerla au"encia de re"ultado" po"iti%o" al"o".

n la ma&orFa de la" mue"tra" "e puede utiliar el medio @+C "innece"idad de aKadir ácido ro"ólico al 1 por 1==$ "iempre Hue no "e

producan intererencia" debida" al crecimiento de ondo. "ta"intererencia" "on de e"perar en agua" de llu%ia Hue ormen

2.3.6 "rocedimiento de incubación retardada para coliformesfecales

"te procedimiento de incubación retardada e" "imilar al Hue "e utiliapara lo" coliorme" totale" ;"ección 9222C<. 3o 'a& nece"idad dedi"poner de un baKo de agua de campo para 'acer la incubación & liberaal anali"ta de la larga tarea Hue "upone el recuento de la" colonia". l

e"tudio en el laboratorio central$ en %e de 'acerlo en el campo$ permiteconfrmar la" colonia" e identifcar por completo lo" microorgani"mo" pormedio" bioHuFmico"$ en ca"o nece"ario.

Lo" re"ultado" Hue con"igue e"te m!todo retardado concuerdan conlo" obtenido" en prueba" e"tándar inmediata" en di"tinto" laboratorio"& en di%er"a" condicione" de u"o en el campo. in embargo$ "e deberádeterminar la aplicabilidad de la prueba para una uente de aguae"pecFfca$ comparándola con la e"tándar de fltro de membrana$"obre todo en ca"o" de agua "alada$ agua" re"iduale" clorada" & agua"Hue contengan "u"tancia" tóJica". La prueba retardada "ólo "e utiliará

cuando no "ea po"ible realiar la prueba 'abitual inmediata paracoliorme" ecale".

Para lle%arla a cabo$ Fltre"e la mue"tra en el campo inmediatamentede"pu!" de 'acer la toma$ colóHue"e el fltro en un medio demantenimiento @>+C ;%!a"e 2a$ má" adelante< & en%Fe"e allaboratorio. La prueba para coliorme" ecale" "e completa pa"ando elfltro a un medio @+C$ incubándolo a 44$( C durante 24 [ 2 'ora" &'aciendo un recuento de la" colonia" de coliorme" ecale".

l medio @>+C mantiene %iable" lo" microorgani"mo" coliorme"

ecale"$ pero e%ita -3 crecimiento %i"ible durante el tran"porte. lmedio de mantenimiento @>+C permite con"er%ar lo" fltro" demembrana 'a"ta dFa"$ "in Hue ello produca un eecto importante"obre el recuento de e"ta" bacteria".

Procedimiento6 tran"porte del fltro de membrana: ColóHue"e unacompre"a ab"orbente en una placa Petri de plá"tico Hue cierre bien &"at#re"e con medio de mantenimiento @>+C. ra" fltrar la mue"tra$




retFre"e el fltro de membrana de la unidad de fltración & colóHue"e enla compre"a "aturada de medio.

-tilFcen"e placa" con cierre 'erm!tico para e%itar la p!rdida de'umedad en la placa$ aunHue tambi!n 'a& Hue tener cuidado de Hueno 'a&a eJce"o de lFHuido. it#e"e la placa con la membrana en un

en%a"e de tran"porte adecuado & en%Fe"e al laboratorio.

La" membrana" pueden permanecer en el medio de tran"porte atemperatura ambiente durante un máJimo de 52 'ora"$ "in Hue elloaecte de orma importante al recuento de coliorme" ecale".

ran"erencia: n el laboratorio$ retFre"e la membrana del medio demantenimiento & colóHue"e en otra placa con medio @+C.

Incubación: -na %e "ituado el fltro en el medio @+C$ introd#can"ela" placa" 'erm!tica" en bol"a" de plá"tico "umergible" & "um!r*an"een un baKo de agua a 44$( X =$2ZC durante 24 X 2 'ora"$ o bienutilFce"e una incubadora.

,ecuento: La" colonia" producida" por lo" coliorme" ecale" pre"entandi"tinto" tono" de aul. La" colonia" de coliorme" no ecale" "on decolor gri" a cremo"o. l recuento "e realia por medio de una lupae"tereo"cópica binocular de campo amplio & 1= a 1( aumento".

2.8 )5lculo de la densidad de coliformes fecales

,egF"tre"e el momento de la toma de la mue"tra$ el de la fltración & eldel e"tudio en el laboratorio$ calculándo"e el inter%alo de tiempo$ Hue"e 'ará con"tar en el inorme.




,e"ultado":




2.4.1 !ase presuntiva y recuento de bacterias heterotróficas

IL$2I'N 1 ml

5ub Cambio notable ;opaco<$ ga" moderado "in5ub

Cambio le%e$ ga" abundante$ 'a& crecimiento$ poca5ub

Cambio notable ;opaco<$ abundante ga"5ub

Cambio le%e$ no 'a& ga"$ "i 'a& crecimiento5ub

Cambio notable ;opaco<$ no 'a& ga"$ 'a& crecimiento$

IL$2I'N104 ml

5ub 3o 'a&5ub

3o 'a&5ub

3o 5ub

3o 'a&

5ub

3o 'a&




IL$2I'N 104) ml

5ubo 1 3o 'a& cambiode5ubo ) 3o 'a&

cambio de 5ubo * 3o 'a&

cambio de 5ubo + 3o 'a&

cambio de 5ubo ! 3o 'a&

cambio de

M$%#5&9 IL$2I'N N;M;P

1 1041 104)< 4 1 = S ( = S ( = S ( <2

=a>o (I9

< 4 ) 2 S ( 2 S ( 1 S 4 ----------

=a>o <imnasio

< 4 ! = S ( = S ( = S ( <2

=a>o (I2




M$%#5&9 IL$2I'N $;(;2;/ ml

'=#%&?92I'N:

$tilizando1 104 104

< 4 1 >300 28( 56 @@@ amaKo: 1 @ (mm.=a>o (I9

< 4)

=a>o

5=9 16( 5656== amaKo: 1 @

(mm.< 4 ! 1= 58 2 58= amaKo: 1 @ (

mm.

=a>o (I2

i "e ob"er%a turbide & producción de ga": Prueba pre"unti%a po"iti%a.ectuar prueba confrmati%a para todo" lo" tubo" po"iti%o".

0u"encia de ga" para todo" lo" tubo" aun cuando 'a&a turbide:Prueba pre"unti%a negati%a$ por lo tanto$ grupo coliorme au"ente."Huema de la prueba completa para la detección de lo" coliorme"totale".




2.9 )onclusiones

n la prueba de pre"unción ;"i "e con"idera lo" re"ultado" tra" un"upue"to monitoreo<$ "e d! a pre"umir la pre"encia de coliorme" en el

ambiente del /aKo Gimna"ioComo "e encontró tubo" po"iti%o" en una de la" mue"tra" "e tendráHue proceder a la prueba confrmati%a en aHuello" tubo" po"iti%o"mencionado" ;en medio />L/<.

2.: #ecomendaciones

ener precaucione" Con el mane*o del agar




4 Técnica de !ermentación de tubos múltiples, !aseconfirmativa, y "rueba de )oliformes !ecales.

4.1 ObjetivosConfrmar la pre"encia de lo" microorgani"mo" ;bacteria"< pre"ente" enlo" tubo" po"iti%o" tra" una prueba en el agar />L/.


3.2.1 3erde &rillante &ilis 2; )aldo.

"te medio e"tá recomendado para el recuento de coliorme" totale" &ecale"$ por la t!cnica del n#mero má" probable.

n el medio de culti%o$ la peptona aporta lo" nutriente" nece"ario" parael adecuado de"arrollo bacteriano$ la bili" & el %erde brillante "on lo"agente" "electi%o" Hue in'iben el de"arrollo de bacteria" Gram po"iti%a"& Gram negati%a" a eJcepción de coliorme"$ & la lacto"a e" el 'idrato decarbono ermentable." una propiedad del grupo coliorme$ la ermentación de la lacto"a conproducción de ácido & ga".

+órmula ;en gramo" porlitro In"truccione"

=ilis de bue@ 2=.= u"pender 4= g del pol%odesAidratada de"'idratado por litro deLactosa 1=.= de"tilada. i"ol%er &Peptona 1=.= por tubo con campanita de?erde brillante =.=1 Preparar ademá"$ el medio a

concentración. "teriliar enautocla%e a 121C durante

minuto".

3.2.2 (iembra

a.@ Para el análi"i" de coliorme" totale" en mue"tra" Ruida"$ "embrarpor triplicado: 1= ml en caldo doble concentración & 1ml & =$1 ml encaldo "imple concentración.




3#merode

>olumende la

>olumende

Concentracióndel

* 1= ml 1= ml oble

* 1 ml 1= ml imple* =.1 1= ml imple

b.@ Para el análi"i" de coliorme" totale" en mue"tra" "ólida" ;alimento"$

co"m!tico"$ ármaco"<$ eectuar dilucione" "eriada" 1=416 1=4) & 1=4* &"embrar cada dilución por triplicado en medio de culti%o "impleconcentración.

3#mero

de

ilución

dela

>olumen

de la

>olumen

de

Concentración

del* 41 1 ml 1= imple* 1=4) 1 ml 1= imple* 1=4* 1 ml 1= imple

c.@ Para análi"i" de coliorme" ecale"$ a partir de cada tubo po"iti%o en el te"tpre"unti%o de coliorme" totale" ;pro%eniente de >erde /rillante & /ili" 2ACaldo o ac ConDe& Caldo ó Lauril ulato$ utiliando la t!cnica del 3P<$ o apartir de colonia" pre"ente" en dierente" medio"$ Hue "e pre"ume "eancoliorme"$ tran"erir una an"ada a un tubo con >erde /rillante & /ili" al 2Acaldo re"co$ incubando a 4( [S@ =.( ZC & otra en 0gua riptona con incubación

a (@5ZC$ para detectar la producción de indol.

3.2.3 Incubación

Para de coliorme" totale": a (@5 C durante 24 'ora".Para coliorme" ;ecale"<: a 44.(@4(.( C durante 24 'ora".

3.2.4 #esultados

@Po"iti%o: pre"encia de ga".Con el n#mero de tubo" po"iti%o"$ calcular el n#mero má" probable. lre"ultado "e eJpre"a por gramo" ó 1== ml de producto@3egati%o: au"encia de ga".CaracterF"tica" del medioedio preparado: %erde e"meralda$ tran"parente




3.2.5 'lmacenamiento

edio de"'idratado: a 1=@( ZC. edio preparado: a 2@8ZC.

4.4 "rocedimiento







4.8 2.8. #esultados

Para Coliorme" +ecale":

b< Prueba Confrmati%a ;media %erde brillante bili"<

M$%#5&9 IL$2I'N

1 1041 104)< 4 1 3o

'a&@@@@@@ @@@@@@

=a>o (I9< 4 ) 2 S 2 2 S 2@ @1 S 1

=a>o <imansio< 4 ! 3o

'a&

@@@@@@ @@@@@

=a>o (I2

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página =



4.9 )onclusiones

e confrma la pre"encia de coliorme" en la mue"tra obtenida del /aKodel Gimna"io.n el /aKo +IC eJi"te una incongruencia debido a la aparición de ga" "in

mo"trar alg#n tipo de crecimiento por lo Hue "e deberá %ol%er a realiarla prueba para le%antar dic'a incongruencia.

e confrma Hue en el baKo de la +I0 no eJi"te "eKale" de coliorme"$ porel momento$ conorme a la" prueba" corre"pondiente" ;P,-3I>0 ?C)3+I,0I>0 ,PCI>03<ado lo" re"ultado" tendremo" Hue determinar el tipo de coliormemediante una P,-/0 C)PL30,I0.

8 Identificación del +rupo )oliforme, Técnica de!ermentación en tubos múltiples< "ruebacomplementaria.

8.1 Objetivos

eterminar la pre"encia de bacteria" gran no e"porulada" procedente"de lo" culti%o" con agar ;emo"tración del grupo coliorme<

>er "i el tipo de coliorme e" del tipo ecal o no ecal.

>er Hu! tipo de bacteria "e pre"enta en la" mue"tra" mediante unaprueba I>IC


4.2.1 %* +#$"O )O*I!O#%

"te grupo de bacteria" comprende todo" lo" bacilo" aerobio" &anaerobio" acultati%o"$ Gram negati%o"$ no e"porulado" Hue producenácido & ga" al ermentar la lacto"a. La" e"pecie" clá"ica" de e"te grupo"on "c'eric'ia Coli & nterobacter aerogene".




La relación de e"to" microorgani"mo" con otro" del grupo enterico \almonella$ 'igella$ Proteu"$ p"eudomona" & alcaligene"$ todo" lo"cuale" "on bacilo" Gram negati%o" no e"porulado" coli$ como &a 'abFa"ido "eKalado$ e" un 'abitante normal del inte"tino 'umano & de lo"animale". nt aerogene" e" má" recuentemente en grano" & planta"

pero tambi!n en la" materia" ecale". Como e"ta" e"pecie" tienen gran"eme*ana en "u a"pecto morológico & caracterF"tica" de culti%o$ e"nece"ario recurrir a prueba" bioHuFmica" para dierenciarla". ,eaccione"Hue tengan la" "iguiente" cuatro caracterF"tica" "on mu& importante"para lograr e"te propó"ito:Capacidad para producir indol.. coli lo produce$ & nt aerogene" no.

Cantidad de ácido producida en un medio e"pecial de caldo gluco"adoadicionado del indicador ro*o de metilo .Lo" do" microorgani"mo"producen acido de la gluco"a .in embargo$ coli produce p má"ba*o $lo Hue 'ace Hue %ire al ro*o de metilo $mientra" Hue nt aerogene"

no cambia el color.Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un medio de peptonagluco"ado. "te compue"to HuFmico "e detecta por la reacción de>ogue"@Pro"Dauer . coli no produce acetilmetilcarbinol mientra" Huent. 0erogene" "i lo 'ace.

-tiliación del citrato de "odio. nt aerogene" e" capa de utiliar elcitrato de "odio como "u #nica uente de carbono$ e"to e"$ "ede"arrollara en un medio de culti%o HuFmicamente defnido en el cual elcitrato de "odio e" el #nico compue"to de carbono .. coli no "e

de"arrollara en e"ta" circun"tancia".Por con%eniencia$ a e"ta" prueba" "e le 'a de"ignado de ormacolecti%a reaccione" I>IC ;IWindol$ Wro*o de metilo$ >iWreacción%ogue"@Pro"Dauer & CW Citrato<.n la tabla mo"trada a continuación "eaprecia la" reaccione" de cada una de la" e"pecie" tFpica" .La"reaccione" de lo" microorgani"mo" del grupo coli@aerogene".

'&<9NI#M'

&%922I'N

IN'L &'B'

?'<%#4

2I5&95'

"c'eri

c'ia

D D 4 4

nterobacter

4 4 D D

ierenciación de la" cepa" tFpica" de "c'eric'ia coli de enterobacteraerogene" en ba"e de la" reaccione" I>IC




e"aortunadamente no "on tan clara" como la" Hue de"criben aHuF.0lguno" culti%o" re"ponden con otra" combinacione" de reaccione" ae"te e"Huema de prueba" & generalmente "e le" conoce como tipo"intermedio". 0demá"$ 'a& e"pecie" del g!nero leb"iella & CitrobacterHue "e parecen a lo" coliorme" & de la" cuale" e" nece"ario obtener

dato" bioHuFmico" & "erológico" má" detallado" para poderdierenciarla".

4.2.2 T%)-I)' % !I*T#')IO- "O# %-&#'-'(

La t!cnica de fltración por membrana para el eJamen bacteriológicodel agua$ Hue con"i"te en lo" "iguiente" pa"o":-n di"co fltrante e"t!ril "e pone en la unidad de fltración.

e 'ace pa"ar un %olumen de agua por el di"co fltrante$ la" bacteria"

"erán detenida" en la "uperfcie de la membrana.

e Huita el di"co fltrante & "e pone "obre una almo'adilla ab"orbenteHue pre%iamente "e 'a "aturado con el medio de culti%o apropiado.La" almo'adilla" ab"orbente" con lo" di"co" fltrante" "e acomodan enca*a" de Petri de tamaKo e"pecial$ la" cuale" "e incuban.

e"pu!" de la incubación$ "e de"arrollaran colonia" "obre el di"cofltrante en cualHuier lugar donde 'a&an Huedado bacteria" atrapada"donde 'a&an Huedado bacteria" atrapada" durante el proce"o defltración

"ta t!cnica tiene muc'a" aplicacione" #tile"$ alguna" de ella" de la"cuale" "on:

e pueden eJaminar grande" %ol#mene" de aguaB teóricamente ca"icualHuier %olumen de agua "e puede fltrar a tra%!" del di"co & lo"microorgani"mo" de cualHuier %olumen Huedaran en el di"co.

La membrana "e puede pa"ar por un medio a otro con un propó"ito de "eleccionar & dierencia" lo" microorgani"mo".

e obtienen re"ultado" má" rápido" Hue con lo" m!todo"con%encionale".

e logran e"timacione" cuantitati%a" de cierto" tipo" de bacteria"$ comocoliorme"$ cuando "e u"an lo" medio" apropiado".

"ta t!cnica con alguna" modifcacione"$ 'a "ido adoptada para muc'o"procedimiento" microbiológico" dierente" a lo" del eJamen del agua.

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página



4.2.3 T%)-I)' %* !I*T#O % %-&#'-' "'#' I%-&#O(

%* +#$"O % *O( )O*I!O#%(La t!cnica de fltro de membrana ;+< e" altamente reproducible$puede utiliar"e para e"tudiar %ol#mene" relati%amente grande" demue"tra & proporciona re"ultado" num!rico" má" rápido" Hue el m!todode lo" tubo" m#ltiple". La t!cnica del fltro de membrana e"eJtraordinariamente #til para controlar la" po"ible" "ituacione" deurgencia en relación con el agua potable & para e"tudiar di"tinta" agua"naturale" .in embargo$ e"ta t!cnica tiene limitacione"$ " o b re todopara e"tudiar agua" con ele%ada turbide o Hue contenga bacteria" nocoliorme". Para e"ta agua$ & tambi!n en ca"o de Hue no "e 'a&a

utiliado anteriormente la t!cnica de fltro de membrana$ e" preeriblelle%ar a cabo prueba" paralela" mediante la t!cnica de ermentación entubo" m#ltiple" demo"trar la aplicabilidad & comparabilidad de aHuella.

1 +I3ICI)3

n lo Hue "e refere a la t!cnica de fltro de membrana$ el grupocoliorme puede defnir"e como el ormado por la" bacteria" aerobia" &anaerobia" acultati%a"$ Gram negati%a"$ no e"porulada" & de orma

alargada$ Hue de"arrollan una colonia ro*a con un brillo metálico en unmedio tipo ndo Hue contenga lacto"a tra" una incubación de 24 'ora"a (C .0l e"tudiar culti%o" purifcado" de bacteria" coliorme" $ "eob"er%a una reacción de citocromo oJida"a;C)< negati%a & una de;)3PG< po"iti%a. n e"ta t!cnica$ toda" la" colonia" ro*a"$ ro"ada"$aule" blanca" o incolora" Hue no tienen brillo "uelen "er con"iderada"como no coliorme".

2. 0PLIC0CI)3

La turbide producida por la eJi"tencia de alga" u otro tipo de materialpuede impedir el e"tudio de un %olumen de mue"tra "ufciente paraobtener re"ultado" "ignifcati%o". La pre"encia de un ele%ado n#mero deno coliorme" o de "u"tancia" toJica" puede dar lugar a un cálculo decoliorme" inerior al real .La t!cnica del + e" aplicable al e"tudio dela" agua" "alada"$ pero no al de agua" re"iduale" Hue "olo 'anrecibido un tratamiento primario$ "eguido de cloración$ debido a "u




turbide en mue"tra" de grande" %ol#mene" o a "u contenido enmetale" o compue"to" orgánico" tóJico" del tipo de lo" enole".

Para detectar lo" coliorme" totale" alterado" en el agua potable tratada& en la" agua" re"iduale" "ecundaria" o terciaria" clorada"$ utilFce"e el

m!todo de"tinado a recuperar lo" microorgani"mo" en condicione"anómala" para lo" coliorme" ecale" $ "e recurre a la t!cnica deermentación en tubo" m#ltiple"$ "iempre Hue lo" re"ultado" debanutiliar"e para obligar al cumplimiento de la" norma".Puede emplear"e una modifcación para coliorme" ecale" de lat!cnica del fltro de membrana$ "i lo" e"tudio" paralelo" con la t!cnicade ermentación en tubo" m#ltiple" mue"tran re"ultado" comparable"para tipo" de mue"tra e"pecFfco" de una localiación.l %olumen e"tándar Hue "e %a a fltrar en la" mue"tra" de agua potablee" de 1= ml Hue$ "i e" nece"ario$ puede di"tribuir"e a lo largo de %aria"membrana". l agua potable tratada no debe contener coliorme" por

1== ml$ por lo Hue la" planta" de tratamiento de agua deben tomar encon"ideración el e"tudio de mue"tra" de 1.1 de agua terminal$ "iempreHue no eJi"tan partFcula" Hue interferan en la fltración o el de"arrollode colonia" ai"lada".

n e"to" ca"o"$ di%Fda"e la" mu e" t ra " en cuatro porcione" de 2(=ml & comunFHue"e la totalidad de coliorme" ob"er%ado" en toda" la"membrana" .Para otro tipo de agua" o en análi"i" e"peciale"$ puedenutiliar"e mue"tra" de ma&or o menor %olumen.

La comparación e"tadF"tica de lo" re"ultado" obtenido" con el m!todo delo" tubo" m#ltiple" & el de fltro de membrana mue"tran la ma&orpreci"ión de e"te #ltimo$ 0unHue lo" dato" de amba" prueba" denre"ultado" ba"tante preci"o" "obre la calidad del agua $ lo" re"ultado"num!rico" no "on id!ntico". n el ca"o de agua" naturale"$ e" lógicoe"perar Hue el 8= por 1== de lo" análi"i" de fltro de membrana e"t!ndentro de lo" lFmite" de confana del 9( por 1== de lo" re"ultado" de laprueba completa de tubo" m#ltiple" ." de e"perar Hue lo" re"ultado"de la prueba de tubo" m#ltiple" "uperen lo" del fltro de membrana$debido a una de"%iación e"tadF"tica po"iti%a.

4.2.4 "rocedimiento est5ndar de filtro de membrana paracoliformes totales

In"trumental de Laboratorio

Lo" análi"i" del fltro de membrana reHuieren in"trumental de %idrio &otro" aparato" abricado" "in agente" Hue pueden producir eecto"

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página (



ad%er"o" "obre el crecimiento bacteriano. 0nóten"e cuidado"amentetoda" la" de"%iacione" Hue "e producan "obre la" recomendacione"eJpue"ta" má" adelante & 'ágan"e prueba" cuantitati%a" parademo"trar Hue e"ta" de"%iacione" no 'an introducido agente" oactore" Hue den lugar a condicione" meno" a%orable" para el

crecimiento bacteriano."terilFce"e el in"trumental de %idrio como "e de"cribe en La%ado &"teriliación$ "ección 9=4=.

0nte" de e"teriliarlo"$ tápe"e la boca de lo" cilindro" graduado" conpapel metálico u otro papel adecuado.n%a"e" del medio de culti%o: Para reducir la contaminación bacteriana$ utilFcen"e matrace" de %idrio boro "ilicato limpio" & pre e"teriliado".e pueden utiliar matrace" de cualHuier orma & tamaKo$ pero paracon"eguir una buena mecla del medio & para "u con"er%ación lo" má"

recomendable" "on lo" erlen me&er de tapone" metálico"$ lo" cubierto"con papel metálico o lo" Hue tienen tapón de ro"ca.

Placa" de culti%o: -tilFcen"e placa" e"t!rile" de %idrio boro "ilicato ode"ec'able" del tipo Petri de 6= mm u otro tamaKo adecuado. La"placa" de %idrio para culti%o$ limpia" & en%uelta" por "eparado o enn#mero adecuado en papel metálico$ "e e"terilian con calor "eco o enpapel adecuado en ca"o de Hue la e"teriliación "e realice enautocla%e.

La" placa" de culti%o de %idrio & alguna" de plá"tico de"ec'able" tienen

a %ece" tapadera" mal a*u"tada"$ lo Hue "e procurara e%itar duranteperdida de 'umedad por e%aporación$ Hue pro%ocarFa la de"ecación delmedio & la p!rdida del ambiente '#medo adecuado para un óptimode"arrollo de la" colonia".

ambi!n pueden utiliar"e placa" de plá"tico de"ec'able" Hue a*u"tanbien & cumplan la" norma" ante" eJpue"ta".

Ji"ten en el mercado placa" de plá"tico e"t!rile" Hue "on adecuada"para e"te m!todo.-nidade" de fltración: l eHuipo de "oporte de fltro ;abricado en

%idrio$ plá"tico re"i"tente al autocla%e$ porcelana o acero inoJidable<con"i"te en un embudo "in *untura"$ unido a una ba"e por un arteactode cierre o manteniendo en "u lugar mediante una uera magn!tica. ldi"eKo debe permitir Hue el fltro de membrana "e mantenga con"eguridad "obre la placa poro"a del receptáculo$ "in Hue "ura daKomecánico$ de manera Hue todo el lFHuido pa"e a tra%!" de lamembrana durante la fltración.




Para e"teriliarlo en el autocla%e ante" de guardarlo$ en"u!l%a"e enpapel uerte$ "eparando amba" parte" del eHuipo.

ambi!n "e puede tratar con lu ultra%ioleta ;"in en%uelto en papel<ante" de %ol%er a utiliarlo$ en ca"o de Hue "e e"t!n lle%ando a cabo

"erie de fltracione".La" unidade" de campo pueden de"inectar"e con una llama de alco'olmetFlico o "umergi!ndola" en agua 'ir%iendo durante ( minuto" .La"parte" plá"tica" no "e e"terilian a la llama. Pueden utiliar"e unidade"de campo e"t!rile" de"ec'able".

Para la fltración$ mónte"e el receptáculo del eHuipo del "oporte delfltro en un matra de 1.1 con un tubo latral & pre"ión dierencial ;4@(1 Pa< "obre el fltro de membrana. Con!cte"e el matra a una bombael!ctrica de %acFo con un fltro de bomba actuando "obre la pre"ión delagua$ un a"pirador manual u otro medio para a"egurar la pre"ión

dierencia" ;18@2=5 DPa<. Con!cte"e un matra de la mi"ma capacidadentre el matra de fltración & la uente de %acFo para atrapar el aguaHue "e e"cape.+iltro de membrana: -tilFcen"e fltro" de membrana ;para otra"caracterF"tica"$ %!a"e la "ección 9=2=< con un diámetro de poro Huepermita una completa retención de la" bacteria" coliorme".

olo "e emplearan fltro" en lo" Hue "e d! una %elocidad de fltración"ati"actoria ;en ( minuto"<$ au"encia de inRuencia" "ignifcati%a" "obreel p del medio ;no má" de & Hue no produca un aumento en eln#mero de colonia" conRuente" o eJpan"i%a"$ en comparación con lo"

fltro" de membrana de control .La" membrana" marcada" con unatrama "e utiliaran de orma Hue no in'iban ni e"timulen el crecimientobacteriano cuando "e incuben con la" bacteria" retenida" en un medioadecuado.

" preerible utiliar fltro" de membrana reciente" &$ "i e" nece"arioguardarlo"$ "e 'ará en un ambiente "in cambio" eJtremo" detemperatura o 'umedad. 3o deberán comprar"e en cantidade" anuale""uperiore" a la" nece"aria".

" preerible utiliar fltro" de membrana pre e"teriliado cu&o"abricante" garanticen Hue la t!cnica de e"teriliación no 'a inducidotoJicidad no alterada la" propiedade" F"ica" o HuFmica" de lamembrana. i "e e"terilian la" membrana" en el laboratorio .Pá"en"e1= minuto" por la autocla%e a 121 C .0l fnaliar la e"teriliación$ d!*e"e Hue el %apor e"cape rápidamente para reducir en lo po"ible laacumulación de agua de conden"ación en lo" fltro".




La" almo'adilla" ab"orbente" con"i"ten en di"co" de papel de fltro uotro material garantiado por el abricante en lo Hue "e refere a la altacalidad & a la au"encia de "ulfto" u otra" "u"tancia" Hue puedan in'ibirel crecimiento bacteriano .-tilFcen"e almo'adilla" de 48 mm dediámetro & un gro"or "ufciente para ab"orber 1$8@2$2 ml de medio. La"

almo'adilla" ab"orbente" e"teriliada" o la" e"teriliada"po"teriormente en el laboratorio deben liberar meno" de i mg de acidetotal ;calculada como< al titularla" titularla" al punto eJtremo deenoltaleFna$ p 8. utiliando 3a) al =.=2 3 ? producir %alore" de p5 la" almo'adilla" "e e"terilian al mi"mo tiempo Hue lo" fltro" demembrana en%uelto" en papel uerte re"ellable o bien de orma"eparada en en%a"e" adecuado".

0nte" de utiliarla"$ deben e"tar "eca" & "in re"to" %i"ible" de 'umedad.Pina". -tilFcen"e pina" "in diente"$ Hue "e e"teriliaran ante" de

utiliarla"$ "umergi!ndola" en alco'ol etFlico al 9( por 1== o en alco'olmetFlico ab"oluto & a la llama.Incubadora": -tilFcen"e incubadora" a una temperatura de (Hue mantengan una 'umedad ele%ada ;alrededor de un 9= por 1== de'umedad relati%a<.

icro"copio & uente de lu: l recuento de la" colonia" Hue eJi"ten enlo" fltro" de membrana "e realia mediante una lupa de 1= a 1(aumento" & ba*o una uente de lu Ruore"cente rFa a*u"tada para Huede un di"cernimiento máJimo del brillo .Lo me*or e" emplear una lupae"tereo"cópica binocular de campo amplio.

3o "e debe utiliar un iluminador de micro"copio con un "i"tema ópticode concentración de lu por una uente de lu incande"cente cuando "etrata de e"tudiar la" colonia" de coliorme" en un medio de tipo ndo.

0,I0L ? I) C-LI>)

La nece"idad de uniormidad obliga a emplear medio" de"'idratado".iempre Hue eJi"tan medio" de"'idratado" adecuado"$ no "e utiliaranmedio" preparado" a partir de "u" ingrediente" bá"ico".Para re'idratar & e"teriliar lo" medio" "e "eguirán la" in"truccione" delo" abricante". ambi!n pueden utiliar"e medio" lFHuido" comerciale"

;ampolla" e"t!rile" u otro"<$ "i "e "abe Hue orece re"ultado"eHui%alente". Para Hue la" caracterF"tica" del control de calidad de lo"medio".

Compru!be"e la producti%idad de cada nue%o lote de medio"preparando dilucione" de un culti%o de enterobacter aerogene" &fltrando %ol#mene" adecuado" Hue permitan obtener 2=@8= colonia" porfltro. Compru!be"e para cada nue%o lote de medio ndo $ un mFnimo de




1= por 1== de colonia" de coliorme" obtenida" a partir de mue"tra"naturale"$ con ob*eto de e"tablecer la eJactitud dierencial del lote delmedio.

4.2.5

"rocedimiento de filtro de membrana para =lebsiellaleb"iella$ un g!nero incluido en el grupo de coliorme" ecale" "eg#n "e'a defnido aHuF$ puede producir crecimiento" de coliorme" en lo""i"tema" de di"tribución del agua & "uele "er un componente importantede la población de coliorme" en la pulpa de papel$ teJtil & otro"re"iduo" indu"triale". La población coliorrne normal de la" 'ece" del'ombre & de otro" animale" de "angre caliente puede contener de un=@4= por 1== de cepa" de leb"iella. 0lrededor de un 4 por 1== de lo"ca"o" de neumonFa bacteriana & de un 18 por 1== de la" ineccione"urinaria" "e deben a cepa" patógena" de leb"iella.

-n 8( por 1== de e"ta" cepa" clFnica" "on coliorme" ecale". La"uente" ambientale"$ como la %egetación$ la" pulpa" de papel$ laproducción teJtil$ la caKa de a#car & lo" producto" de la" gran*a"$contribu&en con un 51@8= por 1== a la población total de leb"iella enlo" coliorme" totale". "la bacteria "e encuentra a %ece" en lo""edimento" de la" rede" de di"tribución de agua$ como con"ecuencia deuna inadecuada protección de la" uente"$ tratamiento" in"ati"actorio"o alteracione" en lo" "i"tema" de conducción.

-n procedimiento de fltro de membrana permite lle%ar a cabocuantifcacione" rápida" mediante una modifcación de la ba"e de agar

@+C$ "u"titu&endo la lacto"a por ino"itol & aKadiendo carbenicilina$ obien utiliando un medio de agar @leb. "to" m!todo" di"minu&en lanece"idad de "ometer la" cepa" pura" a prueba" bioHuFmica".

e recomienda una %erifcación preliminar de la" colonia" dierenciada".

1. In"trumentalPlaca" de culti%o: >!a"e la "ección 9222/.1e para la" e"pecifcacione".-nidade" de fltración: >!a"e la "ección 9222/.1.

2. ateriale" & medio" de culti%o0gar @+C modifcado ;agar @+CIC<: "te medio no "e encuentra a%ece" en orma de"'idratada$ por lo Hue 'abrá Hue prepararlo a partirde "u" ingrediente" bá"ico".

Cali!nte"e et medio 'a"ta ebullición & aKádan"e 1= ml de ácido ro"ólicodi"uelto en 3a) al =$=2 3. nrFe"e por deba*o de 4(ZC & aKádan"e (=




mg de carbenicilina. 3o e"teriliar en el autocla%e. l p debe "er de5$4.

"terilFce"e en autocla%e durante 1( minuto" a 121 C. 0 continuación$enrFe"e a (=C en un baKo de aguaB aKádan"e 2= ml de alco'ol etFlico

al 9( por 1== ;no de"naturaliado< & =$=( g de carbenicilinaSl. 0gFte"econ cuidado & di%Fda"e a"!pticamente en placa" de culti%o deplá"tico de (= J 9 mm. l p fnal debe "er de 5$4 X =$2. l mediopreparado puede con"er%ar"e durante 2= dFa" a 4C.]

Procedimiento

Para elegir et tamaKo de la mue"tra & el procedimiento de fltración$%!a"e "ección 9222/.(. ColóHue"e el fltro de membrana "obre la"uperfcie del agar e inc#be"e durante 24 X 2 'ora" a ( X =$( C. La"colonia" de leb"iella en el agar @+CIC "on aule" o gri" aulada". Lama&orFa de la" colonia" atFpica" "on marrone" o parda". n oca"ione""e dan re"ultado" po"iti%o" al"o" debido" a e"pecie" de nterobacter.La" colonia" de leb"iella en el medio de agar @leb "on de colore"aul e"curo o aul gri"áceo$ mientra" Hue la" demá" "uelen "erra"ada" o$ a %ece"$ amarillo pálido. ága"e el recuento con una lupae"tereo"cópica de campo amplio de ba*o aumento ;1=@1(< o cualHuierotro in"trumento óptico.

>erifcación.

Compru!ben"e la" colonia" de leb"iella del primer lote de mue"tra"de agua" ambientale" & eRuente" & tambi!n cuando "e "o"pec'e "upre"encia en lo" "i"tema" de di"tribución de agua. Compru!be"e unmFnimo de cinco colonia" tFpica"$ pa"ando el crecimiento de la coloniao culti%o puro a un "i"tema comercial de multiprueba parae"pecifcación de Gram negati%o". La" prueba" cla%e" para leb"iella"on citrato ;po"iti%a"<$ indol ;negati%a"<$ motilidad ;negati%a"<$ li"inadecarboJila"a ;po"iti%a"<$ ornitina decarboJila"a ;negati%a"< & urea"a;po"iti%a"<.La leb"iella de origen no ecal puede identifcar"e mediante correlaciónentre la producción de indol & la licueacción de pectina con la capacidadpara crecer a 1= YC & una re"pue"ta negati%a a la" prueba" decoliorme" ecale"

4.2.6 "rocedimiento de incubación retardada para coliformestotales




La modifcación de la t!cnica e"tándar del fltro de membrana permitetran"portar la membrana tra" la fltración 'a"ta un laboratorio ale*adodonde "ea po"ible incubarla & fnaliar la prueba. "ta prueba deincubación retardada re"ulta con%eniente en lo" ca"o" en Hue no "eapo"ible poner en práctica lo" procedimiento" 'abituale". ambi!n "e

puede

recurrir a ella:a< cuando "ea impo"ible mantener la temperatura de"eada de lamue"tra durante "u tran"porteB

b< "i el tiempo tran"currido entre la toma de la mue"tra & "u análi"i""upera el lFmite de tiempo admitidoB

c< cuando la toma de mue"tra "e realia en un lugar le*ano allaboratorioB d< en ca"o de Hue "ea nece"ario controlar la calidad de la"agua" de eRuente" o Hue "e lle%e a cabo acti%idade" de control de

contaminación por un procedimiento e"tándar$ o e< por cualHuier raónHue impida el análi"i" de la mue"tra en o cerca del lugar de la toma.Para comparación de lo" dato" de la" mue"tra" de incubación retardada'aciendo Hue "u" re"ultado" "on concordante" con lo" de la pruebainmediata en e"tudio" independiente" de mue"tra" realiada" en agua"dulce" & "alada". etermFne"e la aplicabilidad de la prueba deincubación retardada para un tipo concreto de agua$ comparando lo"re"ultado" con lo" del análi"i" realiado con Ion m!todo" 'abituale".

Para realiar la prueba de incubación retardada$ Fltre"e la mue"tra "obreel campo inmediatamente de"pu!" de 'acer la toma$ colóHue"e el fltro

en el medio de tran"porte & en%Fe"e al laboratorio. Compl!te"e en !"tela determinación de coliorme" pa"ando la membrana a un medio @ndo o L@ndo e incubándola a ( X =$( YC durante 2= @22 'ora"$para$ por #ltimo$ 'acer el recuento de colonia" tFpica" de coliorme". lmedio de tran"porte e"tá pen"ado para mantener %iable" lo"microorgani"mo" coliorme" &$ en general$ impedir un crecimiento%i"ible durante el mi"mo. Lo" agente" bacterio"tático" de lo" medio" demantenimientoScon"er%ación in'iben el crecimiento de lo"microorgani"mo"$ pero permiten un crecimiento normal de coliorme"una %e pa"ado" a un medio re"co.

La prueba de incubación retardada e" "eme*ante al m!todo de"critopara coliorme" totale" "eg#n el procedimiento del fltro de membrana$"al%o en lo Hue "e indica "eguidamente. e eJponen do" m!todo"alternati%o"$ uno con medio de con"er%ación @ ndo & otro con mediode mantenimiento L +.

!todo" @ndo:




edio de con"er%ación @ndo: Prepáre"e de la orma de"crita en la"ección 9222/.26. ra" el enriamiento a meno" de 4( C$ aKádan"ea"!pticamente $84 g de benoato de "odio ;calidad -P< por 1 o $2ml de una "olución de benoato de "odio al 12 por 1== a 1== ml demedio. !clen"e lo" ingrediente" & di%Fdan"e en porcione" de ( @ 5 ml$

Hue "e

colocan en placa" de Petri de (= J 12 mm. ant!ngan"e la"placa" a 2 \ I) C rec'aando la" no utiliada" de"pu!" de 96 'ora".

olución de benoato de "odio: i"u!l%an"e 12 g de 3aC5()2 en"ufciente agua de"tilada para obtener 1== ml. "terilFce"e en autocla%eo por fltrado a tra%!" de un fltro de membrana con poro" de =$22 m dediámetro. e"!c'e"e de"pu!" de 6 me"e".

!todo L

edio de mantenimiento L +:

,e'idráte"e en agua de"tilada. Cali!nte"e 'a"ta ca"i ebullición paradi"ol%er el agar$ retirándo"e rápidamente del calor & enriándolo ameno" de (= C. 0Kádan"e a"!pticamente 1$= g de benoato de "odio$1$= g de "ulanilamida & =.( g de ciclo'eJimida. ra" meclarlo$repárta"e en porcione" de ( \ 5 ml Hue "e %ierten en placa" de Petri de(= J 12 mm. ^"ta" "e guardan a una temperatura de 2 \ 1=ZC & "eeliminan a la" 2 "emana". l p fnal debe "er de 5$1 =$1.

8.4 %IO(, #%')TI3O( > "#O)%II%-TO(

Lo" medio" & reacti%o" comerciale" a&udan a reducir el traba*o & elco"teB "in embargo$ 'a& Hue incluir controle" po"iti%o" & negati%o" deculti%o" conocido" para a"egurar "u eJactitud & fabilidad. Puedencon"ultar"e detalle" "obre e"to" m!todo". La tabla 922(:11 recoge lo"re"ultado" Hue "e e"peran de e"ta" prueba".

4.3.1 "rueba del indol

l indol e" un producto del metaboli"mo del triptóano.,eacti%o":

edio: -tilFce"e medio lFHuido con triptóano. i"u!l%an"e 1=$= g detriptona o triptica"aSI de agua de"tilada. i%Fda"e en porcione" de ( mlen tubo" de en"a&o & e"terilFce"e.

,eacti%o de prueba: i"u!l%an"e ( g de parametil aminobenalde'Fdoen 5( ml de alco'ol i"oamFlico ;o amFlico normal< de calidad 0C &aKádan"e ( ml de CL conc.




l reacti%o debe "er amarillo. 0lguno" lote" de paradimetilaminobenalde'Fdo no "on "ati"actorio" & lo" aceptable" "e e"tropeancon el pa"o del tiempo.La "olución de alco'ol amFlico debe tener un p inerior a 6$=. antoel alco'ol amFlico como el compue"to de benalde'ido deben comprar"e

en peHueKa" cantidade" en unción del %olumen de traba*o Hue "e%a&a a realiar.

Procedimiento: Inoc#len"e porcione" de ( ml de medio con un culti%opuro e inc#ben"e a ( X =$( C durante 24 X 2 'ora". 0Kádan"e =$2@=$ ml del reacti%o & agFte"e. !*e"e repo"ar uno" 1= minuto" &ob"!r%en"e lo" re"ultado".Ji"te reacción po"iti%a a la prueba del indol cuando aparece un colorro*o o"curo en el alco'ol amFlicoB "i "e mantiene el color original delreacti%o$ la prueba e" negati%a. -n color naran*a indica probablepre"encia de e"catol$ un producto de la degradación del indol.

4.3.2 "rueba del rojo de metilo

La prueba del ro*o de metilo mide el p terminal$ e" decir$ marca laproducción por la" bacteria" de ácido a partir de la gluco"a. La"reaccione" metabólica" demo"trada" por la aparición de ga" & ro*o demetilo$ & la prueba de >oge"@Pro"Dauer e"tán relacionada" entre "F &re"ultan #tile" para dierenciar lo" miembro" del grupo de lo" coliorme".

,eacti%o":edio: -tilFce"e medio lFHuido tamponado de gluco"a. i"u!l%an"e($= g de protea"a peptona o peptona eHui%alente$ ($= g de gluco"a &($= g de o"ato de 'idrógeno dipota"io ; 2P)4< en 1l de aguade"tilada. i%Fda"e en porcione" de ( ml en tubo" de en"a&o &e"terilFce"e en la autocla%e a 121 C durante 12@1( minuto"$a"egurándo"e de Hue el tiempo total de eJpo"ición al calor no "upera lo"= minuto".

olución indicadora: i"u!l%an"e =$1 g de ro*o de metilo en == ml de

alco'ol etFlico al 9( por 1== & dil#&an"e 'a"ta (== ml en aguade"tilada.

Procedimiento: Inoc#len"e con un culti%o puro porcione" de 1= mi delmedio. Inc#ben"e a ( C durante ( dFa". 0Kádan"e ( gota" de la"olución indicadora de ro*o de metilo a ( ml del culti%o.




n la ma&orFa de lo" ca"o"$ ba"ta con una incubación de 48 'ora"$ perono deben 'acer"e incubacione" ineriore" a e"te tiempo. i lo"re"ultado" de la prueba "on eHuF%oco" a la" 48 'ora"$ repFta"e la mi"macon culti%o" incubado" durante 4@( dFa". n e"to" ca"o"$ inc#ben"eculti%o" duplicado" a 22 a 2( C. Compru!ben"e lo" culti%o" a lo" 2$ $ 4

& ( dFa"$

&a Hue el re"ultado po"iti%o puede aparecer ante" del #ltimodFa.

ComunFHue"e como re"ultado po"iti%o la aparición de un color ro*o$mientra" Hue un color claramente amarillo con"titu&e un re"ultadonegati%o. Lo" matice" intermedio" "on re"ultado" cue"tionable"$ Hueindican po"iblemente una purifcación incompleta del culti%o.

4.3.3

"rueba de 3o6es7"ros?auer

"ta prueba detecta la acetoFna$ producida metabólicamente pordeterminada" bacteria" coliorme" en un medio de peptona gluco"a.

,eacti%o"

edio": -tilFce"e el medio de"crito para la prueba dierencial del ro*ode metilo o un medio de "al peptona gluco"a. i"u!l%an"e 1=$= g depolipeptona o protea"a peptona$ ($= g de cloruro de "odio ;3aCl< & 1=$=

g de gluco"a en 1l de agua de"tiladaB el p debe "er de

5$=@5$2.Prepáren"e porcione" de ( ml en tubo" de en"a&o$ Hue "ee"terilian en el autocla%e a 121 C durante 12@1( minuto"$comerciale" de un "olo u"o de e"te reacti%o "on cómoda" &económica"$ pero 'a& Hue utiliarla" con precaución. Cuando "eapreci"o 'acer gotear directamente el reacti%o "obre la" colonia"$utilFcen"e placa" de agar "o*a trFptica$ &a Hue la" de agar nutriti%o danre"ultado" incon"i"tente"B al eJtender una porción de una colonia"obre el papel de fltro impregnado con el reacti%o$ 'a& Hue tener cuidado de Hue no lle%e medio.

Procedimiento: óme"e con un a"a de platino o aplicador de madera oplá"tico$ o con una barra de %idrio$ alguna de la" colonia" del agar &eJti!nda"e "obre la tira de papel. 3o debe utiliar"e 'ierro u otroalambre reacti%o$ &a Hue pueden producir re"ultado" po"iti%o" al"o".La reacción a la oJida"a e" po"iti%a "i a lo" 1= "egundo" "e de"arrollaun inten"o color p#rpura. eben probar"e al mi"mo tiempo culti%o"po"iti%o" & negati%o".




Cuando "e utilia el reacti%o en orma lFHuida$ "e 'ace gotear "obre la"colonia" de la placa de culti%o. La" colonia" po"iti%a" de"arrollan uncolor ro"a$ Hue %ira progre"i%amente a marrón$ ro*o o"curo &$ por#ltimo$ negro.

4.3.4 I!%#%-)I')IO-

e defnen lo" coliorme" como bacilo" Gram negati%o" no e"porulado"Hue ermentan la lacto"a$ dando lugar a la ormación de ga" en 48'ora" a ( C$ o Hue cuando "e utilia el m!todo del fltro demembrana$ producen colonia" ro*o o"curo con brillo metálico a la" 24'ora" de incubación en un medio tipo ndo con lacto"a. in embargo$pueden encontrar"e cepa" anaerog!nica" ;no productora" de ga"< Hueermentan la lacto"a de "c'eric'ia coli$ a"F como coliorme" no

productore" de brillo metálico en medio ndo. "to" microorgani"mo"$a"F como lo" coliorme" tFpico"$ pueden "er con"iderado" comoorgani"mo" indicadore"$ pero "e eJclu&en de la defnición actual de coliorme" para di"tinguirlo"$ e" nece"ario recurrir a prueba" di"tinta" dela" aHuF pre"entada".CaracterF"tica" & prueba"

e pre"entan la" caracterF"tica" de lo" microorgani"mo" indicadore""obre %ario" "u"trato" Hue con"titu&en la ba"e para "u ma&ordierenciación. 3o toda" la" e"pecie" mue"tran "iempre la" reaccione"caracterF"tica". La" prueba" I>iC pueden ba"tar en alguno" ca"o"$

aunHue por lo general "ólo permiten una identifcación parcial.

La" prueba" de decarboJila"a con #tile"$ la" de -"ina decarboJila"aa&udan a di"tinguir la" Citrobacter de 0riona & la" de ornitinadecarboJila"a$ pendiente de agar urea & motilidad$ "on adecuada" paradierenciar leb"iella de nterobacter. La preparación de lo" medio" &reacti%o" dierenciale" puede "er má" co"to"a para muc'o" laboratorio"Hue la utiliación de eHuipo" multiprueba comerciale" &a preparado" &en%a"ado"$ Hue permiten reducir el traba*o de control de calidad.

Lo" eHuipo" pre@empaHuetado" "on ácile" de con"er%ar & utiliar$ &

orecen re"ultado" reproducible" & eJacto"B "in embargo$ 'a& Huecomprobar periódicamente "u" reaccione" con culti%o" conocido" debacteria" para a"egurar la eJactitud & reproducibilidad de lo"re"ultado". i e"to" eHuipo" dan re"ultado" eHuF%oco"$ 'a& Hue realiar nue%a" prueba". á" adelante "e citan %ario" eHuipo"comerciale" ampliamente e%aluado".




4.3.5 I!%#%-)I')I@- % &')T%#I'( )O*I!O#%(

n oca"ione"$ e" nece"ario identifcar a la" bacteria" Hue orman elgrupo de coliorme" ecale" para "tablecer la naturalea de lacontaminación. Pueden utiliar"e la" prueba" dierenciale" "abiendo Hue

toda" la" cepa" taJonómicamente a"ignada" al grupo de lo" coliorme"no "e a*u"tan nece"ariamente a la defnición de coliorme" e"tablecidaen el manual$ &a Hue a %ece" no ermentan la lacto"a o$ "i lo 'acen$pueden no producir ga". 0demá"$ eJi"ten otra" bacteria" Gramnegati%a" Hue$ como lo" coliorme"$ ermentan la lacto"a & producenbrillo ;por e*emplo$ 0eromona" "pp.< & no toda" la" cepa" de una e"peciereaccionan en el medio de manera uniorme. Lo" microorgani"mo"le"ionado" o mutado" no dan a %ece" la" re"pue"ta" clá"ica". La"tradicionale" prueba" I>iC ;e" decir$ utiliación del indol$ el ro*o metilo$el >oge"@Pro"Dauer & el citrato< "on #tile" para dierenciar lo" coliorme"$pero no proporcionan una total identifcación$ "iendo nece"ario recurrir a

prueba" bioHuFmica" adicionale". Lo" eHuipo" comerciale" deidentifcación "on alternati%a" #tile" & económica" a lo" tradicionale"medio" de dierenciación.

IG3I+IC0CI)3 L) II3) IP) C)LI+),

l "ignifcado de lo" di"tinto" tipo" de coliorme" Hue eJi"ten en el agua'a "ido & e" ob*eto de amplio" e"tudio". n con*unto$ "e con"idera a lo"coliorme" como indicadore"$ &a Hue indican la eJi"tencia de 'ece"'umana" o animale".n la" 'ece" "e pueden encontrar todo tipo de coliorme". 0unHue . coli

"e encuentra ca"i "iempre en la" contaminacione" reciente"procedente" de animale" de "angre caliente$ tambi!n pueden 'allar"eotro" coliorme" en ca"o" de contaminación en lo" Hue aHu!l no eJi"te.Lo" g!nero" nterobacter$ leb"iella$ Citrobacter & "c'eric'ia "uelenrepre"entar la ma&or parte de lo" microorgani"mo" ai"lado" en agua"naturale" & "umini"tro" de agua" municipale" tratada"$ "iendonterobacter el Hue "e aF"la con ma&or recuencia$ "i bien no todo" lo"coliorme" tienen nece"ariamente "u origen en la" agua" de alcantarilla.. coli e" el coliorrne má" aectado por lo" tratamiento" 'abituale" delagua. Lo" microorgani"mo" coliorme"$ alguno" de lo" cuale" "on"aprofto" de %ida libre$ pueden multiplicar"e en la@ %adero" de cuero$

madera$ cuerda" de pi"cina & empaHuetadora" de &ute$ & producir a%ece" cieno" en el interior de la" tuberFa". La dierenciación de lo"coliorme" tiene %alor en el momento de determinar la uente de la Hueprocede el aumento de "u den"idad & Hue e" con"ecuencia de lamultiplicación de microorgani"mo" "obre o dentro de materiale"orgánico". La pre"encia de un gran n#mero de coliorme" del mi"mo tipoen el agua de un poo o manantial o en un "olo grio de un "i"tema dedi"tribución "ugiere Hue "e 'a producido la citada multiplicación.




Lo" re"iduo" indu"triale" contienen ele%ada" concentracione" deelemento" nutriti%o" para la" bacteria" & pueden a%orecer grande""obre crecimiento de coliorme" en agua" eRuente" & aRuente". "to"crecimiento" pueden tambi!n aparecer en lo" "i"tema" de di"tribución

de agua" tratada". 0ero mona" & otra" bacteria" Gram negati%a"oJida"a po"iti%a" & rinia pueden encontrar"e en la" agua" naturale" &tratada". "to" do" g!nero" no "on bacteria" indicadora"$ "eg#n ladefnición aHuF utiliada.

ra" la detección del ga". i!mbren"e la" placa" de orma Hue "ea"egure la eJi"tencia de alguna" colonia" ai"lada" "eparada" por almeno" =$( cm .i eJi"ten coliorme" & "e Huiere obtener una ele%adaproporción de ai"lamiento" "ati"actorio"$ "e deben tomar la" "iguiente"precaucione":

-tilFce"e un a"a e"t!ril de mm de diámetro o una agu*a de inoculaciónligeramente cur%ada en la punta0bra"e e inclFne"e el tubo de ermentación e%itando la toma con elagu*a de cualHuier membrana o e"pumaIntrod#ca"e el eJtremo del a"a o la agu*a en el lFHuido del tubo a unaproundidad de alrededor de =.( cmi!mbre"e la placa con la parte cur%ada de la agu*a en contacto con elagar para no araKar la "uperfcie .e Rameara el a"a entre lo"cuadrante" "egundo & tercero para me*orar el ai"lamiento de la"colonia".

Inc#ben"e la" placa" in%ertida" a ( =.( C durante 24 2 'ora"

La" colonia" Hue "e de"arrollan en el agar L ndo pueden "er tFpica";ro"a" a ro*o o"cura" con un brillo metálico %erde"uperfcial<$atFpica";ro"a"$ ro*a" $blanca" o incolora" "in brillo < a la" 24'ora" de incubación o negati%a";toda" la" demá"<.ómen"e de cadaplaca una o má" colonia" tFpica" bien defnida" o$ "i no eJi"ten $ do" omá" entre la" Hue "e con"ideran como probablemente ormada" por microorgani"mo" del grupo coliorme & "e pa"an a un tubo deermentación con medio de lauril tripto"a & a uno con agar en pendiente;"te #ltimo no e" nece"ario "i "e trata de mue"tra" de agua potable.<

i "e con"idera adecuado$ utilFce"e una lupa para colonia" a fn decon"eguir un aumento optimo a la 'ora de tomarla" de la" placa" deagar L ndo .0l tran"erir la" colonia" 'a& Hue elegir la" Hue e"tánbien ai"lada" & tocar apena" "u "uperfcie con una agu*a e"teriliada ala llama & enriada al aire para e%itar en lo po"ible el peligro detran"erir un culti%o miJto.




Inc#be"e lo" tubo" con el medio "ecundario ;medio liHuido de lauriltripto"a con %iale" de ermentación in%ertido"< a ( durante 24 2'ora"B "i no "e produce ga" en e"te periodo "e prolonga la incubación'a"ta 48 .

"t#die"e micro"cópicamente la" preparacione" teKida" con G,0 &obtenida" en lo" culti%o" de pendiente de agar a la" 24 'ora"$corre"pondiente" a lo" tubo" "ecundario" Hue mue"tre" ga".

inción de Gram. i "e trata de mue"tra" de agua potable$ "e puedepre"cindir de la tinción de Gram en la prueba completa$ &a Hue e" raroHue eJi"tan bacteria" gran po"iti%a" & microorgani"mo" e"porulado""obre%i%iente" en e"te m!todo de detección "electi%a.

Ji"ten %aria" modifcacione" de la t!cnica de Gram. -tilFce"e lamodifcación de ucDer para teKir la" eJten"ione" de culti%o" puro":

Incl#&a"e un control para organi"mo" Gram po"iti%o" & otro para Gramnegati%o".

Prepáren"e emul"ione" di"tinta" de lo" crecimiento" bacteriano" ene"tudio & de lo" culti%o" de control po"iti%o" & negati%o" "obre la mi"maporta$ utiliando para ello gota" de agua de"tilada colocada" en elcri"tal. !*en"e "ecar al aire & +F*en"e pa"ando el porta "obre una llamapara de"pu!" teKirlo con la "olución de )Jalato de amonio@cri"tal%ioleta.

0 continuación$ acláren"e con agua corriente & aplFHue"e la "olución de

Lugol durante un minuto.

Lá%e"e de nue%o el porta teKido con agua corriente. ecolóre"e durante1(@= "egundo" con alco'ol acetona$ manteniendo el porta entre lo"dedo" & de*ando Hue el alco'ol acetona Ru&a por la eJten"ión teKida'a"ta obtener un lFHuido incoloro.3o debe decolorar"e en eJce"o. Contrá"te"e con "aranina durante 1("egundo"$ lá%e"e con agua corriente$ "!Hue"e con papel de fltro o alaire & e"t#die"e al micro"copio .Lo" microorgani"mo" Gram po"iti%o" "onaule" & lo" Gram negati%o" ro*o". Lo" re"ultado" "olo "on aceptable"cuando lo" controle" dan la reacción adecuada.

8.8 "rocedimiento

La" colonia" Hue "e de"arrollan en el agar L@ndo pueden "er tFpica";ro"a o ro*o o"curo con brillo metálico "uperfcial<$ atFpica" ;ro"a"$ ro*a"$




blanca" o incolora" "in brillo< a la" 24 'ora" de incubación o negati%a";todo" lo" demá"< omar de cada placa una o má" colonia" tFpica" bien defnida" & "i noeJi"ten$ do" o má" entre lo" Hue "e con"ideran como probablementeormada" por microorgani"mo" del grupo coliorme & "e pa"an a un tubo

de ermentación con medio caldo lauril@tripto"a & a uno con agar enpendiente.embrar la" placa" de orma Hue "e a"egure la eJi"tencia de alguna"colonia" ai"lada"$ "eparada" por al meno" =.( cm.

"coger una colonia di"creta tFpica o atFpica "eparada" =.(cm. ubo con Lauril ripto"a. ubo con 0gar 3utriti%o.Incubar lo" ubo" con el medio caldo Lauril ripto"a in%ertido a (_Cdurante 24'r"

8.9 #esultados

4.5.1 "rueba )omplementaria

I) L 3) )/,>0CI)3

< 4 1 Colonia" atFpica in /rillo

%erde=a>o (I9< E ) Colonia" in /rillo

%erde=a>o (I2

< 4 ! Colonia"atFpica

in /rillo %erde metálico "=a>o <imnasio

I , S > S P C'ri7en D [ @ @'ri7en No 4 @ [ [

+iltro de embrana:

M$%#5&9 &%#$L59' L9$&IL




<&$P'NF01 =a>o(I9

Gubo crecimiento decolonias rosadas enel Medio Les4 %ndo

<&$P'NF0)=ebedero

Gubo crecimiento decolonias rosadas en

el Medio Les4 %ndo<&$P' NF0!%stanque de9rquitectura

Gubo crecimiento decolonias roJas en elMedio Les4 %ndo

-,0 +),0CI)3 G0 3

p C)L),0CI)3G,0

<&$P'NF01

3o 'a& 5 Gram ;@<iplococo"

<&$P'NF0)=a>o

3o 'a& 8 Gram ; [ <

"taflococo"

<&$P'NF0!%stanque

3o 'a& 6 Gram ; @ <"treptococo"

I3)L ,)`) IL)

>)GP,)

CI,0)

<&$P'NF01

2olonia

; @ < ; @ <0marillo

P'W5

; @ < ; @ <

<&$P'NF0)2olonia

; @< ; @ <0marillo

P'W5

; @ < ;[ <

<&$P'NF0!2olonia

; @ < ; @ <0marillo

P'W5

; @ < ; [<

9 )onclusiones

e debe realiar de nue%o la prueba &a Hue no puedo decir nada delre"ultado debido a la incongruencia obtenida en la prueba I>IC.e pre"ume Hue "e trata de la bacteria e"c'eric'ia coli pro%eniente dele"tanHue debido a Hue en el dFa del mue"treo "e encontró aunaacuática ;pre"encia de pece"<.

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página (=



La fltración mediante el m!todo de fltro de membrana "e realió contotal "ati"acción logro "eparar del agua a la "u"tancia con"ideradacoliorme.n la prueba complementaria "e encontraron bacilo" corto" grannegati%o" pero en la la" prueba" no "e pudo determinar debido a

alguna" incongruencia"$ lo cual debe le%antar"e lo má" ante" po"iblecon un intento adicional de dic'a prueba.

l demorarno" "emana" 'aciendo la" prueba" probablemente inRuencioen lo" re"ultado" al momento de la ob"er%ación.

: #ecomendaciones

ebemo" eJtender el culti%o para una me*or ob"er%ación en elmicro"copio &a "ea para el ca"o del Gram [$ Gram \ o cualHuier otro.

La" prueba" no deben durar muc'o &a Hue la ma&orFa de ella" "olo e"tá'ec'a para 'acerla en un par de dFa" & no "emana" como no"otro"demorábamo".

A &iblio6rafBa

'ttp:SS.b%"de.op"@om".orgSb%"acdS"canS=1561S=1561@=2.pd

.*a%eriana.edu.coSbiblo"Ste"i"Sciencia"Ste"i"2=.pd

Laboratorio 6: Identifcación del Grupo Coliorme Página (1

http://www.bvsde.ops-oms.org/bvsacd/scan/013761/013761-02.pdf

http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf

http://www.bvsde.ops-oms.org/bvsacd/scan/013761/013761-02.pdf

http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf



'ttp:SS%iru".u"al.e"SMebSdemoundacuaSdemo2S+iltraembColiauto.'tml

'ttp:SSe".iDipedia.orgSiDiSConteobacteriano

'ttp:SS.b%"de.pa'o.orgSb%"acdS"can2S=2981@I@IIS=2981@I@=5b.pd 'ttp:SS.monografa".comStraba*o"89Sdeterminacion@coliorme"@totale"@ecale"Sdeterminacion@coliorme"@totale"@ecale"."'tml

'ttp:SS.'o.intSater"anitation'ealt'SdHSe"S

'ttp":SSa%dia.fle".ordpre"".comS2=1=S=2Spre"entacion@cla"[email protected]

!todo" 3ormaliado" en el análi"i" de 0gua & de"age".

lemento" de icrobiologFa \IC0L PLCL0,.

http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html


http://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano

http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan2/032981-I-II/032981-I-07b.pdf

http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totales-fecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml


https://avdiaz.files.wordpress.com/2010/02/presentacion-clase-4.pdf



http://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano

http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan2/032981-I-II/032981-I-07b.pdf



https://avdiaz.files.wordpress.com/2010/02/presentacion-clase-4.pdf

Documents

6to-Informe-2015-1 Microbiologia