Efecto Del Estres Agudo

8/18/2019 Efecto Del Estres Agudo

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD

ÁREA: INMUNOLOGÍA

PRESENTA:

M. C. y P. KARLA RAMÍREZ JIMÉNEZ

DIRECTORES DE TESIS

DR. RAFAEL CAMPOS RODRÍGUEZM. EN C. MARYCARMEN GODÍNEZ VICTORIA

MÉXICO, D. F. DICIEMBRE 2009

“ EFECTO DEL ESTRÉS AGUDO POR INMOVILIZACIONEN LA PRODUCCION BASAL DE IgA EN INTESTINO

DELGADO DE RATONES Balb/c”


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I

ÍNDICE

Introducción 1

I. Definición de estrés. 2

a) Clasificación de estrés. 2

b) Etapas de estrés. 3

II. Eje Hipotálamo-Hipófisis-Adrenal. 4

a) Hormonas del estrés (glucocorticoides y

catecolaminas).

5

III. Interacción Eje H-H-A y el Sistema inmune. 6

a) Efecto de las catecolaminas sobre sistema

inmune.

9

b) Efecto “in vitro” de las catecolaminas sobre

macrófagos.

9

c) Efecto “in vitro” de las catecolaminas en las

células NK.

9

d) Modelo de actuación de catecolaminas “in

vivo” en respuesta a linfocitos.

10

IV. Sistema inmunológico 11

V. Anatomía y fisiología de Intestino delgado 12

VI. Sistema Inmunitario de Mucosas 13

a) Sitios inductores y efectores del GALT 14

b) Componentes celulares del GALT 16

c) Componentes humorales del GALT 18

Planteamiento del Problema 23

Justificación 25

Objetivo General 26

Objetivo Particular 26

Hipótesis 27

Material y Métodos 28

I. Grupo muéstrales. 28

II. Obtención de material biológico(suero,

bazo,intestino delgado, líquidos intestinales, placas

de Peyer proximal y distal, lámina propia segmento

29


5/70

II

proximal y distal).

III. Determinación de corticosterona. 31

IV. Determinación de niveles de IgA. 31

V. Determinación de poblaciones linfoides. 32

VI. Análisis estadístico. 33

VII. Resultados. 34

VIII. Niveles de corticosterona en suero. 34

IX. Efecto del estrés sobre los niveles de IgA en suero 35

X. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre los

niveles de IgA en lavados intestinales.

36

XI. Efecto les estrés agudo sobre el porcentaje de

linfocitos T y B en bazo.

37

XII. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de

linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento

proximal del intestino delgado.

39

XIII. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de

linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento

distal del intestino delgado.

39

XIV. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de

linfocitos T y B en lámina propia del segmento

proximal del intestino delgado.

41

XV. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de

linfocitos T y B en lámina propia del segmento distal

del intestino delgado.

43

XVI. Comparación de las poblaciones linfoides de las

placas de Peyer entre el segmento proximal y distal

del intestino delgado.

43

XVII. Comparación de las poblaciones linfoides de

lámina propia entre el segmento proximal y distal del

intestino delgado.

44

Discusión 46

Conclusiones 52

Perspectivas 53


6/70

III

Bibliografía 54

Abreviaturas IV


7/70

IV

ABREVIATURAS

Ac Anticuerpo

ACTH Hormona Adrenocorticotrofa

APC Células presentadoras de Antígenos

BALT Tejido Linfoide Asociado a Bronquios

Cell NK Células Natural Killer

CRH Hormona Liberadora de Corticotropina

Eje H-H-A Eeje Hipótalamo-Hipófisis-Adrenal

ENS Sistema Nervioso Entérico

GALT Tejido Linfiode Asociado a Intestino

IgA Inmunoglobulina A

IgG Inmunoglobulina G

IL Interleucina

LgM Inmunoglobulina M

LIE Linfocitos Intra-Epiteliales

MALT Tejido Linfoide Asociado a Mucosas

NALT Tejido linfoide Asociado a Nariz

RLT Receptor de Linfocito T

SNC Sistema Nervioso Central

TGF-β Factor de Crecimiento Transformante Beta

.


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V

INDICE DE CUADROS Y FIGURAS

Pagina

Figura 1 Eje HHA y el sistema nervioso autónomo dispone dedos vías clave para la desregulación del sistemainmunitario.

8

Figura 2 Características histológicas del intestino delgado 12

Figura 3 Modelo de los sitios inductores y efectores en el GALT 15

Figura 4 Sistema inmune de la mucosas 16

Figura 5 Transporte de la IgA en mucosa intestinal 20

Figura 6 Concentración sérica de corticosterona en respuesta alestrés agudo inducido por inmovilización

33

Figura 7Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA suero

34

Figura 8Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA en

lavados intestinales de los segmentos proximal y distal,

del intestino delgado

35

Figura 9Efecto de estrés agudo sobre el porcentaje de linfocitos

T y B en bazo

37

Figura 10Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el

porcentaje de linfocitos T y B en placas de Peyer del

segmento proximal del intestino delgado

38

Figura 11 Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el

porcentaje de linfocitos T y B en placas de Peyer del

segmento distal del intestino delgado

40

Figura 12Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el

porcentaje de linfocitos T y B en la lámina propia del

segmento proximal del intestino delgado

41

Figura 13 Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el 42


9/70

VI

porcentaje de linfocitos T y B en la lámina propia del

segmento distal del intestino delgado

Cuadro 1 Interacción de las hormonas con las células inmunes 7

Cuadro 2Componentes principales de la inmunidad innata y

adaptativa

11

Cuadro 3Características principales de la inmunidad innata y

adaptativa

12


10/70

VII

RESUMEN

Actualmente se han asociado un gran número de enfermedades con la

exposición repetida y crónica al estrés. Ejemplo de ellas son las enfermedades

neurodegenerativas, cardiovasculares, alérgicas, infecciosas e inflamatorias.

Sin embargo aun se desconocen totalmente los mecanismos a través de los

cuales el estrés puede modular al sistema inmunológico y causar estas

patologias.

El presente trabajo tiene como objetivo determinar el efecto del estrés agudo

inducido por inmovilización sobre el sistema inmune asociado a la mucosa del

intestino delgado de ratones Balb/c, machos. Para esto se determinó la

concentración de inmunoglobulina A total en suero y líquido intestinal de

ratones sanos y ratones sometidos a estrés, por la técnica de ELISA; el

porcentaje de linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotóxicos y linfocitos B,

por citometria de flujo y; la concentradión de corticosterona en suero, por la

técnica de EIA.

También se determinó si existe alguna diferencia en los niveles de IgA y el

porcentaje de linfocitos entre el segmento proximal y distal del intestino

delgado, en ambos grupos de estudio (control y estrés).


11/70

VIII

ABSTRACT

Currently, several illness have been associated with repeated and chronic

exposure to stress. Examples are neurodegenerative, cardiovascular, allergic,

infectious and inflammatory diseases. However, the mechanisms through which

stress can modulate the immune system and cause these pathologies are still

completey unknown.

The aim of this study was to determine the effect of the acute stress induced by

restraint on the immune system associated with the mucosa of the small

intestinal of BALB/c mice. Accordingly, a determination was made of the levels

of IgA in serum and intestinal fluid of healthy mice and mice subjected to stress

by ELISA, the percentage of T helper cells, cytotoxic T and B lymphocytes by

flow cytometry, and the concentratión of serum corticosterone by the EIA

technique.

Finally, it was examined whether there is any difference in IgA levels and the

percentage of lymphocytes between the proximal and distal small intestine in

both study groups (control and stress).


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1

Introducción

Actualmente se han asociado un gran número de enfermedades con la

exposición repetida y crónica al estrés. Ejemplo de ellas son las enfermedades

neurodegenerativas, migraña, depresión, hipertensión, infarto, aneurisma,

alergias, asma, infections respiratoires de vías aéreas altas y bajas,

enfermedad inflamatoria intestinal como colitis ulcerativa, enfermedad de

Chron, entre otras1

El estrés es un conjunto de eventos que se inician con un estímulo (estresor)

que inicia una reacción en el cerebro (percepción del estrés) que

posteriormente activa a los sistemas fisiológicos del cuerpo (respuesta de

estrés)2.. También se define como un “estado de amenaza para la

homeostasis, durante el cual se activa una respuesta adaptativa

compensatoria”3, y en una forma mas simple, como la respuesta general del

organismo ante cualquier estimulo estresor o situación estresante. Sin

embargo, no existe en la actualidad una definición del estrés aceptada en

forma generalizada4,5


13/70

2

I. Definición de estrés

En 1930, Hans Selye definió al estrés como "la respuesta no específica del

organismo a cualquier demanda de cambio".6. En 1966, Richard Lazaros, lo

describe como "el resultado de la relación entre el individuo y el entorno

poniendo en peligro su bienestar".7. En medicina el estrés es un proceso

fisicoquímico y emocional. La Organización Mundial de la Salud (O.M.S.)

postula que el estrés es "el conjunto de reacciones fisiológicas que prepara al

organismo para la acción".8

.

De acuerdo a lo antes mencionado, se permite définir al estrés como la

respuesta del organismo a condiciones externas que perturban la homeostasis

de una persona, dando como resultado la activación y la inhibición fisiológica y

patológica de diferentes procesos biológicos.

Clasificación de Estrés

En la actualidad existen diferentes formas de clasificar al estrés. De acuerdo a

su etiología se puede clasificar en físico (trauma, cirugía, quemaduras e

infecciones), psicológico o emocional (problemas interpersonales, disgustos,

depresión), metabólico (deshidratación, hemorragias, cetoácidosis,

hipoglicemia) y farmacológico (cocaína, anfetaminas, hipoglicemia).


14/70

3

Otra forma de clasificarlo dependiendo de su duración es en es trés ag udo y

es trés crón ic o .

Se denomina es trés agudo cuando el estimulo estresor dura de minutos a

horas y su duración no es prolongada en el tiempo y se presenta en una sola

ocasión.

Es trés crón ic o es cuando la acción de respuesta y el estimulo estresor que el

sujeto debe enfrentar se prolonga en el tiempo y la sensación de amenaza es

constante. Si la situación de estrés crónico se mantiene constante durante un

tiempo muy prolongado ocasiona agotamiento de la respuesta tanto del

sistema nervioso y este agotamiento puede debilitar al sistema inmunológico

siendo más vulnerable a las enfermedades (inmunológicas y crónico

degenerativas), así como también provoca trastornos metabólicos y

psicológicos.9

Etapas de estrés

La respuesta de adaptación orgánica o estrés tiene tres etapas: alarma o

reacción , adaptación y descompensac ión . Las dos primeras se consideran

frecuentes, cotidianas y benéficas para la vida, aumentan levemente las

hormonas de estrés y mejoran las funciones orgánicas para lograr adaptación o

triunfar sobre retos estresantes; esos niveles de estrés se advierten en


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4

situaciones aún placenteras tales como comer, reír, hacer ejercicio moderado y

cuando los problemas estresantes encuentran solución o escape. La tercera

fase o descompensación del estrés es negativa para el organismo,

predisponiendo el desarrollo de enfermedades serias agudas, crónicas y

mortales 10

La reacción al estrés, se desencadena como una respuesta inespecífica

encaminada a compensar cualquier situación en la que el organismo se

encuentre en peligro y altere su homeostasis. Durante las fases de alarma y

agotamiento del síndrome general de adaptación o síndrome de estrés, ocurre

inhibición del sistema inmune como parte de la respuesta normal del organismo

ante la estimulación y ocurre un hipofuncionamiento del sistema inmune, con

lo que el organismo queda expuesto a la acción de los agentes infecciosos del

ambiente, siendo más susceptible a padecer enfermedades4.

II.Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal

La habilidad de adaptarse a una situación de estrés está determinado por el

modo en que se percibe la situación, fisiológicamente la respuesta al estrés

está controlada por el sistema nervioso central (SNC) y la coordinación que

éste ejerce sobre los tres sistemas encargados de mantener la homeostasis:

autónomo, endocrino e inmune. El principal efector de la respuesta al estrés es

el eje hipotálamo-hipófisis-glándulas adrenales (HHA)11,12


16/70

5

En el hipotálamo, las neuronas de la región parvocelular del núcleo

paraventricular poseen axones que se proyectan a la capa externa de la

eminencia media donde secretan la hormona liberadora de corticotropina

(CRH). La hormona liberadora de corticotropina desde la circulación porta-

hipofisiaria estimula a las células corticotropas de la adenohipófisis a que

secreten la hormona adrenocorticotrofa (ACTH) que tiene como órgano blanco

la corteza de las glándulas suprarrenales, específicamente las porciones

fasciculada y reticular, que en respuesta a la estimulación de la ACTH secretan

glucocorticoides; en especial el cortisol que es el glucocorticoide predominante.

Esta hormona estimula la glucogenólisis, la proteólisis y la lipólisis, teniendo

efectos cardiacos inotrópicos (taqicardia, hipertensión arterial, vasoconstricción

periférica sobre todo a nivel intestinal) e induce la expresión genética de varias

proteínas reguladoras y secretoras2.

El sistema nervioso autónomo simpático es otro efector de la respuesta el cual

genera activación de las neuronas preganglionares simpáticas y la liberación

concomitante de noradrenalina por las neuronas posganglionares simpáticas, la

activación simpática estimula a las células cromafines de la médula de la

glándula suprarrenal a que secrete adrenalina al torrente sanguíneo. La

adrenalina aumenta la frecuencia cardiaca y respiratoria y el flujo sanguíneo a

los músculos, con lo que prepara al organismo para emitir una de dos

respuestas, pelear o huir.9

http://www.monografias.com/trabajos/genetica/genetica.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos10/compo/compo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos10/compo/compo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos/genetica/genetica.shtml


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6

III. Interacción del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal y sistema

inmune

Las hormonas glucocorticoides y catecolaminas, liberadas durante la

exposición del organismo al estrés, ejercen funciones inmunoestimulantes o

inmunosupresoras dependiendo del tipo de estrés al que esté expuesto el

individuo. Estos efectos se llevan a cabo a través de su unión directa a sus

receptores específicos, localizados en el citoplasma y en la membrana celular,

de las células inmunes. Los órganos linfoides primarios y secundarios, así

como los linfocitos T y B, los neurotrófilos, los monocitos y los macrófagos,

poseen receptores para hormonas glucocorticoides tipo II, predominantemente.

13

Las catecolaminas adrenalina y noradrenalina modulan el funcionamiento del

sistema inmune a través de sus receptores beta-adrenérgicos localizados en

todos los órganos inmunes y en los linfocitos T y B, las células asesinas

naturales (NK), los monocitos y macrófagos (Cuadro 1)12. El sistema nervioso

autónomo, en su división simpática, inerva la red vascular y parénquima de los

órganos linfoides primarios, como la médula ósea y el timo, y también inerva a

los órganos linfoides secundarios, el bazo, los ganglios linfáticos y el tejido

linfoide asociado a la mucosa pulmonar y al intestino. Las fibras del sistema

nervioso simpático arborizan dentro de compartimentos específicos en los

órganos linfáticos, en la vaina periarteriolar linfática y seno marginal de la pulpa

blanca del bazo y en los cordones medulares, corteza y paracorteza de los

ganglios linfáticos; y establecen contactos, similares a sinapsis neurona-


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7

neurona, con células inmunes como linfocitos T, granulocitos, macrófagos y

células asesinas naturales (NK). La inervación simpática de los órganos del

sistema inmune promueve la maduración y movilización de los linfocitos,

timocitos, células NK y granulocitos en condiciones normales y durante

infección del organismo; mientras que la denervación, por el uso de

antagonistas noradrenérgicos o por simpatectomía, produce supresión de la

respuesta inmune14

. En la figura 1 se muestra la relación entre el HHA y el

sistema inmune.

Cuadro 1. Interacción de las hormonas con las células inmunes

HormonaCélulas que expresan

receptoresFunción celular

GlucocorticoidesCélulas T y B,

neutrófilos y macrófagos

Inhibe la inflamación, inhibe la producción

de ILl-12 por CPA, inducir a un cambio

de la producción de citocinas TH2 a TH1

Hormona liberadora

corticotropina

Células T, monocitos y

macrófagos

Aumenta la producción de IL-1, pruebas

de la modulación de la inflamación

autocrina y / o paracrina

Catecolaminas:

adrenalina y

noradrenalina

Células T y B, células

NK, monocitos y

macrófagos

Inducir cambio hacia la respuesta th2,

participa CPA y células th1


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8

Hipotalamo

Hipófisis

Hormona liberadora

de corticotropina

Nodo linfático

Citocinas tal

como: IL-1Adrenalina yNoradrenalina

Glucocorticoides

Nodo linfáticoCorteza

Médula

Hormona

Adrenocorticotropa

Hormona lib.

prolactina

Sangre periférica

Cerebro

Inervación

simpática

Célula BCélula T

Célula Presentadora de

antígeno

Célula NK

Monocito

Estrés

Figura 1 El eje HHA y el sistema nervioso autónomo dispone de dos vías clave

para la desregulación del sistema inmunitario. Los factores de estrés pueden

activar el eje simpático-adrenal-medular (SAM), así como el eje HPA, y por lo

tanto provocar la liberación de hormonas hipofisarias y suprarrenales como las

catecolaminas (adrenalina y noradrenalina), hormona corticotropina (ACTH),

cortisol, hormona del crecimiento y la prolactina, que a su vez pueden actuar

directa o indirectamente sobre el sistema inmunológico.11

El efecto inmunosupresor de los glucocorticoides se debe principalmente a la

disminución en la producción de citocinas como el interferón-γ (IFN-γ), el factor

de necrosis tumoral (TNF) y las IL-1, IL-2 e IL-6, necesarias para la

maduración y movilización de los linfocitos y otras células inmunitarias.


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9

Efecto de las catecolaminas sobre el sistema inmune

Cuando los niveles de catecolaminas se elevan por el estrés, a

concentraciones de 10-4 M, inhiben la producción de linfocitos T, pero a

concentraciones de 10-8 M y en presencia de hidrocortisona estimulan la

proliferación de estas células. .

Efecto " in v i t ro" de las catecolaminas so bre los m acrófagos

Solo concentraciones de 10-12 M aumentan significativamente la quimiotaxis de

macrófagos. Pero los receptoresα son más importantes en este proceso.

Concentraciones farmacológicas (altas) o fisiológicas de norepinefrina

estimulan la capacidad fagocítica de los macrófagos, a no ser que uno de los

receptores esté bloqueado.

Se supone que la quimiotaxis necesita menos concentración de norepinefrina

que la fagocitosis porque en los vasos no hay mucha cantidad, pero cuando los

macrófagos son atraídos al foco infeccioso, la epinefrina y norepinefrina actúan

autocrinamente sobre las células aumentando la concentración en un lugar

localizado. Concentraciones de 10-5 a 10-12 M son además quimioatrayentes

para los fagocitos.

Efectos " in v itro" de las c atecolam inas en las células NK

Concentraciones mayores o iguales a 10-7 M de norepinefrina inhiben la

proliferación de células NK. Concentraciones menores de 10-7 M la estimulan


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10

bajo determinadas circunstancias. Este efecto se ha visto que influye

directamente sobre las células NK y no sobre las células tumorales.

Modelo de actuación de catecolaminas "in vivo" en respuesta a

linfocitos

La actuación se divide en tres fases temporales: fase inductiva, proliferativa y

efectora.

Fase inductiva: La noradrenalina liberada por las terminaciones nerviosas

estimula la fagocitosis y presentación antigénica así como la colaboración

celular en general a través de receptoresα y β adrenérgicos. Se favorece el

inicio de la respuesta inmunitaria. Las citoquinas producidas por los

macrófagos (fundamentalmente la IL-1) inhiben la acción de la noradrenalina

disminuyendo su concentración.

Fase proliferativa: Concentraciones bajas de noradrenalina a través de

receptores α estimulan la proliferación de los linfocitos T. Segregan IL -2 que

también estimula la producción de noradrenalina. Concentraciones de

noradrenalina altas por receptores β inhiben la proliferación de los linfocitos,

con lo que se para y regula la respuesta proliferativa.

Fase efectora: La noradrenalina, a través de receptoresβ, disminuye la

producción de anticuerpos o la actividad de linfocitos citotóxicos (CTL).


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11

IV. Sistema Inmunológico

El sistema inmune es la defensa natural del cuerpo contra infecciones, como

las bacterias y los virus. Los individuos se encuentran protegidos contra

microorganismos por medio de diferentes mecanismos: la inmun idad Innata ,

que representa la primera línea de defensa contra microorganismos y la

inmunidad adaptat iva que es estimulada tras la exposición a agentes

infecciosos y cuya intensidad y capacidad defensiva aumentan después de la

exposición aún determinado microorganismo pero con características de

especificidad, especialización y la capacidad de recordar y responder con más

fuerza tras exposiciones repetidas al mismo organismo.15,16

En el Cuadro 2 se describen los componentes celulares y humorales de los dos

tipos de respuesta inmune y en el Cuadro 3, se describen algunas

características de estas respuestas.

Cuadro 2. Componentes principales de la inmunidad innata y

adaptativa

Innata Adaptativo

Barreras celulares y

químicas

Piel, epitelios mucosos,

productos químicos

antimicrobianos

Linfocitos presentes en los

epitelios; anticuerpos

segregados en las

superficies epiteliales

Proteínas sanguíneas Complemento, otras Anticuerpos

Células

Fagocitos(macrófagos,

neutrófilos),linfocitos

citolíticos naturales

Linfocitos


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12

Cuadro 3. Características principales de la inmunidad innata y

adaptativa

Innata Adaptativo

Respuesta

Contra patrones

moleculares conservado

(PRRs)

Contra antígenos

microbianos o particulados

EspecificidadLimitada, codificada por la

línea celular

Muy amplia; los receptores

se producen por

recombinación genética

Diversidad Nula Sí

Memoria Sí Sí

V. Anatomía y fisiología de intestino delgado

El intestino es un órgano tubular formado por tres regiones (duodeno, yeyuno e

íleon)13. Histológicamente está compuesto por cuatro capas concéntricas que

constituyen la pared: mucosa, submucosa, muscular y serosa (Figura 2)17. La

función principal del aparato digestivo es permitir que los alimentos ingeridos

puedan ser digeridos y absorbidos para proveer al organismo los nutrientes

necesarios para el mantenimiento general de las funciones corporales, a la vez

que protege frente agentes patógenos (flora bacteriana), esto se consigue

debido a la respuesta integrada por tres sistemas que se encuentran

distribuidos por todo el organismo: él sistema nervioso, sistema inmunitario y

sistema endocrino2.


24/70

13

Figura 2. Características histológicas del intestino delgado.

VI. Sistema inmune de mucosas

El MALT contiene más del 80% de las células inmunes y la respuesta

inmunitaria frente a antígenos orales difiere en algunos aspectos

fundamentales en comparación con la respuesta a antígenos que se

encuentran en otras localizaciones15,16

Las mucosas juegan un papel muy importante en la defensa inmunológica, ya

que un gran número de agentes patógenos entran por estas vías. Las mucosas

cuentan con una cantidad considerable de tejido linfoide asociado a mucosas

denominado (MALT, por sus siglas en ingles, Mucosal Associated Lymphoid

Tissue), en base a su sitio anatómico se divide en: tejido linfoide asociado a

nariz (NALT, por sus siglas en ingles, nasal associated lymphoid tissue), tejido

linfoide asociado a bronquios (BALT, por sus siglas en ingles, bronchiol


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14

associated lymphoid tissue) y tejido linfoide asociado a intestino (GALT, por sus

siglas en ingles, gut associated lymphoid tissue).

El GALT, es el tejido más extenso del organismo. Este se encuentra en

constante renovación, por lo que hay una alta probabilidad de producirse

células tumorales, también es un lugar de entrada de agentes infecciosos y

alérgenos.17

Sit ios ind uctor es y efectores del GALT

En la mucosa gastrointestinal existen sitios para estimular la respuesta inmune,

denominados sitios inductores, y donde se desarrolla la función inmune,

denominados sitios efectores.

Las placas de Peyer (PP) son los sitios inductores reconocidos del GALT. En

el epitelio de las placas existen células especializadas llamadas células M, por

debajo del epitelio se encuentran abundantes células dendríticas (DC), con

capacidad fagocítica, que expresan en su superficie moléculas clase II del

complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-II), que las capacita como células

presentadoras de antígeno (APC). Después de captar los antígenos, los

procesan intracelularmente y migran hacia el interior de las PP para presentar

al antígeno al los linfocitos T (células inductoras de la respuesta inmune) ya

procesados en la molécula MHC-II, para iniciar la respuesta inmune. Una vez


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15

realizada la activación, los linfocitos T y los B (productores de los anticuerpos),

específicos contra el antígeno (Ag), proliferan y abandonan el sitio inductor a

través de la linfa llegando a los ganglios linfáticos regionales (mesentéricos).

De ahí viajan a través del torrente sanguineo y llegan a las otras mucosas del

organismo. Finalmente, la mayoría de esas células llegan a la lamina propia

(LP) intestinal (sitio efector) a través de este mecanismo de recirculación

(Figura 3),18

Figura 3. Modelo de los sitios inductores y sitios efectores en el GALT.


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16

Comp onentes celulares del GALT

En la mucosa del intestino hay una gran cantidad de linfocitos repartidos en

tres regiones (Figura 4):

1. Dentro de la capa epitelial (linfocitos intraepiteliales, LIE)

2. Lamina propia

3. Grupo de placas de Peyer (a lo largo del intestino delgado)

Figura 4 El sistema inmune de la mucosa. A. Esquema de los componentes

celulares del sistema inmune de la mucosa del intestino. B. Microfotografía de

tejido linfático de la mucosa del intestino humano. Similares agregados de

tejido linfoide se encuentran en todo el tracto gastrointestinal y tracto

respiratorio15.


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17

Los LIE corresponden a linfocitos. T, en el hombre gran parte son CD8+, en

ratón el 50% expresan RLTγδ, l las células Tγδ constituyen una porción

minoritaria del total de células T (globalmente menos del 5%), aunque los

porcentajes varían según el tejido y la especie.

En los humanos, las células Tγ δ sólo son aproximadamente entre un 0.5-15%

de las células T de sangre periférica, pero muestran una gran dominancia en el

epitelio intestinal (10% de las células T intestinales) y piel. En el ratón, los

linfocitos intraepiteliales son predominantemente células Tγδ (el 50%).

La lámina propia, contiene una población mixta entre las que cuentan los

linfocitos T CD4+, dotados de fenotipo de células activadas y es probable que

los linfocitos T reconozcan el antígeno en primera instancia a nivel de ganglios

linfáticos mesentéricos de drenaje hacia intestino para poblar la lámina propia.

Posee linfocitos B activados y células plasmáticas así como macrófagos,

células dendríticas, eosinofilos y mastocitos .Además los linfocitos b presentes

en la lamina propia producen IgA15 .

El MALT además de linfocitos contiene tejidos linfáticos organizados: placas de

Peyer de intestino delgado, folículos linfáticos pertenecientes a bazo y ganglios,

los folículos en mucosas forman zonas pobladas de linfocitos que suelen

mostrar centros germinales Las placas de Peyer poseen un número de

linfocitos T CD4+, en la región interfolicular. Existen las células M

caracterizadas por que carecen de microvellosidades permitiendo el paso

antigénico.15,16.


29/70

18

Compon entes hum ora les del GALT

La IgA es la inmunoglobulina que se produce en gran cantidad en estos

tejidos, a nivel de las mucosas existe un contacto íntimo entre organismo y

medio ambiente. La mayoría de los agentes infecciosos llegan al cuerpo a

través de las mucosas, y el moco adherido a la superficie constituye una parte

esencial del sistema inmune mucosa.

En el organismo la IgA constituye más del 80% de todos los anticuerpos

producidos por el MALT. Además, los anticuerpos de IgA no solo están

presentes en las secreciones externas, sino también ejercen propiedades

antimicrobianas a las células epiteliales durante su transporte a través del

epitelio. Representan la clase de inmunoglobulina predominante en las

secreciones externas, cantidad bien definida, que brinda una protección

inmunológica específica para todas las superficies mucosas, al producir un

bloqueo a este nivel ante la penetración al organismo de agentes patógenos.

La IgA es la inmunoglobulina predominante en la saliva y secreciones

intestinales en forma de IgA secretoria, la mayoría se produce como resultado

de una síntesis y no del torrente circulatorio. Entre sus funciones están la de

inhibir la adherencia bacteriana y la neutralización de enzimas, virus y toxinas.

19. Puede unirse de forma específica a moléculas presentes en la superficie

bacteriana mediadora de la unión de esta célula epitelial, y su unión a la

bacteria aumenta la afinidad de este complejo a la mucina, lo cual facilita la


30/70

19

inmovilización del microorganismo a la capa mucosa con la consiguiente

eliminación. Cuando se une a la partícula viral, no solo previene la unión de

esta a la célula huésped mediante el bloqueo de receptores específicos, sino

que este encuentro puede ocurrir dentro de la célula epitelial en el momento del

transporte de IgA (Figura 5) La neutralización de enzimas y toxinas puede

ocurrir por bloqueo del sitio de unión de la toxina con un receptor, o por

modificación conformaciones de este sitio.4.

La cantidad de IgA secretora que produce y transporta hacia las superficies

mucosas cada día, excede los niveles de IgG del suero. La superficie mucosa

en el intestino está cubierta por una capa única de células, entre las que se

encuentran las células absortivas (enterocitos), que son muy numerosas y

cubiertas por mocos y glicocolyx, las Globet cells que sintetizan el moco, las

células de paneth localizadas en el intestino delgado, y que presentan en su

citoplasma gránulos secretorios que contienen lisozimas, IgA, IgE, así como

también células enteroendocrinas, situadas a lo largo del tracto gastrointestinal,

cuya función principal es liberar hormonas al tejido conectivo en respuesta a

cambios en el ambiente exterior.20

Las células M que se encuentran esparcidas por todo el epitelio mucoso y su

función principal de esta célula M es la absorción de partículas desde la luz

gastrointestinal transportándola hacia la región vasolateral rica en linfocitos y

otras células inmunes; además, debido a su bajo contenido en lisozima,

pueden transportar antígenos con una casi nula degradación enzimática. Su


31/70

20

superficie contiene receptores específicos para la región Fc. de la IgA, por lo

que puede fijar y transportar complejos antígenos anticuerpos.

Figura 5. Transporte de la IgA en la mucosa intestinal. La IgA es producida por

el linfocito B en lamina propia y se secreta en forma de dimero y se mantiene

unido mediante una cadena J. La IgA es transportada al lumen por el receptor

de poli-Ig (sintetizado en células epiteliales). El complejo se endocita y es

secretado hacia el lumen por transporte activo mediante vesículas15

La superficie mucosa intestinal está colonizada por una microflora que alcanza

un gran número de células bacterianas en el intestino distal, y más

específicamente en el colon, al mismo tiempo, estas áreas extensas son la

interfase con el ambiente externo, a través del cual la mayoría de los agentes

patógenos inician los procesos infecciosos. Los mecanismos intestinales de

defensa necesitan discernir correctamente entre la micro flora simbiótica y los

patógenos exógenos. Aún no se entiende bien este mecanismo pero


32/70

21

probablemente, tanto la respuesta inmunológica innata como las adaptativa

participen en este proceso.21

Se sugiere un posible papel de las células epiteliales en la presentación de

antígenos. Las células dendríticas situadas en el epitelio de las mucosas que

pueden presentar directamente antígenos hacia las células B, y dirigir sus

cambios de isotipo hacia la IgA e IgA2 con la ayuda de las citoquinas

producidas por las células epiteliales. Las células epiteliales pueden, jugar un

rol mayor en la producción de anticuerpos IgA de las mucosas, los cuales son

esenciales para la defensa contra microorganismos22

Los linfocitos indican que las células inmunológicamente activas son

transportadas hacia secreciones de superficie, y que hay una mayoría

sustancial desde la amígdala nasofaríngea de células inmunológicamente

activas, hacia las secreciones de superficie.

En el epitelio de las vías respiratorias como en aparato gastrointestinal se

produce IL-2, IL-6, IL-10 y TGFβ, factores esenciales para la proliferación clonal

de las células B. La estrecha proximidad de las células B al epitelio de las vías

respiratorias, probablemente garantiza un aporte constante de factores de

crecimiento y diferenciación necesarios para la producción de IgA mucosa.

Además, las células epiteliales producen una glicoproteína, llamada

componente secretor, que no solo confiere creciente estabilidad a la IgA, sino

que es cuantitativamente el receptor más importante del sistema inmunológico


33/70

22

de las mucosas, al ser responsable del transporte externo de polímeros de IgA

e IgM producidos localmente.


34/70

23

Planteamiento del Problema

El problema que se pretende estudiar es el siguiente: ¿Si el estrés agudo por

inmovilización modifica la producción basal de IgA en el intestino delgado de

ratón Balb/C? Esta pregunta, es relevante por las razones que a continuación

se exponen.

Primero , la mucosa intestinal es sitio de entrada de alérgenos y

microorganismos, potencialmente patógenos por lo tanto es importante

establecer cuáles son los efectos del estrés sobre las respuestas inmunitarias

humorales y celulares en este lugar.

Segundo , La inmunoglobulina A secretora (IgAs) desempeña una función

crucial en la defensa del organismo a nivel de mucosa. La secreción de esta

inmunoglobulina esta bajo control de nervios entéricos con fibras colinérgicas y

adrenérgicas. Esta inervación se encuentra afectada durante estés agudo

dando como respuesta la estimulación la secreción de IgAs 22

. Satoshi

Tsujita,1998 demostró que los niveles de IgAs se ven afectados por el estrés.

Sin embargo, a nivel de mucosa intestinal no hay nada escrito. Por otra parte

Jarillo luna, 2007, demostró que durante el estrés crónico afecta el porcentaje

de linfocitos intra epiteliales.


35/70

24

Tercero, Las placas de Peyer juegan un papel importante en el abastecimiento

de células responsables de la inmunidad humoral local lo que sugieren un

camino diferencial para los precursores de IgA y su destino cuando el antígeno

puede causar la expansión de una población de células específicas,23

De aquí la importancia de saber si el estrés agudo es capaz de modificar las

poblaciones linfoides tanto de los sitios inductores (placas de Peyer) como en

los efectores (lámina propia), del tejido linfoide asociado a mucosa intestinal

(GALT)

.

Así también el resaltar la importancia y la diferencia humoral y celular entre los

segmentos proximales y distal del intestino delgado.


36/70

25

Justificación

Numerosos estudios han demostrado la asociación entre el estrés y el sistema

inmune en el desarrollo de enfermedades alérgicas, inflamatorias, infecciosas y

autoinmunes, sin embargo poco se sabe sobre el efecto del estrés agudo sobre

el sistema inmune humoral y celular a nivel de mucosa intestinal, lo cual marca

una gran necesidad de estudiar estas respuestas biológicas para lograr

entender los mecanismos fisiopatológicos a través de los cuales se desarrollan

estas enfermedades y proponer nuevas estrategias preventivas y terapéuticas

Aún no se ha logrado demostrar la importancia del estrés agudo sobre la

producción de IgA y la modificación de las poblaciones linfoides en este sitio

anatómico así mismo se desconoce si existe alguna diferencia estructural sobre

el sistema inmune entre el segmento proximal y distal del intestino delgado.


37/70

26

Objetivo General

Determinar si el estrés agudo inducido por inmovilización es capaz de modificar

el porcentaje de linfocitos T y células B, así como la secreción de IgA en tejido

linfoide asociado al intestino de ratones Balb/c.

Objetivos Particulares

1. Determinar si el estrés agudo por inmovilización modifica los niveles de IgA

en el líquido intestinal del segmento proximal y del distal del intestino

delgado.

2. Determinar si el estrés agudo por inmovilización modifica las poblaciones de

linfocitos B, linfocitos T cooperadores (CD4) y linfocitos T citotoxicos (CD8)

en las placas de Peyer del segmento proximal y distal del intestino delgado.

3. Determinar si existen diferencias entre los segmentos proximal y distal del

intestino delgado, sobre la producción de IgA y en los porcentajes de

linfocitos T y B.


38/70

27

Hipótesis

El estrés agudo inducido por inmovilización es capaz de modificar la

producción basal de IgA en líquido intestinal y de las poblaciones linfoides en

GALT del segmento proximal y distal de intestino delgado en ratones Balb/c,

debido a la secreción elevada de glucocorticoides los cuales tienen efectos

sobre la liberación de citocinas responsables de la proliferación de los linfocitos

y el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas.


39/70

28

Material y Métodos

I. Grupos muéstrales

Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c de 8 -10 semanas de edad, de

20-25 g de peso, proporcionados por el bioterio de la Escuela Superior de

Medicina (ESM), del Instituto Politécnico Nacional.

Los Animales fueron mantenidos a una temperatura entre 20 y 25 °C, con una

humedad entre el 40 y 70%, con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, bajo

condiciones libres de patógenos y alimentados con Lab Diet 503 de PMI

International. Los ratones fueron divididos en 2 grupos de 5 ratones cada uno,

de la siguiente manera:

Grupo l (con trol) : Este grupo corresponde a los ratones control, los cuales se

mantuvieron bajo restricción de agua y alimento durante un periodo de 4 horas

correspondiente al periodo de estrés al cual fue sometido el grupo problema.

Grupo l l (estresados): Estos ratones fueron sometidos a un periodo de estrés

agudo por inmovilización, durante 4 horas continuas. El modelo de estrés

consistió en sujetar las cuatro extremidades de los animales, a una placa de

acrílico de 15 x 25 cm, lo cual impidió su movilización tanto horizontal como

longitudinalmente.


40/70

29

II. Obtención de material biológico

Al concluir el periodo de estrés, ambos grupos de ratones fueron sacrificados

en una cámara de éter. Los líquidos biológicos y los tejidos fueron obtenidos

en condiciones frías (en hielo), de la siguiente manera:

Suero: Para obtener el suero se realizó una punción intracardiaca, obteniendo

1 ml de sangre aproximadamente, por cada ratón. La sangre se centrifugó

inmediatamente a 4000 rpm, por 10 min a 8 °C. Se separó el suero y se

almacenó a -70 °C hasta el momento de su análisis.

Bazo: Este órgano se obtuvo realizando una incisión a nivel de la línea media

en el abdomen de cada animal. Posteriormente fue disgregado y lavado con

medio de cultivo RPMI-1640 y ajustado a 1x106 células/muestra para su tinción

fenotípica y análisis citofluorométrico.

Intest ino delgado: Con el animal en decúbito dorsal sobre una cama de

disección de 15x25cm, se hace una incisión media de apéndice xifoides hasta

región pélvica exponiendo las vísceras, se localiza el estomago tomándolo

como base para la disección del intestino delgado 3 mm por debajo del píloro

hasta 3 mm por arriba del ciego y se divide en porción proximal y distal

respectivamente.


41/70

30

Liqu ido Intest inal : Obtenida la porción proximal y distal de cada muestra y

colocadas en cajas de petri estériles y en medio de cultivo RPMI-1640, se

realizo un lavado con 3 ml de RPMI-1640, utilizando una cánula estéril. Se

adicionó 200 μl de un inhibidor de proteasas, a cada muestra y se centrifugaron

a 1500 rpm, por 10 min, a 4 °C. Se separó el sobrenadante y se almacenaron a

-70 °C hasta el día de su análisis.

Placas de Peyer: Las placas de Peyer fueron removidas de cada segmento

del intestino y colocadas en RPMI-1640, posteriormente fueron disgregadas en

una malla metálica y por ultimo fueron lavadas con PBS 1x y ajustadas a 1x10 6

células/muestra para su tinción y análisis citofluorométrico.

Lamin a propia de intest ino delgado (proxim al y distal): Se evirtieron los

intestinos de cada grupo y se incubaron en colagenasa a 37°C, por 30 min, en

agitación continua (200 rpm). Posteriormente se disgregaron y se filtraron con

una malla de organza. El filtrado se centrifugó a 1500 rpm, por 10 min a 4 °C.

El botón celular fue lavado dos veces con RPMI-1640. Para separar las células

mononucleares, se utilizó un gradiente de percoll.. El gradiente se realizó de la

siguiente manera: el botón celular se resuspendió en una solución de percoll al

40% y fue depositada sobre las paredes de un tubo falcón el cual contenía una

solución de percoll al 70%. Una vez hecho el gradiente, y sin mezclar las fases,

las muestras fueron centrifugadas a 2500 rpm, durante 30 min, a 8 °C,

utilizando una aceleración y desaceleración de cero. El anillo correspondiente a

las células mononucleares fue separado utilizando una pipeta Pasteur y lavado


42/70

31

dos veces con RPMI-1640. Las células fueron ajustadas a 1x106

células/muestra para su tinción fenotípica y análisis citofluorométrico.

III. Determinación de corticosterona

Los niveles de corticosterona fueron determinados en suero por inmunoensayo

enzimático (EIA, por sus siglas en ingles enzyme immunoassay ) utilizando un

kit de la marca Stressgen (catalogo 901-097 480), con base a las instrucciones

del fabricante. La lectura de placa se llevó a cabo en un lector de ELISA (BIO-

RAD), a una longitud de onda de 405 nm. Se realizó una curva estándar para

conocer la concentración de corticosterona en ng/ml.

IV. Determinación de los niveles de IgA

La concentración de IgA fue determinada en suero y lavados intestinales por

medio de la técnica de ELISA.

Se utilizó una placa de ELISA de 96 pozos, la cual se recubrió con un primer

anticuerpo de conejo anti-IgA de mieloma de ratón. Posteriormente se bloqueo

la placa con leche Svelty al 6%, disuelta en PBS 1x y se incubó con los sueros

y los lavados intestinales. Para el suero se utilizó una dilución de 1:1000 y para

los líquidos intestinales, una dilución de 1:2. Después se agregó un segundo

anticuerpo de chivo anti-IgA de ratón peroxidado, a una dilución de 1:1000. Por

último se reveló con un regulador de citrato-fosfatos. La reacción fue detenida


43/70

32

con una solución de H2SO4, a una concentración de 2.5 M. La placa se leyó en

un lector de ELISA de la marca BIO-RAD, a una longitud de onda de 492 nm.

V. Determinación de población linfoides

Los porcentajes de linfocitos T y B fueron determinados en bazo, placas de

Peyer y lámina propia de los segmentos proximal y distal del intestino delgado,

por citometría de flujo.

Los linfocitos T cooperadores fueron marcados con un anticuerpo (Ac) anti-

CD4/FITC (BD Biobienses), los linfocitos T citotóxicos, con un Ac anti-CD8/PE

(Caltag) y los linfocitos B, con la combinación de los Ac´s anti-CD19/-APC (BD

Biobienses) y anti-B220/PerCP (BD Biobienses). Las células CD19+/B220+

involucran a las células pro B, Pre B, B inmaduras y B naive.

Una vez teñidas las células, fueron fijadas en una solución de para-

formaldehido/PBS al 2% y adquiridas en un citómetro FASC Calibur, Becton

Dickinson, utilizando el software Cell Queso-Pro, versión 4.0. Se adquirieron

10,000 eventos de la región de linfocitos delimitada en el histograma de puntos

de tamaño (FSC) contra granularidad (SSC). Los archivos fueron analizados

utilizando el software Summit V 4.0. Los datos representan el porcentaje de

células positivas tomadas de la región de linfocitos totales.


44/70

33

VI. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico Sigma-Stat,

versión 11.0

En todos los casos se compararon las medias de los resultados obtenidos entre

el grupo control y el grupo de estrés (t de student). También se compararon las

medias de los resultados obtenidos de los porcentajes de cada población

linfoide y los niveles de IgA en lavados intestinales entre el segmento proximal

y el segmento distal de cada grupo (andova). La significancia estadística se

consideró cuando el valor de p fue ≤ 0.05.

Para la tinción fenotípica, se hizo un concentrado de los órganos de estudio de

los 5 ratones que conformaban cada grupo y se realizaron tres experimentos

independientes entre sí.


45/70

34

VII. Resultados

VIII. Niveles de corticosterona en suero

Los niveles de corticosterona sérica fueron determinados tanto en el grupo

control con el grupo de estrés, por la técnica de EIA, con la finalidad de

corroborar que el tipo de estrés al cual fueron sometidos los animales, es capaz

de estimular el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA).

En la Figura 6 muestra la media ± D.S. de las concentraciones de

corticosterona en suero de ambos grupos de ratones. En esta figura se pueda

observar un aumento significativo (p


46/70

35

IX. Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA en suero

Los niveles de IgA fueron determinados en suero por la técnica de ELISA, con

la finalidad de observar si el estrés agudo inducido por inmovilización, tiene

algún efecto sobre los niveles de IgA a nivel sistémico (sangre).

En la Figura 7 se puede observar que este tipo de estrés aumentó los niveles

de IgA en suero en comparación con el grupo control (*p=0.001).

Suero

D e n s i d a d O p t i c a ( 4 9 2 n m )

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Figura 7. Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA suero. En esta figura

se muestra la media ± D.S. de la densidad óptica del triplicado de tres

experimentos independientes entre sí. *p=0.001; t de student.

**


47/70

36

X. Efecto del estrés agudo inducido por inmovilización sobre los

niveles de de IgA en lavados intestinales

Los niveles de IgA en lavados intestinales del segmento proximal y distal de

cada grupo de ratones (estrés y control), fueron determinados por la técnica de

ELISA.

En ambos segmentos intestinales se observó un incremento significativo en los

niveles de IgA en comparación con los ratones del grupo control (p


48/70

37

Proximal

D e n s i d

a d o p t i c a ( 4 9 2 n m )

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Distal

Figura 8. Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA en lavados

intestinales de los segmentos proximal y distal, del intestino delgado. En esta

figura se muestra la media ± D.S. de la densidad óptica del triplicado de tres

experimentos independientes entre sí. *p


49/70

38

En la Figura 9 se muestran los resultados obtenidos entre el grupo de estrés y

el control, donde se observa que el estrés es capaz de aumentar

significativamente el porcentaje de linfocitos T citotóxicos (CD8+), en este

órgano (p


50/70

39

XII. Efecto de estrés sobre el porcentaje de linfocitos T y B en placas

de Peyer del segmento proximal del intestino delgado

El efecto del estrés sobre las poblaciones de linfocitos T y B en las placas de

Peyer del segmento proximal del intestino delgado (Figura 10), solo modificó, al

igual que en bazo, el porcentaje de linfocitos T citotóxicos, observándose un

aumento significativo de esta población (4.59±1.36% de células T CD8+) en

comparación con el grupo control (3.37±0.36 % de células T CD8+; p


51/70

40

CD4

C é l u

l a s P o s i t i v a s ( % )

0

20

40

60

80

CD8 CD19 CD19/B220

Figura 10. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el porcentaje de

linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento proximal del intestino delgado.

Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T

citotóxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometría de

flujo. *p


52/70

41

CD4

C é l u l a s P o s i t i v a s ( % )

0

20

40

60

80

CD8 CD19 CD19/B220


linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento distal del intestino delgado.


citotóxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometría de

flujo.

XIV. Efecto de estrés agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en

lámina propia del segmento proximal del intestino delgado

El estrés agudo inducido por inmovilización no modificó los porcentajes de

linfocitos T cooperadores ni citotóxicos pero aumentó significativamente los

porcentajes de linfocitos B (64.71±8.34% de células CD19+/B220+) en


53/70

42

comparación con el grupo control (24.35±1.33%), en la lámina propia del

segmento proximal del intestino delgado (Figura 12).

CD4

C é l u l a s P o s i t i v a s ( %

)

0

20

40

60

80

CD8 CD19 CD19/B220


linfocitos T y B en la lámina propia del segmento proximal del intestino delgado.


citotóxicos (CD8+), los linfocitos B totales (CD19+ y CD19+/B220+), por

citometría de flujo. *p


54/70

43

XV. Efectos de estrés sobre el porcentaje de linfocitos T y B en

lámina propia del segmento distal intestino delgado

El estrés agudo inducido por inmovilización, modificó los porcentajes de

linfocitos T y B, en la lámina propia del segmento distal del intestino delgado

(Figura 13). Las poblaciones que se vieron modificadas fueron los linfocitos T

cooperadores (células CD4+) los cuales disminuyeron del 43.36±2.81% en el

grupo control a 33.72±1.97% en el grupo de estrés. Las células B por el

contrario aumentaron significativamente en el grupo de estrés (52.17±3.71% de

células CD19+ versus 40.07±3.21% en el grupo control; y 49.96±2.0% de

células CD19+/B220+ versus 12.55±10.7% en el grupo control). Los

porcentajes de linfocitos T citotóxicos (CD8+), no se vieron modificados por el

estrés en este sitio.

XVI. Comparación de las poblaciones linfoides de las placas de

Peyer entre el segmento proximal y distal del intestino delgado

Al comparar los porcentajes de linfocitos T y B, entre las placas de Peyer del

segmento proximal y distal (anova de dos-vías), los linfocitos T cooperadores

(CD4+) se encuentran estadísticamente más altos en el segmento proximal

(*p=0.025). Con respecto a la población de linfocitos T citotóxicos (p=0.771) y

linfocitos B (p=0.237), no se observó ninguna diferencia estadística, entre

ambos grupos (control y estrés).


55/70

44

CD4

C é l u

l a s P o s i t i v a s ( % )

0

20

40

60

80

CD8 CD19 CD19/B220


linfocitos T y B en la lámina propia del segmento distal del intestino delgado. Se

determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T citotóxicos

(CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometría de flujo.

*p


56/70

45

grupos (control y estrés). Sin embrago, al hacer una comparación entre

segmentos por grupo (anova de una-vía), se observó que el porcentaje de

linfocitos T CD8+ fue estadísticamente mayor (*p=0.0101) en el segmento

distal del grupo control. Sin embargo esta diferencia se pierde cuando los

ratones son sometidos a un periodo de estrés agudo (p=0.9595). Además en

este último grupo se observa una diferencia estadística entre los porcentajes de

linfocitos B (CD19+/B220+) entre el segmento proximal y distal (p=0.0138*),

siendo más alto el porcentaje en el último segmento.


57/70

46

Discusión

Las respuestas fisiológicas inducidas por el estrés involucran al eje hipotálamo-

hipófisis-adrenal y el sistema nervioso autónomo y son mediadas, en parte, por

la liberación de glucocorticoides y catecolaminas, respectivamente24,25. Otras

interacciones involucran el contacto directo de terminaciones nerviosas con

linfocitos en órganos linfoides26

El sistema neuroendrocrino influye en las respuestas inmunitarias, sobre todo

en el sistema inmunitario de las mucosas27,28,en particular el sistema

inmunitario del intestino. El aparato digestivo está controlado por un sistema

nervioso integrador e independiente con una cantidad de neuronas semejante a

de la medula espinal. Este sistema se considera como una tercera división del

sistema nervioso autónomo y se denomina sistema nervioso entérico. Los

nervios extrínsecos conectan al sistema nervioso entérico (ENS) con el SNC al

través de las vías simpática y parasimpática. Por otro lado, el aparato digestivo

contiene un sistema inmunitario formado por un número igual de células a las

existentes en el resto del cuerpo 32,29,30. La comunicación directa bidireccional

entre el sistema inmunitario y sistema neuroendocrino dentro del intestino esta

mediada en gran parte, por neurotransmisores (noradrenalina, acetilcolina),

neuropéptidos (sustancia P, somatostatina, VIP, etc.) y receptores que son

comunes en ambos sistemas 31,32,33


58/70

47

El estudio de la regulación neuroendocrina de la inmunidad de mucosas se ha

basado principalmente en la determinación de la secreción de IgA en

saliva34,35, en la síntesis y secreción del componente secretor de las glándulas

lagrimales 36,37 y en la regulación de la síntesis del componente secretor en el

aparato reproductor femenino38,39. Otros hallazgos importantes son el

incremento en la secreción de S-IgA después de la administración de

colecistocinina y pilocarpina40,41; el incremento en la secreción de varios

neuropéptidos, como son sustancia P, neurocinina A y péptido vasoactivo

intestinal después de la estimulación eléctrica de nervios extrínsecos del

intestino42,43; y el incremento en la secreción de IgA en ileon después de la

administración de somatostatina y su inhibición con la noradrenalina44

Los efectos del estrés sobre las respuestas inmunitarias en mucosas se han

estudiado casi exclusivamente sobre las enfermedades inflamatorias del

intestino, y en la secreción de la IgA en saliva. La abundante información

existente confirma que el estrés psicológico desempeña un papel fundamental

en la fisiopatología y presentación clínica de la enfermedad inflamatoria del

intestino45,46. Además, estudios en animales, confirman que el estrés

contribuye a la patogénesis de esa enfermedad51. Por otro lado, diversos

estudios han analizado la relación entre los niveles de IgA secretoria (S-IgA) en

saliva y diferentes circunstancias de estrés, tales como ejercicio, estados de

humor, y exámenes académicos; sin embargo, los resultados han sido

contradictorios. En unos se encuentra que el estrés psicológico y físico reduce

los niveles de IgA presente en la saliva de individuos humanos, por el contrario,

en otros se encontró que los niveles de IgA aumenta como consecuencia del


59/70


60/70

49

Otro de los efectos del estrés agudo observado por Ramal et al, ha sido una

disminución en los niveles de IgA en suero inducido por un periodo excesivo de

ansiedad54; Laidlaw et al, no observó cambios en el mismo tipo de estrés55. Sin

embargo Rehenbinder et al, demostraron que los niveles disminuyen en sangre

y aumentan en heces fecales56. En otro modelo también se ha demostrado que

el estrés agudo produce un incremento en las concentraciones de IgA en

saliva57. Por otra parte, Jarillo et al, demostraron que el estrés crónico redujo la

concentración de IgA en líquido intestinal. Estas observaciones nos permiten

confirmar que la respuesta a nivel inmunológico depende tanto del tipo de

estrés como de la duración del mismo (agudo y crónico). En este modelo de

estrés agudo inducido por inmovilización observamos que los niveles de IgA

aumentaron tanto en suero como en líquido intestinal de ambos segmentos y

que la respuesta al estrés en el segmento proximal fue significativamente

mayor en comparación con el segmento distal del intestino tanto en el grupo

control como en el de estrés (Figura 8). El aumento en las concentraciones en

suero correlacionan con lo observado por Karacabey et al , en mujeres

sometidas a un periodo de estrés inducido por ejercicio58

.

Con respecto a las poblaciones de linfocitos T (CD4+ y CD8+) y linfocitos B

(CD19, CD19+/B220+), en un modelo de estrés inducido por inmovilización, no

se observaron modificaciones en bazo ni timo. Sin embargo, el estrés

disminuyó el porcentaje total de linfocitos, en hígado59. Rammal H, observó que

hubo una disminución en el porcentaje de estas poblaciones en sangre, tras un

periodo de ansiedad excesivo auque en otros estudios se ha demostrado que

durante el estrés agudo existe una movilización de linfocitos a la circulación


61/70

50

como un mecanismo de defensa del organismo ante esta situación, siendo los

linfocitos T CD8+, Tγδ, y células NK, las más afectadas60. Otra hipótesis sobre

la modificación de los porcentajes de linfocitos en la circulación y en otros

órganos, ha sido la inducción de apoptosis en estas células debido al aumento

en las concentraciones de corticosterona61

. Sin embargo la redistribución de

los linfocitos o la muerte de estos no han sido totalmente demostradas. A nivel

de GALT solo se encuentra el trabajo de Jarillo et al , donde observaron una

disminución en el porcentaje de linfocitos intraepiteliales en intestino delgado,

en ratones sometidos a estrés crónico. En el presente trabajo se realizo un

análisis del porcentaje de linfocitos T y B en diferentes regiones del GALT y

bazo. Los resultados mostraron que a nivel de sitios efectores como la lámina

propia, hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos B. Este incremento

pudiera deberse a una activación policlonal o a una redistribución de las

células, sin embargo nuestros estudios no nos permiten dar una explicación a

este fenómeno.

A nivel de sitios inductores se pudo observar un aumento en el porcentaje de

linfocitos T citotóxicos (placas de peyer del segmento proximal y bazo). Los

linfocitos T cooperadores solo se vieron modificados en las placas de peyer del

segmento distal del intestino delgado.

Una situación sobresaliente sobre la distribución y la respuesta ante el estrés

entre los segmentos intestinales es el hecho de que en las placas de Peyer del

segmento proximal aumentan los linfocitos T CD8+ y que en el segmento distal


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disminuyen y aumentan los linfocitos T CD4+. Las diferencias sobre el

porcentaje de linfocitos T y B entre los segmentos proximal y distal del intestino

delgado se deben probablemente a que en el segmento distal, la flora intestinal

es más abundante. Esto demanda a que haya una mejor regulación y

tolerancia del sistema inmunológico.


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Perspectivas

1. Correlacionar los niveles de IgA en líquidos intestinales con el porcentaje

de linfocitos B y células productoras de anticuerpos localizadas en tanto

en los sitios inductores (placas de Peyer) y sitos efectores (lámina

propia) de los segmentos proximal y distal del intestino delgado de

ratones control y estresados.

2. Conocer si el estrés agudo modifica la expresión de citocinas (TGF-β,

IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6) involucradas en el cambio de isotipo para IgA en

células productoras de anticuerpos (lgA+)en el segmento proximal y

distal de intestino delgado en sus sitios inductores (placas de Peyer) y

sitios efectores (lamina propia).

3. Medir el componente secretor del segmento proximal y distal del

intestino delgado para relacionarlo con los niveles de IgA así como de la

cuantificación de IL.


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Efecto Del Estres Agudo