Thiago de Oliveira Araujo Determinação de Biomoléculas Derivadas de … · 2018-01-31 · obtenção do grau de Doutor pelo programa de Pós-graduação em Química Analítica

Thiago de Oliveira Araujo

Determinao de Biomolculas Derivadas de Compostos Oncolticos Base de Platina em

Diferentes Linhagens Celulares

Tese de Doutorado

Tese apresentada como requisito parcial para obteno do grau de Doutor pelo programa de Ps-graduao em Qumica Analtica do departamento de Qumica da PUC-Rio. Orientadores: Prof. Ricardo Queiroz Auclio

Prof. Reinaldo C. de Campos (in memoriam)

Co-orientadora: Profa. Janana Fernandes

Rio de Janeiro

Outubro de 2014

DBDPUC-Rio - Certificao Digital N 0812623/CB

DBDPUC-Rio - Certificao Digital N 0812623/CA

Thiago de Oliveira Araujo

Determinao de Biomolculas Derivadas de Compostos Oncolticos a Base de Platina em Diferentes Linhagens Celulares

Tese apresentada como requisito parcial para obteno do grau de Doutor pelo programa de Ps-graduao em Qumica Analtica do departamento de Qumica da PUC-Rio. Aprovada pela Comisso Examinadora abaixo assinada.

Prof. Ricardo Queiroz Auclio Orientador

Departamento de Qumica - PUC-Rio

Prof. Janana Fernandes UFRJ

Prof. Josino Costa Moreira

Fiocruz

Prof. Ricardo Erthal Santelli UFRJ

Prof. Fatima Ventura Pereira Meirelles

Departamento de Qumica - PUC-Rio

Prof. Aderval Severino Luna UERJ

Prof. Cssia Ribeiro Ponciano

Departamento de Fsica - PUC-Rio

Dra. Marcia Silva da Rocha INMETRO

Prof. Jos Eugenio Leal

Coordenador Setorial do Centro Tcnico Cientfico - PUC-Rio

Rio de Janeiro, 27 de outubro de 2014



Todos os direitos reservados. proibida a reproduo total ou parcial do trabalho sem autorizao da universidade, do autor e do orientador.

Thiago de Oliveira Araujo Graduou-se Bacharel em Qumica pela Universidade de Braslia (UnB) em 2002 e atua desde ento como pesquisador no Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Inmetro). Coordenou o Laboratrio de Anlise Inorgnica (Labin), no perodo de 2006 2009. Atua intensamente na rea de garantia da qualidade em anlises qumicas, e na pesquisa e desenvolvimento em qumica analtica e bioanaltica. Atualmente coordena a rea transversal de Metrologia Forense na Diviso de Metrologia Qumica.

Ficha Catalogrfica

CDD: 540

Araujo, Thiago de Oliveira

Determinao de biomolculas derivadas

de compostos oncolticos base de platina em

diferentes linhagens celulares / Thiago de Oliveira

Araujo ; orientador: Ricardo Queirz Auclio ; co-

orientadores: Janana Fernandes, Reinaldo C. de

Campos. 2014.

147 f. : il. (color.) ; 30 cm

Tese (doutorado)Pontifcia

Universidade Catlica do Rio de Janeiro,

Departamento de Qumica, 2014.

Inclui bibliografia

1. Qumica Teses. 2. Cisplatina. 3.

Oxaliplatina. 4. Carboplatina. 5. HPLC-ICP-MS. 6.

K562. 7. Acetilcolinesterase. 8. Aduto de DNA

biomarcador. I. Auclio, Ricardo Queirz. II.

Fernandes, Janana. III. Campos, Reinaldo C. de

IV. Pontifcia Universidade Catlica do Rio de

Janeiro. Departamento de Qumica. V. Ttulo.



Ao meu irmo, Davi e minha mulher, Lilian.



Agradecimentos

Primeiramente eu agradeo ao Professor Reinaldo Calixto por confiar a mim o

desenvolvimento de um projeto bonito, inovador e relevante. Ele foi um exemplo

de paixo pelo trabalho e elegncia no convvio com as agruras da pesquisa no

Brasil. Obrigado Professor, sinto voc no estar aqui para colher comigo mais este

fruto de uma semente plantada.

Agradeo ao Professor Ricardo Auclio, que me acolheu, acreditou e apoiou

durante toda nossa caminhada juntos no desenvolvimento deste trabalho.

Agradeo por ter dedicado a mim nada alm de respeito, confiana e apoio. Sem

isso, certamente eu no teria conseguido. Espero conseguir seguir seu exemplo em

minha carreira futura.

Agradeo tambm Professora Janana Fernandes, entusiasta da bancada que me

conduziu pelas, para mim, tortuosas veredas da biologia celular e molecular.

Sempre empolgada, disposta e meticulosa com os experimentos e seus resultados.

Muito do meu desenvolvimento nas atividades laboratoriais se devem a voc

professora, obrigado.

No tenho como agradecer suficiente minha alma gmea, professora, amiga,

irm... minha mulher Lilian. Sempre atenta a meu andamento, advertindo,

aconselhando, arregaando as mangas. Sem ela, ou mesmo sem o apoio dela no

daria, eu no chegaria aqui. Ela me apoiou e confortou, estudou comigo e discutiu

o assunto... enfim, obrigado meu amor, meu grande amor.

Agradeo a meus filhos, Carolina e Bernardo, pela compreenso, alegria e preces

para papai terminar a tese. Apoio e interesse em saber, o que o pai est fazendo,

quando vai terminar e pela fervorosa torcida, obrigado meus amores.

Agradeo ao meu irmo Davi Araujo e a meus pais Joo Rita de Araujo e Marieta

do Carmo de Oliveira pelo carinho, compreenso e apoio incondicional que me



ofereceram durante toda esta caminhada. Mesmo a distncia, foram fundamentais

para me orientar, prover foras e estimular para que eu continuasse.

Agradeo de forma sincera pela contribuio, apoio e disponibilidade aos

queridos: Danielle Cavalcanti, Rodrigo Araujo, Bruno Silva, Douglas de Oliveira,

Manuel de Castro Carneiro, Fernanda Veronesi Marinho Pontes, Daniela

Loureno, Carolina Catta Preta, Marcia Rocha, Lilian Silva, Jefferson Rodrigues,

Maria Luiza, Alfredo Sanz Mendel, Valnei Smararo, Janana Caixeiro e

Humberto Brandi. Me desculpo com aqueles no mencionados nominalmente,

mas tambm fundamentais para o sucesso deste trabalho, Obrigado.

Agradeo ainda s instituies que me apoiaram. Primeiramente ao Inmetro pelo

imenso investimento em minha formao e apoio a meu desenvolvimento

profissional. PUC-Rio pela bolsa de iseno e infraestrutura fornecidas.

UFRJ e CETEM pela infraestrutura. As agncias de fomento FAPERJ e CNPq

pelo apoio que mantm o funcionamento dos laboratrios envolvidos.



Resumo

Araujo, Thiago de Oliveira; Auclio, Ricardo Queiroz; Fernandes Janana. Determinao de Biomolculas Derivadas de Compostos Oncolticos Base de Platina em Diferentes Linhagens Celulares. Rio de Janeiro, 2014. 147p. Tese de Doutorado Departamento de Qumica, Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro.

A utilizao de drogas base de platina o tratamento de primeira linha

para diversos tipos de cncer. Pacientes tratados com estas drogas apresentam

resultados melhores que os obtidos com outros regimes de quimioterapia para os

mesmos tipos de malignidades. As principais limitaes para a utilizao destes

compostos so os efeitos colaterais severos e a resistncia dos tumores ao

tratamento. A cisplatina foi a primeira droga dessa categoria a ser empregada.

Desde o final dos anos 70 at hoje, esta droga vem sendo amplamente utilizada e

com sucesso substancial. Acredita-se que o principal mecanismo de ao desta

classe de medicamentos seja a ligao de dois stios ativos da platina com o DNA

das clulas tumorais, impedindo sua multiplicao e finalmente induzindo a

apoptose, o que provoca a reduo, e em alguns casos a eliminao, dos tumores.

Entretanto, devido complexidade dos mecanismos envolvidos, uma descrio

clara da atuao intracelular destas drogas ainda no foi estabelecida. A

combinao de tcnicas de separao como eletroforese ou cromatografia lquida

de alta performance com tcnicas de espectrometria atmica tem se apresentado

como uma poderosa alternativa para investigao de fenmenos biolgicos que

envolvem, de alguma maneira, espcies metlicas. A hifenao destas tcnicas

permite a separao e deteco em linha de biomolculas contendo metais,

possibilitando a obteno de informaes nicas sobre os processos biolgicos. O

presente trabalho apresenta o desenvolvimento de mtodos analticos utilizando

eletroforese em gel de agarose (GE), cromatografia lquida de alta eficincia

(HPLC) e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS)

para a determinao de biomolculas contendo platina em materiais biolgicos. O

principal objetivo do trabalho fornecer ferramentas analticas para o estudo dos



mecanismos de ao de drogas base de platina em humanos. Foram utilizados

diversos materiais biolgicos, como sangue, urina e culturas de clulas. A

cromatografia lquida em fase reversa foi usada na determinao das drogas

intactas e de seus produtos de hidrlise; a cromatografia de excluso por tamanho

foi empregada para a avaliao de protenas presentes nas amostras enquanto a

cromatografia de par inico para separao de fragmentos de DNA. A deteco de

platina nos eluatos por ICP-MS permitiu a obteno de cromatogramas limpos

apresentando claramente as molculas contendo platina. A evidncia da

aplicabilidade dos mtodos desenvolvidos foi avaliada com a prospeco de

biomarcadores de eficincia do tratamento com cisplatina. Diversas linhagens

celulares foram expostas a diferentes tratamentos com cisplatina e tiveram seus

comportamentos avaliados. A determinao de adutos de DNA contendo platina

apresentou-se como uma interessante perspectiva para a obteno de um

biomarcador de resistncia ao tratamento com cisplatina.

Palavras-chave

Cisplatina; oxaliplatina; carboplatina; HPLC-ICP-MS; K562; aduto de

DNA; biomarcador.



Abstract

Araujo, Thiago de Oliveira; Auclio, Ricardo Queiroz (Advisor); Fernandes Janana (Co-advisor). Determination of Biomolecules Derived from Platinum-Based Oncolitic Compounds in Different Cell Lines. Rio de Janeiro, 2014. 147p. Doctoral Degree Theses Departamento de Qumica, Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro.

The use of platinum-based drugs is the first line treatment for many

cancers. Patients treated with these drugs present better outcome when compared

with other chemotherapy regimens for the same types of malignancies. The major

limitations to the use of these drugs are the severe side effects and resistance

tumors present to the treatment. Cisplatin was the first platinum-based drug to be

approved for human use. Since the late 1970s until today, this drug has been

widely used with great success. It is believed that the major mechanism of action

of these drugs is the binding of two active sites of platinum complexes with the

DNA of the tumor cells, preventing their multiplication and finally inducing

apoptosis, that leads to a reduction, and in some cases eliminating, tumors.

However, due to the complexity of the mechanisms involved, a clear description

of the intracellular action of these drugs has not been established. The

combination of separation techniques such as electrophoresis or high performance

liquid chromatography with atomic spectrometric techniques has emerged as a

powerful alternative for investigation metal-related biological phenomena. The so

called hyphenation of these techniques allows the separation and detection of

biomolecules containing metals, making possible to obtain unique information

about biological processes. This work presents the development of analytical

methodologies using agarose gel electrophoresis (GE), high performance liquid

chromatography (HPLC) and inductively coupled plasma with mass spectrometry

(ICP-MS) for the determination of platinum-containing biomolecules in biological

materials. The main objective of this work is to provide analytical tools for the

study of the mechanisms of action of platinum-based drugs in humans. Various

biological materials such as blood, urine and cell cultures were used. Reverse



phase liquid chromatography was used for the determination of intact drugs and

its hydrolysis products; size exclusion chromatography was used to assess the

protein profile in samples while the ion-pair chromatography for separation of

DNA fragments. The detection of platinum in the eluates by ICP-MS allowed the

obtention of clean chromatograms clearly presenting the platinum-containing

molecules. The evidence of the applicability of the developed methods was

assessed with the search for biomarkers of efficacy of treatment with cisplatin.

Several cell lines were exposed to different treatments of cisplatin and their

behavior were evaluated. The determination of DNA adducts containing platinum

presented an interesting approach for obtaining a marker of resistance to cisplatin

treatment.

Keywords

Cisplatin; oxaliplatin; carboplatina; HPLC-ICP-MS; DNA adduct;

biomarker.



Sumrio

1. Introduo 18

1.1 Contextualizao 18

1.2 Objetivos 19

1.2.1 Geral 19

1.2.2 Especficos 20

2. Fundamentao terica 21

2.1 Algumas caractersticas do cncer humano 21

2.2 Tratamento para o Cncer 23

2.3 Drogas base de platina 24

2.3.1 Cisplatina 26

2.3.1.1 Mecanismo de ao 27

2.3.1.2 Efeitos Colaterais 33

2.3.1.3 Resistncia Cisplatina 34

2.3.2 Carboplatina 37

2.3.3 Oxaliplatina 39

2.4 Determinao de biomolculas contendo metais: Metalmica. 41

2.4.1 Anlise de especiao 42

2.5 Clulas como Modelos Biolgicos 44

2.6 Tcnicas utilizadas 46

2.6.1 ICP-MS 46

2.6.2 HPLC e HPLC-ICP-MS 48

2.6.3 Citometria de fluxo 51

2.6.4 Extrao de DNA e eletroforese em gel 53

3. Materiais e Metodologia 55

3.1 Materiais 55

3.1.1 Reagentes 55

3.1.2 Materiais 57

3.1.3 Instrumentos 57



3.2 Procedimentos 59

3.2.1 Especiao de platina em drogas com acoplamento HPLC-ICP-MS 59

3.2.2 Cultura de clulas 61

3.2.3 Determinao de metabolismo celular da cisplatina 61

3.2.4 Extrao de DNA e eletroforese em gel 63

3.2.5 Extrao do DNA do gel 67

3.2.6 Determinao de fragmentos de DNA por HPLC-ICP-MS. 67

4. Resultados e discusso 70

4.1 Estudo de separao cromatogrfica aplicado a drogas base de

platina 70

4.2 Estudos com clulas 82

4.3 Experimentos de acumulao celular de Pt 89

4.4 Extrao de DNA e eletroforese em gel 91

4.5 Determinao de fragmentos de DNA contendo platina por HPLC-

ICP-MS 96

5. Concluso 104

6. Referncias Bibliogrficas 106

7. Anexo I: Composio do meio de cultura RPMI 1640 127

8. Anexo II - Publicaes resultantes dos trabalhos desenvolvidos na

Tese. 128



Lista de Figuras

Figura 1: Estruturas dos compostos platnicos mais utilizados com

atividade oncoltica. a) cisplatina; b) carboplatina; c) oxaliplatina. 25

Figura 2: Produtos da hidrlise da cisplatina aps cruzar a membrana

celular 29

Figura 3: Ao da cisplatina na frao no nuclear da clula 30

Figura 4: Estrutura do DNA aps ligao da cisplatina 31

Figura 5: a) Modelo da estrutura do DNA evidenciando stios de ligao

preferenciais; b) adutos mais recorrentes da ligao da cisplatina com

DNA; c) modelo de estrutura qumica de adutos formados pela

oxaliplatina, anlogos aos formados pela cisplatina 33

Figura 6: Produtos de hidrlise da carboplatina em meio aquoso 38

Figura 7: Produtos de hidrlise da oxaliplatina. 40

Figura 8: Esquema da estrutura de um espectrmetro de massa com fonte

de plasma indutivamente acoplado usado para medies por ICP-MS. 47

Figura 9: Representao esquemtica de um sistema de HPLC. 49

Figura 10: Representao esquemtica de um citmetro de fluxo. 51

Figura 11: Resultado de avaliao de viabilidade celular por citometria de

fluxo 52

Figura 12: Sistema HPLC-ICP-MS da PUC-Rio. 60

Figura 13: Aparato de eletroforese em gel 66

Figura 14: Exemplo de gel de agarose utilizado para separao dos

fragmentos de DNA 66

Figura 15: Sistema HPLC-ICP-MS montado no Inmetro. 68

Figura 16: Cromatograma de uma soluo contendo 200 g L-1 de

cisplatina em soro fisiolgico. 71

Figura 17: Cromatograma de uma soluo contendo 50 g L-1 de

carboplatina em soro fisiolgico. 72



Figura 18: Cromatogramas apresentando as espcies de Pt presentes em

uma soluo aquosa da mistura de cisplatina e carboplatina. 73

Figura 19: Cromatogramas da separao de espcies de platina em uma

soluo de 50 g L-1 cisplatina em soro fisiolgico. 75

Figura 20: Cromatograma apresentando a separao das espcies de

platina em uma soluo de 50 g L-1 de carboplatina 76

Figura 21: Cromatograma de uma soluo de 50 g L-1 de oxaliplatina em

gua 76

Figura 22: Cromatograma das trs drogas diludas em um soro fisiolgico

a 50 g L-1 cada uma. 77

Figura 23: Cromatogramas da oxaliplatina solubilizada em urina

imediatamente aps o preparo da soluo. 78

Figura 24: Cromatogramas obtido 24 h aps a solubilizao da

oxaliplatina em urina. A indica os picos comuns encontrados na urina

incubada com oxaliplatina e urina advinda de um paciente tratado com

oxaliplatina (ver Figura 25). 79

Figura 25: Urina de uma paciente tratado com oxaliplatina coletada 72 h

aps a infuso e analisada 1 h aps a coleta. A representa os sinais

comuns aos observados na urina incubada com oxaliplatina por 24 h; e

B so os picos referentes a metablitos da oxaliplatina observados

apenas nas amostras oriundas de paciente em tratamento com o frmaco.

80

Figura 26: Urina de um paciente tratado com oxaliplatina coletada 72 h

aps a infuso da droga e analisada 24 h aps a coleta aps

armazenamento 4 C. 81

Figura 27: Clulas em cultura. a) H460 e b) Lucena. 82

Figura 28: Resultados de viabilidade celular por citometria de fluxo.

Incubao de K562 por 48 h com diferentes concentraes de cisplatina:

84

Figura 29: Resultados de viabilidade celular por citometria de fluxo.

Incubao de Lucena por 48 h com diferentes concentraes de cisplatina

84

Figura 30: ndice de apoptose para linhagem Lucena. 85

Figura 31: ndice de morte celular para linhagem K562. 86



Figura 32: Avaliao do funcionamento das bombas de efluxo Pgp por

citometria de fluxo. 88

Figura 33: Resultados de eletroforese em gel. Raia a: DNA ladder 1 kb;

raias b, c e d DNA ladder 1 kb, DNA de culturas de K562 sem tratamento

e tratadas por 48 h com 10 g mL-1 de cisplatina extrados pelo mtodo 1;

raias e, f e g o mesmo que nas raias b, c e d com extrao pelo mtodo 2.

94

Figura 34: (1) Gel apresentando um padro de degradao do DNA

devido apoptose induzida por cisplatina, destacando bandas com

fragmentos de DNA de 200 PB. (2) Mesmo gel aps a remoo das

pores contendo os fragmentos de DNA de interesse. 95

Figura 35: Cromatograma de uma injeo de um branco (Tris-HCl 10

mmol L-1, pH 7,5) com as condies escolhidas para separao dos

fragmentos de DNA. 99

Figura 36: Cromatograma obtido para DNA Ladder 100 BP. 100

Figura 37: Cromatograma obtido para a cisplatina pura a 1 mg L-1. 101

Figura 38: Cromatograma do DNA da K562 tratada com cisplatina 102



Lista de Tabelas Tabela 1: Condies otimizadas para separao das espcies de Pt das

drogas e seus produtos de hidrlise com deteco por ICP-MS 60

Tabela 2: Parmetros instrumentais para determinao da cintica de

entrada e de sada de cisplatina da linhagem K562 e Lucena. 63

Tabela 3: Condies cromatogrficas escolhidas para determinao de

fragmentos de DNA contendo platina. 68

Tabela 4: Condies cromatogrficas otimizadas para separao de

drogas base platina intactas e produtos de hidrlise em meio aquoso e

fluidos biolgicos. 74

Tabela 5: Resultados do estudo de efluxo de cisplatina pelas clulas K562

e Lucena. 90

Tabela 6: Condies do ICP-MS para determinao de fragmentos de

DNA contendo Pt. 96

Tabela 7: Condies cromatogrficas otimizadas para separao de

fragmentos de DNA. 98



preciso amar as pessoas como se no houvesse amanh, porque se voc

parar pra pensar, na verdade, no h.

Renato Russo, Pais e Filhos



18

1. Introduo

1.1 Contextualizao

O presente trabalho aborda o desenvolvimento de mtodos analticos como

ferramenta para o entendimento da bioqumica envolvida no tratamento de

cnceres com drogas base de platina. Este tipo de frmaco vem sendo utilizado

desde a dcada de 1970 e, devido complexidade e espectro de sua atuao, os

processos bioqumicos responsveis pela efetividade das drogas e tambm pela

resistncia de certos tumores ao tratamento ainda no foram completamente

esclarecidos. Pontos que ainda devem ser respondidos so o entendimento dos

processos bioqumicos de ao das drogas e o estabelecimento de indicadores de

eficcia do tratamento com drogas base de platina (biomarcadores). Tal

conhecimento pode reduzir drasticamente a exposio de pacientes aos severos

efeitos colaterais trazidos por esta classe de medicamentos.

Em parte, o no entendimento dos processos celulares deve-se falta de

abordagens analticas que permitam desvendar os processos que envolvem estes

frmacos dentro do organismo. Nesta lacuna, a qumica analtica pode prestar

grande servio biologia e medicina, desenvolvendo estratgias para se extrair

informao relevante e que repercutam na avaliao da efetividade dos

medicamentos e no ajuste dos tratamentos realizados com estes. Os qumicos

analticos contribuem com uma compreenso aprofundada das ferramentas

disponveis e com uma percepo apurada da qualidade dos resultados das

determinaes qumicas. Em trabalhos como este, a parceria com bilogos e

mdicos, que trazem uma percepo dos processos moleculares, celulares e

sistmicos em organismos vivos, deveria mostrar grande sinergia para conduzir a

achados que no seriam possveis de obter isoladamente.

Neste trabalho foram desenvolvidas abordagens analticas que objetivaram

esclarecer etapas do metabolismo de drogas base de platina. A hifenao da

cromatografia lquida e a espectrometria de massas foram obtidas, assim como



19

abordagens analticas que permitiram acessar informaes biolgicas at ento

mascaradas por tratamentos de amostras inadequados.

O presente trabalho foi construdo com o acmulo de conhecimentos nas

reas da qumica analtica e da biologia e exigiu o desenvolvimento de aptides no

tratamento de amostras biolgicas, cultura e manuteno de populaes de clulas

e uso de tcnicas caractersticas das anlises biolgicas. No processo foi

desenvolvido um protocolo para detectar um possvel indicador do prognstico do

tratamento de clulas tumorais com drogas base de platina. A rotina analtica

consistiu em extrair o DNA das clulas selecionadas, separar os fragmentos de

DNA de interesse para posterior anlise, que possibilitou uma primeira

investigao de fragmentos de DNA contendo Pt de clulas de leucemia tratadas

com cisplatina. Vale salientar que os mtodos atualmente disponveis na literatura

para determinao de DNA ligado Pt so precedidos por uma digesto com

DNAse, que fragmenta o DNA em pares de bases. Esta prtica remove a

informao biolgica que indica a origem do fragmento de DNA, isto , o

tamanho da molcula que contm platina. Com a abordagem proposta aqui no se

perde tal informao, permitindo inferir algo sobre a origem dos fragmentos de

DNA contendo platina, consequentemente sobre o processo biolgico envolvido

na produo deste fragmento. Uma vez identificados, estes fragmentos tm

potencial para serem utilizados como biomarcadores para resistncia ao

tratamento.

1.2 Objetivos

1.2.1 Geral

Desenvolver mtodo baseado na tcnica HPLC (HPLC-ICP-MS) de forma a

contribuir para a compreenso do mecanismo oncoltico dos compostos de Pt

utilizados no tratamento de cncer pela identificao e quantificao de Pt em

modelos celulares buscando informao sobre a frao de droga no modificada e

biomolculas derivadas destes compostos;



20

1.2.2 Especficos

Desenvolver mtodo analtico sensvel e seletivo para a

determinao de Pt por ICP-MS em fluidos biolgicos e modelos

celulares, aps tratamento com compostos antineoplasicos base de

platina;

Estudar o metabolismo de drogas base de Pt em modelos celulares.

Desenvolver mtodos analticos sensveis e seletivos para

identificao de espcies de Pt em fluidos biolgicos e modelos

celulares, aps tratamento com compostos antineoplasicos base de

platina;

Identificar e otimizar os parmetros analticos relativos a

determinao instrumental das amostras tratadas por HPLC-UV e

HPLC-ICP-MS;

Desenvolver uma sistemtica para identificao de biomarcadores

para determinao da resistncia / eficcia do tratamento com drogas

base de platina.



21

2. Fundamentao terica

2.1 Algumas caractersticas do cncer humano

O que comumente chamado de cncer humano compreende, na realidade,

mais de 200 doenas diferentes que, em conjunto, responsvel por,

aproximadamente, um quarto das mortes nos Estados Unidos (Siegel, Rebecca,

Naishadham, Deepa e Jemal, Ahmedin, 2013). Um em cada trs ingleses

desenvolver algum tipo de cncer em seu perodo de vida (Sasieni et al., 2011) e

na Alemanha, com seus 82 milhes de habitantes, mais de 400 mil novos casos

so diagnosticados todos os anos com aproximadamente 200 mil bitos. Como a

incidncia da maioria dos cnceres cresce com a idade do indivduo, a tendncia

desta incidncia de aumento, uma vez que a expectativa de vida continua a subir

(Schulz, 2005). No Brasil, o Instituto Nacional do Cncer (INCA) estima que

cerca de 580 mil novos casos da doena sejam reportados em 2014. Os tipos mais

comuns de cncer e a previso de incidncia para 2014 no Brasil so: para

homens: prstata (70 mil), clon e reto (15 mil), estmago (13 mil); para

mulheres: mama feminina (56 mil), clon e reto (17 mil), colo do tero (15 mil),

traqueia brnquio e pulmo (11 mil) (Estimativa 2014 - Incidncia de Cncer no

Brasil, 2013).

Os principais tipos de cncer que se apresentam em humanos so os de

tecidos epiteliais, chamados carcinomas; os de tecidos conjuntivos, chamados

sarcomas; os cnceres do sistema linftico chamados de linfoma; alm do de

clulas do sistema imune (leuccitos) chamado leucemia.

Apesar de sua diversidade, os tipos de cncer humanos apresentam diversos

aspectos comuns e que os definem como cncer. Tais caractersticas so: 1)

proliferao descontrolada de clulas; 2) diferenciao gentica; 3) metabolismo

alterado; 4) instabilidade genmica; e 5) capacidade de invadir tecidos e rgos

vizinhos ou distantes (metstase) (Schulz, 2005).



22

Os cnceres so, em geral, hipersensveis aos estmulos de crescimento1, por

outro lado, eles se tornam independentes destes estmulos externos para continuar

crescendo. Ao mesmo tempo, eles so pouco sensveis aos estmulos de inibio

do crescimento. Juntas estas caractersticas resultam em uma autonomia de

crescimento que caracteriza os cnceres, e estas caractersticas tendem a se

acentuar na medida em que a doena evolui (Alberts, 2008).

Este comportamento de crescimento do cncer permite que suas clulas

sejam alvejadas por frmacos no especficos, uma vez que, para manter o ritmo

aumentado de crescimento e de replicao, as clulas do tumor possuem um

metabolismo muito mais acelerado que o das clulas normais. Consequentemente,

estas clulas metabolizam uma quantidade maior de frmacos do que as clulas

equivalentes que no sofreram mutao, possibilitando assim que algumas drogas

sejam txicas s clulas tumorais sem serem letais para os pacientes (Kroemer e

Pouyssegur, 2008).

A capacidade de invaso de outros tecidos e de gerar metstase o critrio

definitivo para se discernir um tumor benigno de um tumor maligno. Juntamente

com a caquexia2 e a supresso do sistema imune, a metstase a responsvel pela

maior parte da mortalidade dos cnceres humanos. Na invaso, as clulas

cancerosas crescem em vrios pontos e em vrias camadas do mesmo tecido e

eventualmente extrapolam este tecido passando para os tecidos vizinhos. Isto

permite que o tumor cresa de forma praticamente indefinida, o que produz mais

rapidamente os efeitos no paciente.

Na metstase, clulas cancerosas se desprendem do tumor e viajam pela

corrente sangunea ou pelo sistema linftico e aderem em outros rgos onde

formam novos tumores. Entretanto, este processo de aderncia em condies

favorveis ao crescimento no ocorre frequentemente, e as clulas cancerosas ou

pequenos grupos de clulas podem ficar retidos em vasos capilares e sobreviver

ali por anos at se adaptar ao novo ambiente e reiniciar seu processo de

crescimento descontrolado (Alberts, 2008). Estas clulas, ou pequenos grupos no

podem ser diagnosticados por imagem, mas muitos podem ser identificados por

1 Crescimento, neste contexto, diz respeito reproduo celular. 2 Caquexia a perda de apetite, fadiga, fraqueza, associada perda de massa corprea que

no pode ser revertida atravs de meios nutricionais, i. e. mesmo se o paciente ingere mais calorias, ele continua perdendo massa magra. Em geral provocada em pacientes de cncer pela demanda do tumor por energia.



23

biomarcadores presentes na corrente sangunea (Brenner, Kloor e Pox, 2013). Os

rgos que apresentam maior incidncia de metstase so aqueles com sistemas

microcapilares extensos como o fgado, o pulmo e os ossos (Schulz, 2005).

2.2 Tratamento para o Cncer

O tratamento a ser indicado para o cncer depende do tipo de tumor, do

estgio em que se apresenta e das caractersticas e estado de sade do paciente

(Schulz, 2005; Estimativa 2014 - Incidncia de Cncer no Brasil, 2013). Em geral

uma gama de terapias est disponvel, sendo as mais comuns a cirurgia, a

radioterapia, a quimioterapia alm de combinaes destas. Cirurgias e radioterapia

so indicadas para cnceres localizados, j as leucemias, linfomas, tumores

metastticos, carcinomas avanados e tumores em tecidos moles requerem

quimioterapia.

As abordagens so complementares, uma vez que cada uma apresenta

caractersticas especficas e os tumores so complexos e diversos. Por exemplo, a

aplicao de quimioterapia ou de radioterapia, aps um procedimento cirrgico

para combater clulas que no puderam ser dissecadas, chamada de tratamento

adjuvante. Analogamente, a quimioterapia empregada antes de uma cirurgia com

intuito de diminuir o tumor e facilitar sua completa retirada chamada de terapia

neo-adjuvante.

Na quimioterapia, uma grande variedade de drogas pode ser utilizada.

Algumas atuam diretamente sobre o cncer, outras atuam melhorando e

estabilizando funes do paciente comprometidas pela doena. O componente

principal para a maioria dos tratamentos um agente citotxico. Neste tipo de

terapia, compostos qumicos bloqueiam funes celulares bsicas como a

replicao de DNA ou mitose3 conduzindo estas clulas apoptose4. As drogas

base de platina so parte importante destes tratamentos. Outro tipo de terapia

conduzido com o uso de agentes biolgicos que se ligam aos receptores nas

clulas cancerosas que regulam, de forma indireta, a replicao de DNA ou o

processo de mitose. Exemplos deste tipo de substncia so hormnios e anti- 3 Mitose o processo de diviso celular dos eucariotos. 4 Apoptose morte celular que ocorre de forma ordenada e demanda energia para a sua

execuo. Pode ser acionada tanto por mecanismos de controle da homeostase, quanto por danos celulares irreparveis (como leso do DNA, por exemplo).



24

hormnios usados no tratamento de cncer de seio ou de prstata. Outros grupos

importantes de agentes biolgicos utilizados mais recentemente so as citocinas5,

os fatores de crescimento, interferons6 e interleucinas7. Hoje eles so responsveis

por tratamentos de doenas que eram incurveis h apenas uma dcada atrs.

Alguns atuam diretamente sobre o tumor, outros estimulam o sistema imune a

combater as clulas cancerosas (Schulz, 2005; Alberts, 2008).

2.3 Drogas base de platina

Desde a descoberta de suas propriedades oncolticas em meados dos anos

60, a cisplatina tornou-se, inclusive no Brasil, uma droga padro no tratamento de

diversos tipos de tumores, em especial o testicular (Williams e Einhorn, 1980).

Apesar das boas respostas obtidas para tumores slidos como o sarcoma

(Rosenberg, Barnett, 1980), o tratamento com a cisplatina acompanhado de

efeitos colaterais severos (danos aos rins, nusea, danos aos ouvidos e ao sistema

nervoso perifrico), que levaram investigao de outros compostos de platina

que mantivessem a capacidade teraputica, minimizando os efeitos txicos. Entre

estes novos compostos esto a carboplatina, a oxaliplatina, a loboplatina e a

satraplatina (Weiss e Christian, 1993). Esses compostos apresentam menor

toxicidade ao paciente quando comparados com a cisplatina, entretanto, eles so,

de forma geral, menos ativos. A carboplatina o segundo composto platnico

autorizado para uso clnico, apresentando excelentes resultados para diversos tipos

de tumores, especialmente o cncer de ovrio (Calvert et al., 1989; Ozols et al.,

2003). A sua atuao semelhante da cisplatina, sendo menos txica, e

apresentando resistncia cruzada com a cisplatina, isto , os tumores resistentes

cisplatina so tambm resistentes carboplatina (Go e Adjei, 1999). A

oxaliplatina um complexo platnico de terceira gerao, menos txico e com

atuao distinta da cisplatina (Raymond et al., 1998), sendo atualmente utilizada

5 Citocina um termo genrico empregado para designar um extenso grupo

de molculas envolvidas na emisso de sinais entre as clulas durante o desencadeamento das respostas imunes.

6 Os interferons so protenas produzidas por clulas sob ataque, so produzidos pelas clulas do organismo para defend-lo de agentes externos como vrus, bactrias e clulas de tumores.

7 As interleucinas so alguns tipos de protenas produzidas principalmente por clulas do sistema imune e atuam principalmente na ativao deste contra um agente especfico.



25

como droga de primeira linha no tratamento de carcinoma colo-retal. Na Figura 1

so apresentas as estruturas das principais drogas base de platina utilizadas para

tratamento do cncer.

Figura 1: Estruturas dos compostos platnicos mais utilizados com atividade oncoltica.

a) cisplatina; b) carboplatina; c) oxaliplatina.

Para explicar os complexos processos de transporte, armazenamento,

eliminao e capacidade de interagir com biomolculas, que determinam o

mecanismo de ao citotxica destas drogas, preciso entender a reatividade da

platina e, consequentemente, de seus compostos de coordenao. A platina, no

forma ons em meio aquoso tendo apenas gua como ligante, mas sim ons

complexos envolvendo outros ligantes mais fortes que a gua. Tanto os

complexos de Pt(II) quanto os de Pt(IV) so importantes em matrizes biolgicas.

A platina tem uma forte capacidade de ligao com grupos doadores de eltrons

como os presentes em aminocidos e tem a habilidade de formar quelatos (Lee,

1996). No estado de oxidao II, os complexos geralmente so tetra-coordenados

e apresentam geometria planar quadrtica, uma vez que envolve um sistema de

eltrons d8. Pode-se destacar, em meio aquoso, os complexos [PtCl4]2- , que tem

grande importncia na qumica preparativa e se hidrolisa facilmente em gua,

formando [Pt(H2O)Cl3]- e [Pt(H2O)2Cl2]. Quando a platina est no estado de

oxidao IV, complexos hexacoordenados com geometria octadrica so

formados. Em geral, os complexos de platina (II ou IV), apresentam uma elevada

estabilidade termodinmica e uma relativa inrcia cintica.



26

As trs drogas base de platina e comercialmente disponveis, so na

realidade pr-drogas, que somente apresentam a configurao ativa aps sua

hidrlise, seja no meio extracelular ou meio intracelular. A cintica de ativao

das drogas modula sua atividade e seus efeitos colaterais (Desoize e Madoulet,

2002). Deve acrescentar-se que a cisplatina e carboplatina tm uma atividade

substancial em clulas tumorais para sensibilizao radioterapia especialmente

em tumores na cabea e pescoo, pulmo, esfago, colo do tero, bexiga e no reto

(Desoize e Madoulet, 2002).

2.3.1 Cisplatina

A cis-diaminodicloroplatina (II) (cisplatina) foi primeiramente sintetizada

em 1844 por Michel Peyrone recebendo o nome de Cloreto de Peyrone. O

composto se apresenta como um p amarelo com solubilidade em gua de

2,53 mg mL-1, a 25C, e de menos de 1 mg mL-1 a 19C. A cisplatina um

complexo quadrado planar com dois ligantes cloreto e dois ligantes amino em

posio cis, como pode ser observado na Figura 1.

Em 1961 Barnett Rosenberg iniciou estudos explorando a exposio de

clulas mitticas de mamferos campos magnticos. Em testes com a bactria

Escherichia coli, ele observou uma diminuio da reproduo celular e o

alongamento das bactrias. Rosenberg investigou esta resposta e observou que os

eletrodos de platina utilizados se degastavam com a formao de complexos de

platina que eram responsveis por este efeito nas bactrias. Rosenberg percebeu as

possibilidades deste resultado e direcionou sua pesquisa para a busca de um

agente antineoplsico, uma vez que estes complexos, ao parar o ciclo celular,

poderiam ser de grande valia no tratamento de tumores, considerando que uma das

principais caractersticas destes a reproduo descontrolada.

Em 1965 Rosenberg relatou o alongamento da Escherichia coli e o associou

presena de metais de transio no meio de cultura (Rosenberg, Vancamp e

Krigas, 1965); em 1969 Rosenberg sugeriu um grupo de complexos platnicos

como agentes antitumorais, inclusive a cisplatina (Rosenberg et al., 1969). J em

1971 ele demonstrou a atuao da cisplatina com a drstica reduo de um

sarcoma implantado em camundongos. Este experimento teve um grande efeito na

aceitao da cisplatina como agente antineoplasico (Rosenberg, 1971), e em 1978



27

a droga j estava aprovada para uso nos Estados Unidos pelo Food and Drug

Administration (FDA) para uma srie de tumores (Rosenberg, B., 1980). At hoje

a cisplatina utilizada como tratamento de primeira linha contra diversos cnceres

e apresenta taxa de cura de at 97% dos casos contra tumores de testculo, por

exemplo (Siegel, R., Naishadham, D. e Jemal, A., 2013).

Com a descoberta acidental de Rosenberg, um novo horizonte no tratamento

do cncer se abriu. Nenhuma droga (a maioria, compostos orgnicos de origem

natural) at ento apresentara respostas to significativas no tratamento da doena.

Com os resultados obtidos com a cisplatina, diversos compostos de coordenao

contendo platina comearam a ser investigados. O prprio Rosenberg se dedicou a

esta busca por anos (Rosenberg, 1973). Alm da platina, complexos contendo

outros metais como Pd, Au, Fe, Ru (Cutillas et al., 2013), Ir, Mg (Bruijnincx e

Sadler, 2008), Co e Cu (Gasser e Metzler-Nolte, 2012; Graf e Lippard, 2012) vm

sendo investigados como agentes antineoplasicos. A maioria destes apresentam

mecanismos de ao semelhantes ao da cisplatina, porm, alguns apresentam

comportamentos bem distintos.

2.3.1.1 Mecanismo de ao

Um entendimento completo dos mecanismos de ao da cisplatina ainda no

foi alcanado, e constantemente observam-se dados contraditrios na literatura

(Klein e Hambley, 2009). Sem dvida a cisplatina a droga base de platina mais

estudada e serve de referncia em termos de atividade e princpio farmacolgico

para as outras drogas de tratamento do cncer. O que se tem praticamente como

consenso que o principal mecanismo responsvel pela citotoxicidade da

cisplatina a formao de ligao covalente com o DNA, impedindo a diviso

celular e induzindo a clula a apoptose. Entretanto diversas frentes de atuao da

droga corroboram para sua eficincia.

A cisplatina administrada aps uma super-hidratao do paciente seguida

da administrao de diurticos de modo a diminuir os efeitos nefrotxicos da

droga. Um monitoramento atento do fluxo diurtico obrigatrio para o controle

da toxicidade, que se configura no maior fator limitante de dose deste frmaco

(O'dwyer, Stevenson e Johnson, 2000). Aps a aplicao da cisplatina por via

intravenosa, devido concentrao de cloreto no plasma sanguneo, a molcula



28

no sofre hidrlise e carreada pelo sangue em sua forma original. Em torno de

90% da cisplatina interage fisicamente com protenas do plasma como albumina, e

o restante solubilizado. A cisplatina se distribui rapidamente nos rgos e

tecidos, e encontrada principalmente no fgado e nos rins (O'dwyer, Stevenson e

Johnson, 2000). As concentraes plasmticas da droga decaem rapidamente,

sendo a meia vida da platina ultrafiltrvel no plasma, isto , solubilizada em sua

forma original, de 20 a 45 min. Aproximadamente 25% do frmaco excretado na

urina nas primeiras 24 h, at 90% eliminado em at cinco dias e o restante da

platina pode ficar retida no organismo por anos.

Muitos estudos tm sido realizados para esclarecer a farmacocintica dos

medicamentos base de platina, mas a maioria deles so baseados na

determinao total de Pt. A distribuio espacial de platina em linfcitos de

pacientes tratados com cisplatina e em linhas de clulas cultivadas so quase a

mesma: 20% na membrana, de 60% na fraco citoslica, 10% no citoesqueleto e

10% no ncleo (Zayed, Shoeib, et al., 2011).

Enquanto a cisplatina encontra-se no plasma sanguneo, ela permanece em

sua forma original devido concentrao de cloreto neste meio (aproximadamente

100 mmol L-1). Ao atravessar a membrana celular por difuso passiva ou atravs

de transporte ativo auxiliado por protenas de membrana como as chaperonas de

cobre (Blair et al., 2009), a cisplatina encontra um meio com uma concentrao de

cloreto da ordem de 3 a 20 mmol L-1 e sofre hidrlise convertendo-se nas formas

mais ativas da droga (Klein e Hambley, 2009; Galluzzi et al., 2012). Na Figura 2

(Klein e Hambley, 2009) esto ilustrados os possveis produtos de hidrlise que

determinaro a atividade da cisplatina no meio celular. Existem evidencias de

diversas interaes das formas ativas da cisplatina com o meio intracelular,

podendo-se dividi-las em dois grupos principais, ao no citoplasma e no ncleo.



29

Figura 2: Produtos da hidrlise da cisplatina aps cruzar a membrana celular (Klein e

Hambley, 2009).

Ao entrar na clula, a cisplatina interage com a membrana plasmtica

perturbando interaes lipdio-lipdio e lipdio-protena (Martins et al., 2008).

Acredita-se que esta interao pode provocar o recrutamento e ativao da

caspase-88 e consequentemente a ativao em cascata das outras caspases

conduzindo a clula apoptose caspase-dependente.

Na frao citoplasmtica a cisplatina interage com uma srie de espcies

nucleoflicas endgenas como a glutationa reduzida (GSH), metionina,

metalotioneinas, alm de outras protenas citoplasmticas (Barefoot, 2001;

Calderon et al., 2003; Finney e O'halloran, 2003; Galluzzi et al., 2012). A ao da

cisplatina no citoplasma tem um carter depletivo de espcies reduzidas,

formando um ambiente favorvel ao estresse oxidativo, que favorece a atuao da

droga no ncleo da clula (Galluzzi et al., 2012), no retculo endoplasmtico e na

8 Caspase-8 uma, de um grupo de protenas codificada pelo gene CASP8. A ativao

sequencial das caspases tem um papel central no processo de execuo da apoptose celular. O

nome "caspase" derivado dessa funo molecular caracterstica: cysteine-aspartic-acid-proteases.



30

mitocndria. Uma vez que a mitocndria atacada por espcies oxidantes, danos

a suas macromolculas como lipdios, protenas e DNA mitocondrial (Podratz et

al., 2011) induzem a apoptose tanto via caspase quanto por vias independentes de

caspase (Martins et al., 2008), (Pabla e Dong, 2008). Na Figura 3 so

apresentados os mecanismos de ao no nucleares da cisplatina. Ainda na frao

citoplasmtica da clula, a cisplatina interage com RNA (Hostetter, Osborn e

Derose, 2012), comprometendo a sinalizao celular e a expresso gnica.

Considerando o que se conhece at hoje, estes so os principais mecanismos

citotxicos da cisplatina exercidos na frao citoplasmtica da clula. Todas as

outras interaes da droga no citoplasma so consideradas como fontes de

resistncia, isto , diminuem a concentrao da cisplatina no citoplasma

disponvel para induzir a apoptose, e sero discutidas mais adiante.

Figura 3: Ao da cisplatina na frao no nuclear da clula (Adaptado de Pabla e Dong,

2008)

No ncleo da clula, a cisplatina se liga ao DNA alterando sua estrutura e

impedindo a replicao celular. Na Figura 4 ilustrada a estrutura do DNA aps a

ligao da cisplatina (Pabla e Dong, 2008). Os estudos estruturais que

determinaram a estrutura dos adutos de Pt-DNA foram conduzidos por difrao de

raios-x, e por espectroscopia de ressonncia nuclear magntica, alm de diversos

estudos com simulao computacional. Entretanto, todos estes estudos foram

feitos com o DNA isolado, purificado e fora de sua estrutura de cromatina, na qual

Ativao de Caspase-8

Ativao de Caspase-9

Ativao de Caspase-12

Via Mitocondrial

Citocromo C

Independente . de Caspase

Via de receptoresde apoptose Estresse RE



31

se encontra no meio celular, logo as concluses quanto estrutura no apresentam

uma correlao adequada com a configurao real da molcula em meio celular

ou com a resposta fisiolgica induzida pela droga. Durante muitos anos se

acreditou que este era o mecanismo de ao da cisplatina, entretanto, pesquisas

mais recentes vm elucidando, de forma mais clara e realista, o intrincado

mecanismo de ao da droga.

Figura 4: Estrutura do DNA aps ligao da cisplatina (adaptado de Gelasco e Lippard,

1998).

Cerca de 1% da cisplatina total absorvida pela clula encontra-se ligada ao

DNA nuclear (Gonzalez et al., 2001) A cisplatina interage com o DNA formando

uma srie de adutos, ligando-se preferencialmente posio N7 das bases

purnicas (adenina e guanina), podendo formar adutos duplos, com ligaes em

uma nica fita ou entre as fitas de DNA. A cisplatina pode ainda formar adutos

simples com bases de DNA ou ainda adutos de protena-DNA. Na Figura 5-b

observa-se a representao de alguns desses adutos.

O aduto majoritrio o cis-1, 2, [Pt(NH3)2]2+-d(GpG) intrafita, que responde

por 65% do total de adutos formados. O segundo mais abundante o cis-1, 2,

[Pt(NH3)2]2+-d(ApG) intrafita que responde por 25% dos adutos formados

enquanto que entre 5 e 10% dos adutos so cis-1, 3, [Pt(NH3)2]2+-d(GpNpG)

tambm intrafita, com uma frequncia menor encontra-se os adutos interfita (Todd

e Lippard, 2009).



32

As leses causadas ao DNA pela cisplatina ativam uma srie de mecanismos

de reparo, sendo o que envolve o sistema de reparo por exciso de nucleotdeo

(NER) o que constitui a mais importante via de retiradas de adutos da fita de

DNA. Entretanto, mecanismos de reparo de erro de pareamento (MMR) tambm

participam da remoo dos adutos de platina da fita de DNA. Quando as leses

so limitadas, a cisplatina induz uma parada do ciclo celular aprisionando a clula

em S ou G29, permitindo ao sistema de reparo reestabelecer a integridade do

DNA. Se o dano ao DNA muito extenso, ou seja, quando no pode ser reparado,

a clula evolui para a morte por apoptose ou, dependendo da dose de cisplatina,

por necrose.

9 G1, S e G2 indicam o estado de uma clula em relao mitose. As clulas em G1 esto

com seu contedo de DNA normal, S indica um estado onde a clula iniciou o processo de duplicao de seu contedo gentico; e G2 o estado em que todo o DNA da clula j se encontra duplicado, faltando a essa dividir-se em duas novas clulas filhas.

Adenina Timina

Estrutura de fosfato-desoxirribose

CitosinaGuanina



33

Figura 5: a) Modelo da estrutura do DNA evidenciando stios de ligao preferenciais; b)

adutos mais recorrentes da ligao da cisplatina com DNA (Esteban-Fernandez et al., 2010); c)

modelo de estrutura qumica de adutos formados pela oxaliplatina, anlogos aos formados pela

cisplatina (Zayed, Jones, et al., 2011).

A cascata de sinalizao mais importante, que liga a leso ao DNA causada

pela cisplatina morte celular por apoptose, envolve a ativao em sequncia de

uma srie de protenas no ncleo e no citoplasma. O processo se inicia por

ativao de protenas que percebem e sinalizam o dano presente no DNA, como

a checkpoint kinase 1 (CHEK 1), e por sua vez fosforila a protena supressora de

tumor TP53 (Shieh et al., 2000; Appella e Anderson, 2001; Zhao e Piwnica-

Worms, 2001). Uma vez ativada a TP53 dispara uma srie de funes letais no

ncleo e no citoplasma que culminam com a apoptose da clula. Alm deste

mecanismo, diversos outros vem sendo reportados e estudados, entretanto,

descrev-los est alm do escopo deste trabalho (Wang et al., 2006; Pabla e Dong,

2008; Galluzzi et al., 2011).

2.3.1.2 Efeitos Colaterais

Entre os efeitos colaterais mais comuns da administrao de cisplatina esto

os efeitos emetognicos10, ototoxicidade, anemia e nefrotoxicidade (O'dwyer,

Stevenson e Johnson, 2000).

Os efeitos emetognicos podem ser muito severos e comprometer o

andamento do tratamento com cisplatina. Em geral esses efeitos indesejados so

tratados com drogas que atuam no sistema nervoso central, como serotonina ou

antagonistas 5-HT3 como o ondansentron (Eisenberg et al., 2003).

A nefrotoxicidade , certamente, a maior preocupao em relao

administrao da cisplatina. A afinidade desses compostos pelas clulas renais, e

sua alta citotoxicidade culminam na induo de apoptose e tambm de necrose das

clulas renais, comprometendo os tecidos e a funo do rgo de forma reversvel

ou permanente. A nefrotoxicidade o mais importante dos fatores limitantes da

dose administrada de cisplatina. A disfuno renal induzida pela droga se

manifesta clinicamente por insuficincia renal, hipocalemia e hipomagnesemia.

10 Emetognicos i.e. provocam intensa irritabilidade no trato gastrointestinal, induzindo o

reflexo do vmito de forma intensa e difcil de controlar.



34

Os riscos destes efeitos colaterais so dose-dependentes e podem ser minimizados

com uma hidratao intensiva antes e durante a infuso da cisplatina (O'dwyer,

Stevenson e Johnson, 2000; Pabla e Dong, 2008). O principal mecanismo de ao

nefrotxica da cisplatina parece estar relacionado com a induo das clulas

epiteliais do tbulo proximal apoptose, conduzindo a um quadro clnico descrito

como necrose tubular aguda. A cisplatina induz apoptose nestas clulas,

principalmente por via mitocondrial. Medicamentos capazes de proteger a

mitocndria das clulas epiteliais dos tbulos proximais se apresentam como

promissores adjuvantes no tratamento de diversos tumores, possibilitando o

aumento das doses ministradas de cisplatina (Pabla e Dong, 2008; Podratz et al.,

2011).

Alguns efeitos colaterais dos compostos platnicos esto relacionados a

interaes com biomolculas ainda no sangue, sendo que os estudos dos possveis

compostos formados, sua estrutura e cintica de formao, podem ajudar a

entend-los e posteriormente evit-los. Estudos recentes comeam a elucidar as

estrutura de biomolculas formadas com a cisplatina ainda no sangue e que

transportam o medicamento at as clulas (Huang et al., 1995). Compostos com

grupos tiol, como a L-metionina, a L-cisteina e GSH reagem com as drogas base

de platina administradas a pacientes e existem evidncias de que a nefrotoxicidade

da cisplatina aumentada na presena de L-metionina. Mais recentemente o

espectro de biocompostos de interesse tem sido delimitado e tanto a estrutura de

protenas ligadas platina quanto de adutos de DNA tem sido indicados como os

mais ativos, tanto na ao oncoltica quanto nos efeitos colaterais (Takahara et al.,

1995; Teuben et al., 1999; Kelland, 2000; Timerbaev, Kung e Keppler, 2002;

Mcsheehy, S. et al., 2003; Kim et al., 2009; Wong et al., 2010).

2.3.1.3 Resistncia Cisplatina

A base da resistncia a cisplatina pode ser descrita seguindo o modo de ao

molecular da droga, que envolve vrios passos at a resposta da clula tumoral.

Processos celulares que impedem a apoptose mitocondrial, ou que os danos



35

causados ao DNA evoluam para apoptose induzida por p5311 (Jamieson et al.,

1999; Cohen e Lippard, 2001) so os principais fatores que prejudicam a

eficincia da cisplatina, levando a uma m resposta do tratamento. Uma melhor

compreenso do mecanismo pelo qual estas molculas so reguladas, bem como

de seus papis na sensibilidade e na resistncia droga so necessrias e ainda

no esto bem estabelecidas na literatura.

Vrias molculas esto envolvidas na resistncia cisplatina, a protena 1 de

ligao ao domnio metil-CpG (MBD1), que desempenha um papel importante na

progresso da doena, uma delas. Esta protena recrutada para locais de danos

ao DNA induzidos por cisplatina e atua no reparo do material gentico da clula,

conferindo a esta uma maior resistncia ao frmaco. Assim, o silenciamento da

expresso da MBD1 prejudica a resposta do sistema de verificao de danos ao

DNA, e, consequentemente, reduz significativamente a capacidade da clula de

reparar o DNA (Xu et al., 2013).

Outro modulador da atividade da cisplatina a protena Jun activating

binding protein (Jab1), uma protena multifuncional que participa no controle da

proliferao das clulas e na estabilidade de vrias protenas e desempenha um

importante papel na resposta celular cisplatina e a irradiao atravs do controle

de danos ao DNA e rotas de reparo (Pan et al., 2013). A Jab1 regula

positivamente a expresso da Rad5112 por via dependente de p53. O aumento da

expresso ectpica13 de Rad51 confere resistncia celular cisplatina, radiao

infravermelha e ao UV em clulas deficientes de Jab1. Pan et al. demostraram que

a Jab1 superexpressa em duas linhagens celulares de carcinoma de nasofaringe

relativamente resistentes cisplatina, radiao infravermelha e UV.

Fatores de transcrio FOXO, funcionando ao logo da cascata de sinalizao

PI3K-AKT-PTEN(PKB), so essenciais para a proliferao celular, diferenciao,

reparao de danos ao DNA e apoptose (Kwok et al., 2010). Pesquisas recentes

indicam que o fator de transcrio relacionado FOXM1 um alvo direto da

represso por protenas FOXO. A inativao da FOXO ou sobre expresso de

FOXM1 est associada com tumorgnese e progresso do cncer. Alm disso, os

11 Quando a cisplatina provoca um dano que no pode ser reparado a protena p53 inicia a

cascata de reaes que culminam na apoptose celular. 12 Rad51 uma protena que assiste no reparo de quebras nas duas fitas do DNA. 13 Expresso ectpica a expresso, num organismo, de um gene numa localizao em que

normalmente ela no acontece.



36

efeitos citostticos e citotxicos de um vasto espectro de drogas antineoplsicas,

tais como paclitaxel, doxorrubicina, lapatinib, gefitinib, imatinib e cisplatina, so

mediadas atravs da ativao de FOXO3a e/ou a inibio de seu alvo metablico,

a protena FOXM1. Paradoxalmente, protenas FOXO tambm contribuem para a

resistncia aos medicamentos, por influir na expresso de genes importantes para

o efluxo de drogas, bem como a reparao do DNA e os meios de sobrevivncia

celular em cnceres (Kwok et al., 2010) resistente a drogas.

Outro mecanismo presente em clulas resistentes cisplatina a reduo da

acumulao intracelular de drogas base de platina em sua forma ativa. Isto pode

resultar da reduo da absoro da droga, do aumento do efluxo de drogas ou do

sequestro intracelular. Embora um dos mecanismos de captao de cisplatina seja

mediado pela protena transportadora de cobre CTR1, o efluxo realizada por

dois outros canais de escoamento de cobre: as adenosina-trifosfatases tipo p

(ATP7A e ATP7B). Samimi et al. descreveu que as alteraes na expresso destas

protenas tm sido implicadas na resistncia cisplatina e a baixos ndices de

sobrevivncia de pacientes, em alguns tipos de cncer, mais notavelmente no

cncer de ovrio (Samimi et al., 2003). A chaperona ATOX1 foi recentemente

descrita como o transportador que conduz a Pt da CTR1 para ATP7B. A Pt parece

competir com a GSH na interao com essa protena. Adutos estveis de

ATOX1-Pt foram recentemente observados (Galliani et al., 2014).

Outro sistema de efluxo importante, cMOAT/MRP2, tm sua expresso

aumentada nas clulas tumorais. Vrios trabalhos demonstraram que este

transportador de membrana pode contribuir para a resistncia cisplatina (Xie et

al., 2010). MRP2 requer GSH como um cofator, e o seu papel na proteo contra

os efeitos citotxicos da cisplatina pode ser um resultado da sua capacidade para o

transporte de conjugados de GSH/cisplatina atravs da membrana plasmtica

(Tonigold et al., 2014). GSH pode trabalhar em conjunto com a cMOAT/MRP2

para bombear conjugados de GSH-cisplatina para fora das clulas de uma maneira

dependente de ATP. A resistncia cisplatina atravs deste mecanismo

completamente dependente de GSH (Arner et al., 2001). De fato, o aumento dos

nveis de GSH intracelular so frequentemente observados em tumores resistentes

cisplatina (Singh, Okamura e Ali-Osman, 2010).

Alm dos mecanismos de efluxo descritos anteriormente as clulas tambm

dispe da P-glicoprotena 1 (Pgp), esta uma importante protena de membrana



37

celular que bombeia muitas substncias estranhas para fora das clulas, isto ,

uma bomba de efluxo dependente de ATP que atua sobre um amplo espectro de

substratos (Aller et al., 2009). A Pgp uma glicoprotena que, em humanos,

codificada pelo gene ABCB1. A atividade da Pgp sobre a cisplatina no est

completamente elucidada, sabe-se que a cisplatina induz um aumento na

expresso de Pgp, entretanto a cisplatina no substrato para a bomba de efluxo,

isto , a protena transmembrana no capaz de transportar a cisplatina para fora

da clula diretamente. Entretanto observa-se, em clulas com uma maior

expresso da Pgp uma maior resistncia cisplatina.

A capacidade das drogas base de platina, e tambm de outros frmacos,

para formar ligaes com os grupos tiol, os tornam adequados para formar

ligaes com metalotionenas (MTs), que so protenas intracelulares, que contm

a maior quantidade de grupos tiol no citoplasma. O aumento do nvel de MT um

mecanismo de resistncia a esta classe de medicamentos, uma vez que a ligao

da droga MT, ainda na frao citoplasmtica, impede as molculas ativas de

cisplatina de alcanar o seu alvo: o DNA intranuclear das clulas tumorais

(Gumulec, Balvan, et al., 2014; Gumulec, Raudenska, et al., 2014).

A excision repair cross-complementation group 1 (ERCC1) uma

componente chave da maquinaria de reparo de DNA atravs da exciso de

nucleotdeos (NER). A expresso desta protena se apresenta marcadamente mais

elevada em diversas linhagens tumorais resistentes cisplatina (Bauman et al.,

2013; Ozdemir et al., 2013; Muallem, Braicu, et al., 2014; Muallem, Marnitz, et

al., 2014; Torii et al., 2014). A ao da ERCC1 produz fragmentos de DNA de

cadeia simples (de cerca de 30 nucleotdeos) contendo o aduto de Pt e protenas

do sistema NER ligadas. DNA polimerases e ligases preenchem a lacuna deixada

na fita de DNA, utilizando a fita complementar remanescente como um molde

(Friedberg, 2001).

2.3.2 Carboplatina

A cis-diammina (1,1-ciclobutanodicarboxilato) platina(II), comumente

chamada de carboplatina, um anlogo da cisplatina desenvolvida pela Bristol-

Myers Squibb com a colaborao de um nmero de oncologistas e institutos

acadmicos. A droga foi introduzida em testes clnicos em 1981 e foi aprovada



38

pelo FDA para uso em 1989 (Go e Adjei, 1999). Aps uma extensa triagem pr-

clnica que envolveu um grande nmero de derivados de platina, a carboplatina foi

escolhida principalmente por causa de sua menor toxicidade em comparao com

a cisplatina (Lebwohl e Canetta, 1998). Infelizmente, ela apresenta resistncia

cruzada com a cisplatina. O limitante da dose a mielossupresso14 provocada

pela administrao da carboplatina. A trombocitopenia15 o efeito colateral

predominante (Go e Adjei, 1999; O'dwyer, Stevenson e Johnson, 2000).

A carboplatina foi amplamente testada em um grande nmero de ensaios

clnicos aleatrios, avaliando-se sua eficcia em comparao cisplatina. A sua

atividade anti-tumoral foi demonstrada contra o cncer de ovrio. Uma meta-

anlise de 11 ensaios clnicos, que inclui mais de 2.000 pacientes, no indicou

superioridade de carboplatina sobre a cisplatina (Chemotherapy in advanced

ovarian cancer: an overview of randomised clinical trials. Advanced Ovarian

Cancer Trialists Group, 1991). A combinao de carboplatina com o paclitaxel16

de grande interesse, uma vez que a toxicidade desta reduzida. Esta combinao

utilizada nomeadamente em cnceres do ovrio, cabea e pescoo e bexiga, e em

NSCLC17 (Lokich e Anderson, 1998).

Figura 6: Produtos de hidrlise da carboplatina em meio aquoso (adaptado de (Pavelka,

Lucas e Russo, 2007).

14 Mielossupresso a diminuio da produo de clulas sanguneas pela medula ssea. 15 Trombocitopenia a reduo do nmero de plaquetas no sangue, deixando o paciente

mais suscetvel a hemorragias. 16 Paclitaxel um inibidor de mitose utilizado em regimes de quimioterapia combinado

com outras drogas. 17 NSCLC a sigla em ingls para Non Small Cell Lung Cancer.



39

Na prtica, a carboplatina substitui a cisplatina em diversas indicaes. A

dose tipicamente calculada com relao rea da superfcie corporal do

paciente, com uma dose mdia de 400 mg m-2, em comparao com 100 mg m-2

para a cisplatina. Alm da sua eficcia e toxicidade inferior, o regime de

administrao utilizado, com uma nica infuso rpida, mais prtico do que a

infuso prolongada tpico da administrao de cisplatina. (Desoize e Madoulet,

2002).

A carboplatina apresenta um ligante abandonador mais estvel que os

cloretos da cisplatina, o grupo carboxilato, que confere droga menor toxicidade,

porm tambm uma menor atividade.

2.3.3 Oxaliplatina

A trans-L-diaminociclohexano-oxalato platina(II), comumente chamada de

oxaliplatina foi sintetizada por Kidani na Universidade de Nagoya, Japo e foi

desenvolvida primeiramente na Frana, com o apoio dos Laboratrios Roger

Bellon, Debiopharm e Sanofi-Synthelabo. Esta droga foi selecionada para o

desenvolvimento, pois apresentou uma maior eficcia e uma menor toxicidade do

que a cisplatina em estudos pr-clnicos in vivo e, o mais importante, no

apresentou resistncia cruzada com a cisplatina.

O efeito colateral mais proeminente e que limita a dose a neuropatia

sensorial significativa, que no pode ser prevista. No incio do processo de

desenvolvimento do medicamento, Levi e colegas relataram a superioridade da

cronomodulao18 de perfuses sobre a infuso a velocidade constante nos

estudos pr-clnicos e clnicos com oxaliplatina (Boughattas et al., 1989;

Caussanel et al., 1990; Levi et al., 2000). Este modo particular de administrao

resultou numa toxicidade diferenciada. Para regimes de infuso com velocidade

constante, observou-se estomatite nos pacientes com maior frequncia. Em

contraste, para regimes de infuso com cronomodulao, os sintomas observados

com maior frequncia foram emese e neuropatia sensorial.

A oxaliplatina apresentou resultados interessantes em cnceres de ovrio, de

mama, cncer de cabea e pescoo, no linfoma no-Hodgkin, melanoma maligno, 18 Cronomodulao variao da velocidade de infuso da droga ao longo de um

determinado perodo.



40

glioblastoma e NSCLC. A sua eficcia mais notvel contra o cncer resistente a

outros derivados de platina. Os melhores resultados at agora tm sido obtidos no

tratamento de cncer colo-retal. Alm disso, uma sinergia significativa foi

observada com leucovorina e fluorouracilo e produz uma taxa de resposta

impressionante (De Gramont et al., 1997; Maindrault-Goebel et al., 1999).

A oxaliplatina apresenta um mecanismo de hidrlise particular e o produto

final significativamente diferente do da cisplatina e da carboplatina. A

oxaliplatina menos estvel mesmo em concentraes de cloreto mais elevadas

como as do plasma sanguneo. Nesse ambiente, a droga sofre hidrlise espontnea

ao entrar em meio biolgico aquoso, liberando o grupamento oxalato e mantendo

o diaminociclohexano (DACH). A espcie predominante Pt(DACH)Cl2 (Jerremalm et al., 2004). O grupo oxalato pode ser substitudo por espcies

nucleoflicas como Cl-, HCO3- e mesmo H2O. Na Figura 7 so apresentadas as

espcies mais abundantes em meio aquoso.

A oxaliplatina interage de forma irreversvel com os eritrcitos, e apena 5%

da droga injetada fica disponvel para entrar na clula. A quantidade de adutos

formados menor que os formados pela cisplatina em doses equivalentes,

entretanto o carter mais hidrofbico do grupo DACH parece dificultar o reparo

dos adutos, tornando a droga mais eficiente (Esteban-Fernndez et al., 2010).

Figura 7: Produtos de hidrlise da oxaliplatina.



41

Foi demonstrado que a oxaliplatina atua de forma semelhante s drogas

anlogas cisplatina e carboplatina. A oxaliplatina tambm exerce seu efeito

citotxico atravs da formao de adutos de DNA , Zayed et. al. demonstraram

que os adutos formados mais abundandes so G Pt (DACH) G, G Pt (DACH)

A (Zayed, Jones, et al., 2011). Entretanto, a eficincia da oxaliplatina no

apresenta correlao com a atividade de GSH ou da glutationa S transferase

(GST)19 (Arnould et al., 2003).

2.4 Determinao de biomolculas contendo metais: Metalmica.

No decorrer do processo evolutivo, minerais e ons disponveis na crosta

terrestre foram inseridos em processos biolgicos fundamentais de todos os seres

vivos. Diversos metais participam de processos fisiolgicos, sendo que alguns

ons metlicos, quando associados a polipeptdios, podem catalisar reaes

qumicas nicas e atuar em funes fisiolgicas especficas. Nos sistemas

celulares, os metais atuam como ativadores de protenas, equilibram foras

eletrostticas, catalisam reaes, etc. Assim, a vida est associada aos elementos

majoritrios e a elementos-trao, alm dos elementos tpicos das substncias

orgnicas C, H, O, N, P e S. Por outro lado, elementos como Hg, Pb e As, entre

outros, podem provocar danos significativos a sistemas biolgicos mesmo em

baixssimas concentraes (Caldern et al., 2003).

Neste contexto, os sistemas vivos possuem mecanismos para regulao das

concentraes dos elementos essenciais e, ao mesmo tempo, mecanismos de

defesa contra elementos cujo efeito acima de uma dada concentrao txico.

Elementos como Na, K, Ca e Fe desempenham papis vitais na maioria dos

organismos e esto presentes em concentraes bastante altas, ao mesmo tempo

elementos como Co, presentes em nveis da ordem de ng kg-1 tambm se

apresentam essenciais para a vida. A bioqumica dos elementos majoritrios j

bem compreendida e descrita, entretanto ainda se sabe pouco sobre o efeito dos

19 GST uma famlia de enzimas que catalisa a ligao da glutationa molculas txicas

para a clula, como a cisplatina por exemplo. Estas molculas ligadas a GSH ento so reconhecidas pelas bombas de efluxo Pgp e removidas do interior da clula.



42

metais encontrados em baixas concentraes associados a biomolculas. Para um

melhor entendimento neste campo necessrio um profundo entendimento da

qumica e da biologia envolvida, pois estudos meramente qumicos podem

conduzir a concluses irreais em sistemas biolgicos (Metallomics: whence and

whither, 2012).

A metalmica se apresenta como uma abordagem para estudar elementos

em sistemas biolgicos, correlacionando as espcies presentes e suas funes. A

International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) define metaloma

como a totalidade das espcies de um metal/metaloide presentes em um sistema

biolgico definido quanto sua identidade e/ou concentrao. J a metalmica

definida como o estudo do metaloma, interaes e conexes funcionais de um

elemento e suas espcies com genes, protenas, metablitos e outras biomolculas

em sistemas biolgicos (Lobinski et al., 2010).

No contexto biolgico, tornou-se claro que a determinao do contedo total

de um dado elemento no suficiente, necessrio conhecer, alm do contedo

total do elemento, sua distribuio nas diferentes formas qumicas em que se

apresentam (especiao), distribuio esta que ir determinar, por exemplo, sua

biodisponibilidade, toxicidade, etc. (Caruso et al., 2003).

2.4.1 Anlise de especiao

Para a completa aplicao da Metalmica, os mtodos de anlise qumica

devem ser capazes de determinar as diferentes espcies presentes nos sistemas

biolgicos. Para tanto, a anlise de especiao deve proporcionar: 1) limites de

deteco ainda menores que anlise de quantidades-trao totais, pois a parte

sempre menor do que o todo; 2) capacidade de separao das espcies, uma vez

que cada espcie participa de forma nica nos sistemas biolgicos; 3) pr-

tratamento suave de amostras, pois esta etapa no pode modificar a identidade

qumica das espcies (Michalke, 2003). Todo o conhecimento acumulado relativo

anlise de traos passa a necessitar de uma reviso, uma vez que, por exemplo,

procedimentos de preservao de analitos em quantidades-trao para a

determinao do contedo total geralmente no so aplicveis quando da

especiao.



43

Dentre os mtodos para determinao de analitos em quantidades-trao e de

anlise de especiao, de longe, os mais frequentes so os que se utilizam da

espectrometria atmica para deteco seletiva de elementos. Entretanto, no resta

dvida que os avanos mais impressionantes em termos de capacidade de

deteco associam-se s tcnicas de massa cuja principal vantagem associar

limites de deteco instrumentais extremamente baixos, rapidez, possibilidade de

discriminao isotpica e modos multi-elementares de anlise (Heumann, 2004).

A deteco por espectrometria de massa facilmente acoplvel a tcnicas de

separao (eletroforese capilar, CG e, principalmente, no presente caso, HPLC),

permitindo a fcil hifenao em linha, dado que a vazo de sada da fase mvel

compatvel com a vazo de entrada da amostra no espectrmetro. Tcnicas

hifenadas como HPLC-ICP-MS e LC-MS tm sido muito utilizadas na anlise de

especiao (Szpunar et al., 1999; Kelland, 2000; Timerbaev, Kung e Keppler,

2002; Mcsheehy, Shona et al., 2003; Rogers, Ray e Hieftje, 2010), aplicando-se

diversas tcnicas de separao por diferena de tamanho (SEC), troca aninica,

fase reversa, pareamento inico, entre outras (Esteban-Fernndez et al., 2010;

Hann et al., 2010). Nas suas primeiras verses, interferncias espectrais (espectro

de massa) de espcies poliatmicas eram mais frequentes. Entretanto, a melhor

resoluo de massa dos analisadores quadrupolares comerciais (os mais

populares) aliada introduo de clulas de coliso ou reao, em muito

diminuram este problema, permitindo a anlise de amostras mais complexas. O

ICP-MS conta ainda com a possibilidade de calibraes por diluio isotpica, um

mtodo de quantificao considerado absoluto (Sanz-Medel, Montes-Bayon e

Luisa Fernandez Sanchez, 2003).

Para a anlise de especiao a diluio isotpica pode ser utilizada de duas

formas particulares, com fortificao com a espcie especfica ou com uma

espcie no especfica (Koellensperger et al., 2008). No primeiro caso, a molcula

que se quer quantificar dever ser sintetizada utilizando o elemento enriquecido,

tornando possvel a co-eluio de ambos, o analito na frao fortificada e o analito

originalmente presente na amostra. Neste caso, o mtodo pode ser considerado

como primrio, de mais alta qualidade metrolgica. No segundo caso a calibrao

por diluio isotpica requer correes no processo de deteco que podem

comprometer a qualidade dos resultados (Herrmann et al., 1994). Mesmo vrios

anos aps as primeiras publicaes sobre especiao utilizando a diluio



44

isotpica, a calibrao espcie no especfica muito mais comum e aplicvel,

uma vez que h fornecedores comerciais de material enriquecido isotopicamente

para a maioria dos elementos, enquanto padres moleculares marcados

isotopicamente so raros de se encontrar comercialmente e difceis de se sintetizar

nos prprios laboratrios de pesquisa (Rodrguez-Gonzlez e Garca Alonso,

2010).

Na anlise de especiao, a confiabilidade das anlises deve ser avaliada

com as mesmas ferramentas de validao tpicas dos mtodos de anlise qumica.

O emprego de controles, padres internos e avaliao com materiais de referncia

certificados fundamental para a demonstrao da adequao dos mtodos ao uso

proposto. Entretanto, ainda so poucos os materiais de referncia com certificao

para diferentes espcies, e s vezes, a prpria padronizao questionvel, dado o

desconhecimento da forma exata em que se apresenta o elemento, isto entre outras

situaes anlogas (Caruso et al., 2003; Michalke, 2003) ainda impe uma grande

incerteza associada a estas medies, suscitando diferentes concluses e

divergncias entre grupos de pesquisa.

Os avanos recentes da metalmica e da anlise de especiao so notveis.

Diversos regulamentos tcnicos e legislaes j contemplam a determinao de

espcies de As, Se e Cr. A aplicao da especiao aos compostos de platina,

considerando sua ampla utilizao no tratamento do cncer, condio obrigatria

para se contribuir com a elucidao dos mecanismos de ao e resistncia dessa

classe de frmacos. Frente diversidade dos mecanismos envolvidos e

dificuldade dos processos biolgicos a serem compreendidos, poucos estudos

foram realizados. Mesmo os estudos in vitro realizados com material biolgico

no so totalmente representativos, e a falta de estudos in vivo ainda uma das

maiores dificuldades para o entendimento deste problema (Esteban-Fernndez et

al., 2010).

2.5 Clulas como Modelos Biolgicos

A utilizao de clulas como modelo uma tcnica de pesquisa bem

estabelecida. Atravs de modelos celulares, por exemplo, pode-se estudar reaes

que ocorrem nas clulas alvo de um tratamento com um frmaco citotxico. Esta

abordagem extremamente vantajosa, pois culturas de clulas so rapidamente



45

renovadas assim como diversos estudos podem ser conduzidos simultaneamente.

A desvantagem que no se pode observar o comportamento sistmico dos

frmacos ou das prprias clulas em seu ambiente natural, uma vez que a

vizinhana influencia o metabolismo celular, a ausncia da matriz extracelular real

pode introduzir erro sistemtico nos resultados. No entanto, como um modelo

inicial, esta uma abordagem largamente empregada e til.

A cultura de clulas envolve a manuteno destas em um ambiente que se

aproxime das condies naturais, provendo nutrientes, estabilidade trmica e

espao fsico para que estas cresam e se mantenham saudveis. Para clulas de

mamferos, em geral utiliza-se estufas com variabilidade trmica menor ou igual a

1C, com concentrao controlada de CO2 e protegidas da incidncia de luz.

Diversas linhagens celulares foram utilizadas neste trabalho: 1) clulas

leucmicas da linhagem K562 sensvel cisplatina; 2) clulas leucmicas

homologas K562, linhagem Lucena resistente cisplatina; 3) clulas de cncer

de pulmo linhagem H460; e 4) clulas de cncer de colo retal linhagem HCT-

116. A K562 foi a primeira linhagem celular de leucemia mieloide imortalizada.

Esta linhagem derivada de uma paciente do sexo feminino portadora de

leucemia mieloide crnica em crise blstica20. As clulas so arredondadas e no

aderentes (Lozzio e Lozzio, 1975; Drexler, 2001). A Lucena 1 uma linhagem

celular resistente a diversas drogas e foi selecionada a partir da linhagem K562. A

clulas que constituem esta linhagem foram inicialmente selecionadas para

resistncia a vincristina21. Esta linhagem apresenta diferenas em sua expresso

proteica, e em seu citoesqueleto. Quando comparada K562, ela apresenta

resistncia radiao UV e a diversas drogas, incluindo a cisplatina (Rumjanek et

al., 2001). A HCT116 uma linhagem celular maligna isolada de um paciente do

sexo masculino com carcinoma de clon. As clulas so do tipo epitelial,

aderentes e se apresentaram tumorgnicas em ratos. A H460 uma linhagem

celular obtida a partir do fluido pleural de um paciente do sexo masculino com

cncer de clulas grandes de pulmo. Esta linhagem aderente, tumorgnica e no

20 Crise blstica a fase final da evoluo da leucemia mieloide crnica, e comporta-se

como uma leucemia aguda, com rpida progresso e sobrevivncia curta. 21 Vincristina um alcaloide da vinca utilizado com quimioterpico, com atividade

antimittica.



46

apresenta grandes mutaes em seu DNA se comparada a clulas grandes de

pulmo normais (Banks-Schlegel e Quintero, 1986).

2.6 Tcnicas utilizadas

2.6.1 ICP-MS

A espectroscopia de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS)

pode ser utilizada para determinar a composio isotpica e concentrao de

grande parte dos elementos da tabela peridica. Ao serem nebulizadas, a partir de

uma soluo lquida, as amostras passam por processos que levam secagem da

nvoa, atomizao e ionizao ao longo de seu tempo de residncia no plasma de

alta temperatura. Uma frao dos ons que penetram no espectrmetro de massa

so ento separados e determinados. Como existe uma funo de calibrao

estabelecida entre a quantidade de analito em solues padres e o sinal produzido

na deteco, a quantificao pode ser realizada com exatido. A sensibilidade da

tcnica varia em funo dos elementos, como resultado das diferenas de: 1)

facilidade de ionizao; 2) nveis de fundo de elementos no ambiente; 3) o efeito

imposto pela matriz da amostra e 4) as interferncias de combinaes de tomos

que formam ons com a mesma razo massa/carga que o elemento a ser detectado.

Na Figura 8 apresentada a estrutura de um espectrmetro de massa com fonte de plasma indutivamente acoplado. O equipamento possui um sistema de

introduo de amostra, responsvel por admitir uma quantidade suficiente de

amostra com caractersticas adequadas para no perturbar o plasma a ponto de

extingui-lo ou desestabiliza-lo, alm de uma tocha com uma vazo suficiente de

argnio para manter o plasma aceso. O plasma iniciado atravs de uma descarga

Tesla atravs do fluxo de argnio. Esta descarga retira eltrons de alguns tomos

de argnio e um campo magntico oscilante gerado por uma bobina de induo

acoplada a um gerador de radiofrequncia estabiliza os ctions de argnio e os

eltrons. Uma reao em cadeia se estabiliza rapidamente nesta regio formando o

plasma. As temperaturas alcanadas no plasma variam entre 6000 e 10000 K, e,

virtualmente todas as molculas que chegam ao plasma so dissociadas e os

elementos ionizados. Desta forma o ICP uma fonte de ons muito abundante,



47

adequada para a determinao de aproximadamente 70% dos elementos da tabela

peridica.

Os ons so conduzidos ao analisador de massa atravs de uma interface de

presso intermediria presso atmosfrica da fonte de ICP e o alto vcuo

caracterstico da operao do espectrmetro de massa. A diferena de presso e/ou

uma diferena de potencial aceleram os ons que deixam o plasma em direo ao

detector. Aps a passagem pela interface, o feixe de ons colimado e as

partculas tem sua energia cintica ajustada em uma lente inica.

Alguns elementos sofrem interferncia de isbaros ou de ons poliatmicos

produzidos pelas condies extremas do plasma. No caso das interferncias

poliatmicas, elas podem ser contornadas com a escolha de istopos livres de

interferncia para se realizar o monitoramento do elemento de

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Thiago de Oliveira Araujo Determinação de Biomoléculas Derivadas de … · 2018-01-31 · obtenção do grau de Doutor pelo programa de Pós-graduação em Química Analítica