Pirogênios Em Injetáveis PDF (1)

7/23/2019 Pirognios Em Injetveis PDF (1)

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Prof. Marcos R. dos Santos

CENTRO UNIVERSITRIO FRANCISCANO UNIFRACURSO DE FARMCIA

CONTROLE BIOLGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS

So substncias que, quando injetadas em pacientes causam

elevao da temperatura corporal (pirexia ou febre), podendo

ser:

EXGENOS: Se originam fora do corpo e induzem elevao

trmica quando injetados em animais e no homem.

Exemplos: Origem bacteriana (e seus componentes Gram (+) eGram(-), fungos, vrus e no-microbiana (alguns frmacos,esterides, fraes do plasma).

ENDGENOS: produzido internamente pelo hospedeiro em

resposta ao pirognio exgeno (considerado o mediador

primrio da febre).

Exemplos: diferentes substncias sintetizadas por diferentes clulasdo hospedeiro.

Constituem uma classe de PIROGNIO, so complexos de alto peso

molecular associados membrana externa de bactrias Gram(-)

negativas e representam a mais significativa fonte de contaminantes

pirognicos de produtos estreis para a indstria farmacutica.

Quando purificadas so denominadas de lipopolissacardeos (LPS) para

enfatizar a sua natureza qumica, quando no purificadas podem conter

lpides, carboidratos e protenas.

IMPORTANTE: So termoestveis, porm inativadas por cic los decalor seco, condies alcalinas ou cidas, capazes de provocar

profundas alteraes fisiolgicas quando administradas via parenteral.

Devido a estas propriedades, fica evidente a necessidade de sua

deteco e eliminao por parte de fabricantes de produtos parenterais.


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A estrutura qumica das endotoxinas consiste de um

polissacardio, ou longas cadeias de acares, e uma gordura, lipdio A. O

polissacardio, que varia de uma espcie bacteriana para outra,

composto da cadeia 0-especfica (construda por unidades que se

repetem, de trs a oito acares) e os ncleos interno e externo. O lipdio

A contm duas glicosaminas modificadas por fosfato (PO4) e nmerovarivel de cidos graxos.

Quimicamente as ENDOTOXINAS soLIPOPOLISSACARDIOS LPS

POLISSACARDIO LIPDIO APOLISSACARDIO LIPDIO A

(Carter hidroflico aumenta a potncia) (Funo principal naendotoxicidade)

-

CADEIA LATERALO ESPECFICA

NCLEO

OLIGOSSACARDIO

UNIDADELIPDICA


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PRODUO DE MEDIADORES POR ESTIMULAO DOMACRFAGOS POR ENDOTOXINAS

LIPOPOLISSACARDIO(LPS)

Protena de ligao-lipopolissacardica

(PLL)

MAC

N

Mediadores dafebre

Mensagemestimulatria

Receptor CD14 paracomplexo LPS-PLL

Lipopolissacardio (LPS) (laranja), liga-se protena de ligao-lipopolissacardica (PLL) (verde) no sangue. Ento o complexo ativareceptor conhecido como CD14, estimulando os macrfagos aproduzirem mediadores (esferas vermelhas).

Muitas atividades biolgicas so atribudas unidade lipdeo A daendotoxina, a exemplo:

- pirogenicidade;

- toxicidade letal;

- leucopenia seguida de leucocitose;

- necrose da medula ssea;

- queda da presso sangunea;

- agregao plaquetria.

- outros fatores.

Os limites mximos de endotoxinas (K) em produtos farmacuticos,

atualmente considerados aceitveis pelo FDA, USP, Farmacopia Europia

e WHO so:

NVEIS DE CONTAMINANTES PIROGNICOS EMPRODUTOS FARMACUTICOS

Classe de produto Rota deadministrao

Limite mximo de endotoxina(K)(Unidades de Endotoxina

EU)

Pessoa Kg

Parenterais Intratecal 14 0,2

Radiofrmacos Intravenosa 175 2,5

Parenterais (exceto

radiofrmacos)

Parenterais (exceto

intratecais)350 5,0

PodePode serser realizadarealizada dede duasduas formasformas::

-- InativaoInativao

-- RemooRemoo dede endotoxinasendotoxinas

HidrliseHidrlise cidocido--BaseBase reduzreduz ouou eliminaelimina aa atividadeatividade biolgicabiolgica dedelipopolissacardeos,lipopolissacardeos, pelapela desativaodesativao dodo lipdeolipdeo AA.. ExEx:: HClHCl (( 3030 minmin aa 100100C)C)

OxidaoOxidao PossivelmentePossivelmente atravsatravs dada oxidaooxidao dosdos cidoscidos graxosgraxos presentespresentesnono lipdeoslipdeosAA dodo LPSLPS.. ExEx:: HH22OO22..

AlquilaoAlquilao PromovePromove aa reduoreduo dada atividadeatividade viavia substituiosubstituio nucleoflicanucleoflica nanaligaoligao glucosaminaglucosaminadodo lipdeolipdeoAA.. ExEx:: xidoxido dede etilenoetileno..


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TratamentoTratamento porpor calorcalor secoseco estufasestufas ee tneistneis dede conveco,conveco, conduoconduo ououirradiaoirradiao (infravermelho),(infravermelho), parapara materiaismateriais termorresistentestermorresistentes.. ExEx:: (( 250250 CC 3030min)min)..

RadiaoRadiao ionizanteionizante UsoUso dede 6060CoCo parapara aa reduoreduo dada toxicidadetoxicidade dedeendotoxinasendotoxinas bacterianasbacterianas.. ComCom esteeste processo,processo, aumentaaumenta aa possibilidadepossibilidade dede

alteraesalteraesqumicasqumicas desconhecidasdesconhecidas emem frmacosfrmacos ee soluessolues parenteraisparenterais..

PolimixinaPolimixina BB AntibiticoAntibitico catinicocatinico queque podepode anularanular aa atividadeatividade biolgicabiolgica dodoLPSLPS..

LavagemLavagem UtilizandoUtilizando solventessolventes estreisestreis ee apirognicosapirognicos..

DestilaoDestilao AA guagua recentementerecentemente destilada,destilada, coletadacoletada ee mantidamantida emem frascosfrascosestreisestreis ee apirognicosapirognicos..

UltrafiltraoUltrafiltrao UsoUso dede membranasmembranas comcom capacidadecapacidade dede retenoreteno dede molculasmolculas

comcom tamanhotamanho dede 100100..000000 daltonsdaltons ouou maioresmaiores..

OutrosOutros mtodosmtodos::Osmose reversa, carvo ativo, atrao eletrosttica, atraopor membranas hidrfoba..

Deve-se ressaltar a importncia em trabalhar todo o processoprodutivo em condies adequadas de higiene, dos operadores eambiente, alm de empregar matrias-primas com baixas cargas

microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado.

Em resumo, aplicar todos os conceitos deBPF, de forma que oproduto seja obtido apirognico no primeiro processamento,dispensando preocupaes quanto processos ou tratamentosadicionais.

1 Teste da hipertermia em coelhos

2 Mtodo do lisado de amebcitos do Limulus(LAL)

- gelificao- turbidimtrico- cromognico

3 Ensaio da cultura da linhagem de clulasEx.: Clulas Mono Mac-6


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Teste da hipertermia em coelhos (5.5.2.1 PIROGNIOS)5.5.2.1 PIROGNIOS)Pg: 226 Farmacopia 5edio

O teste Oficial de Pirognios em coelhos foi descrito

inicialmente na USP XII em 1942:

Fundamenta-se na medida do aumento da temperatura

corporal dos coelhos, aps injeo intravenosa de dose-limite

de 10 ml por Kg de peso, durante perodo no superior a 10

minutos, de soluo estril da substncia ativa ou produto

farmacutico sob anlise.

Seleo dos animais:

- coelhos adultos e sadios;

- preferencialmente da mesma raa;

- pesando no mnimo 1,5 kg;

- mantidos em gaiolas individuais, livre de perturbaes e sobtemperatura controlada (20C 2C);

- a reutilizao de animais s pode ser feita aps 48 horas de

descanso, desde que o resultado no tenha sido positivo. Neste caso, ser

necessrio um perodo de 2 semanas de intervalo.

Registro de temperatura:

- Utilizar termmetro clnico de preciso, graduado em 0,1 C,

com tempo de elevao mxima previamente determinado ou qualquer

outro dispositivo de registro de temperatura de igual sensibilidade.

- Introduzir no reto do animal profundidade aproximada de 6

centmetros.

- Se for utilizado registrador, que deva permanecer no reto

durante o perodo de teste, conter os coelhos de maneira que fiquem em

postura natural de repouso.


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Adaptao dos animais:

Uma semana antes e at o dia anterior ao ensaio realizar testesde adaptao simulando as condies do dia do teste:

- acomodar o animais nas caixas de conteno e empregaro termmetro

- injetar soluo fisiolgica estril (10 mL/kg) simulando aamostra

- acompanhar e anotar as variaes de temperatura.Valores acima de 0,3C entre as leituras podem indicarpossibilidade de falso-positivo

- suprimir a alimentao na noite anterior ao ensaio edurante sua realizao

Preparao da amostra:

- todos os utenslios utilizados para a

diluio/preparao da amostra devem ser apirognicos:

vidraria: 200 C 1 h ou 250 C 30 min.

soluo fisiolgica: 121C 15 min. x 3 ciclos

- realizar a diluio no dia do teste

- dose: 0,5 a 10 mL/kg de soluo na concentrao

especificada na monografia do produto

- aquecer a soluo 37 38C antes de injetar

Procedimento do ensaio:

- Utilizar 3 animais para cada amostra.

- No mnimo 40 minutos antes do ensaio determinar atemperatura controle (inicial) de cada animal mediante duas

leituras feitas com intervalos de 20 minutos. A mdia dastemperaturas considerada como o valor de T C controle doanimal, que a base para a determinao de qualquer aumentode temperatura resultante da injeo da soluo teste durante oensaio.

- No devem ser usados os animais que apresentaremdesvio maior do que + 0,2 C, nas duas leituras da temperaturacontrole.

Procedimento do ensaio:

- A disperso da T C controle entre os animais de cadagrupo no deve ser superior a 1,0 C

- No usar animais com temperatura superior a 39,8 C.

- Injetar pela veia marginal da orelha de trs coelhos aquantidade indicada na monografia. A injeo no deve durarmais de 10 minutos, a menos que na monografia se especifiquetempo diferente.

- Registrar a temperatura nos tempos de 1:00, 2:00 e3:00 horas aps a injeo


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Interpretao dos resultados:

Se nenhum coelho apresentar um aumento individual detemperatura igual ou superior 0,5C, em relao t emperaturacontrole e a soma dos aumentos dos trs no exceder a 1,4C, oproduto cumpre com os requisitos do teste de pirognios.

Se algum dos coelhos apresentar um aumento igual ou

superior a 0,5C, repete-se o teste com outros 5 co elhos. Nestecaso, se no mais que 3 coelhos apresentarem aumentosindividuais de 0,5 C ou, se a soma dos 8 aumentos individuais detemperatura no exceder a 3,3C, o produto em exame cumprecom os requisitos do teste de pirognios.

DESVANTAGENS

- Baixa sensibilidade

- Custo elevado

- Interferncias na resposta

- Uso de animais

- Qualitativo VANTAGENS

- Reproduz resposta

fisiopatolgica

- Detecta pirognios

Nestes casos a especificidade da resposta est intimamenterelacionada com endotoxinas, excluindo outras substnciastermognicas.

Teste de toxicidade de pirognio bacteriano em embrio degalinha. Resposta txica em camundongos. Reduo de ferro em ratos.

httphttp:://www//www..acciusaacciusa..com/lal/product/LALcom/lal/product/LAL%%2020Reagents/indexReagents/index..htmlhtml


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((55..55..22..22)) FarmacopiaFarmacopia BrasileiraBrasileira 55pgpg:: 227227

MTODO DO LISADO DE AMEBCITOS DO LIMULUS- LAL -

Princpio:

O teste deO teste de endotoxinaendotoxina bacteriana usado parabacteriana usado para detectar oudetectar ou quantificarquantificar

endotoxinasendotoxinas de bactriasde bactrias gramgram negativas presentesnegativas presentes em amostras para qualem amostras para qual

o teste o teste preconizado. Utilizapreconizado. Utiliza--sese o extrato aquoso dos amebcitoso extrato aquoso dos amebcitoscirculantes docirculantes do LimulusLimulus polyphemuspolyphemus ou doou do TachypleusTachypleus tridentatustridentatuspreparadopreparado

e caracterizado como reagente LAL.e caracterizado como reagente LAL.

MTODO DO LISADO DE AMEBCITOS DO LIMULUS- LAL -

Princpio:

um mtodo in vitro onde diluies da amostra so misturadas

com uma soluo do lisado de amebcitos do caranguejo Limulus

Polyphemus. No caso da presena de endotoxinas bacterianas na

amostra sob anlise, estas produzem uma reao de gelificao

com o lisado atravs de um processo enzimtico, possibilitando a

determinao semi-quantitativa da presena de endotoxinas em

produtos farmacuticos.


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Informaes gerais do ensaio - Farmacopia Brasileira:HH duasduas tcnicastcnicas comcom sensibilidadesensibilidade diferentediferente parapara esteeste testeteste::

11.. MTODOMTODO DEDE COAGULAOCOAGULAO EMEM GELGEL:: baseadobaseado nana formaoformao dede cogulocoguloouou gelgel (mtodo(mtodo semisemi--quantitativo)quantitativo)

22.. MTODOSMTODOS FOTOMTRICOSFOTOMTRICOS quantitativosquantitativos queque incluemincluem::

OO MTODOMTODO TURBIDIMTRICO,TURBIDIMTRICO, (baseado(baseado nono desenvolvimentodesenvolvimento dede turbidezturbidezapsaps quebraquebra dede umum substratosubstrato endgenoendgeno));;

OO MTODOMTODO CROMOGNICOCROMOGNICO (baseado(baseado nono desenvolvimentodesenvolvimento dede corcor apsapsquebraquebra dede umum complexocomplexo peptdeopeptdeo sintticosinttico cromgeno)cromgeno)..

QualquerQualquer umum destesdestes procedimentosprocedimentos podepode serser realizado,realizado, aa menosmenos quequeindicadoindicado contrriocontrrio nana monografiamonografia..

Informaes gerais do ensaio - Farmacopia Brasileira:- Vidrarias e descartveis:

- Padro de referncia de endotoxinas (PRE) e padro deendotoxina (PE):Todas as vidrarias devem ser despirogenisadas em estufausando um processo validado. Utilize um tempo e temperatura mnimos de 250 Cpor 30 minutos. Se utilizar descartveis plsticos, como ponteiras e pipetas usemsomente os certificados que indicam ser livres de endotoxinas para no haverinterfernciano teste.

- Teste da sensibilidade do reagente LAL (confirmar a

sensibilidade declarada do regente).

- Teste de inibio ou potencializao (determinar possveisinterferncias da amostra sobre o ensaio).

- Mxima diluio vlida (diluio da amostra em que no h

endotoxina detectvel).

Ponto final de Gelificao

O mais simples e amplamente usado dos procedimentos paradeteco de endotoxinas baseia-se na gelificao.

Mtodo de escolha para testes em nmeros reduzidos ou nofreqentes, para amostras que turvem ou com expectativa deresultado negativo.

Exemplo: Monitoramento em processos de materiais e da gua.

Ensaios Turbidimtricos

Permite melhor medida quantitativa da endotoxina em grandes faixasde concentraes.

Concentrao de endotoxinas x aumento da turbidez

Uso em monitoramentos dirios de gua, permitindo medidas de aocorretiva em caso de desvio de padro da qualidade.

Necessidade de elaborao de curva padro de endotoxinas, parainterpolao dos resultados obtidos a partir das avaliaes dasamostras.


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Ensaios Cromognicos

A reao enzimtica interrompida no final do tempo pr-estabelecido pela adio de reagente, antes das leituras.

Espectrofotmetro (405 nm).

Necessidade de elaborao de curva padro de endotoxinas, parainterpolao dos resultados obtidos a partir das avaliaes das

amostras.

Outros mtodos

- ensaios de microdiluio.

- ensaio de LAL radiomarcado e fluorescente

ReaoReao positivapositiva::FormaoFormao dedegelgel..

Microplate Absorbance Readers

ENSAIO DO LISADO DE AMEBCITOS

DO LIMULUS

RESULTADOS FALSO NEGATIVOS

agentes desnaturantes

soro ou plasma pH < 3 ou > 9

ons clcio > 0,67 M

lipdios, emulses para infuso

glutationa, acetil cistena

cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina

penicilinas semi-sintticas

bactrias Gram (+) : Achromobacter


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Mtodo alternativo para teste de pirognios, fundamentado no efeitodas endotoxinas bacterianas, que induzem a secreo de Interleucina-6 por moncitos humanos ou linhagens de clulas monocticas.

DETERMINAO DE IL-6, IL-1e TNF

POR ELISA

Verificar o LIMITE DE ENDOTOXINAS (UE/mL ou mg) preconizado paraa amostra nas farmacopias

-Se no citado, deve-se calcular: L. E. = K/M

onde:

L. E. = limite de endotoxina

M = dose humana mxima/kg ou por 70 kg administrada numa injeopor hora.

K = 5 UE/kg (parenterais);

2,5 UE/kg (radiofrmacos);

0,2 EU/ kg (parenteraisadm. intratecal)

Calcular a MXIMA DILUIO VLIDA (MDV) para a amostra:

Limite de endotoxinas UE/mLMDV =sensibilidade do lisado ()

OU

Limite de endotoxinas UE/mg ou UE/UI x [ ] do produtoMDV =sensibilidade do lisado ()

EXEMPLO:

Produto: Diclofenaco de sdio

Dose mxima por Kg (M): 1,07 mg/kg ou 75 mg/70 kg

Forma de apresentao: Ampola de 75mg/3 ml Sensibilidade do Lisado (): 0,06 EU/ml

L.E. = 5 UE/Kg = 4,7 UE/mg

1,07 mg/Kg

MDV = 4,7 UE/mg x 25 mg/ml = 1958 ou 1/1958

0,06 UE/ml

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