ANÁLISE DA ACIDIFICAÇÃO PRODUZIDA PELO KEFIR DE LEITE

1

Saber Científico, Porto Velho, V., n., p. – , mês./mês. 2016.

ANÁLISE DA ACIDIFICAÇÃO PRODUZIDA PELO KEFIR DE LEITE

TRADICIONAL ENTRE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP. E

KLEBSIELLA SPP.

Sarianne Delfino Da Silva COSTA1*; Lorena Brandhuber De MOURA1; 1.Centro Universitário São Lucas (UNISL). 1. Centro Universitário São Lucas (UNISL). Afiliação Autor –

[email protected]

RESUMO: Os grãos de kefir são um alimento a base de probióticos composto por bactérias ácido acéticas,

ácido lácticas e leveduras convivendo em simbiose em uma matriz de polissacarídeo. É comprovado que a sua

ingestão cotidiana traz inúmeros benefícios à saúde do seu usuário, como a melhora no sistema imunológico e

respiratório, além de regularização e equilíbrio da microbiota residente humana. A proposta principal deste

projeto foi a de averiguar se a acidez produzida pelo soro de kefir é suficiente para inibir bacteriostaticamente a

Salmonella spp., Escherichia coli e Klebsiella spp. A metodologia adotada foi dividida em produção do kefir,

preparo dos meios de cultivo, preparação das diluições, interação entre as amostras de kefir e as enterobactérias e

o semeio para controle. Inicialmente realizou-se uma diluição seriada em tubos múltiplos de 25ml de soro em

225ml de leite pasteurizado, em seguida, inoculou-se 1ml do soro diluído em caldo BHI e em caldo Selenito

associado a 1ml da bactéria em fase exponencial a ser analisada. Os inóculos foram submetidos a processo de

incubação em estufa bacteriológica pelo período de 24, 48 e 72 horas. A cada 24 horas de incubação realizou-se

semeio com a técnica de esgotamento em ágar MacConkey e ágar SS, para visualização da presença ou ausência

de crescimento bacteriano. Os resultados alcançados demonstraram que a elevação do pH obtido pela

fermentação de 24 horas não é capaz de inibir o desenvolvimento bacteriano, a fermentação de 48 horas teve

efeito bacteriostático nas bactérias Salmonella spp. e Escherichia coli. Entretanto, não apresentou qualquer ação

de bloqueio sobre a Klebsiella spp. A fermentação de 72 horas inibiu totalmente o crescimento de todas as

bactérias analisadas, confirmando que a acidez instituída pelos Lactobacillus e leveduras presentes no soro de

kefir surtiu impacto bactericida sobre as enterobactérias. Conclui-se que o soro de kefir tradicional apresentou

grande eficácia no possível exercício de inativação bacteriostática e bactericida, revelando este alimento como

uma proposta a ser analisada de medicamento natural que pode ser administrado com consumo diário.

PALAVRAS-CHAVE: Kefir. Enterobacteriaceae. Fermentação. Antibacterianos.

INTRODUÇÃO

Com o advento da globalização e a

ausência de tempo nas grandes sociedades,

fez com que o número de bactérias

multirresistentes se elevasse nos últimos anos

(GURGEL e CARVALHO, 2008, AYCAN

et al., 2014, LOUREIRO et al., 2016,). O que

se sucedeu em uma maior procura por

hábitos alimentares mais saudáveis, levando

em consideração a qualidade do alimento,

sua atuação sobre o organismo e o seu custo-

benefício. Dentro desses parâmetros, os

alimentos a base de probióticos ofereceram

maior destaque para os leites fermentados,

sendo um deles o kefir (HUNGRIA e

LONGO, 2009, RAIZEL et al., 2011). Este

poderoso alimento similarmente conhecido

como cogumelos tibetanos, quefir, grãos de

kefir, cogumelos do iogurte, tibicos e plantas

do iogurte (LEITE et al., 2012, MARCHI,

2015) não possui estudos que comprovem

com veracidade a sua origem até a presente

data. Porém, acredita-se tenha surgido nas

imediações da Europa e Ásia ocidental entre

as montanhas dos Cáucasos no século XVIII,

em múltiplas tribos muçulmanas, os quais

consideravam este alimento a base de

probióticos como um presente dado pelas

divindades, pois era uma riqueza tribal que

deveria ser passado por todas as gerações

(RODRIGUES et al., 2005, LOPITZ-

OTSOA et al., 2006, CARVALHO, 2011,

LEITE et al., 2012, PAIVA, 2013).

Seu nome traduzido do turco para a

linguagem portuguesa, significa “sentir-se

bem” e na Grécia, é conhecido como a “água

da cura” (LOPITZ-OTSOA et al., 2006) Tais

probióticos, obtiveram reconhecimento nos

anos noventa, quando a russa Irina Sakharova

transportou uma pequena colônia destas

bactérias para o seu país de origem. Esta cepa

foi utilizada como um medicamento

poderoso no combate de múltiplas doenças,

como as infecções de origem bacteriana e

viral, como por exemplo, as diarreias

2


correlacionadas com o uso de antibióticos,

alergias e outros (CARNEIRO, C.S, 2012,

LEITE et al., 2012, SAAD et al., 2013). Este

kefir é um agente biostático com ação eficaz,

devido a sua composição. Dado que se

resume em um conglomerado de bactérias

ácido acéticas, ácido lácticas e leveduras

inerentes a uma solvência acidificada e

viscosa, convivendo de forma simbiótica

devido a uma matriz de polissacarídeo que os

mantém unidos (YANG et al., 2008,

WESCHENFELDER, 2009, REIS, 2015,

DIAS et al., 2018).

Os grupos de microrganismos que

compõem os grãos de kefir são os

Lactobacillus, leveduras e

Streptococci/lactococci. Ao grupo dos

Lactobacillus, as bactérias em maior

quantidade estão as: Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus casei,

Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus

paracasei, Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus e Lactobacillus plantarum. Ao

grupo das leveduras estão: Candida

friedrichii, Candida rancens, Candida

humilis, Candida tenuis, Saccharomyces

cerevisiae e Saccharomyces pastorianus. Já

no grupo Streptococci/Lactococci encontra-

se em maior número: Streptococcus

thermophilus, Lactococcus lactis,

Lactococcus cremoris e Enterococcus durans

(LOPITZ-OTSOA et al., 2006,

WESCHENFELDER, 2009, JIANZHONG

et al., 2009).

INGESTÃO DE KEFIR E INTERAÇÃO

COM ENTEROBACTÉRIAS

De acordo com estudos o uso de

alimentos a base de probióticos ajuda a

equilibrar a microbiota residente humana,

melhora os sistemas imunológico,

respiratório, digestivo e outros. Além de ter

fácil manuseio, armazenamento simples e

alto custo benefício (KOMATSU et al.,

2008). Algumas das vantagens diárias da

ingestão kefir é a luta contra células

cancerígenas, redução de processos alérgicos

e auxílio na absorção do leite em pacientes

intolerantes a lactose (KOMATSU et al.,

2008, LEITE et al., 2012,). Este probiótico

auxilia no combate a bactérias intestinais

aptas a causar disfunções no ser humano,

sendo uma dessas a Salmonella spp e a

Escherichia coli (WESCHENFELDER,

2009, CARVALHO, 2011, MARCHI, 2015).

Essas bactérias são frequentes

causadoras de ocorrências de diarreias nas

regiões Norte e Nordeste do Brasil

(LOUREIRO et al., 2010, COSTA, 2013),

alguns dos fatores que permitem a sua

proliferação são o clima favorável, condições

socioeconômicas, falta de conscientização da

população em manter hábitos higiênicos,

ausência de armazenamento adequado dos

fornecedores de mantimentos e o saneamento

básico precário na maior parte das grandes

cidades (BÜHLER et al., 2014, PAIVA e

SOUZA, 2018). O contágio ocorre pela

ingestão de água e alimentos contaminados

com fezes ou que não passaram por um

processo de esterilização, conhecida como

transmissão fecal-oral (FERENS e HOVDE,

2011, HEITHOFF et al., 2012).

Essa transmissão resulta em

constantes casos de internação hospitalar

com sintomas graves de diarreia

sanguinolenta, vômitos, fortes dores

abdominais, náuseas, cefaleias e alterações

constantes da temperatura corporal

(SHINOHARA et al., 2007). Esses relatos

de sinais e sintomas associados a esses

microrganismos conduziu uma aflição a

sociedade do mundo moderno, aumentando a

necessidade de estudos mais profundos que

demonstrassem uma alternativa perdurável e

segura para combate destas bactérias.

Uma das bactérias responsáveis por

esta aflição é a Escherichia coli, a qual trata-

se de uma enterobactéria presente no

intestino humano em forma de bastão,

anaeróbia facultativa, Gram-negativa

(CHAURET, 2011), que possui a capacidade

de segmentar-se em múltiplas classificações

patogênicas, sendo algumas delas a:

Enteropatogênica(EPEC),enteroinvasora(EIE

C),enterohemorrágica(EHEC),enterotoxigêni

ca(ETEC),enteroagregativa(EaggEC) e a

cepa produtora da toxina de shiga (STEC) e

são esses diferentes mecanismos de

3


virulência entre as cepas de E.coli, que

tornam essa bactéria em tal intensidade

nociva à saúde humana levando a

toxinfecção intestinal (ELSAS et al., 2011).

Já a Salmonella spp. se caracteriza por se

dispor em forma de bastonete, é anaeróbica

facultativa, Gram negativa, não fermentadora

de lactose, temperatura recomendada de

37ºC, pH de 7.0 e tem sua mobilidade dada

por flagelos (ORDÓNEZ et al., 2011). Suas

principais espécies patogênicas é a

Salmonella bongori e Salmonella enterica

(PETERSEN et al., 2011).

Diante o contexto apresentado em

que as principais bactérias que causam

intoxicação alimentar ou infecção intestinal

são a Escherichia coli e a Salmonella spp, o

kefir que tem seu conhecimento empírico no

uso de seus benefícios no cotidiano da

sociedade, é uma proposta de tratamento

alternativo e natural que proporciona

eficiência e qualidade, em razão que a

população de baixa renda está mais

vulnerável a desenvolver essas patologias.

Faz–se então necessário um estudo mais

aprofundado sobre a interação desde

probiótico em uma situação de diarreia.

O objetivo desta pesquisa é analisar

se a elevação da acidificação produzida pelos

Lactobacillus é suficiente para inibir o

crescimento das enterobactérias testadas.

MATERIAL E MÉTODO

A metodologia foi dividida nas

seguintes etapas: (1) Produção do kefir, (2)

Preparo dos meios de cultivo, (3) Preparação

das diluições, (4) Interação entre as amostra

de kefir e as enterobactérias e (5) Semeio

para controle. Inicialmente foi necessário

realizar uma busca bibliográfica virtual sobre

a história e funcionalidade do Kefir, através

de artigos científicos e monografias

disponível nos bancos de dados SciELO,

PubMed, NCBI, Periódicos e Google

Acadêmico. Excluindo aqueles cujo o

conteúdo não respondia às dúvidas do estudo.

Na primeira etapa teve início a pesquisa em

campo, onde foi selecionada uma colônia de

grãos de kefir in natura, não submetidos a

tratamento térmico, da qual houve

armazenamento e preparo adequado. A

segunda etapa concretizou-se pelo preparo

dos meios de cultura em ágar, no qual foram

utilizados: Caldo Selenito Cistina Base,

produzido pela HiMedia Laboratories Pvt.

LTDA, Ágar Salmonella Shigella, Ágar

MacConkey e Caldo Brain Heart Infusion

(BHI), produzidos pela Kasvi. Nesta etapa

também se sucedeu a esterilização de todos

os utensílios a serem manipulados. A terceira

etapa realizou-se o preparo dos tubos para

diluição. A quarta etapa executou-se a

interação entre as enterobactérias e o kefir. A

última etapa caracterizou-se pelo semeio em

ágar para controle.

Os meios de culturas utilizados

nesta pesquisa foram dissolvidos em água

destilada e dispostos em autoclave calibrada

para processo de esterilização. Foram

despejados em placas de petri estéreis e

incubados na estufa bacteriológica por 24

horas para controle de esterilização e

detecção de possíveis falhas. Não houve

crescimento microbiológico em nenhuma das

placas e tubos, demonstrando a eficácia de

todo o procedimento de produção dos meios.

PREPARAÇÃO DO KEFIR

O kefir se desenvolveu conforme o

seu cultivo, para atingir grãos saudáveis

primeiramente realizou-se a ativação das

colônias por meio de descongelamento em

temperatura de 6 a 10ºC. No momento em

que os grãos encontravam-se totalmente em

meio líquido, foi incluído o leite com teor de

gordura a 3% e processou a primeira

fermentação de 24 horas. O recipiente

adequado para o armazenamento foi um

frasco de vidro estéril, no qual o kefir

permaneceu reservado em um local com

baixa luminosidade e em temperatura

ambiente. As primeiras fermentações de 24,

48 e 72 horas foram desprezadas e a cada

troca de leite realizou-se uma lavagem dos

grãos com água destilada. Após as primeiras

72 horas de fermentação, o kefir já se

encontrava apto para consumo.

4


Quando o kefir permanece somente

com o leite inicial, sem trocas e

posteriormente a 24 horas de fermentação

durante subsequentes dias, uma modificação

da estrutura original ocorre. Transformando o

leite que encontrava-se em estado líquido

para o sólido, evidenciando uma massa

aglomerada de leite. Tal mudança é

popularmente conhecida como “queijação do

leite”. Para obtenção do soro do kefir,

inicialmente foi necessário separar a parte

sólida da líquida com um auxílio de um

coador de papel, por 12 horas em

temperatura de refrigeração. Como medida

de controle dos grãos de kefir, uma cultura

em ágar Sabouraud foi realizada para

confirmação das leveduras e uma coloração

de Gram para verificar a presença dos

Lactobacillus antes da iniciação dos testes.

PREPARAÇÃO DAS DILUIÇÕES

A Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA) estabelece que a

concentração para caracterização de um

determinado alimento em probiótico ou

funcional, deve encontrar-se nas

concentrações de 10-10 e 10-11, alegadas nas

resoluções de número 18 e 19 datadas em 30

de abril de 1999. Para atingir esses valores,

foi necessário realizar a técnica de diluição

seriada em tubos múltiplos, o processamento

da técnica iniciou-se com a esterilização de

225 ml de leite pasteurizado com teor de

gordura a 3%, 25 ml de soro de kefir foram

inseridos no leite após a esterilização e o

material foi transferido para um recipiente de

vidro igualmente estéril, tornando-se assim a

solução mãe. Onze tubos de ensaio contendo

9 ml de leite pasteurizado foram utilizados

para as diluições e 1 ml da solução mãe foi

transferida para o primeiro tubo 1:10 (10-10)

e passado aos seguintes, até ao décimo

primeiro tubo 1:100000000000 (10-11)

diminuindo deste modo a carga bacteriana.

INOCULAÇÃO DAS AMOSTRAS EM

CALDO BHI E CALDO SELENITO

Posteriormente às diluições, os

tubos 10-10 e 10-11 foram selecionados para

inoculação nos meios de cultura para

crescimento. Seis tubos de ensaio contendo 1

ml de Caldo BHI e seis tubos de ensaio

contendo 1 ml de Caldo Selenito foram

utilizados e semeados as amostras. No Caldo

BHI, em cada tubo 01 houve a inoculação do

soro de kefir obtido das diluições 10-10 e 10-

11, em cada tubo 02 houve a inoculação do

soro de kefir associada à Escherichia Coli e

em cada tubo 03 não houve nenhuma

inoculação. No Caldo Selenito, em cada tubo

01 houve a inoculação do soro de kefir

obtido das diluições 10-10 e 10-11, em cada

tubo 02 houve a inoculação do soro de kefir

associado à Salmonella spp. e em cada tubo

03 não houve nenhuma inoculação.

Resultando em tubo 01 para controle

negativo, tubo 02 para controle positivo e 03

apenas para controle. Todos os tubos foram

inseridos na estufa bacteriológica por 24, 48

e 72 horas.

Destaca-se a importância destes

tubos como medida de controle durante todo

o procedimento, visto que o tubo controle

negativo (tubo 01) somente com a existência

dos Lactobacillus e as leveduras, permitiu

avaliar o desenvolvimento da fermentação do

leite inserido e a degradação dos meios de

cultura. Com o passar dos dias, o leite que foi

introduzido para nutrição do kefir sofreu um

processo de agregação e o gás da

fermentação foi elevando esta massa.

Evidenciando desta forma, que os mesmos

fatos que ocorrem com o kefir tradicional

disposto em frasco para consumo, estavam

ocorrendo com o soro in vitro. Confirmando

a presença do kefir nos controle negativo

(tubo 01) e controle positivo (tubo 02).

Já o controle positivo (tubo 02),

possibilitou a visualização do confronto entre

os microrganismos presente no kefir e as

enterobactérias testadas. Em razão de que a

realização dos semeios em placas controles

demonstrou a presença ou ausência das

bactérias. O controle (tubo 03) é de suma

importância para todo o processo, mediante

ao fato que este tubo representa a pureza dos

meios de cultura utilizados. Constatando que

5


os meios de cultura usados permaneceram

estéreis durante todo o procedimento, sem

qualquer interferência de microrganismos

externos que pudessem causar alterações nos

resultados. Este processo esta localizado na

Figura 1.

SEMEIO PARA CONTROLE EM

ÁGAR MACCONKEY E ÁGAR

SALMONELLA SHIGELLA

Foram selecionadas trinta e seis

placas de Ágar MacConkey e dezoito

placas de Ágar Salmonella Shigella para

certificação de crescimento das amostras

nos tubos. Os tubos 01, 02 e 03 de Caldo

BHI das concentrações 10-10 e 10-11 foram

semeados aplicando a técnica de

esgotamento, cada um em uma placa de

Ágar MacConkey após 24 horas de

incubação, o processo se repetiu para as

6


outras 48 e 72 horas. Os tubos 01, 02 e 03

de Caldo Selenito das concentrações 10-10

e 10-11 foram semeados aplicando

igualmente a técnica de esgotamento, cada

um em uma placa de Ágar Salmonella

Shigella após 24 horas de incubação, o

processo se repetiu para as outras 48 e 72

horas. Estas etapas estão situadas na Figura

2.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Posteriormente a primeira incubação

de 24 horas, todos os meios de cultura

encontravam-se apropriados para análise.

Iniciou-se com a leitura dos testes para

Escherichia coli, no qual pôde-se observar

com o controle negativo que os Lactobacillus

Gram positivos não são capazes de se

proliferar em meio MacConkey. O controle

positivo possibilitou a visualização de

crescimento bacteriano em todo o semeio da

placa, determinando deste modo, que a

acidez produzida pelo kefir durante o período

7


de um dia foi insuficiente para inibir o

desenvolvimento da bactéria. Não houve

qualquer crescimento na placa controle,

demonstrando que o meio BHI continuava

sem contato com interferentes externos que

pudessem ocasionar mudança nos resultados.

Foram adicionadas 10 gostas de leite no tubo

controle positivo (tubo 01) e no tubo controle

negativo (tubo 02), para preservar a

quantidade de kefir inserido inicialmente sem

qualquer estresse por escassez de nutriente.

Os resultados para a Salmonella spp.

foram semelhantes ao da Escherichia coli,

visando que na placa controle negativo os

Lactobacillus não foram capazes de se

proliferar em ágar SS. O controle positivo

demonstrou proliferação da Salmonella spp.

por todo o semeio da placa, constatando que

a acidez produzida pelo kefir durante as 24

horas é insuficiente para inibir o

desenvolvimento da bactéria. Não houve

qualquer crescimento na placa controle,

validando que o meio Selenito Cistina

encontrava-se sem contato com interferentes

externos que pudessem ocasionar mudanças

nos resultados. Foram adicionadas 10 gostas

de leite no tubo controle positivo (tubo 01) e

no tubo controle negativo (tubo 02), para

preservar a quantidade de kefir inserido

inicialmente sem qualquer estresse por

escassez de nutriente.

Todas as placas foram submetidas à

incubação por igual período para processo de

confirmação no qual os resultados

permaneceram positivos, evidenciando que a

fermentação de 24 horas não pode ser usada

como uma possível ferramenta

bacteriostática contra bactérias patogênicas.

Com essas resultas, torna-se expositivo o

cuidado indispensável com o manuseio e o

tempo de fermentação do kefir para fins de

consumo, sendo necessária a higienização

correta das mãos e utensílios, com o

propósito de evitar que bactérias nocivas

possam entrar em contato com a matéria-

prima. Ressalta-se igualmente o risco ao

consumidor caso o leite utilizado seja de

procedência duvidosa ou esteja contaminado.

Os resultados desta fermentação estão

dispostos na Tabela 1.

Tabela 1. Fermentação de 24 horas.

MEIOS SEMEADOS CONTROLE -

TUBO 1

CONTROLE +

TUBO 2

CONTROLE

TUBO 3

MacConkey para Escherichia coli. - + -

SS para Salmonella spp. - + -

LEGENDA: Não houve crescimento

(-) e houve crescimento (+)

*Fonte: Dados da pesquisa

**Nota:: Incubação por 24 horas dos tubos 01,02 e 03.

Após 48 horas de incubação dos

tubos testes, fez – se novo semeio em ágar

MacConkey e SS. Seguida a incubação, os

resultados para Escherichia coli

demonstraram que na placa controle negativo

persistiu sem crescimento dos Lactobacillus.

Na placa controle positivo não houve

crescimento da bactéria, comprovando que a

elevação do pH no meio em 48 horas é

suficiente para diminuir o crescimento

bacteriano. A placa controle continuou sem

qualquer crescimento microbiológico,

evidenciando a ausência de contaminantes

externos no tubo contendo o meio BHI

estéril. Foram adicionadas novamente 10

gotas de leite nos tubos controle positivo

(tubo 01) e controle negativo (tubo 02) para

nutrir o kefir.

Os resultados para Salmonella spp.

em 48 horas de fermentação, atestaram que a

8


placa controle negativo continuou sem

crescimento dos Lactobacillus. A placa

controle positivo não demonstrou

crescimento da bactéria, confirmando que a

elevação do pH no meio testado durante o

tempo analisado é suficiente para diminuir a

carga bacteriana. A placa controle continuou

sem crescimento microbiológico,

comprovando a ausência de contaminantes

externos no tubo contendo o meio Selenito

estéril. Foram adicionadas igualmente 10

gotas de leite nos tubos controle positivo

(tubo 01) e nos tubos controle negativo (tubo

02) para nutrição do kefir. Todas as placas

foram sujeitas novamente a incubação para

processo de confirmação, os resultados se

mantiveram os mesmo.

Czamanski (2003),pode encontrar

concentrações inibitórias no soro de kefir

contra bactérias patogênicas. Observando que

a Salmonella spp. e a Escherichia coli

analisadas no seu trabalho, sofreram ação

bacteriostática,e as que pertenciam ao grupo

das Gram-positivas passaram por ação

bactericida. Carvalho (2011), realizando

experimentos em camundongos com a

Salmonella Typhimurim, evidenciou que os

animais tratados com o soro de kefir

alcançaram maior sobrevivência do que

aqueles que não foram submetidos ao soro.

Santos (2008), em suas indagações observou

resultados equivalentes ao dos outros

escritores já citados, onde o kefir impediu o

crescimento da Escherichia coli e da

Salmonella Typhimurim, todas as

informações fornecidas por esses autores

encontravam – se em conformidade com os

dados obtidos neste artigo. Os resultados

desta fermentação estão localizados na

Tabela 2.


MEIOS SEMEADOS CONTROLE -

TUBO 1

CONTROLE +

TUBO 2

CONTROLE

TUBO 3

MacConkey para Escherichia coli - - -

SS para Salmonella spp. - - -




**Nota: : Incubação por 48 horas dos tubos 01,02 e 03.

Em continuação com as incubações,

em 72 horas os resultados para Escherichia

coli permaneceram com a progressão da

ausência de crescimento na placa controle

negativo. Na placa de controle positivo não

houve nenhum crescimento bacteriano.

Atestando que a acidificação no tubo

controle positivo encontrava-se em grande

elevação, tornando o meio BHI inadequado

para a sobrevivência da Escherichia coli

ocasionando a possível eventual morte. Na

placa controle também não houve

crescimento bacteriano, demonstrando que o

meio BHI de crescimento sem amostra ainda

estava estéril.

Os resultados da Salmonella spp.

foram idênticos ao da E.coli, no qual a placa

controle negativo continuou sem crescimento

dos Lactobacillus. A placa controle positivo

não demonstrou nenhuma proliferação

bacteriana, comprovando que a acidificação

no tubo controle positivo encontrava-se em

grande elevação, tornando o meio Selenito

inadequado para a sobrevivência da

Salmonella spp. ocasionando a possível

eventual morte. Na placa controle também

não houve crescimento bacteriano,

demonstrando que o meio Selenito de

crescimento sem amostra permanecia estéril.

As placas foram adicionadas novamente a

9


estufa bacteriológica pelo período de 24

horas para confirmação dos resultados, todas

mantiveram os resultados negativos.

Segundo Weschenfelder (2009), a

Escherichia coli em concentração de 10-8 foi

inibida pelo soro de kefir, reiterando o soro

de kefir como um agente anti-Escherichia

coli. Ulusoy et al. (2007), atestou em suas

pesquisas efeito antibacteriano com o uso do

kefir em diversas bactérias testadas, sendo

algumas delas a Salmonella enteretidis e

Escherichia coli em fermentações de 24 e 48

horas. Rodrigues (2005), igualmente atingiu

resultas de bloqueio contra a Salmonella spp.

e Escherichia coli com o uso do soro de

kefir. Todos esses relatos apresentam dados

de bloqueio da proliferação destas

enterobactérias que correspondem aos

encontrados neste trabalho, comprovando

que o kefir pode diminuir a carga

microbiológica de bactérias aptas a causar

distúrbios intestinais. Não apenas atuando na

melhora do sistema imunológico, bem como

impedindo a simbiose e a proliferação de

cepas patogênicas que podem ocasionar a

uma maior fatalidade de seu hospedeiro

temporário. Os resultados desta fermentação

estão dispostos para análise na Tabela 3.


MEIOS SEMEADOS CONTROLE –

TUBO 1

CONTROLE +

TUBO 2

CONTROLE

TUBO 3

MacConkey para Escherichia coli. - - -

SS para Salmonella spp. - - -




**Nota: : Incubação por 72 horas dos tubos 01,02 e 03.

Durante a incubação da primeira

amostra bacteriana ocorreu a possibilidade de

expor o soro de kefir em concentração

elevada, a uma bactéria que apresentassem

maior resistência aos antimicrobianos. Sendo

assim, utilizou-se as concentrações 10-5 e 10-6

em oposição a Klebsiella spp. em caldo de

crescimento BHI. Esta bactéria foi escolhida

pelo fato de ser um bacilo Gram-negativo

igualmente pertencente à família da

Enterobacteriaceae, encapsulada, aeróbia

facultativa e imóvel, causadora de infecção

frequente em pacientes imunossuprimidos

(ROSSI, 2014, ROSA, 2014, VERDI, 2016).

Moreira e Freire (2011),objetivaram que a

capacidade de resistência desta bactéria,

ocorre devido a produção da enzima KPC

que inativa diversos antimicrobianos. Verdi

et al. (2016), observou através de buscas em

inúmeros artigos da literatura que a

Klebsiella spp. é o bacilo mais persistentes

em hospitais do Brasil. Sendo este um

patógeno oportunista, é frequentemente

responsável por diversos casos de diarreia

por infecção em pacientes com

antibioticoterapia prolongada ou que estejam

imunodeprimidos. Podendo levar a piora do

quadro clinico do paciente mais rápido do

que outras bactérias. Matos (2017), afirma

que esta presença em clinicas e hospitais

decorre pelo uso indiscriminado de

antimicrobianos e da junção de pessoas

vulneráveis no mesmo ambiente. Para que os

resultados fossem análogos aos das outras

bactérias testadas, todos os processos

realizados para as enterobactérias anteriores,

foram repetidos para a Klebsiella spp. e suas

amostras foram semeadas em ágar

MacConkey. O meio de enriquecimento BHI

foi utilizado para semeio da Klebsiella spp.

10


os tubos controle negativo (tubo 01), controle

positivo (tubo 02) e controle (tubo 03) foram

submetidos a processo de incubação em

estufa bacteriológica por 24 horas, pra início

das fermentações e semeio em ágar

MacConkey. Passados 24 horas do semeio no

MacConkey introduziu-se a primeira leitura

dos resultados, no qual foram constatados

que na placa controle negativo não houve

crescimento dos Lactobacillus, na placa

controle positivo houve proliferação

bacteriana total em todo o crescimento da

placa. E na placa controle não houve

crescimento microbiológico, evidenciando a

esterilidade dos meios. Foram inseridas 10

gotas de leite nos tubos controle negativo

(tubo 01) e controle positivo (tubo 02), para

que o kefir pudesse permanecer saudável

durante todo o período de teste. Todas as

placas foram submetidas novamente a estufa

bacteriológica por 24 horas, os resultados se

mantiveram iguais.

Para a fermentação de 48 horas os

resultados apresentaram-se diferentes das

outras enterobactérias, de modo que na placa

controle negativo os resultados

permaneceram os mesmos. Porém, na placa

controle positivo continuou o crescimento

bacteriano em todo o semeio na placa. A

placa controle manteve-se com resultados

negativos para crescimento microbiológico.

Desde modo pôde-se concluir que a

Klebsiella spp. mesmo disposta em maior

concentração de bactérias acido láticas e

leveduras, é resistente a acidez de 24 e 48

horas produzida pelo kefir. Evidenciando a

sua grande capacidade de sobrevivência em

ambientes acidificados e sua simbiose com

microrganismos de outros reinos. Foram

inseridas novamente 10 gotas de leite nos

tubos controle negativo (tubo 01) e controle

positivo (tubo 02), mantendo desta forma o

kefir nutrido e sem estresse por escassez de

nutrientes. As placas foram inseridas outra

vez na estufa para confirmação dos

resultados, os quais se mantiveram os

mesmo. A fermentação de 72 horas retornou

com resultados similares das outras bactérias

analisadas. De forma que a placa controle

negativo perdurou-se com resultados

negativos para o desenvolvimento dos

Lactobacillus. A placa controle positivo não

expressou nenhum desenvolvimento

bacteriano e a placa controle igualmente não

demonstrou qualquer crescimento

microbiológico. Estabelece-se então, que a

fermentação de 72 horas é suficiente para

prover uma possível ação bactericida sobre a

Klebsiella spp. Todas as placas foram mais

uma vez submetidas a estufa bacteriológica

como medida de controle e certificação dos

resultados, os quais permaneceram todos

negativos. Estes resultados podem ser

visualizados na Tabela 04.

Tabela 4. Fermentações da Klebsiella spp.

MEIOS SEMEADOS CONTROLE –

TUBO 1

CONTROLE +

TUBO 2

CONTROLE

TUBO 3

MacConkey para Klebsiella spp. em

24 horas. - + -


48 horas.


72 horas.

-

-

+

-

-

-




**Nota: : Incubação por 24, 48 e 72 horas dos tubos 01,02 e 03.

11


CONCLUSÃO

A proposta principal deste artigo

acadêmico foi demonstrar que as leveduras e

bactérias presentes nos grãos de kefir são

capazes de inibir o crescimento de outros

microrganismos devido a elevação do pH.

Por intermédio dos dados anexados pode se

afirmar que os resultados analisados durante

três dias, comprovam a eficácia do kefir

quando em contato com a E.coli, Salmonella

spp. e Klebsiella spp., pois não permitiu a

proliferação bacteriana corroborando com a

ideia inicial. Tornando o kefir um aliado a

boa saúde e trazendo uma proposta de

medicamento natural e efetivo que pode ser

administrado a longo prazo. Ressalta-se

também a necessidade de mais estudos para

desvendar maiores benefícios que o kefir

pode vir a proporcionar em seus tratamentos

não medicamentosos. Assim, poderá

contribuir na saúde e ser utilizado como

tratamento natural em hospitais, clínicas e em

medidas profiláticas para evitar possíveis

doenças, principalmente relacionadas à

infecção ou intoxicação alimentar.

AGRADECIMENTOS

Ao Centro Universitário São Lucas,

pelo seu rico acervo bibliográfico,

infraestrutura e corpo docente. À Profª. Ma.

Lorena Brandhuber por suas orientações,

suporte e por acreditar no alcance didático

deste projeto. A grande profissional Olivia

Bezerra da Silva, pela sua prestatividade,

disponibilidade e paciência. E ao professor

Paulo de Tarso por demonstrar neste projeto

outro ponto de reflexão.

___________________________________________________________________________

ANALYSIS OF ACIDIFICATION PRODUCED BY TRADITIONAL MILK KEFIR

AMONG STRAINS OF ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP. AND

KLEBSIELLA SPP.

ABSTRACT: The grains of kefir are a food based on probiotics composed of acetic acid bacteria, lactic acid and

yeasts coking in symbiosis in a polysaccharide matrix. It is proven that their daily in take brings countless

benefits to the health of their users, such as improvement in

the immune and respiratory system, as well as regularization and balance of the human resident microbiota. The

main proposal of this project was to check whether the acidity produced by the serum of kefir would be

sufficient to inhibit bacteriostatically the Salmonella spp. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. The

methodology adopted was divided into kefir production, preparation of culture media, preparation of dilutions,

interaction between kefir and enterobacteriaceae and sowing for control. Initially, a serial dilution was performed

in multiple tubes of 25ml of serum in 225ml of pasteurized milk, then inoculated 1ml of serum diluted in BHI

broth and Selenito broth associated with 1ml of the bacterium in an exponential phase to be analyzed. The

inoculums were subjected to incubation process in a bacteriological greenhouse for the period of 24, 48 and 72

hours. Each 24 hours of incubation was performed with the technique of exhaustion in MacConkey agar and SS

agar, to visualize the presence or absence of bacterial growth. The results showed that the elevation of the PH

obtained by the fermentation of 24 hours is not able to inhibit the bacterial development, the fermentation of 48

hours had bacteriostatic effect on the bacteria Salmonella spp. and Escherichia coli. However, it did not present

any blocking action on Klebsiella pneumoniae. The fermentation of 72 hours totally inhibited the growth of all

the bacteria analyzed, confirming that the acidity instituted by the Lactobacillus and yeasts present in the serum

of kefir had a bactericidal impact on the Enterobacteriaceae. The traditional kefir serum showed great efficacy in

the exercise of bacteriostatic and bactericidal inactivation, revealing this food as a proposal to be analyzed from

natural medicine that can be administered with daily consumption.

KEYWORDS: Kefir. Enterobacteriaceae. Fermentation. Anti-Bacterial Agents.

___________________________________________________________________________

REFERÊNCIAS

12


1. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Alegações de propriedade

funcional aprovadas. Rio de Janeiro.

2. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RESOLUÇÃO Nº 18, DE 30

DE ABRIL DE 1999. Rio de Janeiro.

3. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RESOLUÇÃO Nº 19, DE 30

DE ABRIL DE 1999. Rio de Janeiro.

4. AYCAN, Ilker Onguc; CELEN, Mustafa Kemal; YILMAZ, Ayhan; ALMAZ,

Mehmet Selim; DAL, Tuba; CELIK, Yusuf; BOLAT, Esef. Colonização bacteriana

por causa do aumento da carga de trabalho da equipe de enfermagem em unidade de

terapia intensiva. Elsevier Revista Brasileira de Anestesiologia, v. 65, n.3, 180 –

185, 2015.

5. BÜHLER, Helena Ferraz; IGNOTTI, Eliane; NEVES, Sandra Mara Alves da Silva;

HACON, Sandra Souza. Análise espacial de indicadores integrados determinantes

da mortalidade por diarreia aguda em crianças menores de 1 ano em regiões

geográficas. Ciência & Saúde Coletiva, v. 19, n.10, 4131- 4140, 2014.

6. CARNEIRO, C. S. Leites fermentados: histórico, composição, características físico-

químicas, tecnologia de processamento e defeitos. PUBVET, Londrina, v. 6, n. 27,

Ed. 214, Art. 1424 , 2012.

7. CARVALHO, Natália Caldeira;LOPES, Evelyn de Souza Oliveira; NICOLI,

Jacques Robert; LABOISSIERE, Lúcia Helena Esteves dos Santos. Efeito do

método de produção de kefir na vida de prateleira e na infecção experimental

com Salmonella Typhimurium em camundongos. 2011. 135F. Dissertação de Pós

Graduação - Faculdade de Farmácia da UFMG, Belo Horizonte, 2011.

8. CHAURET, Christian. Survival and control of Escherichia coli O157:H7 in foods,

beverages, soil and water. Virulence, v. 2, n.6, 593-601, 2011.

9. COSTA, Cristiane Mara Silva; MANGIA, Adriana Hamond Regua. Caracterização

molecular de amostras de Escherichia coli carreadoras dos genes stx isoladas

de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro. 2013. 100F.

Dissertação de Mestrado – Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013.

10. CZAMANSKI, Raquel Teresinha; WIEST, José Maria; Avaliação da atividade

antibacteriana de filtrados de quefir artesanal. Dissertação de Mestre –

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2003

11. DIAS, Priscila Alves; SILVA, Daiani Teixeira; TIMM, Cláudio Dias. Atividade

Antimicrobiana De Microrganismos Isolados De Grãos De Kefir. Ciênc. anim.

bras., Goiânia , v. 19, e-40548, 2018.

12. ELSAS, Jan Dirk Van; SEMENOV, Alexander V.; COSTA, Rodrigo; TREVORS,

Jack. Survival of Escherichia coli in the environment: fundamental and public

health aspects. The ISME Journal, Fev, 2011, v.5, 173-183.

13. FERENS, Witold A., HOVDE, Carolyn J. Escherichia coli O157:H7: Animal

Reservoir and Sources of Human Infection. Foodborne Pathogens and Disease, v.

8, n. 4, 2011.

13


14. GURGEL, Thaís C.; CARVALHO, Wânia S. A assistência farmacêutica e o

aumento da resistência bacteriana aos antimicrobianos. Latin American Journal of

Pharmacy, v. 27, n. 1, 118-23, 2008.

15. HEITHOFF, Douglas M.; SHIMP, William R.; HOUSE, John K.; XIE, Yi;

WEIMER, Bart C.; SINSHEIMER, Robert L.; MAHAN, Michael J. Intraspecies

Variation in the Emergence of Hyperinfectious Bacterial Strains in Nature. PLOS

Pathogens Journal, 12, Abril, 2012, v. 8, e – 1002647, 2012.

16. HUNGRIA, TD; LONGO, PL. Viabilidade de Lactobacillus casei em alimento

probiótico infantil relacionada a vida-de-prateleira. Revista Saúde – UNG – SER,

v. 3, n.3, 2009.

17. JIANZHONG, Zhou; XIAOLI, Liu; HANHU, Jiang; MINGSHENG, Dong.

Analysis of the microflora in Tibetan kefir grains using denaturing gradient gel

electrophoresis. Elsevier Food Microbiology, v. 26, 770–775, 2009.

18. KOMATSU, Tiemy Rosana; BURITI, Flávia Carolina Alonso; SAAD, Susana

Marta Isay. Inovação, persistência e criatividade superando barreiras no

desenvolvimento de alimentos probióticos. Revista Brasileira de Ciências

Farmacêuticas, v. 44, n.3, 2008.

19. LEITE, Analy Machado de Oliveira; PASCHOALIN, Vânia M. Flosi; SILVA, Joab

Trajano; MIGUEL, Marco Antonio Lemos. Análise da diversidade microbiana de

grãos de kefir, caracterização da bebida fermentada e potencial probiótico das

estirpes isoladas. Tese de Doutorado – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio

de Janeiro, 2012.

20. LOPITZ-OTSOA, Fernando; REMENTERIA, Aitor; ELGUEZABAL, Natalia,

GARAIZAR, Javier. Kefir: A symbiotic yeasts-bacteria community with alleged

healthy capabilities. Revista Iberoamericana de Micología, v.23, 67-74, 2006.

21. LOUREIRO, Edvaldo Carlos Brito; SOUZA, Cintya Oliveira; SOUSA, Eveline

Bezerra; SANTOS, Daniel Vasconcelos; ROCHA, Daniela Cristiane da Cruz;

RAMOS, Francisco Lúzio de Paula; SILVA, Mônica Cristina Moraes. Detecção de

bactérias enteropatogênicas e enteroparasitas em pacientes com diarreia aguda em

Juruti, Pará, Brasil. Revista Pan-Amaz Saúde, v. 1, n.1, 143-148, 2010.

22. LOUREIRO, Rui João; ROQUE, Fátima; RODRIGUES, António Teixeira;

HERDEIRO, Maria Teresa; RAMALHEIRA, Elmano. O uso de antibióticos e as

resistências bacterianas: breves notas sobre a sua evolução. Revista Portuguesa de

Saúde Pública, v. 34, n. 1, 77- 84, 2016.

23. MARCHI, Luana; PALEZI, Simone Canabarro; PIETTA, Giordana Maria.

Caracterização e avaliação sensorial do kefir tradicional e derivados. Unoesc &

Ciência – ACET, Edição Especial, 15-22, 2015.

24. MATOS, Julyana Sthéfanie Simões; CORÇÃO, Gertrudes. Susceptibilidade

antimicrobiana em isolados bacterianos de amostras de água do sistema de

abastecimento de água e dos efluentes líquidos em hospitais do Vale dos Sinos.

2017. 97F. Dissertação de Mestrado - Universidade Federal do Rio Grande do Sul,

Porto Alegre, 2017.

14


25. MOREIRA, Vanessa Carvalho; FREIRE, Daniel. Klebsiella pneumoniae e sua

resistência a antibióticos. Publicação Online. 2011.

26. ORDÓÑEZ, Avelino Álvarez; BEGLEY, Máire; PRIETO, Miguel; MESSENS,

Winy; LÓPEZ, Mercedes; BERNARDO, Ana; HILL, Colin. Salmonella spp.

survival strategies within the host gastrointestinal tract. Microbiology Society, v.

157, 3268-3281, 2011.

27. OTLES, Semih; CAGINDI, Ozlem. Kefir: a probiotic dairy-composition, nutritional

and therapeutic aspects. Pakistan Journal of Nutrition, v. 2, n. 2, 54-59, 2003.

28. PAIVA, Igor Moura; NUNES, Álvaro Cantini; NEUMANN, Elisabeth.

Caracterização estrutural e avaliação da capacidade imunomodulatória de

exopolissacarídeos produzidos por lactobacilos isolados de kefir. Dissertação de

Mestre – Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2013.

29. PAIVA, Roberta Fernanda Da Paz De Souza; SOUZA, Marcela Fernanda Da Paz.

Associação entre condições socioeconômicas, sanitárias e de atenção básica e a

morbidade hospitalar por doenças de veiculação hídrica no Brasil. Cadernos de

Saúde Pública, Niterói, v. 34, e- 00017316, 2018.

30. PETERSEN, Randi Fons; LITRUP, Eva; LARSSON, Jonas T.; TORPDAHL, Mia;

SORENSEN, Gitte; MULLER, Luise; NIELSEN, Eva M. Molecular

Characterization of Salmonella Typhimurium Highly Successful Outbreak Strains.

Foodborne Pathogens and Disease, v. 00, n. 00, 10.1089, 2011

31. RAIZEL, Raquel; SANTINI, Eliana; KOPPER, Andressa Magali; REIS FILHO,

Adilson Domingos. Efeitos do consumo de probióticos, prebióticos e simbióticos

para o organismo humano. Revista Ciência & Saúde, Porto Alegre, v. 4, n.2, 66-

74, 2011.

32. REIS, Sandra Aparecida; MATTA, Sérgio Luis Pinto; PELUZIO, Maria do Carmo

Gouveia. Efeito do consumo de kefir de leite integral sobre o desenvolvimento

de lesões pré-neoplásicas intestinais em ratos wistar. Dissertação de Pós

Graduação – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2015.

33. RODRIGUES, K. L.; CARVALHO, J. C. T.; SCHNEEDORF, J. M. Anti-

inflammatory properties of kefir and its polysaccharide extract.

Inflammopharmacology, v. 13, n. 5-6, 485-492, 2005.

34. ROSA, Tawana Correa Rodrigues Amorim. Análise de aspectos epidemiológicos e

clínicos e caracterização de genes de resistência das Enterobactérias

produtoras de carbapenemases em um hospital do Distrito Federal. 2014. 80F.

Monografia de Conclusão de Curso - Universidade de Brasília, Faculdade de

Ceilândia, Ceilândia, 2014.

35. ROSSI, Diogo Jorge et al.; RECHENCHOSKI, Daniele Zendrini; VIVAN, Ana

Carolina Polano; DAMBRÓZIO, Angélica Marim Lopes; GARBIN, Renata

Perugini Biasi; MAGALHÃES, Gerusa Luciana Gomes; QUESADA, Regina

Mariuza Borsato; MARRONI, Floristher Elaine Carrara; PELISSON, Marsileni;

PERUGINI, Marcia Regina Eches; CAROLINA, Eliana. Evolução da resistência de

Klebsiella pneumoniae no Hospital Universitário de Londrina no período de 2000 a

15


2011. Semina: Ciências Biológicas e da Saúde, Londrina, v. 36, n. 1, supl, p. 267-

274, ago. 2015.

36. SAAD, N.; DELATTRE, C.; URDACI, M.; SCHMITTER, J.M.; BRESSOLLIER,

P. An overview of the last advances in probiótico and prebiotic field. Elsevier LWT

– Food Science and Technology, v. 50, n. 20, 1-16, 2013.

37. SANTOS, João Paulo Victorino. Avaliação da microbiota de grãos de kefir e

atividade inibidora da bebida sobre algumas bactérias patogênicas. 2008. 88F.

Dissertação de Pós Graduação – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2008.

38. SHINOHARA, Neide Kazue Sakugawa; BARROS, Viviane Bezzera; JIMENEZ,

Stella Maris Castro; MACHADO, Erilane De Castro Lima; DUTRA, Rosa Amália

Fireman; LIMA FILHO, José Luiz. Salmonella spp., importante agente patogênico

veiculado em alimentos. Ciência & Saúde Coletiva, Recife, v. 13, e- 1675-1683,

2008.

39. ULUSOY, Beyza Hatice; ÇOLAK, Hilal; HAMPIKYAN, Hamparsun; ERKAN,

Mehmet Emin. An in vitro study on the antibacterial effect of kefir against some

food-borne pathogens. Türk Mikrobiyol Cem Derg, v. 37, n. 2, 103-107, 2007.

40. VERDI, Camila Marina; ZIMMERMANN, Carine Eloise Prestes; ANDRADE,

Eduardo Nascimento Correa; LEDUR, Pauline Christ; VELASQUEZ, Patrícia

Gurgel. Detecção Laboratorial Dos Mecanismos De Resistência Da Klebsiella

Pneumoniae: Uma Revisão. Revista Saúde Integrada, v. 9, n. 17, 2016.

41. WESCHENFELDER, Simone; WIEST, José Maria; CARVALHO, Heloisa Helena

Chaves. Caracterização de kefir tradicional quanto à composição físico-

química, sensorialidade e atividade anti-Escherichia coli. Dissertação de Pós

Graduação – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009.

42. YANG, Zhiwei; ZHOU, Feng; JI, Baoping; LI, Bo; LUO, Yangchao; YANG, Li;

LI, Tao. Symbiosis between Microorganisms from Kombucha and Kefir: Potential

Significance to the Enhancement of Kombucha Function. Appl Biochem

Biotechnol, v. 160, n. 2, 446-55, 2008.

16


Documents

ANÁLISE DA ACIDIFICAÇÃO PRODUZIDA PELO KEFIR DE LEITE