UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE

FACULDADE DE ENFERMAGEM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE

MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE

ANÁLISE DA PLASTICIDADE CELULAR DA MEDULA ESPINAL

NA PRESENÇA DE MEIO CONDICIONADO DO NERVO

ISQUIÁTICO COM ADIÇÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO

FIBROBLÁSTICO - 2 EM CULTURA

CLEBER MAHLMANN VIANA BEZERRA

MOSSORÓ/RN

2015

CLEBER MAHLMANN VIANA BEZERRA

ANÁLISE DA PLASTICIDADE CELULAR DA MEDULA ESPINAL

NA PRESENÇA DE MEIO CONDICIONADO DO NERVO

ISQUIÁTICO COM ADIÇÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO

FIBROBLÁSTICO - 2 EM CULTURA

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Saúde e

Sociedade da Universidade do Estado

do Rio Grande do Norte, como requisito

final para obtenção do grau de Mestre

em Saúde e Sociedade

Orientador: Dr. Fausto Pierdoná Guzen

MOSSORÓ/RN

2015

94

Catalogação da Publicação na Fonte.

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.

Bibliotecária: Jocelania Marinho Maia de Oliveira CRB 15 / 319

Bezerra, Cleber Mahlmann Viana

Análise da plasticidade celular da medula espinal na presença de meio condicionado do nervo isquiático com adição do fator de crescimento fibroblástico - 2 em cultura. / Cleber Mahlmann Viana Bezerra. – Mossoró, RN, 2014.

93 f. Orientador(a): Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen

Monografia (Mestre em Saúde e Sociedade). Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. Programa de Pós-graduação em Saúde e Sociedade.

1. Cultura da medula espinal. 2. Fator de crescimento fibroblástico -2. 3. Meio

condicionado - Plasticidade neuronal. I. Guzen, Fausto Pierdoná. II. Universidade do Estado do

Rio Grande do Norte. III.Título.

DEDICATÓRIA

À minha família, especialmente aos

meus pais José de Arimatéa e

Sandra Viana, dedico a vocês este

trabalho, pelo incentivo a vencer na

vida e ressaltar que a educação é o

melhor caminho.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por ser meu guia mostrando que promover o bem é minha missão.

Aos meus pais pelo apoio que sempre me deram ao longo desta jornada da vida e profissional, proporcionando uma estrutura que me possibilitou chegar até aqui. A distância hoje existente entre nós em virtude dos nossos trabalhos serviu para mostrar ainda mais o tamanho do nosso amor e da nossa cumplicidade, obrigado por essa conquista.

As minhas irmãs Vanessa Viana Bezerra e Waleska Viana Bezerra pelo amor, respeito e amizade que temos um pelo outro e pelo apoio que sempre obtive de vocês.

Aos meus irmãos Abrão Bezerra e Luiza Bezerra que mesmo na inocência de uma criança contribuíram me dando força através do amor que só os irmãos têm.

À Libina Edriana, minha esposa que durante está jornada me incentivou e sempre esteve ao meu lado mesmo nas horas mais complicadas apoiando, e dedicando seu amor incondicional.

Ao professores e orientadores, Fausto Pierdoná Guzen e Eudes Euler Souza Lucena, pelo grande apoio constante e incondicional durante toda a realização deste trabalho, pelo incentivo a participar desse fascinante projeto, por mostrar que o que sabemos é apenas uma gota e o que ignoramos é um oceano e por me conduzir na transposição das minhas dificuldades acreditando no nosso trabalho.

Ao Profº. Rodolfo Lopes, que conheci ao longo dessa caminhada e se tornou um grande amigo. Obrigado pelas oportunidades e ajudas proporcionadas. Serei sempre grato.

Ao Prof. Worgelsanger Pereira, pela disponibilização ao acesso no BIOMOL, e por se fazer extremamente solícito.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade da UERN.

Ao amigo Salvador Viana, pela parceria na execução da pesquisa.

A todos os professores e profissionais da Universidade Potiguar – UnP do departamento de Fisioterapia pelo incentivo, ajuda e compreensão das minhas ausências.

A todos os profissionais da Universidade do Estado Rio Grande do Norte, especialmente os parceiros de trabalho diário da Faculdade de Ciências da Saúde - FACS.

Aos meus inestimáveis companheiros de pesquisas do laboratório de Neurologia Experimental da UERN.

A todos os meus alunos, por me ensinaram a lecionar a cada dia melhor.

Muito obrigado!

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO........................................................................................ 16

1.1. O Problema.............................................................................................. 16

1.2. Objetivos.................................................................................................. 17

1.2.1. Objetivo Geral.......................................................................................... 17

1.2.2. Objetivo Específico................................................................................... 17

1.3 Justificativa............................................................................................... 17

2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 18

2.1. Características Anatômicas do Nervo Isquiático.................................... 18

2.2. O ambiente de lesão e regeneração do sistema nervoso....................... 19

2.3. Fator de crescimento fibroblástico-2 (FGF-2).......................................... 23

3. METODOLOGIA....................................................................................... 26

3.1. Desenho experimental.............................................................................. 26

3.2. Extração e cultivo das células da medula espinal (ME)........................... 27

3.3. Extração e cultivo dos explantes de nervo isquiático............................... 29

3.4. Subcultivos das células da medula espinal e os grupos experimentais 31

3.5. Marcação imunocitoquímica..................................................................... 33

3.6. Dosagem de íons...................................................................................... 36

3.7. Análise dos dados.................................................................................... 37

4. RESULTADOS......................................................................................... 37

4.1. Mudanças morfológicas e expansão das células glias............................. 41

4.2. Mudanças morfológicas e expansão das células neuronais.................... 53

4.3. Fenótipo das células glias e neuronais..................................................... 64

4.4. Dosagem dos íons no meio de cultura..................................................... 69

5. DISCUSSÃO............................................................................................. 73

6. CONCLUSÕES E SUGESTÕES.............................................................. 81

7. REFERÊNCIAS........................................................................................ 82

APÊNDICE............................................................................................... 93

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabelas Tabela 1. Descrição da amostra dos grupos de acordo com número de células

gliais..................................................................................................................44

Tabela 2. Descrição da amostra dos grupos de acordo com área de células

gliais..................................................................................................................47

Tabela 3. Descrição da amostra dos grupos de acordo com perímetro de

células gliais......................................................................................................50

Tabela 4. Descrição da amostra dos grupos de acordo com número de células

neuronais..........................................................................................................55

Tabela 5. Descrição da amostra dos grupos de acordo com área de células

neuronais..........................................................................................................58

Tabela 6. Descrição da amostra dos grupos de acordo com perímetro de

células neuronais..............................................................................................61

Quadros

Quadro 1. Lista de anticorpos primários...........................................................33

LISTA DE FIGURAS

Figuras

Figura 1. Aspectos Anatômicos do nervo isquiático.........................................18

Figura 2. Ambiente de lesão e regeneração do sistema nervoso.....................21

Figura 3. Extração e preparo da medula espinal para suspensão

celular................................................................................................................27

Figura 4. Troca de meio de cultura celular........................................................28

Figura 5. Acesso cirúrgico ao nervo isquiático..................................................29

Figura 6. Nervo Isquiático dissecado.................................................................29

Figura 7. Remoção do epineuro e perineuro dos ramos nervosos....................30

Figura 8. Placas P60 com meio condicionado por explantes de nervo

isquiático............................................................................................................31

Figura 9. Células precipitadas após centrifugação............................................31

Figura 10. Delineamento do estudo: formação dos grupos e observação

celular................................................................................................................32

Figura 11. Campos de observação celular em placas P60...............................35

Figura 12. Identificação dos meios de cultura após 72 horas para dosagem de

íons....................................................................................................................36

Figura 13. Células de morfologia fibroblastóide................................................37

Figura 14. População de células de Schwann..................................................38

Figura 15. Aspectos morfológicos das células gliais e neuronais.....................39

Figura 16. Morfologia das células após formação dos grupos experimentais por

72 horas. Grupo 1: painéis A (24 horas), B (48 horas), C (72 horas); Grupo 2:

Painéis D (24 horas), E (48 horas), F (72 horas); Grupo 3: Painéis G (24 horas),

H (48 horas), I (72 horas); Grupo 4: Painéis J (24 horas), K (48 horas), L (72

horas). Escala 100µm........................................................................................40

Figura 17. Número de células gliais observadas em cada grupo experimental

de acordo com o dia de observação..................................................................45

Figura 18. Número de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com

o grupo experimental.........................................................................................46

Figura 19. Área de células gliais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação.......................................................................48

Figura 20. Área de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o

grupo experimental............................................................................................49

Figura 21. Perímetro de células gliais observadas em cada grupo experimental

de acordo com o dia de observação..................................................................51

Figura 22. Perímetro de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo

com o grupo experimental.................................................................................52

Figura 23. Número de células neuronais observadas em cada grupo

experimental de acordo com o dia de observação...........................................56

Figura 24. Número de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo

com o grupo experimental.................................................................................57

Figura 25. Área de células neuronais observadas em cada grupo experimental

de acordo com o dia de observação..................................................................59

Figura 26. Área de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo

com o grupo experimental.................................................................................60

Figura 27. Perímetro de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de

acordo com o grupo experimental.....................................................................62

Figura 28. Perímetro de células neuronais observadas em cada grupo

experimental de acordo com o dia de observação...........................................63

Figura 29. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo β-

Tubulina (FITC).................................................................................................64

Figura 30. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP

(Alexa Fluor 488)..............................................................................................65

Figura 31. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NF-200

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................65

Figura 32. Células do G 3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................66

Figura 33. Células do G 3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NeuN

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................66

Figura 34. Células do G 3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo OX-42

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................67

Figura 35. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................67

Figura 36. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NeuN

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................68

Figura 37. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NF-200

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................68

Figura 38. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo OX-42

(Alexa Fluor 488)...............................................................................................69

Figura 39. Dosagem de sódio de acordo com cada grupo

experimental......................................................................................................70

Figura 40. Dosagem de cálcio de acordo com cada grupo

experimental......................................................................................................71

Figura 41. Dosagem de potássio de acordo com cada grupo

experimental......................................................................................................72

LISTA DE ABREVIATURAS

AVL: Analisador de eletrólitos.

°c: grau Celsius.

μg: Micrograma.

μl: Microlitro.

μM: Micromolar.

μmol/L: micromol por litro.

μm2: Micrômetro quadrado.

BDNF: Fator neurotrófico derivado do cérebro.

BSA: Albumina de soro de boi.

β – Tubulina: São as proteínas que compõem os microtúbulos.

Ca: Cálcio

CO2: Gás Carbônico

CS: Célula de Schwann

CEEA: Comissão de Ética de experimentação animal

D-10: Meio de cultura

DMEM: Dulbeco´s Modified Eagle´s Medium

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELA: Esclerose Lateral Amiotrófica

FGF-2: Fator de crescimento fibroblástico-2

GFAP: Proteína ácida fibrilar glial

K: Potássio

HRTM: Hospital Regional Tarcísio Maia

IGF: Fator de crescimento tipo insulina

IL-1: Interleucina-1

L-15: Meio Leibovitz 15

LIF: Fator inibidor de leucemia

L4: Quarta vertebra lombar

L5: Quinta vertebra lombar

M: Molar

ml: Mililitro

MAP-2: Proteína associada ao Microtúbulo 2

mm: Milímetro

ME: Medula Espinal

MCNI: Meio condicionado de nervo isquiático

Na: Sódio

NeuN: Marcador nuclear neuronal

NF-200: Neurofilamento 200

NGF: Fator de crescimento do nervo

NT-3: Neurotrofina-3

OX-42: Anticorpo primário

PBS: Tampão fosfato

P60: Placas de petri 60 milímetros

rpm: Rotações por minuto

SNC: Sistema nervoso central

SNP: Sistema nervoso periférico

S1: Primeira vertebra sacral

S2: Segunda vertebra sacral

S3: Terceira vertebra sacral

TGF: Fator transformador de crescimento

UERN: Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

RESUMO

Eventos traumáticos são cada vez mais frequentes no cotidiano da sociedade,

gerando lesões graves na medula espinal, implicando na sobrevivência das

células nervosas, prejudicando a regeneração e o restabelicimento dos contatos

funcionais, frequentemente associada à perda permanente da função. Sabe-se

que os nervos periféricos são conhecidos como bons substratos, pois possuem

ambiente ideal para induzir o meio regenerativo. Evidências mostram a influência

da matriz extracelular e do fator de crescimento fibroblástico -2 (FGF-2) no

crescimento de fibras nervosas lesadas no Sistema Nervoso Periférico (SNP).

Nessa perspectiva, esse estudo teve como objetivo analisar a plasticidade

celular da medula espinal na presença de meio condicionado do nervo isquiático

de ratos wistar diante da adição do FGF-2. Esta pesquisa foi aprovada sobre o

parecer consubstanciado CEEA/UERN n0 007/13. O crescimento e a morfologia

celular foram avaliados ao longo de 72 horas. Além disso, a avaliação fenotípica

foi feita a partir da imunocitoquímica para GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III,

NeuN e NF-200 no terceiro dia de cultivo também foi realizada a dosagem de

íons presente no meio de cultura. As células cultivadas com meio condicionado

sozinho ou combinado com FGF-2 demonstraram características morfológicas

semelhantes a neurônios e células gliais e uma significativa atividade

proliferativa, crescimento da área e perímetro nos grupos 2, 3 e 4 ao longo dos

dias. As células cultivadas com meio condicionado desprovido de tratamento

com FGF-2 adquiriram fenótipo glial demostrando imunorreatividade para GFAP,

β-tubulina III e NF-200. As células cultivadas com meio condicionado com adição

de FGF-2 expressaram GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III, NeuN e NF-200. O

estudo possibilitou a plasticidade de células da medula espinal em linhagens

neuronal e glial.

PALAVRAS CHAVE: Cultura da medula espinal. Fator de crescimento

fibroblástico -2. Meio condicionado. Plasticidade neuronal.

ABSTRACT

Traumatic events are more frequent in everyday society, causing severe spinal

cord injuries, resulting in the survival of nerve cells, which impair regeneration

and reestablishment of functional contacts, often associated with permanent loss

of function. It is known that peripheral nerves are known as good substrates

because they have ideal environment to induce the regeneration medium. It is

known that peripheral nerves are known as good substrates because they have

ideal environment to induce the regeneration medium. Evidence shows the

influence of extracellular matrix and fibroblast growth factor -2 (FGF-2) in the

growth of injured nerve fibers in the peripheral nervous system (PNS). From this

perspective, this study aimed to analyze the cellular plasticity of the spinal cord

in the presence of conditioned media of the sciatic nerve of Wistar rats before the

addition of FGF-2. This research was approved on the opinion embodied

CEEA/UERN n0 007/13. Growth and cell morphology were assessed over 72

hours. In addition, phenotypic analysis was performed from

immunocytochemistry GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulin III, NeuN, NF 200 and

third day of cultivation in the dosage of ions present were also carried out in the

culture medium . Cells cultured with conditioned medium alone or with FGF-2

showed morphological features similar to neurons and glial cells and a significant

proliferative activity of the growth area and perimeter in groups 2, 3 and 4

throughout the day. Cells cultured with conditioned medium devoid of FGF-2

treatment with glial phenotype demonstrating acquired immunoreactivity for

GFAP, β-tubulina III e NF-200. Cells cultured with conditioned medium with FGF-

2 expressed addition GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III, NeuN e NF-200. The

study enabled the plasticity of spinal cord cells in neuronal and glial lineages.

KEY WORKS: Spinal cord culture. fibroblast growth factor -2. Conditioned medium. Neuronal plasticity.

15

I INTRODUÇÃO

O Sistema Nervoso é responsável pelas funções orgânicas e pela

integração do homem e dos demais animais ao meio ambiente, uma vez que ele

controla e coordena todas as funções dos demais sistemas corporais, recebendo

e interpretando estímulos oriundos do meio ambiente, desencadeando respostas

específicas a cada estímulo recebido, sejam elas voluntárias ou involuntárias. É

descrito que o Sistema Nervoso divide-se anatomicamente em Sistema Nervoso

Central (SNC) e Sistema Nervoso Periférico (SNP), onde o primeiro tem como

função receber, interpretar e dar respostas aos estímulos conduzidos pelo SNP,

o qual transporta informações de todas as áreas do organismo. Embora tenham

funções e localizações diferentes, o SNC e o SNP são interdependentes (Lundy-

Ekman, 2008).

Pela sua disposição anatômica os nervos periféricos apresentam

possibilidades de lesões frequentes e com mecanismos de injurias variados com

eventos clínicos e traumáticos, cada vez mais comum no cotidiano da sociedade,

como por exemplo: os acidentes automobilísticos, responsáveis por problemas

graves, como dor e sequelas muitas vezes permanentes. Estes danos diminuem

a qualidade de vida das pessoas acometidas, pois geram a incapacitação física

e a perda parcial ou total de suas atividades produtivas, o que origina importantes

consequências econômicas, além do altíssimo custo social gerado pelo aumento

nas despesas da saúde pública (Noble et al., 1998; Santos et al., 2012).

Uma parcela significativa da população Brasileira afetada por lesões em

nervos periféricos encontram-se na plenitude da idade produtiva e

independência funcional, posteriormente ao evento passam para um estágio

onde necessitam da ajuda de terceiros, redução da autoestima e aumento do

custo de vida. Esta afecção vem a constitui-se então, um dos desafios para os

profissionais e pesquisadores da saúde, devido possuir uma alta incidência com

a inexistência de tratamento satisfatório (Cristante et al., 2010; Brito et al., 2011).

16

Estima-se que a incidência das lesões traumáticas em alguns países seja

superior a 500.000 novos casos anuais, dos quais 2,8% dos pacientes adquirem

incapacidades vitalícias em virtude da dificuldade regenerativa, o qual o tempo

é um fator crucial para este evento. No Brasil são poucos os trabalhos publicados

a respeito desta epidemiologia, porém estima-se que ocorram mais de 10.000

novos casos por ano (Noble et al., 1998; Novak e Mackinnon, 2005).

Na busca do modelo mais adequado para pesquisa experimental de

substâncias sistêmicas que atuem na regeneração pós-traumática do SNC,

encontram-se nas literaturas diversos métodos, com variações nas espécies

animais, sítio e método de lesão, tempo de evolução, e meios de análise

funcional e histológica. Diversos estudos publicados demonstram as influências

de inúmeros fatores na recuperação, abordando técnica cirúrgica, enxertos de

fregmentos de nervos e células, administração de substâncias neurotróficas,

laser e até exposição a pulsos eletromagnéticos (Shacklock, 1995; Choi e Dunn,

2001; Boyd et al., 2005; Monte-Raso, 2005; Guo e Dong, 2009; Lukas, 2011;

Souza et al., 2011).

1.1 O PROBLEMA

O crescente número de pessoas no Brasil e no mundo estão sendo

acometidas por doenças neurodegenerativas como a Esclerose Lateral

Amiotrófica, Esclerose Múltipla, Hanseníase, entre outras e por acidentes

traumáticos com mecanismos de injúrias variados, entre eles destacam-se os

acidentes por armas brancas, armas de fogo, acidentes automobilísticos e os

acidentes com motocicletas. Estes acidentes e as doenças neurodegenerativas,

promovem lesões neurológicas de ordem central e ou periférica gerando uma

dependência funcional e passam para um estágio onde necessitam da ajuda de

terceiros, redução da autoestima e aumento do custo social. Esta afecção vem

a constitui-se então, um dos desafios para os profissionais e pesquisadores da

saúde em virtude da inexistência de tratamentos satisfatórios.

17

1.2 OBJETIVOS 1.2.1 OBJETIVO GERAL

Analisar a plasticidade celular da medula espinal na presença de meio

condicionado, na presença e ausência do FGF-2. 1.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar a plasticidade das células da medula espinal promovida pelo meio

condicionado do nervo isquiático e pelo fator FGF-2 a partir dos seguintes

parâmetros:

• Evolução de número, área, perímetro e morfologia celular por 72 horas;

• A imunorreatividades das proteínas gliais: proteína ácida fibrilar glial

(GFAP), marcador microglial OX-42 através da imunocitoquímica das

células gliais da medula espinal;

• A imunorreatividades da proteína associada ao microtúbulo-2 (MAP-2), β-

tubulina III, das proteínas neuronais de neurofilamentos 200 (NF-200) e

da proteína nuclear neuronal (NeuN) através da imunocitoquímica das

células da medula espinal;

• A dosagem dos íons Ca, K e Na no meio de cultura utilizado.

1.3 JUSTIFICATIVA

A pesquisa irá contribuir de forma somatória as discussões sobre o tema,

fomentando a relevância das intervenções mais adequadas, visando à melhoria

da qualidade de vida e a promoção da saúde.

Nesse contexto, visando suprimir as lacunas existentes, a terapia com uso

de meio condicionado do nervo isquiático (MCNI) e a utilização do FGF-2 por ter

se mostrado bastante promissor, possibilitando um alto nível de proliferação

celular, um bom controle de sua atividade proliferativa, plasticidade fenotípica e

regeneração nervosa.

18

II REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS DO NERVO ISQUIÁTICO

Considerado o maior nervo do corpo, o nervo isquiático faz parte do SNP,

pertencendo em carnívoros tanto ao plexo sacral quanto ao lombossacral

(Schwarze e Schröder, 1970; Ellenberger e Baum, 1985; Konig e Liebich 2004).

É um nervo motor que envia, primariamente, a mensagem ao músculo

para que haja contração. Isto ocorre porque o neurônio motor recebe um impulso

nervoso que passa para o corpo celular do neurônio. Esse impulso segue para

o axônio, local onde haverá a despolarização e gerará um potencial de ação na

célula (Konig e Liebich 2004).

Morfologicamente o ramo anastomótico de L4 se une ao L5 constituíndo

o tronco lombossacral, esta constituição se une com S1 e depois

sucessivamente ao S2, S3 e S4 (Figura 1) atravessando o forame isquiático

maior e na sequência emite seus ramos colaterais, chegando ao ramo terminal

chamado de nervo isquiático, por isso denominado como um nervo periférico

(Sobotta e Becher, 2013).

Fonte: Atlas de Anatomia Humana Petra Kopf-Maier 6aed.

Figura 1. Aspectos anatômicos do nervo isquiático.

19

Caudalmente, passa pela coxa entre o trocânter maior do fêmur e a

tuberosidade isquiática, ao longo da superfície lateral do músculo

semimembranáceo, emitindo ramificações para o músculo glúteo médio,

semimembranáceo, semitendíneo, bíceps femoral, gêmeos, quadrado femoral e

adutores. Na região medial da coxa, o nervo isquiático dobra-se distalmente e

se bifurca em nervo fibular comum (L4, L5, S1 e S2) e nervo tibial formado por

L4, L5, S1, S2 e S3. O nervo fibular comum já na fossa poplítea dirige-se

obliquamente para baixo e lateralmente se bifurcando em nervos fibulares

superficial e profundo (Monte-Raso, 2006; Aversi-Ferreira, 2011).

Para os músculos da região glútea vão os nervos glúteo superior (L4, L5

e S1) e glúteo inferior (L5, S1 e S2). Um ramo sensitivo importante é o nervo

cutâneo posterior da coxa, formado por S1, S2 e S3. Para o períneo, temos o

nervo pudendo formado a partir de S2, S3 e S4. Da região glútea em direção à

face posterior da coxa, onde se situa sobre o músculo adutor magno e é cruzado

posteriormente, pela cabeça longa do músculo bíceps femoral, o nervo também

supre ramos articulares para o quadril e ramos musculares para os músculos do

jarrete (Sobotta e Becher, 2013).

2.2 O AMBIENTE DE LESÃO E REGENERAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO

O SNP é composto pelas fibras nervosas, formadas por um ou mais

axônios, envoltos pelas células de Schwann (CSs), mantidas pelo endoneuro,

mais material amorfo da matriz extracelular, capilares, fibroblastos e mastócitos,

assim como o epineuro e o perineuro (Birdi e Antia, 2003). Dentro da bainha

perineural, os axônios e as CSs são envolvidos pela lâmina basal e composta

por várias moléculas secretadas por múltiplas células, dentre elas, as de

Schwann (Alberts et al., 2010). A lâmina basal, através de interações, com

receptores da membrana celular, participa no metabolismo celular, na

organização das proteínas das membranas plasmáticas, na migração celular,

durante a embriogênese e na diferenciação celular. Além disso, influencia a

regeneração axonal, servindo de guia das fibras nervosas e possui ainda funções

estruturais e sinalizadoras (Stoll e Muller, 1999).

Nos anos 80, os experimentos de Aguayo et al.(1981) demonstraram o

potencial de crescimento de fibras de neurônios no modelo de transecção de

20

nervo óptico de ratos adultos, que aloja as fibras nervosas que ligam a retina aos

núcleos subcorticais responsáveis por algumas das funções visuais. Após a

transecção, segmento de nervo isquiático foi interposto entre o coto proximal do

nervo óptico seccionado e o colículo superior, no mesencéfalo. Todo o trajeto do

nervo interposto se fez do lado de fora do crânio. Após alguns meses, a

regeneração foi constatada pela obtenção de registros elétricos no mesencéfalo

após estimulação visual.

O ambiente de lesão dos axônios do SNC difere muito daquele do SNP.

Ao contrário dos nervos, os axônios do SNC não são estruturalmente separados

por bainhas perineurais e neurilemais, estruturas que fornecem um substrato

anatômico para o crescimento da fibra lesada (Junqueira e Carneiro, 2012).

Como os neurônios dos mamíferos geralmente não se dividem, a destruição de

um neurônio representa perda permanente. Seus prolongamentos, no entanto,

dentro de certos limites podem regenerar-se devido à atividade sintética dos

respectivos corpos celulares. Por isso, as fibras se regeneram, embora com

dificuldade. Quando uma célula nervosa é destruída, as que a ela se ligam nada

sofrem, exceto nos raros casos em que um neurônio recebe impulsos

exclusivamente de outro. Neste caso, o neurônio que fica completamente

privado de impulsos nervosos, pela destruição do outro, sofre a chamada

degeneração transneuronal (Purves et al., 2010).

Ao contrário dos elementos nervosos, as células da glia do SNC, e as do

SNP (CSs e células satélites dos gânglios), são dotadas de grande capacidade

de proliferação. Os espaços deixados pelas células e fibras nervosas do SNC

destruído por acidentes ou doença são preenchidos por células da neuroglia

(Alberts et al., 2010). Quando um nervo é seccionado, ocorrem alterações

degenerativas, seguidas de uma fase de reparação. No nervo lesado deve-se

distinguir a parte da fibra que, pela lesão, desligou-se do seu neurônio (parte

distal) e a parte que continua unida ao neurônio (parte proximal). O segmento

proximal, por manter contato com o corpo celular, que é o centro trófico,

frequentemente é regenerado, enquanto o segmento distal degenera totalmente

e acaba por ser reabsorvido (Machado e Haertel, 2014).

No coto distal, tanto o axônio, agora separado de seu centro trófico, como

a bainha de mielina degeneram totalmente. Enquanto se processam essas

alterações, as CSs proliferam, formando colunas celulares compactas. Essas

21

colunas servirão de guia para os axônios que vão crescer durante a fase de

regeneração. Por outro lado, o segmento proximal do axônio cresce e se

ramifica, formando vários filamentos que progridem em direção às colunas de

CSs. Todavia, somente as fibras que penetram nessas colunas têm possibilidade

de alcançar um órgão efetor (Figura 2). Quando o segmento distal do nervo é

perdida, como ocorre na amputação de um membro, as fibras nervosas crescem

ao acaso (Junqueira e Carneiro, 2013).

Fonte: http://new.lakeforest.edu

Figura 2. Ambiente de lesão e regeneração do sistema nervoso.

A eficiência funcional da regeneração depende das fibras ocuparem as

colunas de CSs destinadas aos locais corretos. Num nervo misto, por exemplo,

se as fibras sensitivas regeneradas ocuparem colunas destinadas às placas

motoras de um músculo estriado, a função do músculo não será restabelecida.

A possibilidade de recuperação funcional é aumentada pelo fato de cada fibra

em regeneração dar origem a vários prolongamentos e cada coluna receber

prolongamentos de várias fibras (Purves et al., 2010).

22

Após a lesão, axônios fragmentados e restos de bainha de mielina não

são rapidamente e eficientemente removidos do sítio da ferida no SNC, em parte

porque o processo de ativação microglial é inferior ao observado pelos

macrófagos nos nervos. Alguns trabalhos sugerem que células como as de

linhagem glial e os fagócitos são decisivas no processo de reparo e cicatrização,

com interferência no fenômeno de crescimento de fibras nervosas (Bootcov et

al., 1997; Zeev-brann et al., 1998; Chan et al., 2001; Markus et al., 2002b).

Mudanças na expressão local de citocinas ocorrem após a lesão do SNC.

Citocinas como interleucina-1 (IL-1) e fator de crescimento tumoral-α (TNF-α)

são expressas pelas células que invadem o sítio de lesão da medula espinal e

contribuir para o recrutamento de células inflamatórias e modulação da resposta

glial à cicatrização (Ghirnikar et al., 1998). TNF-α e o fator de crescimento de

colônia-1 (CSF-1) aumentam a migração de macrófagos para a região de nervos

lesados (Lotan e Schwartz, 1994), bem como a adesividade destas células,

sugerindo que elas poderiam melhorar a permissividade do crescimento de fibras

(Prewitt et al., 1997).

As lesões completas, com perda de substância, raramente apresentam

recuperação sem intervenção cirúrgica, e as técnicas atuais de reparação

oferecem resultados aleatórios e frequentemente insatisfatórios. O enxerto

autólogo de nervo proporciona os melhores resultados no reparo quando há

transecção de nervo periférico. Este, porém, apresenta limitações, como uma

maior morbidade no local de retirada do enxerto, escassez de sítios doadores de

nervo, diferenças estruturais entre o nervo doador e receptor, além do déficit

sensitivo resultante na área da qual foi retirado (Oliveira et al., 2004; Ichihara et

al., 2008). Nesse contexto, muitos pesquisadores buscam terapias alternativas,

como transplante de células tronco (CTs) autólogas, técnicas de tubulização com

o uso de diferentes materiais e aplicação de fatores tróficos, com o propósito de

otimizar o reparo de nervos periféricos danificados (Oliveira et al., 2004).

Diversos fatores, como a expressão diferencial de genes envolvidos com

o crescimento, os genes relacionados à estrutura do axônio, as moléculas de

adesão celular e outras da matriz extracelular, o suprimento de fatores

neurotróficos, a presença das citocinas inflamatórias e dos fatores inibidores

relacionados à substância branca, em combinações específicas, determinam

23

como o crescimento axonal será sustentado após a lesão nervosa (Bethea e

Dietrich, 2002; Condic e Lemons, 2002; Nguyen et al., 2002; Snider et al., 2002).

2.3 FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO-2 (FGF-2)

Os fatores neurotróficos são polipeptídeos que auxiliam no processo

regenerativo do SNP. Compreendem basicamente um conjunto de famílias de

moléculas e seus receptores responsáveis por manter o crescimento e a

sobrevivência dos axônios e neurônios motores e sensitivos, após danos

teciduais. Diversos fatores tróficos, também conhecidos como fatores de

crescimento, são utilizados e testados in vitro e in vivo na regeneração de nervos

periféricos. Essas proteínas atuam diretamente na proliferação e diferenciação

de diferentes tipos celulares, sendo capazes de promover reparo tecidual e

recuperação funcional (Boyd e Gordon, 2003).

Vários fatores neurotróficos são liberados e atuam conjuntamente após

uma lesão neural periférica a fim de estimular a regeneração neural; incluem o

fator de crescimento do nervo (NGF), o fator neutrófico derivado do cérebro

(BDNF) (Boyd e Gordon, 2003), a neurotrofina-3 (NT-3) (Markus et al., 2002), os

fatores de crescimento tipo insulina I e II (IGF-I e IGF-II) (Perlson et al., 2004), o

FGF-2 (Terenghi, 1999), entre outros.

No que diz respeito às interações tróficas que determinariam o melhor

microambiente à regeneração, uma nova fase se iniciou com a descoberta do

NGF por Rita Levi Montalcini. Foi descrito que a interação entre o neurônio e as

CSs poderia implicar na sinalização recíproca, envolvendo a liberação de

moléculas com atividade trófica (Levi-Montalcini e Angeletti, 1968).

De forma ampla, os fatores neurotróficos influenciam na atividade neural,

incluindo-se a atividade sináptica, o desenvolvimento durante o período

embrionário, a manutenção e sustentação durante a vida adulta e a

sobrevivência dos neurônios após a lesão nervosa. Estes são produzidos pelos

órgãos alvo e transportados retrogradamente ao corpo celular dos neurônios.

Quando ocorre uma lesão nervosa, há a interrupção no fornecimento destes

fatores, podendo levar à morte neuronal e consequentemente à ausência

24

regenerativa (Terenghi, 1999). Em virtude disso, os componentes não neurais,

por exemplo as CSs, passam a produzi-los, de forma a proteger os neurônios e

estimular a regeneração axonal (Lewin et al., 1997). Os fatores neurotróficos são

divididos em duas classes: as neurotrofinas e as neurocitocinas. Exemplos

clássicos de neurotrofinas são o NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. Como exemplo de

neurocitocinas, destacam-se o FGF, interleucina (IL-1), o fator de crescimento

transformado (TGF), e o fator inibidor de leucemia (LIF) (Lewin et al., 1997).

Estes fatores neurotróficos são importantes para o desenvolvimento e

sobrevivência dos neurônios sensitivos, motores, simpáticos do SNP e neurônios

colinérgicos presentes no SNC. Fatores como o FGF, promovem a sobrevivência

neural, proliferação das CSs e interação entre as células da glia e os neurônios

(Sendtner et al., 1992; Koop et al., 1997; Wang et al., 2008).

O transplante de populações purificadas das CSs parece ser uma

alternativa viável na tentativa de contornar fatores restritivos relacionados ao

microambiente regenerativo e ao crescimento de fibras nervosas. As CSs

secretam fatores neurotróficos, expressam moléculas de adesão e produzem

numerosas moléculas da matriz extracelular, que sabidamente influenciam o

crescimento das fibras nervosas (Xu et al., 1997). Além disso, a injeção local de

CSs está relacionada à diminuição da cicatriz glial (Martini, 1994). Outra

vantagem do uso dessas células deve-se as características técnicas, já que, o

seu número pode ser rapidamente aumentado in vitro em um curto período de

tempo (Morrissey et al., 1991).

As CSs produzem os fatores neurotróficos NGF, BDNF e outras

neurotrofinas, além de membros da família dos fatores de crescimento de

fibroblastos, como o FGF-2 e membros dos IGFs (Yamamoto et al., 1993;

Springer et al., 1994; Hammarberg et al., 1996; Menei et al., 1998; Sayers et al.,

1998; Russell et al., 2000; Kubo et al., 2002). A expressão gênica de vários

fatores neurotróficos ocorre nas CSs nas porções proximal e distal dos cotos

nervosos após a lesão do nervo isquiático do rato (Cheng et al., 1996; Frostick

et al., 1998; Kirsch et al., 1998). O suprimento aumentado de fatores

neurotróficos por estas células serviria para proteger o axônio de uma maior

degeneração retrógrada e, consequentemente, o corpo celular do neurônio, bem

25

como promover o crescimento da fibra no coto distal do nervo lesado (Raivich e

Kreutzberg, 1993; Henderson et al., 1994).

Sabe-se que o FGF-2 é uma proteína mitogênica capaz de agir em

múltiplos tipos de células tal como fibroblastos, neurônios e células da glia (Davis

e Stroobant, 1990; Baird e Klagsbrun, 1991). A proteína e o RNAm do FGF-2

têm sido identificados no citoplasma de neurônios e no núcleo de astrócitos de

muitas regiões do encéfalo (Matsuyama et al., 1992; Woodward et al., 1992;

Humpel et al., 1993; Fuxe et al., 1996; Chadi e Fuxe, 1998). FGF-2 tem uma

função no desenvolvimento neuronal durante a vida prenatal e também influencia

a sobrevivência e a plasticidade de neurônios no SNC maduro. Por exemplo,

favorece neuroproteção para neurônios e astrócitos do núcleo do nervo

hipoglosso após axotomia deste nervo (Walicke, 1988; Chadi et al., 1993).

No SNC, FGF-2 pode causar remielinização e também proteger diferentes

células neuronais de danos induzidos por morte (Butt e Dinsdale, 2005). O FGF-

2 exógeno uma vez aplicado no sistema adulto nigroestriatal, promove a

sobrevivência e crescimento de neurônios dopaminérgicos e os protege da morte

induzida por neurotoxinas in vivo e in vitro (Grothe e Timmer, 2006).

As atividades mitogênicas e neurotróficas do FGF-1 e 2 incluem sua

capacidade de melhorar a sobrevivência e o crescimento de vários tipos de

células neuronais, como do neocórtex, hipocampo, cerebelo, medula espinal e

neurônios sensoriais isolados do SNC de adultos (Matsuda et al., 1990; Peulve

et al., 1994; Himmelseher et al., 1997; Dono, 2003). Eles também influenciam na

migração e diferenciação das células neuronais (Anderson, 1993; Reuss et al.,

2003). Além disso, ambos FGFs como seus receptores são aumentados após

lesão periférica e central do sistema nervoso (Gomez-Pinilla et al., 1992; Logan

et al., 1992; Mocchetti e Wrathall, 1995; Grothe et al., 2001).

A capacidade dos FGFs para atuarem como potentes fatores

neurotróficos tem sido amplamente demonstrada através da prevenção da morte

induzida por axotomia de neurônios glutamatérgicos (Peterson et al., 1996). In

vitro, o FGF-2 protege os neurônios contra citotoxicidade, diminui a morte celular

apoptótica, forma novos vasos sanguíneos e promove reconstrução da bainha

de mielina, exercendo um efeito neuroprotetor nos neurônios motores após

transecção do nervo isquiático ou da injúria contusa da medula espinal (Mattson

26

et al., 1989; Mattson et al., 1993; Fressinaud, 1994; Baffour et al., 1995; Teng et

al., 1998; Teng et al., 1999; Romero et al., 2001).

Em 2009, Guzen et al. avaliaram o potencial regenerativo do GDNF

adicionado a segmentos de nervos isquiáticos interpostos em medulas espinais

transeccionadas de ratos. O GDNF adicionado favoreceu a recuperação motora,

o crescimento de fibras neuronais locais e a neuroplasticidade. Em 2012, Guzen

et al. utilizaram o mesmo modelo de lesão descrito, bem como o mesmo método

terapêutico. No entanto, foi adicionado FGF-2 no espaço promovido pela

transecção completa da medula espinal avaliando a possibilidade de aumentar

a capacidade do enxerto do nervo isquiático em melhorar a recuperação

sensitivo-motora e tecidual observando o desempenho dos membros posteriores

avaliados semanalmente, durante 8 semanas, usando pontuação do

comportamento motor (BBB) e testes sensoriais ligados ao comportamento da

pontuação combinada (CBS), que indicam o grau de melhoria motora e a

porcentagem de déficit funcional, respectivamente. O tratamento da medula

espinal com nervo isquiático e nervo isquiático na adição do FGF-2 permitiu a

recuperação parcial dos movimentos dos membros posteriores em relação ao

controle, manifestado por escores significativamente mais elevados de

comportamento. O FGF-2 adicionado no enxerto de nervo favoreceu a

recuperação motora parcial e fibras imunorreativas para MAP-2, GAP-43 e NF-

200 onde foram encontrados em maior quantidade no interior do enxerto

adicionado de FGF-2.

III METODOLOGIA 3.1 DESENHO EXPERIMENTAL

Para a realização do experimento foram utilizados 12 animais (ratos da

linhagem Wistar - Rattus novergicus), 06 destes animais, machos com idade

entre 40 a 50 dias e peso aproximado de 250 gramas que permaneceram no

biotério por uma semana antes de serem utilizados, mantidos em gaiolas

plásticas (30 x 16 x 19 cm) coletivas com, no máximo, três animais em cada

27

gaiola e com temperatura média de 22 ± 2ºC, alimentados com ração padrão e

água de torneira fornecida ad libitum. E outros 06 com idade de 02 dias oriundos

do Biotério da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN). O

projeto atendeu as normas para a realização de pesquisa em animais com todos

os procedimentos, passando pela Comissão de Ética no Uso de Animais da

(UERN) sendo aprovado e autorizado através do parecer consubstanciado

CEEA/UERN n0 007/13 (Apêndice 1).

3.2 EXTRAÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DA MEDULA ESPINAL (ME)

As células da medula espinal foram coletadas de seis ratos Wistar com 2

dias de vida. Para a extração da (ME) foi utilizado o protocolo modificado de

Cheng e colaboradores (1996). Foi realizado uma eutanásia nos neonatos

utilizando pentobarbital, 60-80mg/kg por via intraperitoneal, posteriormente foi

realizado uma incisão longitudinal paralela a coluna vertebral, retirando toda a

coluna e transferido para tubo falcon de 15mL contendo 4mL de meio Leibovitz-

15 (L-15: GIBCO Invitrogen Corporation). Sob fluxo laminar, teve inicio o

processo de extração da medula, com auxílio de uma tesoura e uma espátula

pequena (Figura 3).

Figura 3. Extração da medula espinal e preparados da medula para a suspensão celular.

28

Novos tubos cônicos facon de 15mL com 4mL de meio Knockout DMEM

low (Dulbecco`s modified Eagle`s medium), suplementado com 10% de soro

bovino fetal e 10U/ml de penicilina G, 10μg/ml de estreptomicina e 25μg/ml de

anfotericina B (D-10), todos obtidos da Cultilab® foram preparados e receberam

a medula extraída para realizar a suspensão celular. A suspensão foi

centrifugada a 3000rpm durante cinco minutos a uma temperatura de 370C, após

o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em 1mL de

meio, procedimento repetido por três vezes. Placas para cultura com 60mm

(P60) para o plaqueamento foram preparadas com 1mL de soro bovino fetal,

retirado e desprezado após 30 minutos, na sequência foi adicionado 4,5mL de

D-10 nas P60, em seguida foi realizado o gotejamento das células recém

extraídas, mantidas em estufa úmida a 370C com 5% de CO2 e 95% de ar. A

microscopia de luz invertida com contraste de fases foi utilizada para observação

da adesão celular no fundo das placas. Para possibilitar um suprimento

nutricional adequado, eliminar células hematopoiéticas e desprendidas, bem

como possibilitar uma adequada adesão celular no fundo das placas, o meio de

cultura D-10 foi trocado a cada três dias (Figura 4).

Figura 4. Troca de meio de cultura celular.

29

3.3 EXTRAÇÃO E CULTIVO DOS EXPLANTES DE NERVO ISQUIÁTICO

Sob o fluxo laminar, placas para cultura, P60 foram preparadas com 5ml

do meio L-15. Nos animais que foram submetidos à extração do nervo isquiático,

foi realizada a eutanásia com pentobarbital, 60-80mg/kg por via intraperitoneal e

posteriormente a realização de uma tricotomia da região posterior do dorso e

assepsia local com álcool a 70%. A seguir, foram feitos acessos cirúrgicos na

região posterior da coxa nos dois antímeros, afastando os planos musculares,

resultando na exposição do nervo isquiático e promovendo a retirada do mesmo

(Figura 5).

Figura 5. Acesso cirúrgico ao nervo isquiático.

Cada segmento apresentou aproximadamente 35 mm de comprimento

por 1 mm de diâmetro (Figura 6).

Os nervos isquiáticos foram retirados e colocados nas P60 com meio L-

15, sob técnica cirúrgica asséptica com o auxílio de microinstrumentos (tesoura,

pinça, afastadores). Todo excesso de tecido (músculo, gordura e vasos

sanguíneos) aderido aos nervos foi removido sob magnificação por lupa

estereoscópica SZ61 (Olympus®).

30

Figura 6. Nervo isquiático dissecado.

A seguir, o epineuro e perineuro dos nervos foram removidos sob

magnificação e técnica microcirúrgica (Figura 7).

Figura 7. Remoção do Epineuro e Perineuro do nervo isquiático.

Os nervos dissecados foram segmentados em explantes de 1mm de

comprimento cada. Sob fluxo laminar, os fragmentos dos nervos foram

colocados nas P60 com meio de cultura D-10.

O excesso do meio foi removido de forma que os explantes não ficassem

flutuando, nem tão pouco submersos no meio (Figura 8). Após o quinto dia, o

meio D-10 destas culturas foi trocado 02 vezes por semana, sendo os explantes

transferidos para uma placa nova, com meio novo 01 vez por semana. O meio

trocado foi imediatamente desprezado. Esse procedimento possibilitou um

suprimento nutricional adequado aos explantes, bem como a sua reatividade.

Foram plaqueados 18 explantes de nervo isquiático em cada P60.

31

Figura 8. Placas P60 com meio condicionado por explantes de nervo isquiático.

3.4 SUBCULTIVOS DAS CÉLULAS DA MEDULA ESPINAL E OS GRUPOS EXPERIMENTAIS

Quando as células da ME atingiram 70-90% de confluência no fundo da

placa, o meio básico foi removido e adicionados às placas 2 ml de tripsina/EDTA

(0,25% de tripsina contendo 1 mM de EDTA-Cutilab/Brasil®). A suspensão

celular foi colocada em tubo cônico tipo Falcon com o mesmo volume de meio

DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal por 10 minutos, com o

objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante

dez minutos, após o sobrenadante foi desprezado e as células foram

ressuspendidas em 1 mL de meio (Figura 9).

Figura 9. Células precipitadas após centrifugação.

32

As células foram depositadas em 12 P60, sendo 3 placas para cada grupo

e observadas em três períodos de tempo: 24, 48 e 72 horas (Figura 10), desta

forma foi possível avaliar a aderência e proliferação das células da ME nos

seguintes grupos:

Grupo 1 (G1): ME + Meio D-10;

Grupo 2 (G2): ME + Meio de cultura do nervo isquiático (MCNI);

Grupo 3 (G3): ME + MCNI + FGF-2;

Grupo 4 (G4): ME + FGF-2.

Figura 10. Delineamento do estudo: Formação de grupos e observação celular.

No grupo G1 encontramos células da ME na presença do meio D-10, no

G2 encontramos células da ME na presença de MCNI. Nos grupos de estudo G3

e G4 foi acrescido 1μl de FGF-2 (Sigma®) na concentração 1:10 (Guzen et al.,

2012). Já nos grupos 2 e 3 foi acrescido 1ml de meio (D-10), o qual foi coletado

do meio que estava plaqueado os explantes.

Para observação celular foi utilizado um microscópio invertido com

contraste de fases CKX41 (Olympus®) com câmera digital Moticam 3.0 (Motic®)

acoplada.

33

A contagem das células foi realizada usando microscopia de contraste de

fases em 4 campos não sobrepostos no aumento de 200x. Foram feitas

microfotografias dos 4 grupos em 24 horas, 48 horas e 72 horas, sendo que,

após 72 horas de observação celular, procedeu a imunocitoquímica.

3.5 MARCAÇÃO IMUNOCITOQUÍMICA

No terceiro dia (72 horas), o meio foi retirado e as células lavadas em duas

etapas de cinco minutos com tampão de fosfato (PBS) de sódio, 0,1M, pH 7,4,

fixadas em paraformaldeído (4%) por trinta minutos e, novamente, lavadas em

três banhos de PBS, cinco minutos cada. Em seguida, as células foram tratadas

com Triton à 0,5% (Sigma®) por 10 minutos e lavadas em PBS. Posteriormente,

bloqueios de sítios inespecíficos foram realizados durante 30 minutos em

solução PBS 0,1M contendo 0,2% de Triton e 1% de albumina do soro de boi

(BSA). As células foram, então incubadas com um dos anticorpos primários

descritos abaixo por 2 horas à temperatura ambiente (quadro 1).

Quadro 1. Lista de anticorpos primários.

Anticorpo 1° Animal Concentração Fornecedor

GFAP Mouse 1:400 Sigma

OX 42 Mouse 1:500 Millipore

MAP-2 Mouse 1:2000 Abcam

β-tubulina Rabbit 1:500 Millipore

NeuN Mouse 1:500 Millipore

NF-200 Mouse 1:1200 Abcam

1. Anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) feito em camundongo

(Sigma) para marcação de astrócitos na concentração de 1:400; Este gene

codifica uma das principais proteínas de filamentos intermediários de astrócitos

34

maduros, sendo utilizado como um marcador para distinguir os astrócitos de

outras células gliais durante o desenvolvimento.

2. Anti-CD11b antibody [OX-42]: Este marcador reconhece a maioria

dos macrófagos, células de Kupffer e também rotula extensões de células

dendríticas, granulócitos e células com a morfologia da microglia no cérebro.

3. Anti-proteína associada ao microtúbulo-2 (MAP-2) feito em

camundongo (Abcam) para marcação de fibras na concentração 1:2000; Este

gene codifica uma proteína que pertence à família das proteínas associadas aos

microtúbulos. Tais proteínas estão envolvidas com a montagem de microtúbulos

no citoesqueleto dos neurônios, determinando e estabilizando a forma dendrítica

durante o desenvolvimento neuronal.

4. Anti-β-tubulina: O anticorpo reconhece todas as cinco isoformas de

β-tubulina (β1-β5) 0,1 reage com o β-Lc e fragmentos β-sc na parte carboxi-

terminal da β-tubulina em imunotransferência. A polimerização de dímeros de

tubulina estão relacionados à formação de microtúbulos. O anticorpo pode ser

usado para localizar β-tubulina em cultura de células ou secções de tecido.

5. Anti-NeuN feito em camundongo (Millipore) para marcação de

corpos neuronais na concentração 1:500; Trata-se de uma proteína nuclear

específica para neurônios que é identificado por imunorreatividade com um

anticorpo monoclonal anti-NeuN. Tem sido amplamente utilizado como uma

ferramenta confiável para detectar tipos de células neuronais pós-mitótica em

neurociência, biologia do desenvolvimento, e diagnóstico histopatológico.

6. Anti-neurofilamento-200 (NF-200) feito em camundongo (Abcam)

para marcação de fibras na concentração 1:1200; Este gene codifica a proteína

de neurofilamento dos axônios, mantendo o calibre e podendo desempenhar um

papel no transporte intracelular. Esta proteína é normalmente utilizada como um

biomarcador de danos neuronais.

Ao término desta etapa, as células foram lavadas em PBS (0,1M; pH 7,4)

por cinco minutos e incubadas por 1 hora com anticorpo secundário anti-mouse

e anti-rabbit produzidos em donkey (Jackson, EUA) conjugados ao fluorofore

AlexaFluor 488 ou AlexaFluor 594 ou FitC ou TritC mantidas em ambiente

refrigerado com ausência de luz. Após a incubação secundária, as células foram

lavadas com PBS por cinco minutos e, imediatamente, examinadas no

microscópio de fluorescência do Laboratório de Neurologia Experimental da

35

UERN (Eclipse E200, Nikon®) e posteriormente no microscópio de fluorescência

do Laboratório de Estudos Neuroquímicos da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte / UFRN (Eclipse Ni, Nikon®).

As fotomicrografias foram realizadas com as câmeras digitais Moticam 3.0

e 5.0 (Motic®) nos aumentos de 40x, 100x, 200x em 4 campos numa sequência

definida previamente em cada placa (Figura 11). Na ocorrência de marcações

fluorescentes registrada nas células da ME, existiu o cuidado de examinar o

compartimento subcelular, citoplasmático ou nuclear das imunorreatividades.

Figura 11. Campos de observação celular nas P60.

Dois avaliadores independentes quantificaram as células por campo em

números absolutos, aferindo o perímetro (μm) e a área (μm2) de cada célula em

campos visuais não sobrepostos aleatoriamente, usando cultura de células de

no mínimo 3 experimentos diferentes com aumento de 200x, através de

softwares previamente calibrados (kappa = 0,94). Os softwares utilizados foram

Motic Images Plus 2.0 (Motic®) para observação morfológica, o software Image-

J para contagem celular. Para correção mínima de brilho e contraste das

fotomicrografias, foi utilizado o software Adobe Photshop CS-6.0 (Adobe®).

36

3.6 DOSAGEM DE ÍONS Ao completar 72 horas do subcultivos dos grupos experimentais o meio

de cultura foi retirado das P60 e sob o fluxo laminar colocados em tubos cônicos

tipo falcon de 15mL devidamente identificados (Figura 12) e posteriormente

levados ao setor de análises clínicas do Hospital Regional Tarcísio Maia (HRTM)

para a realização das dosagens dos íons sódio (Na), potássio (K) e cálcio (Ca).

Figura 12. Identificação dos meios de cultura após 72 horas para dosagem de íons.

As dosagens foram realizadas em um analisador (9180 electrolyte

analyzer) AVL automatizado da Roche®. Inicialmente foi realizado uma limpeza

do analisador utilizando o Cleaning solution (Roche®) e com o Sodium electrode

conditioner (solução condicionadora da Roche®), ambas realizadas através da

agulha analisadora de forma automatizada, na sequência solicitou a

autocalibração.

Foram separados tubos de hemólise esterilizados e identificados para que

pudessem receber 100μl de cada meio de cultura que foi analisado. Os tubos de

hemólise já com os meios de cultura foram levados de forma individual ao

analisador e realizado a dosagem dos íons.

37

3.7 ANÁLISES DOS DADOS

O banco de dados da pesquisa foi construído na plataforma do software

SPSS® (Statistical Package for Social Sciences) versão 22.0, com posterior

verificação de consistência da digitação. Após a estruturação final do banco de

dados, foi realizada inicialmente uma análise descritiva de todos os dados

(número, área, perímetro celular e dosagem de íons).

Os dados de expansão celular (número de células, área e perímetro) ao

longo de 72 horas e a dosagem dos íons foram comparados estatisticamente

através da análise de variância (ANOVA) com teste de Bonferone considerando

significante quando p < 0,05.

IV RESULTADOS

Nas placas com explantes de nervo isquiático (seta), constatou-se

inicialmente migração de células de morfologia fibroblastóide (cabeça de seta)

dos fragmentos (Figura 13). Nesta fase, os explantes foram removidos após

cinco dias para uma nova placa de cultura, o que levou à eliminação progressiva

das células que migraram do tecido para o fundo da placa e a possibilidade de

migração de população de CSs (Figura 14)

38

Figura 13. Células de morfologia fibroblastóide.

Figura 14. População de células de Schwann.

Após os procedimentos de subcultivos e formação dos grupos de estudo,

as células ficaram aderidas ao fundo das placas e foram acompanhadas ao longo

de 3 dias para observação do crescimento populacional, área, perímetro,

mudanças morfológicas e fenotípicas.

As culturas de células realizadas, quando cultivadas em MCNI acrescido

de FGF-2, apresentaram alterações mais visíveis quando comparadas com

culturas desprovidas desse tratamento, possibilitando a identificação mais

evidente da morfologia das células gliais e neuronais, resultando desta forma em

efeito plástico (Figura 15).

39

Figura 15. Aspectos Morfológicos das células gliais (cabeça de seta) e células neuronais (seta).

As populações de células da ME utilizadas foram morfologicamente

homogêneas. As culturas de células derivadas da ME, quando cultivadas em

MCNI e FGF-2, apresentaram alterações mais visíveis quando comparadas com

as culturas cultivadas somente em meio D-10, ou somente com FGF-2,

sobretudo no terceiro dia de observação microscópica (Figura 16).

40

Figura 16. Morfologia das células após formação dos grupos experimentais por 72 horas. Grupo 1: painéis

A (24 horas), B (48 horas), C (72 horas); Grupo 2: Painéis D (24 horas), E (48 horas), F (72 horas); Grupo

3: Painéis G (24 horas), H (48 horas), I (72 horas); Grupo 4: Painéis J (24 horas), K (48 horas), L (72 horas).

Escala 100µm.

A B C

D

G

E F

H I

J K L

41

4.1. MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E EXPANSÃO DAS CÉLULAS GLIAIS

Com o acompanhamento das células por 72 horas, verificou-se que as

populações se multiplicaram progressivamente desde o primeiro dia até o último

dia de observação em todos os grupos experimentais. No entanto, percebe-se

que no grupo 1 o número de células gliais era maior que o número de células

neuronais. No primeiro dia de registro no grupo 1, alguns campos foram

microfotografados e apresentaram poucas células gliais, especificamente no

primeiro dia de observação. Em contrapartida no segundo dia de observação

foram contabilizadas 116 células no grupo 2 e 106 células no grupo 4.

Contabilizando todas as células ao longo dos três dias de observação em

números absolutos, destacaram-se o grupo 2 (284) e o grupo 4 (239) com maior

número de células, seguido do grupo 3 (146) e do grupo 1 com 96 células gliais

(Tabela 1).

Especificamente, no grupo 1 ocorreu diferença estatística significante

entre o número de células nos 3 dias de observação, onde em 72 horas

(p=0,001) a média das células foi maior que em 24 horas e 48 horas (p=0,004)

maior que 24 horas. No grupo 2, a média de células observadas foi maior no

terceiro dia quando comparado ao dia 1 (p=0,001). Ainda no grupo 2 observa-se

que o número de células foi maior em 48 horas (p=0,001) quando comparado a

24 horas e que em 72 horas (p=0,004) apresentou um número maior quando

comparado a 48 horas. No grupo 3, a média de células contadas em 72 horas

foi superior ao número de células registradas em 24 (p=0,001) e 48 horas

(p=0,007). Porém, 48 horas (p=0,002) foi maior que 24 horas no grupo 3. No

grupo 4, houve diferença estatística significante em 48 horas (p= 0,001) e em 72

horas (p= 0,001) quando comparadas ao número de células registradas em 24

horas. E entre 72 horas (p=0,001) e 48 horas (Figura 17).

Comparando a média do número de células observadas de todos os

grupos experimentais por dia de registro (Dias 1, 2 e 3), verificou-se que não

houver diferença estatística significante no dia 1 e no dia 2. Porém, no dia 3

observa-se uma diferença significante entre os grupos 2 (p= 0,012), 3 (p=0,032)

e 4(0,012) quando comparado com o grupo 1.

42

Considerando a área como aspecto morfológico das células, os grupos 1,

2, 3 e 4 mantiveram ao longo dos três dias de observação um crescimento das

células gliais. Destaque para o grupo 4 por apresentar uma média de

865334184,50 μm2 em 72 horas das células gliais (Tabela 2).

Nos três dias (24 horas, 48 horas e 72 horas) de observação, a área média

das células gliais do grupo 4 foi superior às dos grupos 1, 2 e 3 (Figura 20).

Na observação da área glial do grupo 1 verificou-se que no grupo 1 não

houve diferença estatística significante. No grupo 2, a área glial observada foi

maior no dia 2 (p=0,001) e no dia 3 (p=0,001) quando comparado ao dia 1, ainda

no grupo 2 observou que no dia 3 (p=0,001) a área foi maior que o dia 2. No

grupo 3, a área das células gliais em 72 horas foi superior a área das células em

24 (p=0,001) e 48 horas (p=0,001). O grupo 4, também apresentou diferença

estatística significante na área das células glias no dia 2 (p=0,001) e no dia 3

(p=0,001) quando comparado com dia 1. O dia 3 (p=0,001) também, apresentou

áreas gliais maiores que o dia 2 do grupo 4 (Figura 19).

Observou-se que a área das células gliais de todos os grupos

experimentais por dia de registro (Dias 1, 2 e 3), apresentaram crescimento

maior que as do grupo 1. No dia 1 percebeu que a área celular das glias do grupo

3 (p=0,021) foi maior que o grupo 1 e maior que do grupo 2 (p=0,001). Ainda no

dia 1 o grupo 4 (p=0,001/p=0,001) apresentou área maior que a do grupo 1 e 2

respetivamente. No dia 2 verificou-se que os grupos 2 (p=0,001), 3 (p=0,001) e

4 (p=0,001) apresentaram células gliais com áreas maiores que o grupo 1. Já no

dia 3 foi possível observar que os grupos 2 (p=0,001), 3 (p=0,001) e 4 (p=0,001)

apresentaram áreas celulares maiores que o grupo 1 e que o grupo 3 (p=0,009)

e o grupo 4 (p=0,001) apresentou células com áreas maiores que o grupo 2

(Figura 20).

Após a medição do perímetro das células gliais, observou-se que ao longo

dos três dias de observação dos grupos 1, 2, 3 e 4 as células gliais aumentaram

seu perímetro. No dia 2 de observação (48 horas), o perímetro médio das células

do grupo 2 e 3 foi superior às dos grupos 1 e 4. No dia 3 de aferição, os

perímetros médios das células gliais dos grupos 3 e 4 foram bastante

semelhantes e maiores que dos grupos 1 e 2 (Tabela 3).

Verificou-se que no grupo 1 não apresentou diferença estatística

significante entre os grupos. No grupo 2, o perímetro das células observadas foi

43

maior no terceiro dia quando comparado ao dia 1 (p=0,001) e ao dia 2 (p=0,001).

No grupo 3, o perímetro das células gliais em 48 horas (p=0,001) foi superior ao

registrado em 24 horas, bem como, em 72 horas o perímetro das células gliais

foi superior ao registrado em 24 (p=0,001) e 48 horas (p=0,001). O grupo 4,

houve diferença estatística significativa do perímetro glial no terceiro dia

comparado aos dois dias anteriores (p=0,001/24horas; p=0,001/48horas) (Figura

21).

Comparando a média do perímetro das células gliais observadas de todos

os grupos experimentais ao longo dos três dias (Dias 1, 2 e 3), verificou-se que

em 24 horas, a média do perímetro das células no grupo 2 (p=0,001), grupo 3

(p=0,001) e do grupo 4 (p=0,002) foi superior a perímetro das células gliais do

grupo 1. Em 48 horas de observou-se que a média dos perímetros das células

gliais dos grupos 2, 3 e 4 foram superiores ao grupo 1 (Grupo 2/p=0,001; Grupo

3/p=0,001; Grupo4/p=0,001), que o grupo 3 (p=0,015) foi superior ao grupo 2 e

que o grupo 3 (p=0,065) foi superior ao grupo 4. No último dia de observação

dos perímetros gliais os grupos 2, 3 e 4 foram superiores ao grupo 1 (Grupo

2/p=0,001; Grupo 3/p=0,001; Grupo4/p=0,001) e os grupos 3 (p=0,001) e 4

(p=0,001) foram superior ao grupo 2 (Figura 22).

44

Tabela 1. Descrição da amostra dos grupos de acordo com número de células

gliais

Grupo ME + D10

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 6,50 + 2,08 6,50 4,50 – 8,50 4,00 9,00

48 horas 13,75 + 2,21 14,00 11,50 – 15,75 11,00 16,00

72 horas 17,50 + 5,25 16,00 13,50 – 23,00 13,00 25,00

Grupo ME + MCNI

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 8,75 + 1,75 9,00 7,25 – 10,50 6,00 11,00

48 horas 17,75 + 5,06 17,50 13,75 – 22,75 10,00 25,00

72 horas 25,75 + 10,87 25,00 15,25 – 34,75 11,00 43,00

Grupo ME + MCNI + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 10,75 + 3,30 11,00 507, – 13,75 7,00 13,75

48 horas 18,57 + 10,22 17,00 8,00 – 29,00 8,00 34,00

72 horas 20,60 + 5,98 22,00 15,00 – 25,50 12,00 28,00

Grupo ME + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 8,50 + 2,07 8,00 7,25 – 9,00 6,00 13,00

48 horas 20,62 + 9,11 17,50 13,25 – 29,25 13,00 37,00

72 horas 29,00 + 7,98 28,00 21,25 – 36,00 20,00 41,00

45

Figura 17. Número de células gliais observadas em cada grupo experimental

de acordo com o dia de observação. P valores (a= 0,001; b= 0,004; c= 0,001;

d= 0,004; e= 0,001; f= 0,001; g=0,002; h=0,007; i=0,001; j=0,001; k=0,001).

c

e

f g

i j

a b

d

h

k

46

Figura 18. Número de células gliais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com

o grupo experimental. P valores (a= 0,012; b= 0,032; c=0,012)

c b a

47

Tabela 2. Descrição da amostra dos grupos de acordo com área de células gliais.

Grupo ME + D10

Número celular N Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas

10 5721,60 + 2165,91 5879,50 4337,00 –

7816,00 1652,0

0 8601,00

48 horas

49

21016,57 + 25336,45 4516,00 2595,50 –

40846,50 1026,0

0 84262,00

72 horas

37

68255,02 + 87138,46 44519,00 36589,00 –

65702,00 22717,

00 476453,0

0

Grupo ME + MCNI

Número celular N Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas

54

46840556,72 + 17924530,42

44137825,00

33784893,75 – 62845764,25

10629512,00

86345550,00

48 horas

116

368286411,90 + 209321088,20

414975264,00

310676512,50 – 511482261,50

11885136,00

853617150,00

72 horas

114

497461767,20 + 227521356,40

523512596,00

325670366,50 – 655605458,00

12224695,00

999989150,00

Grupo ME + MCNI + FGF2

Número celular N Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 30 379012033,20 +

710738308,80 19089846

9,00 128766837,50 – 278886268,80

51955319,00

3999765450,00

48 horas 42 331334737,40 +

411798168,40 31120497

0,00 44840904,00 – 431186594,50

13582997,00

2659654803,00

72 horas

74

695408816,10 + 124179050,70

648775176,00

625773755,80 – 778678484,00

420782039

945638928,00

Grupo ME + FGF2

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas

35

200956213,50 + 183191773,30

212021050,00

54332162,00 – 228592303,00

14465808,00

876634100,00

48 horas 106 436897368,60 +

296110245,20 62101973

8,00 108816907,80 – 664853500,00

10119340,00

837421359,00

72 horas 98 616116568,40 +

416186295,70 86533418

4,50 58406984,50 – 943499614,50

10323103,00

998341156,00

48

Figura19. Área de células gliais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação. P valores (a= 0,001; b= 0,001; c= 0,001; d=

0,001; e= 0,001; f= 0,001; g= 0,001; h= 0,001).

f g h

d e

a b c

49

Figura 20. Área de células gliais observadas nos dias 1, 2 e 3 de acordo com o

grupo experimental. P valores (a= 0,001; b= 0,021; c= 0,001; d= 0,001; e=

0,001; f= 0,001; g= 0,001; h=0,001; i= 0,001; j= 0,001; k= 0,001; L=0,009).

a b

e

g f

h i

j k

L

c d

50

Tabela 3. Descrição da amostra dos grupos de acordo com perímetro de células gliais.

Grupo ME + D10

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 10 3626,30 + 1025,68 3379,50 3105,25 –

3993,50 2112,0

0 5770,00

48 horas 49 13853,46 +

16763,11 2839,00 2078,00 – 27739,50

1042,00 81940,00

72 horas 37 89447,48 +

51266,64 124027,00 30421,50 – 133703,00

15798,00

138814,00

Grupo ME + MCNI

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 54 4110458,70 +

4363676,97 3191872,5

0 2412034,75 – 4214390,50

1146618,00

29449369,00

48 horas 116 4492756,17 +

3117513,20 6138479,0

0 312081,75 – 7200282,75

134379,00

9246509,00

72 horas 114 6879317,72 +

1315599,66 7198521,5

0 6253811,25 – 7413427,75

255190,00

9391048,00

Grupo ME + MCNI + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 30 4489999,40 +

1354535,22 4480039,5

0 3341483,75 – 5389645,25

1364420,00

7383281,00

48 horas 42 5898764,40 +

2236620,32 6240485,5

0 5269889,25 – 7260866,00

178229

9296201,00

72 horas 74 8128709,71 +

1090469,74 8258491,5

0 7276986,75 – 9206516,25

5179175,00

9405780,00

Grupo ME + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 35 4013214,45 +

1570409,09 4157091,0

0 3154367,00 – 5187032,00

1158938,00

8231739,00

48 horas 106 4724517,30 +

2695571,12 5572404,5

0 1357602,50 – 6674496,50

189190,00

8793721,00

72 horas 98 8219812,76 +

1001163,02 8278656,0

0 7311828,75 – 9237308,75

6130492,00

9399978,00

51

Figura 21. Perímetro de células gliais observadas em cada grupo experimental

de acordo com o dia de observação. P valores (a= 0,001; b= 0,001; c= 0,001;

d= 0,001; e= 0,001; f= 0,001; g= 0,001).

g f

c d e

a b

52

Figura 22. Perímetro de células gliais observadas nos dias 1, 2 e 3 de acordo

com o grupo experimental. P valores (a= 0,002; b= 0,001; c= 0,001; d= 0,001;

e= 0,001; f= 0,001; g= 0,015; h= 0,065; i= 0,001; j= 0,001; k= 0,001; L= 0,001;

m= 0,001).

a b

c

d e

f g h

i j

k m L

53

4.2. MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E EXPANSÃO DAS CÉLULAS NEURONAIS

Nas observações realizadas das células neurais, destacamos o grupo 2

no dia 2, onde foram contabilizadas 182 células neuronais e 117 células no grupo

4. Quando contabilizado todas as células neuronais ao longo dos três dias em

números absolutos, destacaram-se o grupo 2 (290) e o grupo 4 (196) com maior

número de células, seguidos do grupo 3 (153) e do grupo 1 com 15 células

neuronais (Tabela 4).

Verificou-se que no grupo 1 não apresentou diferença estatística

significante entre o número de células entre 24 horas e 48 horas e 72 horas. No

grupo 2, a média de células observadas foi maior no terceiro dia quando

comparado ao dia 1 (p=0,001) e ao dia 2 (p=0,001). Ainda no grupo 2 foi possível

observar que o dia 2 (p=0,001) apresentou um número maior de células quando

comparado ao dia 1. No grupo 3, a média de células contadas em 72 horas foi

superior ao número de células registradas em 24 (p=0,001) e 48 horas (p=0,001).

No grupo 3 também foi possível observar que a média de células contadas em

48 horas foi superior ao número de células registradas em 24 (p=0,001). O grupo

4, houve diferença estatística significante no número de células vistas no terceiro

dia para os dois dias anteriores (p=0,001/24horas; p=0,006/48horas) e entre as

células observadas no dia 2 e 1 (p=0,001) (Figura 23).

Comparando a média do número de células neuronais observadas de

todos os grupos experimentais por dia de registro (Dias 1, 2 e 3), verificou-se

que em 24 horas, a média de células contadas no grupo 2 foi superior ao número

de células do grupo 1 (p=0,002). Após 48 horas de indução, a média de células

neuronais observadas no grupo 3 foi superior aos demais grupos e a média do

grupo 2 (p=0,001) e do grupo 4 (p=0,001). Foi superior à do grupo 1. No último

dia de contagem os grupos 2 (p=0,001), 3 (p=0,001) e 4 (p=0,001) foram

superiores ao grupo 1. É possível observar também que o grupo 3

(p=0,001/p=0,001) apresentou uma média de células neuronais maior que o

grupo 2 e 4 respectivamente (Figura 24).

Considerando a área como aspecto morfológico das células, observou

que ao longo das 72 horas uma semelhança na média das áreas dos grupos 3 e

4 em relação ao grupo 1 e 2 (Tabela 5).

54

Quando observado a área das células neuronais do grupo 1 foi possível

identificar que não houver diferença estatística significante. No grupo 2 a área

entre 48 horas (p=0,019) e 24 horas apresentou diferença estatística, da mesma

forma quando comparado 72 horas (p=0,001) entre 24 horas e 72 horas (0,001)

entre 48 horas. No grupo 3 observou que entre 48 horas (p=0,024) e 24 horas

apresentou diferença estatística significante, da mesma forma quando

comparado 72 horas (p=0,001) entre 24 horas e 72 horas (0,001) entre 48 horas.

No grupo 4 a área apresentou diferença entre 48 horas (p=0,001) e 24 horas e

entre 72 horas (p=0,001) e 24 horas (Figura 25).

Comparando a média da área das células neuronais observadas de todos

os grupos experimentais ao longo dos três dias (Dias 1, 2 e 3), percebeu que no

dia 1 o grupo 4 (p=0,0047) foi superior ao grupo 1. Porém, não apresentou

diferença estatística significativa para os demais grupos. No dia 2 de observação

os grupos 2 (0,001), grupo 3 (p=0,001) e o grupo 4 (p=0,001) foram superiores

ao grupo 1 e ainda apresentou o grupo 4 (p=0,004) superior ao grupo 2. No dia

3 os grupos 2 (p=0,001), 3 (0,001) e 4 (p=0,003) foram superiores ao grupo 1 e

ainda foi possível observar que o grupo 2 (p=0,000) foi superior ao grupo 3 e

grupo 4.

Na observação do perímetro das células neuronais do grupo 1 não houve

diferença estatística significativa entre os três dias. No grupo 2, o perímetro das

células observadas foi maior em 72 horas (p=0,001) quando comparado ao dia

1 e também, foi maior em 72 horas (p=0,001) quando comparado ao dia 2. No

grupo 3, o perímetro das células neuronais em 48 horas (p=0,001) e em 72horas

(0,001) foi superior ao registrado em 24 horas, bem como, em 72 horas (p=0,001)

o perímetro das células foi superior ao registrado em 48 horas. Já no grupo 4 o

perímetro das células neuronais foi superior em 72 horas ao registrado, quando

comparado aos dois dias anteriores (p=0,001/24horas; p=0,001/48horas) e é

possível observar também que em 48 horas (p=0,000) foi superior a 24horas

(Figura 27).

Quando observado a média do perímetro das células neuronais de todos

os grupos experimentais ao longo dos três dias (Dias 1, 2 e 3), foi possível

perceber que no dia 1, a média do perímetro das células no grupo 2

(p=0,038/p=0,012), foi superior ao perímetro das células do grupo 4 e grupo 1.

Todavia, a média dos perímetros dos grupos 4 e 3 não apresentaram diferença

55

estatística significante quando comparado ao grupo 1. No dia 2 observou-se que

a média dos perímetros das células neuronais dos grupos 2, 3 e 4 foram

superiores ao grupo 1 (Grupo 2/p=0,010; Grupo 3/p=0,001; Grupo4/p=0,001) e

que o grupo 4 (p=0,001) foi superior ao grupo 2. Ainda no segundo dia observou

que o grupo 3 (p=0,001) foi maior que o grupo 2. No último dia de observação

dos perímetros neuronais os grupos 2, 3 e 4 foram superiores ao grupo 1 (Grupo

2/p=0,001; Grupo 3/p=0,001; Grupo4/p=0,001) (Figura 28).

Tabela 4. Descrição da amostra dos grupos de acordo com número de células neuronais

Grupo ME + D10

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 2,75 + 0,95 2,50 2,00-3,75 2,00 4,00

48 horas 6,00 + 1,63 6,00 4,50-7,50 4,00 8,00

72 horas 13,50 + 1,29 13,50 12,25-14,75 12,25 15,00

Grupo ME + MCNI

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 9,12 + 2,47 9,00 8,25-9,75 5,00 14,00

48 horas 22,87 + 5,54 22,00 21,25-25,00 13,00 33,00

72 horas 38,25 + 11,32 37,00 32,00-49,00 20,00 54,00

Grupo ME + MCNI + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 7,00 + 3,38 6,00 5,00-8,75 3,00 14,00

48 horas 35,62 + 8,22 34,00 29,50-40,00 26,00 58,00

72 horas 50,87 + 14,38 48,50 37,75-61,75 32,00 79,00

Grupo ME + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 6,00 + 2,00 5,00 5,00-7,50 4,00 10,00

48 horas 21,00 + 4,98 22,50 17,00-23,75 12,00 28,00

72 horas 33,12 + 10,78 32,50 23,50-39,50 21,00 54,00

56

Figura 23. Número de células neuronais observadas em cada grupo

experimental de acordo com o dia de observação. P valores (a= 0,001; b=

0,001; c= 0,001; d= 0,001; e= 0,001 f= 0,001; g= 0,001; h= 0,006; i= 0,001).

c

a b

e f

d

g h

i

57

Figura 24. Número de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo

com o grupo experimental. P valores (a= 0,002; b= 0,001; c= 0,001; d= 0,001;

e= 0,001; f= 0,001; g=0,001; h=0,001; i=0,001; j= 0,001).

c b

a

e

g f h i j

d

58

Tabela 5. Descrição da amostra dos grupos de acordo com área de células neuronais.

Grupo ME + D10

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 3 6203,00 + 3092,81 5872,00 3289,00 –

5872,00 3289,0

0 9448,00

48 horas 7

6658,65 + 2675,66 7695,00 5641,47 – 8183,12

1210,94 9309,94

72 horas 5 32033,20 +

26075,64 18032,00 16145,50 – 54921,50

15720,00 76953,00

Grupo ME + MCNI

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 33 27392813,36 +

27423816,07 21250985,

00 2457550,00 – 46276380,00

1145212,00

91324800,00

48 horas 182 48399920,33 +

27656817,45 37125570

0,00 22642650,00 – 72620550,00

13555862,00

13555862,00

72 horas 75 160300768,70 +

63801592,00 13555886

2,00 129446600,00 – 173523012,00

91121700,00

428653400,00

Grupo ME + MCNI + FGF2

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 21 35036361,10 +

17290108,95 32118650,

00 23205492,50 – 50833884,50

12136412,00

72548610,00

48 horas 45 52612032,82 +

26619898,43 49726012,

00 30261139,00 – 75817468,50

92611881,00

99521825,00

72 horas

87

72735070,51 + 23702981,00

76875362,00

61958400,00 – 92661425,00

4207438,00

98958400,00

Grupo ME + FGF2

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 25 36670041,52 +

20310508,07 31307500,

00 21338700,00 – 53323313,00

1145327,00

83458450,00

48 horas 117 59146501,26 +

29613594,19 61119025,

00 32517600,00 – 86456375,00

3259100,00

99697431,00

72 horas 54 69697985,26 +

27417198,90 78305190,

00 61213631,50 – 89661138,00

9597800,00

99880179,00

59

Figura25. Área de células neuronais observadas em cada grupo experimental

de acordo com o dia de observação. P valores (a= 0,001; b= 0,019; c= 0,001;

d= 0,001; e= 0,024; f= 0,001; g=0,001; h= 0,001).

g h

a c b

d f

e

60

Figura 26. Área de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo

com o grupo experimental. P valores (a= 0,047; b= 0,001; c= 0,001; d= 0,001;

e= 0,004; f= 0,003; g= 0,001; h= 0,001; i= 0,001; j= 0,001).

a

b c

d e

f g

h j i

61

Tabela 6. Descrição da amostra dos grupos de acordo com perímetro de células neuronais.

Grupo ME + D10

Número celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 3 7222,00 + 2250,41 8346,00 4631,00 –

8346,00 4631,0

0 8689,00

48 horas 7

6137,44 + 2375,91 7073,10 5245,75 – 7553,00

1137,84 8034,55

72 horas 5 44932,80 +

30006,41 46316,00 14710,50 – 74463,50

11074,00 75531,00

Grupo ME + MCNI

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 33 2249212,57 +

2380104,07 1583960,0

0 481223,50 – 3323205,50

121348,00

9333004,00

48 horas 181 3542497,84 +

3161528,43 2368394,0

0 1611633,00 – 2786498,00

1006773,00

21557498,00

72 horas 75 6639607,30 +

3141382,26 7824220,0

0 4753585,00 – 8914317,00

1051820,00

9958042,00

Grupo ME + MCNI + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 21 1417263,38 +

776067,21 1243945,0

0 988706,00 – 2122440,50

125391,00

3226332,00

48 horas 44 4758732,95 +

2856708,86 5681733,5

0 1292299,75 – 7083893,00

555003,00

9068450,00

72 horas 87 6705048,55 +

2466938,74 7512291,0

0 5512291,00 – 8587652,00

512291,00

9937354,00

Grupo ME + FGF2

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 25 1071766,64 +

700911,06 1178471,0

0 230296,50 – 1732129,50

121480,00 1898466

48 horas 117 5380350,53 +

2635628,01 6117800,0

0 2573369,50 – 7585009,00

1004938,00

9793721,00

72 horas 54 7387879,59 +

1625457,47 8070309,0

0 6265169,50 – 8265643,00

222611,00

9836400,00

62

Figura 27. Perímetro de células neuronais observadas nos dias 1,2 e 3 de

acordo com o grupo experimental. P valores (a= 0,001; b= 0,001; c= 0,001; d=

0,001; e= 0,001; f= 0,001; g= 0,001; h=0,001).

f g h

d e c

b

a

63

Figura 28. Perímetro de células neuronais observadas em cada grupo

experimental de acordo com o dia de observação. P valores (a=0,012; b=

0,038; c= 0,001; d= 0,001; e= 0,001; f= 0,010; f= 0,001; g= 0,001; h=0,001;

i=0,001; j=0,001).

b

c d e

f

h i

j

a

g

64

4.3. FENÓTIPO DAS CÉLULAS GLIAIS E NEURONAIS

Após 72 horas de observação, procedeu-se a imunocitoquímica dos 4

grupos do experimento. Foi realizado o fechamento dos filtros do microscópio de

fluorescência para validar a marcação. As células do grupo 1 não expressou

nenhuma proteína glial ou neuronal, em contrapartida, as populações do grupo

2 expressaram β- tubulina (Figura 29), GFAP (Figura 30) e NF-200 (Figura 31).

As populações de células do grupo 3 expressaram GFAP (Figura 32), NeuN

(Figura 33) e OX-42 (Figura 34). No grupo 4 as células expressaram GFAP

(Figura 35), NeuN (Figura 36), NF-200 (Figura 37) e OX-42 (Figura 38). No

entanto, as alterações morfológicas das células se fazem novamente presentes

e, agora, mais frequentes no grupo 4.

Figura 29. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo β- Tubulina (FITC). Escala

100µm.

65

Figura 30. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

Figura 31. Células do G 2 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NF-200 (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

66

Figura 32. Células do G 3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

Figura 33. Células do G 3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NeuN (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

67

Figura 34. Células do G 3 submetidas a imunofluorecência do anticorpo OX-42 (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

Figura 35. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo GFAP (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

68

Figura 36. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NeuN (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

Figura 37. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo NF-200 (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

69

Figura 38. Células do G 4 submetidas a imunofluorecência do anticorpo OX-42 (Alexa Fluor 488). Escala

100µm.

4.4. DOSAGEM DOS ÍONS NO MEIO DE CULTURA

Em nosso experimento a dosagem do íon de Na apresentou uma

diferença estatística significante em Micromol por litro entre os grupos

experimentais. No grupo 2 (p=0,001), grupo 3 (p=0,001) e grupo 4 (p=0,001)

quando comparado com o grupo 1. Além disso, foi possível observar também

que o grupo 2 (p=0,001) apresentou uma superioridade em relação ao grupo 3,

sendo o grupo 3 (p=0,001) superior ao grupo 4 (Figura 39).

Na dosagem de Ca os grupos 2 (p=0,001), 3 (p=0,001) e 4 (0,001)

apresentaram significância estatística quando comparado com o grupo 1. O

grupo 2 (p=0,001/p=0,001) apresentou superioridade ao grupo 3 e 4

respectivamente. Quando comparado o grupo 3 (p=0,019) com o grupo 4

percebeu uma diferença estatística significante (Figura 40).

Quando observado o Micromol de K por litro entre os grupos

experimentais percebeu que o grupo 1 foi inferior aos grupos 2, 3 e 4 (Grupo

2/p=0,001; grupo 3/p=0,001 e grupo 4/p=0,001). No entanto, o grupo 2 (p=0,001)

70

apresentou Micromol de K por litro maior que no grupo 3 e 4. Quando comparado

o grupo 3 (p=0,001) com o grupo 4 percebe-se uma superioridade estatística

(Figura 41).

Figura 39. Dosagem de sódio de acordo com cada grupo experimental. P

valores (a= 0,001; b= 0,001; c= 0,001; d= 0,001; e= 0,001).

a b

d c

e

71

Figura 40. Dosagem de cálcio de acordo com cada grupo experimental. P

valores (a= 0,001; b= 0,001; c= 0,001; d=0,001; e=0,001 e f=0,019).

a b

c

d

f

e

72

Figura 41. Dosagem de potássio de acordo com cada grupo experimental. P

valores (a= 0,001; b= 0,001; c= 0,001; d= 0.001; e= 0,001; f=0,001).

a b c d e

f

73

V DISCUSSÃO

O presente estudo objetivou a analisar a plasticidade celular da medula

espinal na presença do MCNI, na adição ou ausência do FGF-2 em cultura.

O complexo sistema nervoso de mamíferos nunca alcança um patamar

de organização encontrado antes de lesões ou injúrias. Este pode ser um

mecanismo de proteção fisiológico inerente para prevenir uma excessiva

regeneração desorganizada. Especificamente, o reparo nervoso periférico

requer uma complexa interação entre um guia para crescimento axonal, células

de suporte como as CSs, fatores de crescimento e matriz extracelular (Costa et

al., 2009). O reparo de defeitos periféricos nervosos tem sido um problema para

os cirurgiões em diferentes especialidades.

Várias modalidades de tratamento têm sido investigadas ou

recomendadas. A neurorrafia direta, coaptação dos cotos distal e proximal, é a

escolha de preferência (Di Summa et al., 2011). No entanto, em muitos casos,

isto não é possível devido ao longo espaço (defeito) entre os segmentos

nervosos separados. Enxertos nervosos autólogos, interposições de enxertos

musculares, enxertos venosos e arteriais e o uso de condutos nervosos têm sido

utilizados como alternativas. Muitos modelos de lesão, diferentes combinações

de tipos celulares, o uso de diversos tipos de condutos, bem como os protocolos

de avaliação embasam esse novo campo da ciência (Ghoreishian et al., 2013).

As CSs são células gliais do SNP, que envolvem os axônios e facilitam a

condução do impulso nervoso. Na degeneração axonal Waleriana, as CSs

aliadas aos macrófagos medeiam os passos iniciais para remoção de mielina.

Elas proliferam, migram para formar as bandas de Büngner e secretam fatores

neurotróficos que ajudam a estabelecer um ambiente favorável para inervação

precisa do tecido alvo. No entanto, existem limitações inerentes de uso direto no

reparo nervoso experimental, já que essas células vêm de recursos restritos e

tem disponibilidade limitada (Wei et al., 2010). A aplicação de CSs em nervos

artificiais tem se tornado concreto, no entanto, existem certas limitações como o

74

recurso limitado de células, a necessidade de uma cirurgia secundária e a

rejeição imunológica de enxertos exógenos (Guo e Dong, 2009).

Para que as células funcionem adequadamente, elas devem se organizar

no espaço e interagir mecanicamente com o ambiente ao seu redor. Devem

apresentar uma conformação correta, serem fisicamente robustas e estarem

estruturadas de forma adequada internamente. Muitas células devem também

ser capazes de modificar sua forma e migrar para outros locais. Além disso, toda

célula deve ser capaz de reorganizar seus componentes internos como

decorrência dos processos de crescimento, divisão e/ou adaptação a mudanças

no ambiente (Alberts et al., 2010).

O aspecto mais importante para a sobrevivência celular em um tecido

receptor é o microambiente. Inicialmente, esse aspecto está relacionado à

expressão celular de marcadores de adesão de superfície que interagem com

componentes da matriz extracelular. Adicionado aos efeitos parácrinos dos

fatores de crescimento secretados pelas células adjacentes, o microambiente

possibilita condições para a sobrevivência, migração, invasão tecidual e

diferenciação (Caddick et al., 2006). Correntemente, a diferenciação neuronal

pode ser atingida de 4 maneiras: Uso de fatores neurotróficos ou citocinas,

exposição a indutores químicos, a combinação desses ou com co-culturas de

células nervosas (Yang et al., 2014).

Em nosso trabalho, o meio criado a partir de fragmentos nervosos

simulou uma situação in vivo de injuria nervosa. Dessa maneira, esperava-se

que os explantes se tornassem reativos e secretassem naturalmente fatores que

possibilitassem um ambiente favorável à regeneração nervosa pós-trauma.

O número superior de células contadas nos grupos 2, 3 e 4, bem como

as mudanças morfológicas mais evidentes são teoricamente reflexos do meio

condicionado. O meio D-10, utilizado como um controle foi muito importante para

averiguar se as células da ME adquiriam fenótipos distintos sem nenhuma

indução no decorrer dos dias. Como as propriedades dos fatores neurotróficos

são bastante discutidas, o uso do FGF-2 poderia potencializar os efeitos

fenotípicos das células, bem como induzir uma maior atividade proliferativa e

efeito neuroprotetor.

75

Lucena et al. (2014), investigou a plasticidade de CTs mesenquimais de

medula óssea de ratos na presença de meio condicionado do nervo facial do

FGF – 2, sendo possível perceber que, o uso do FGF-2 potencializou os efeitos

fenotípicos das células,assim como induziu uma maior atividade proliferativa. Em

2008, Lee et al. realizou um modelo transecção completa da ME em que o

segmento da coluna vertebral T8 foi removido para estudar o efeito do tratamento

combinado de enxerto de nervo periférico e aplicação do fator neurotrófico sobre

o meio ambiente da glia e concluiu que a presença do fator neurotrófico

possibilitou uma mudança do ambiente glial possibilitando uma regeneração do

SNC.

Parece plausível que as interações entre FGF-2 e células neurogliais

influenciam o microambiente da lesão, restaurando a homeostase metabólica,

proporcionando a proteção para as células não danificadas e, possivelmente,

resgatando neurônios prejudicados. Uma hipótese provisória é pela diminuição

da degeneração Walleriana e/ou preservação dos oligodendrócitos, preservando

a função de um determinado subconjunto de axônios supraespinais, incluindo os

tratos não piramidais que é importante para modular o desempenho motor

grosseiro (Fehling e Tator, 1995; Yasuda et al., 1995).

O FGF-2 medeia atividade neurotrófica em neurônios dopaminérgicos

mesencefálicos cultivados de ratos embrionários, demonstrando papel

importante no tratamento da doença de Parkinson (Grothe et al., 2000).

Descrição do papel das CSs em neurônios dopaminégicos embrionários em

cultura também é mencionada por Collier e Martin (1993), os quais

demonstraram que essas células promovem sobrevivência e extensão neurítica

em neurônios cultivados. Além disso, ações do FGF-2 e do FGF-20 são descritas

em desordens motoras como a esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica

e a distrofia muscular (Webster, 1997; Rizvanov et al., 2011).

Trabalho publicado em 2009 utilizando o fator neurotrófico GDNF em

modelo de transecção da ME submetida ao enxerto de nervo periférico

demonstrou que o fator aumenta a resposta sensitivo-motora dos animais

quando comparado aos animais desprovidos da substância (Guzen et al., 2009).

Fazendo uma analogia entre os fatores neurotróficos GDNF e FGF-2 observa-

76

se que os animais que receberam inoculação do nervo periférico na presença do

GDNF cursam com melhora da resposta motora quando comparado aos animais

que receberam inoculação de FGF-2. Animais que recebem GDNF apresentam

no final da análise do BBB pontuação motora em torno de 8, enquanto os animais

que recebem FGF-2 apresentam no final da análise do BBB pontuação em torno

de 5. Além disso, no estudo realizado por Guzen e colaboradores em 2009

demonstra efeito do GDNF na resposta sensitiva analisada através do CBS.

Entretanto, na análise do FGF-2 não observamos efeito na resposta sensitiva em

ambos os testes quando comparado ao grupo que recebeu enxerto de nervo

isquiático na ausência do FGF-2.

Neste estudo, foram utilizados 4 meios de cultura distintos. As células da

ME pertencentes ao grupo 1 foram cultivadas apenas com meio D-10. No grupo

2, o meio D-10 foi condicionado a partir de explantes do nervo isquiático. No

grupo 3 foi usado o MCNI acrescido de FGF-2. Ao meio D-10 foi adicionado FGF-

2 para o cultivo celular do grupo 4. Nossos resultados demonstraram que a

média de células gliais e neuronais contadas nos grupos 2, 3 e 4 aumentaram

após 24 horas. De uma forma geral, a atividade proliferativa encontrada,

sobretudo nos grupos 2, 3 e 4 revela uma importante característica das células

da ME: uma rápida expansão num curto período de tempo.

Este fato deve-se também em virtude do FGF-2 demonstrar um papel

importante, possibilitando o aumento da regulação celular após a injúria do

nervo, promovendo suporte de crescimento neurítico e possibilitando a

sobrevivência de neurônios sensitivos durante a regeneração nervosa (Grothe

et al., 1997, 2006). In vitro, o FGF-2 protege neurônios contra excitotoxicidade,

diminui a morte celular apoptótica e promove reconstrução da bainha de mielina

exercendo um efeito neuroprotetor nos neurônios motores após transecção do

nervo isquiático ou da injúria contusa da medula espinal (Mattson et al., 1989;

Romero et al., 2001).

Outro aspecto importante destacado em nosso estudo foi à área e o

perímetro celular. Pois foram parâmetros elencados primordialmente para

77

descrição morfológica das células ao longo dos dias. Onde apresentaram,

relevância na análise estatística ao longo dos 3 dias de observação. O controle

do tamanho da célula é um aspecto importante do desenvolvimento celular e o

controle da morfologia é essencial para a diferenciação e para o

desenvolvimento de órgãos e tecidos. O tamanho da célula depende do tipo

celular e de seu estágio no ciclo celular (Kharitonova e Vasiliev, 2008). No cultivo,

as alterações do número, tamanho e área celular acontecem durante o

crescimento (Vasiliev, 2004). A forma é controlada por estruturas do

citoesqueleto interno e estruturas de adesão fixando a célula à superfície

(Moizhess e Vasiliev, 2001; Rovensky et al., 2001).

A diferenciação celular é mais bem compreendida considerando que

cada célula é dotada de duas características: diferenciação e potencialidade.

Diferenciação é o grau de especialização da célula, enquanto a potencialidade é

a capacidade que a célula tem de originar outros tipos celulares. As primeiras

células embrionárias (blastômeros) da maioria das espécies podem originar

qualquer tipo celular. Essas células tem o grau de diferenciação zero, e portanto

100% de potencialidade. Dessa maneira, são classificadas como totipotentes.

São consideradas pluripotentes as células derivadas dos folhetos embrionários

e multipotentes as células que derivam progenitores exclusivos de suas

linhagens (Junqueira e Carneiro, 2013).

O controle da forma celular envolve uma organização da membrana

plasmática dentro de uma superfície de contato com o ambiente extracelular

(células vizinhas, matriz extracelular, meio de cultura etc) (Levayer e Lecuit,

2007). As integrinas são versáteis receptores que possibilitam o intercâmbio do

meio celular externo com o meio interno. Muitos processos como morfologia

celular, motilidade, proliferação, diferenciação e morte celular são possíveis,

devido esse trânsito (Docheva et al., 2007). Isso é explicado pelo fenótipo dos

anticorpos neuronais. Claramente vê-se uma tendência que essas células

apresentaram maiores mudanças morfológicas condizentes com a organização

do nosso sistema nervoso: maior número de células com áreas menores e

morfologias distintas (explicado pelo perímetro). Uma completa caracterização

das interações celulares, bioquímicas e moleculares das células da ME com o

78

seu nicho é necessária para compreender como estas células podem ser

reguladas in vitro.

Nesse universo, a especificidade primorosa dos anticorpos por antígenos

específicos, transformam-nos em valiosos reagentes para a detecção,

purificação e quantificação de antígenos e consequentemente possibilita o uso

de protocolos para denotar diferenciação ou plasticidade celular. Nessa

perspectiva, esse estudo também, utilizou a imunocitoquímica como técnica de

escolha para possível identificação de plasticidade das células da ME diante de

meios de cultivo distintos. Para tanto, foram elencados marcadores de linhagem

neuronal (MAP-2, β-tubulina III, NeuN e NF-200) e marcadores de linhagem glial

(GFAP e OX-42).

Proteínas que se ligam lateralmente aos microtúbulos são coletivamente

chamadas de proteínas de associação a microtúbulos (MAPs). Assim, as MAPs

podem estabilizar os microtúbulos, prevenindo sua dissociação. Células que

superexpressam MAP-2, a qual apresenta longos domínios projetados, formam

feixes de microtúbulos estáveis com um amplo espaçamento. Os microtúbulos

são longos, cilindros, ocos formados pela proteína tubulina. A tubulina ocorre em

todas as células eucarióticas, podendo ser encontrada sob múltiplas isoformas.

As diferentes formas de tubulina são bastante similares e geralmente

copolimerizam em microtúbulos mistos em testes in vitro. No entanto, elas

apresentam posicionamento celular distinto e realizam tarefas relativamente

diferentes (Alberts et al., 2010).

No desenvolvimento neurogênico, β-Tubulina III é expressa em

neurônios em um estágio mais precoce do desenvolvimento, e certas isoformas

de MAP-2 são expressas precocemente durante a diferenciação neuronal de

células precursoras (Huang et al., 2007). β -tubulina III é um confiável marcador

de diferenciação neuronal por ser expresso em neurônios maduros e células

neurais progenitoras (Schwindt et al., 2009).

NeuN é uma proteína nuclear neuronal específica de vertebrados. A

coloração imunocitoquímica é primeiramente vista no núcleo se estendendo até

o citoplasma. Sua imunoreatividade é observada precocemente após mitoses

neuronais. É um excelente marcador de neurônios em culturas primárias. Os

79

filamentos intermediários são fibras compostas por proteínas de filamentos

intermediários, as quais pertencem a uma grande e heterogênea família

(Schwindt et al., 2009).

Os neurofilamentos são encontrados em altas concentrações nos

axônios dos neurônios dos vertebrados. Durante o crescimento do axônio, novas

subunidades de neurofilamentos são incorporadas ao axônio em um processo

dinâmico que envolve tanto a adição de subunidades longitudinalmente ao

comprimento do filamento quanto a adição de subunidades às extremidades do

filamento (Schwindt et al., 2009). A proteína ácida fibrilar glial é um elemento

estrutural de astrócitos fibrilares. GFAP é usado como um marcador astrocítico,

mas também pode ser expresso em células neurais progenitoras imaturas

(Schwindt et al., 2009) e o anticorpo OX-42 marca células dendríticas

extensivamente, granulócitos e células com morfologia de micróglia no cérebro.

Nossos experimentos demonstraram que as células do grupo 2

expressaram GFAP, NF-200 e β– Tubulina III. Já no grupo 4 que apresentava

apenas FGF-2 as células expressaram GFAP, NeuN, NF-200 e OX-42. Além

desses achados, as células que foram cultivas com o meio condicionado

acrescido de FGF-2 expressaram GFAP, NeuN e OX-42. Hipotetizamos que o

fator de crescimento fibroblástico potencializou a plasticidade das células do

grupo 4. A expressão desses anticorpos num curto período de tempo pós

indução (3 dias) pode ser justificado pela evidente reatividade dos explantes

nervosos. A forma histológica com que o nervo isquiático está organizado

possivelmente explica a alta e rápida reatividade bem como uma possível

deposição de fatores neurotróficos no meio condicionado. O microambiente de

lesão periférica simulado pelo meio condicionado a partir de explantes de nervo

isquiático pode justificar a rapidez da plasticidade neuronal e glial encontrada.

Outro achado importante em nosso experimento foi à identificação de que

o nosso meio de cultura apresentou um ambiente rico, nutritivo e com um grande

potencial elétrico, pois através da dosagem dos íons foi observado que os grupo

2, 3 e 4 apresentaram grandes concentrações de Na, K e Ca. A maioria das

células animais apresentam diferenças de potencial elétrico (voltagem), através

de suas membranas plasmáticas. O citoplasma costuma ser eletricamente

80

negativo em relação ao líquido extracelular. Para que haja troca de moléculas e

íons entre a célula e seu meio ambiente, a membrana plasmática possui

proteínas transportadoras e um desses recursos é a bomba de sódio e potássio.

Essa bomba transportadora de íons é fundamental para a sobrevivência dos

seres vivos (Goff,2006).

Para alguns íons, como o Na, os gradientes de concentração e voltagem

atuam na mesma direção criando um gradiente eletroquímico relativamente alto.

O Na é o íon positivamente carregado mais abundante fora da célula, logo, tende

a entrar nas células se tiver oportunidade. Já no íon K os gradientes de

concentração e de voltagem possuem efeitos opostos e o gradiente

eletroquímico é pequeno. O K é um íon positivamente carregado que está

presente em muito maior concentração dentro das células do que fora então, por

causa do efeito oposto, esse íon possui pouco movimento resultante através da

membrana (Jamor et. al., 2012)

O Ca é o principal mineral do esqueleto e um dos cátions mais abundantes

no organismo, representando cerca de 2% do peso corporal. Aproximadamente

99% do Ca corporal está sob a forma inorgânica no esqueleto, principalmente

sob a forma de cristais de hidroxiapatita, o restante (1%) encontra-se no espaço

vascular e intracelular (membrana e retículo endoplasmático). Cerca de 1% do

Ca ósseo é livremente intercambiável com o cálcio do fluido extracelular (Goff,

2006).

Jamor et. al. (2012) descreve que os sais de cálcio têm a função de manter

a integridade da estrutura do esqueleto, e os íons de cálcio estão nos fluidos

intracelular e extracelular, sendo um instrumento de controle de um grande

número de processos bioquímicos. De fato, enquanto os íons de cálcio

intracelular são necessários na atividade de um grande número de enzimas e

também estão envolvidos na transmissão de informações desde a superfície até

o interior da célula, os íons na porção extracelular são necessários para a

excitabilidade neuromuscular, coagulação do sangue e secreção hormonal,

entre muitas outras funções.

81

VI CONCLUSÃO

As células da ME demonstraram uma morfologia típica e rápida expansão,

sobretudo as células que foram expostas ao MCNI. Além disso, a significante

atividade proliferativa nos grupos 3 e 4 em um curto período asseguram seu

potencial de diferenciação in vitro sob a exposição a estímulos adequados. De

uma forma geral, o ambiente condicionado por explantes de nervo isquiático

circundante às células da ME, induziu mudanças morfológicas, bem como

possibilitou plasticidade nervosa.

O FGF-2 adicionado ao meio condicionado potencializou esse efeito, de

forma que as células da ME expressaram proteínas neuronais (MAP-2, β-

tubulina III, NeuN e NF-200) e proteína gliais (GFAP e OX-42). Em média, a área

e perímetro das células dos grupos 3 e 4 foram maiores do que as dos grupos 1

e 2. Essa potencialização e a maior sobrevivência das células se deve ao meio

de cultura utilizado na pesquisa pois apresenta grandes concentrações de Na, K

e Ca possibilitando um ambiente rico, nutritivo e com um grande potencial

elétrico, ideal para a sobrevivência da célula.

Nessa perspectiva construímos um protocolo viável, de fácil execução, em

curto espaço de tempo que possibilitou plasticidade de células da ME numa

linhagem neuronal e glial. O presente estudo melhora nosso conhecimento sobre

a plasticidade de células da ME e facilita a compreensão na busca por melhores

técnicas com terapia celular no uso de doenças e traumas no SNC.

Nesse contexto, vale salientar a importância dos resultados de outras

pesquisas que reproduzam as condições clínicas e a necessidade de utilização

de outros métodos de avaliação.

82

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Parecer Consubstanciado do CEEA/UERN N0 007/13