Alfredo Nicodemos da Cruz Santana Estudo da trombose ... Aos Professores Francisco Vargas, Mário Terra e Rogério de Souza, pela belo trabalho realizado junto à pós-graduação

Alfredo Nicodemos da Cruz Santana

Estudo da trombose microvascular em biópsias

pulmonares de pacientes com granulomatose de

Wegener

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de concentração: Pneumologia

Orientadora: Profa. Dra. Carmen Sílvia Valente Barbas

São Paulo

2008

DEDICATÓRIA

Dedico esta tese a:

Meus avôs Cândido, Manoel Denguinho, Neli e Raimunda

(grandes sonhadores no sertão cearense);

Meus pais José Alfredo e Maria Lourdes

(vida dedicada aos filhos);

Minhas irmãs Renata e Camila

(convívio de amor e amizade);

Minha noiva Natália

(fonte de força e esperança a cada amanhecer).

AGRADECIMENTOS

Aos Professores Francisco Vargas, Mário Terra e Rogério de Souza,

pela belo trabalho realizado junto à pós-graduação da Pneumologia.

À Professora Carmen Valente Barbas, minha orientadora, sempre

empenhada em transformar essa tese em uma realidade.

Ao Professor Carlos Carvalho, pelos ensinamentos e pelas palavras de

incentivo ao longo destes anos.

À Dra. Teresa Takagaki, com sua simplicidade e sabedoria, sempre

presente no ensino da Pneumologia.

Ao Dr. Ronaldo Kairalla, por nos ensinar a não crer cegamente nas

“verdades” da Medicina.

À Professora Vera Capelozzi e ao Dr Alexandre Ab'Saber, pela grande

ajuda na realização deste trabalho.

Aos pacientes do ambulatório da Pneumologia, Professora Gláucia

Santelli, Roberto, Dra. Telma Antunes, Dra. Juliana Barros, Dra. Walcy, Dr.

Edwin Parra, Jesus, Carmen e Amelinha, pelo convívio durante a realização

desta Tese.

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas

Lista de siglas

Lista de tabelas

Lista de figuras

Resumo

Summary

1.Introdução.........................................................................................................1

1.1.Granulomatose de Wegener: história e incidência........................................2

1.2.Acometimento sistêmico da granulomatose de Wegener.............................6

1.3.Enfatizando o acometimento do sistema respiratório na granulomatose de

Wegener..............................................................................................................9

1.3.1.Exames de imagem na granulomatose de Wegener.....................10

1.3.2.Função pulmonar na granulomatose de Wegener.........................12

1.3.3.Histopatologia pulmonar na granulomatose de Wegener..............14

1.4.Elevada incidência de eventos trombo-embólicos na granulomatose de

Wegener............................................................................................................17

1.4.1.Base fisiopatológica para o estado pró-trombótico na

granulomatose de Wegener....................................................................23

2.Hipótese do estudo.........................................................................................27

3.Objetivos........................................................................................................29

4.Métodos..........................................................................................................31

4.1.Delineamento e local do estudo...................................................................32

4.2.Preparo das amostras de tecido pulmonar..................................................34

4.3.Imunofluorescência utilizada para estudo das artérias pulmonares de

pequeno e médio calibre....................................................................................35

4.4.Quantificação da área do trombo, da área do lúmen ,da área livre do lúmen

e da área total das artérias pulmonares de pequeno e médio calibre...............36

5.Análise estatística...........................................................................................41

6.Resultados......................................................................................................43

7.Discussão.......................................................................................................50

7.1.O paradoxo: eventos trombo-embólicos numa vasculite (às vezes)

hemorrágica.......................................................................................................52

7.2.Esquematizando as alterações fisiopatológicas da granulomatose de

Wegener para explicar os achados trombo-embólicos......................................54

7.3.Possível papel da trombose in situ na fisiopatologia da granulmatose de

Wegener............................................................................................................57

7.4.Considerações sobre o potencial benefício da anticoagulação no

tratamento da granulomatose de Wegener.......................................................59

7.5.Eventos trombo-embólicos em outras vasculites.........................................61

8.Conclusão.......................................................................................................63

9.Perspectivas futuras.......................................................................................65

10.Referências bibliográficas.............................................................................68

11.Anexo I..........................................................................................................96

LISTA DE ABREVIATURAS

µm: Micrômetro.

µm2: Micrômetro ao quadrado.

nm: Nanômetro.

nM: Nanomolar.

mg: Miligrama.

dL: Decilitro.

LISTA DE SIGLAS

GW: Granulomatose de Wegener.

NNT: Número necessário para tratar.

RRA: Redução de risco absoluto.

IC: Intervalo de confiança.

ST: Sulfametoxazol-trimetoprim.

CAR: Colégio Americano de Reumatologia.

IRA: Insuficiência renal aguda.

ANCA: Anticorpo anticitoplasma de neutrófilo.

MTX: Metotrexate.

SNC: Sistema nervoso central.

SNP: Sistema nervoso periférico.

TGI: Trato gastrointestinal.

AVC: Acidente vascular cerebral.

IAM: Infarto agudo do miocárdio.

TC: Tomografia computadorizada.

PET: Tomografia por emissão de pósitrons.

PFP: Prova de função pulmonar.

DLCO: Capacidade de difusão do monóxido de carbono.

CO: Monóxido de carbono.

VO2: Consumo de Oxigênio.

LBA: Lavado broncoalveolar.

ETE: Eventos trombo-embólicos.

TVP: Trombose venosa profunda.

TEP: Tromboembolismo pulmonar.

LES: Lúpus eritematoso sistêmico.

WGET: Wegener's Granulomatosis Etanercept Trial.

PR3: Proteinase 3.

CEAp: Célula endotelial apoptótica.

TM: Trombomodulina.

FT: Fator tecidual.

LIM: Laboratório de investigação médica.

ICB: Instituto de Ciências Biomédicas.

InCor: Instituto do Coração.

HC: Hospital das Clínicas.

FMUSP: Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

FITC: Isômero de isocianato de fluoresceína.

H&E: Hematoxilina-Eosina.

CD34: Antígeno marcador de endotélio.

AT: Área do trombo.

AL: Área do lúmen.

ALL: Área livre do lúmen.

ATV: Área total do vaso.

AT/ATV: Divisão da área do trombo pela área total do vaso.

AL/ATV: Divisão da área do lúmen pela área total do vaso.

ALL/ATV: Divisão da área livre do lúmen pela área total do vaso.

TNF: Fator de necrose tumoral.

AD: Atividade de doença.

TAT: Complexo trombina-antitrombina III.

CIVD: Coagulação intravascular disseminada.

PDGF: Fator de crescimento derivado de plaqueta.

RNI: Relação normalizada internacional.

VCAM: Molécula de adesão de célula vascular.

ICAM: Molécula de adesão intercelular.

SAF: Síndrome antifosfolípide.

HAPI: Hipertensão arterial pulmonar idiopática.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Incidência de eventos trombo-embólicos (ETE) em diferentes

populações.

Tabela 2. Correlação entre marcadores séricos da GW e atividade de doença.

Tabela 3. Áreas (em µm2) de cada artéria no grupo granulomatose de

Wegener.

Tabela 4. Áreas (em µm2) de cada artéria no grupo Controle.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação da complexa interação entre neutrófilo, célula

endotelial e trombose in situ.

Figura 2. Sistema de microscopia confocal a laser

Figura 3. A. Artéria pulmonar sem trombo (grupo contole), com barra branca

correspondendo a um tamanho de 300 µm. B. Artéria pulmonar com trombo

(grupo GW).

Figura 4. A. O círculo branco contorna a parede externa do vaso, obtendo-se a

ATV. B. O círculo branco delimita a parede interna do vaso, determinando-se a

AL. C. O círculo branco contorna o trombo, obtendo-se a AT.

Figura 5. Gráficos do grupo GW e Controle em relação à ATV, AT e ALL.

Figura 6. Gráficos dos subgrupos GW1 e GW2 sobre as relações da AT/ATV,

AL/ATV e ALL/ATV.

Figura 7. Efeito de feedback positivo entre inflamação vascular - dano

endotelial - trombose in situ.

RESUMO

Santana, ANC. Estudo da trombose microvascular em biópsias

pulmonares de pacientes com Granulomatose de Wegener. [tese]. São Paulo:

Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2008.

A granulomatose de Wegener (GW) é associada com eventos trombo-

embólicos. Neste trabalho, quantificamos os trombos em artérias pulmonares

de pequeno/médio calibre de pacientes com GW (n:24), comparando com um

grupo Controle normal (n:16). O resultado mostrou que a área total das artérias

no grupo GW foi similar a do grupo Controle. Já a área do trombo foi

significativamente maior no grupo GW em relação ao Controle. Em

contrapartida, a área livre do lúmen do vaso foi significativamente menor no

grupo GW em comparação ao Controle. Concluindo, este estudo demonstra

uma obstrução da microcirculação pulmonar na GW, sugerindo um papel da

trombose in situ na fisiopatologia desta doença.

Descritores: Granulomatose de Wegener, Trombose, Pulmão, Biópsia,

Vasculite, Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos

SUMMARY

Santana, ANC. Study of microvascular thrombosis in lung biopsies of

patients with Wegener’s granulomatosis. [tese]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo; 2008.

Wegener’s granulomatosis (GW) is associated with thromboembolic

events. In this work, we quantified the thrombus in small/medium-sized

pulmonary arteries of patients with GW (n:24) compared to normal controls

(n:16). The results showed that the GW and control arteries were similar

regarding total area. The thrombus area was significantly increased in GW

compared to controls; in contrast, the free lumen area was significantly

decreased in GW compared to controls. In summary, this study shows

obstruction of microvascular bed in GW, suggesting a possible role of

thrombosis in situ in pathophysiology of this vasculitis.

Descriptors: Wegener granulomatosis, Thrombosis, Lung, Biopsy, Vasculitis,

Antibodies antineutrophil cytoplasmic.

1

Tese de Doutorado Alfredo Nicodemos da Cruz Santana

1. INTRODUÇÃO

2


1.1. Granulomatose de Wegener: história e incidência

A primeira descrição de um caso de GW foi realizada 1931 por Klinger

em uma necrópsia (1,2). Tal paciente apresentava sinusite com destruição

óssea, glomerulonefrite e vasculite disseminada (2). Entretanto, foi somente em

1936 que Wegener incorporou critérios clínico-histológicos para descrever uma

síndrome que ele acreditava ser única, e que receberia seu nome

(granulomatose de Wegener) (3).

Já na década de 50, Goldman e Churg descreveram mais 7 novos casos

de GW (4). Além disso, revisaram os 22 casos já relatados previamente na

literatura, e propuseram novos critérios clínicos e histopatológicos para o

diagnóstico desta doença (4). Os 3 critérios histopatológicos foram (I) lesão

granulomatosa necrozante no trato respiratório superior ou inferior, (II) vasculite

necrozante generalizada e (III) glomerulonefrite.

Até então, a presença de GW estava condicionada à presença de lesão

glomerular. Entretanto, na década de 60, Carrington e Liebow propuseram a

existência da forma limitada da GW ao descreverem 16 pacientes com achados

histopatológicos clássicos desta vasculite, mas com ausência de

glomerulonefrite (5). Essa descrição da forma limitada foi muito importante para

3


a GW, pois tem implicação direta tanto no tratamento quanto no prognóstico de

tais pacientes. A forma limitada pode ser tratada sem ciclofosfamida e

apresenta um melhor prognóstico.

Quanto ao tratamento da forma clássica, a introdução da ciclofosfamida

na década de 70 teve grande impacto no prognóstico da GW (6,7). De uma

sobrevida de 18% em 1 ano, passou a ser de 70-90% em 5 anos. Esses dados

foram corroborados por outros trabalhos publicados na década de 80 (8).

Entretanto, a taxa de recidiva de doença continuava alta, em torno de 50-70%

em 5 anos; necessitando da reintrodução da ciclofosfamida para controle da

mesma. Porém, ciclos repetidos de ciclofosfamida podem se associar com

efeitos adversos graves e até mesmo letais, como aparecimento de tumores

malignos (9,10).

Diante disso, na década de 90, foi testado o sulfametoxazol-trimetoprim

(ST) na prevenção de recidivas na GW (11). Felizmente, o resultado desse

trabalho foi positivo; 18% dos pacientes em uso de ST apresentaram recidiva

da doença em 24 meses, comparado com 40% no grupo placebo (p<0,05,

RRA:22%, NNT: 4,5).

Ainda na década de 90, o Colégio Americano de Reumatologia (CAR)

propôs novos critérios diagnósticos da GW (12). Dessa forma, para o

diagnóstico desta doença, é necessária a presença de 2 em 4 critérios

4


(sensibilidade de 88% e especificidade de 92%). Tais critérios são (I)

inflamação oral ou nasal (úlceras orais ou descarga nasal sanguinolenta ou

purulenta), (II) alteração na radiografia de tórax (nódulos, cavidades ou

infiltrados pulmonares), (III) hematúria microscópica no sedimento urinário ou

(IV) biópsia mostrando inflamação granulomatosa numa artéria ou região

periarterial.

Outro importante ponto para o diagnóstico e para o manejo terapêutico

da GW foi a descrição do anticorpo anticitoplasma de neutrófilo (ANCA). Este

ganhou grande espaço na literatura também na década de 90 (13). Entretanto,

deve-se ter cuidado para não supervalorizar o ANCA no diagnóstico desta

vasculite, na ausência de confirmação histopatológica; já que este anticorpo

pode estar presente em outras doenças, como fibrose cística, retocolite

ulcerativa, artrite reumatóide e lúpus eritematoso sistêmico. Da mesma forma,

não se deve utilizar o ANCA isoladamente para firmar que a doença entrou em

remissão ou em recidiva. Novamente, como em outras doenças, o julgamento

clínico-patológico-laboratorial é superior a um dado laboratorial isolado para

estabelecer-se um diagnóstico ou uma terapêutica.

Na presente década, novos trabalhos estão sendo realizados

especialmente com dois intuitos. Primeiro, diminuir a taxa de recidiva de

doença que continua alta mesmo com o uso de ST. Nesse ponto, o uso de

5


novas terapêuticas, como o etanercept, não conseguiu diminuir a taxa de

recidiva em GW, e associou-se a uma alta freqüência de efeitos colaterais

importantes, como aumento da incidência de câncer sólido (14). Segundo,

diminuir o tempo de exposição à ciclofosfamida, devido a seus importantes

efeitos colaterais (como cistite hemorrágica, câncer de bexiga e leucemia)

(15,16). Nesse sentido, em estudo utilizando a azatioprina após a remissão na

GW, esta droga se mostrou segura e benéfica para manter a doença fora de

atividade (17).

Por último, analisemos a incidência da GW (18,19). Em estudo realizado

com dados da Suécia no período de 1975-2001, a incidência anual de GW foi

0,33 (95% IC: 0,28-0,39) no período 1975-85, 0,77 (95% IC: 0,69-0,85) em

1986-90, e 1,19 (95% IC: 1,12-1,26) em 1991-2001; resultando numa

incidência anual média de 0,78 (95% IC: 0,74-0,82) (18). Tal incidência

crescente deve-se a introdução do ANCA no arsenal diagnóstico.

6


1.2. Acometimento sistêmico da granulomatose de Wegener

A GW, desde a sua descrição inicial, caracteriza-se por seu

acometimento sistêmico (1-4). Dessa forma, os principais órgãos acometidos

são o pulmão, o rim e o nariz / seios da face.

A lesão renal é muito importante na GW. Ela está presente em cerca de

75% dos pacientes e é histologicamente descrita como uma glomerulonefrite

necrozante pauci-imune. O envolvimento renal traz implicações na

classificação, no tratamento e no prognóstico dessa doença. A presença do

acometimento glomerular caracteriza a ‘forma clássica’ da GW (em oposição à

‘limitada’), o que confere um pior prognóstico, necessitando de uma terapêutica

baseada em ciclofosfamida (ao invés de MTX) (20,21). Recentemente, um

trabalho demonstrou o benefício de associar plasmaférese à ciclofosfamida em

casos com insuficiência renal aguda (IRA) e creatinina inicial > 5,8mg/dL (22).

Com isso, a taxa de dependência à diálise caiu de 51% para 31% em 3 meses

(NNT:5, RRA:20%).

Quanto ao acometimento otorrinolaringológico, este pode estar presente

em até 90% dos pacientes (1,23). Os principais achados são sinusite grave /

refratária, descarga nasal sangüinolenta, nariz em sela (destruição de septo

7


nasal), otite/mastoidite, surdez/labirintopatia e estenose laríngea (24-26).

Entretanto, as biópsias de tais lesões são geralmente inespecíficas e só

ajudam a confirmar o diagnóstico de GW em 10-20% dos casos (27). Além

disso, tais acometimentos trazem consigo um importante impacto negativo na

qualidade de vida desses pacientes, bem como podem interferir na taxa de

recidiva da doença e de lesões seqüelares (11).

Outro importante acometimento da GW é o oftalmológico. Tal

acometimento pode estar presente em até 50% dos pacientes, sendo

representado por conjuntivite, episclerite, esclerite, ceratite necrozante,

perfuração corneoscleral, uveíte posterior, neurite óptica, hemorragia/exsudato

retiniano ou papiledema (28-31). Outra importante manifestação da GW é a

proptose, que decorre de um processo inflamatório granulomatoso retroorbital e

está presente em cerca de 10% dos pacientes (28-31). Outras possíveis

causas de proptose são hipertireoidismo, miosite orbital, histiocitose e tumores

orbitários.

A GW, como outras vasculites, apresenta freqüentemente manifestações

cutâneas. Estas são pioderma gangrenoso, eritema nodoso, púrpura palpável,

petéquia, pápula, úlcera e rash (32-35). Em alguns pacientes, a lesão cutânea

pode representar a principal lesão da vasculite; sendo necessário, às vezes, o

uso de ciclofosfamida ou plasmaférese para controle de atividade de doença

8


(32). Histopatologicamente, a lesão cutânea é representada por vasculite

leucocitoclástica (a mais freqüente) e inflamação granulomatosa, dentre outras

(32-35).

Menos freqüentemente, a GW também pode acometer sistema nervoso

central (SNC), sistema nervoso periférico (SNP), coração, trato gastrointestinal

(TGI) e grandes artérias. Primeiro, alterações no SNC/SNP estão presentes em

cerca de 5-20% dos pacientes com GW. Estas podem ser AVC isquêmico, AVC

hemorrágico, insuficiência pituitária, convulsão, tumoração cerebral, paralisia

de nervo craniano, espessamento meníngeo e mononeurite; e decorrem de

processo vasculítico ou de lesão granulomatosa originária de seios de face ou

de órbita (36,37). Os fatores de risco para o acometimento do sistema nervoso

são sexo masculino, idade avançada e altos títulos de ANCA (37). Segundo, o

envolvimento cardíaco acontece em 8% dos casos, como pericardite,

miocardite, arterite/IAM e endocardite marântica (38-40). Terceiro, as

manifestações do TGI só acontecem em 5% dos casos, tais como dor

abdominal, diarréia sanguinolenta, perfuração intestinal e infarto esplênico (41-

43). Por último, relatos anedóticos descrevem lesão de grandes artérias na

GW, como aorta, carótida interna e mesentérica (44-46).

9


1.3. Enfatizando o acometimento do sistema respiratório inferior na

granulomatose de Wegener

O acometimento do sistema respiratório inferior na GW é em torno de

50-100% (23,47-53). Essa grande variação pode acontecer devido ao

acometimento pulmonar ser silencioso em até 30% dos pacientes. Dessa

forma, casuísticas oriundas de serviços de Pneumologia mostram um

acometimento pulmonar na GW bem mais freqüente do que as provenientes de

serviços de Reumatologia ou Nefrologia, provavelmente devido ao uso mais

freqüente de radiografia/TC de tórax e de broncoscopia pelos pneumologistas.

10


1.3.1. Exames de imagem na granulomatose de Wegener

A radiografia de tórax apresenta alguma alteração em mais de 70% dos

pacientes em diferentes séries de casos (23,51-53). Os achados mais comuns

são nódulos e massas (cavitados ou não), opacidades pulmonares e, bem mais

raramente, derrame pleural e linfadenomegalia.

Já a tomografia computadorizada (TC) de tórax mostra alterações mais

freqüentes e exuberantes do que a radiografia de tórax. Isso se deve a melhor

sensibilidade da TC para detecção de comprometimento intratorácico em

diversas doenças, inclusive a GW. Um exemplo bem claro disso é a freqüência

de linfadenomegalia intratorácica na GW que é de 20% na TC e de apenas 2%

na radiografia (53,54). Em nossa série de casos, as alterações detectadas na

TC foram nódulos (25,2%), nódulos cavitados (18,6%), massas (4,3%), massas

cavitadas (17,5%), opacidade pulmonar/vidro fosco (37,3%) e estenose de

traquéia/brônquio (9,8%) (23). Vale ressaltar que a cavitação tende a ocorrer

em nódulos pulmonares >2cm (23, 51-55). Com o tratamento, as alterações

tomográficas (como vidro fosco, opacidade pulmonar, nódulos e massas)

regridem, deixando como seqüelas, as opacidades lineares, fibrose discreta,

nódulos residuais ou cavidades de parede fina (56-58).

11


Recentemente, vem sendo descrito estudos com PET (tomografia de

emissão de pósitrons) na GW (59). Como em outras doenças pulmonares com

componente de vasculite ou de granuloma (Behçet, sarcoidose e tuberculose),

o PET também mostra captação pulmonar na GW (59-64). Além disso, este

exame pode servir para demonstrar a concomitância de outras vasculites

(como arterite de Takayasu) com a GW (63).

12


1.3.2. Função pulmonar na granulomatose de Wegener

As alterações das provas de função pulmonar (PFP) são diversas e até

opostas em diferentes pacientes com GW (47,49,65). Isso se deve ao fato da

doença apresentar múltiplos acometimentos, tais como alterações de vias

aéreas (estenose brônquica, bronquiectasia ou bronquiolite) com padrão

obstrutivo, ou lesões de parênquima (opacidade pulmonar, vidro fosco, fibrose

pulmonar) com padrão de restrição (47,49,65,66). Entretanto, com o tratamento

imunossupressor, tanto o padrão de restrição quanto o de obstrução podem

melhorar (65).

Quanto à difusão do monóxido de carbono (DLCO), novamente

podemos encontrar resultados paradoxais (47,49,65-67). Na maioria dos casos,

encontramos redução da difusão, porém na vigência de hemorragia alveolar há

aumento deste parâmetro da PFP (67). Esse aumento decorre da maior

presença de hemácias no alvéolo, as quais passam a captar mais monóxido de

carbono (CO) na PFP. Assim, o aparelho de função pulmonar interpreta que o

alvéolo está com uma maior taxa de difusão de CO. Entretanto, na realidade, a

difusão de oxigênio (o que realmente interessa para o ser humano) está

comprometida, pois o alvéolo está inundado por hemácias, comprometendo a

13


função da membrana alvéolo-capilar (67). Com isso, surgem as manifestações

de dispnéia e hipoxemia.

Além disso, as alterações na PFP podem trazer implicação direta na

capacidade de exercício destes pacientes. Em trabalho publicado em 2005, a

DLCO foi o único preditor da capacidade de exercício na análise multivariada,

podendo explicar 52% da variabilidade do pico de consumo de oxigênio (VO2)

(49).

14


1.3.3. Histopatologia pulmonar na granulomatose de Wegener

Classicamente, o diagnóstico de GW requer uma confirmação

histológica (1,12,20,21). O primeiro local a ser biopsiado é gengiva/nariz/seios

de face, depois rim e por último pulmão, por questões de ordem crescente de

risco de morbimortalidade relacionada a tal procedimento (1,12). Dessa forma,

os números de biópsias renais disponíveis são maiores, com conseqüente

maior número de estudos histopatológicos publicado pelos nefrologistas (68-

70). Entretanto, não se podem extrapolar todos os dados de estudos renais

para o acometimento pulmonar da GW. Conseqüentemente, é muito importante

estudar detalhadamente e sistematicamente o acometimento histológico

pulmonar nesta vasculite.

A biópsia pulmonar na GW pode ser broncoscópica, transtorácica e a

céu aberto (cirúrgica) (1,71-75). Entretanto, o rendimento diagnóstico com as

biópsias broncoscópicas e transtorácicas não é animador, além do fato de

poder ocorrer sangramento como complicação destes procedimentos (47,72).

Portanto, a biopsia cirúrgica mostra-se como o padrão-ouro para o diagnóstico

do acometimento pulmonar na GW. Quando opacidade focal ou nódulo/massa

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estão presentes, a biópsia cirúrgica tem um rendimento diagnóstico maior do

que 90% (71).

Os achados nas biópsias pulmonares da GW são diversos. Entretanto,

os mais importantes são vasculite (em até 94% dos casos), necrose geográfica

(50-84%), células gigantes (60-79%), microabscessos (40-69%), granulomas

(40-59%), capilarite (20-41%) e necrose fibrinóide (até 20%) (71-76). Quanto à

trombose in situ, este dado é pouco mencionado nos estudos histopatológicos

pulmonares, e, quando o é, a sua freqüência é de aproximadamente 5%.

Porém, esse dado pode estar subestimado, pois (I) estudos renais na GW

mostram freqüentemente trombos e deposição de fibrina, (II) relatos de casos

demonstraram até reversão da insuficiência renal na GW com o uso da

heparina (corroborando a importância da trombose e do potencial papel

terapêutico da anticoagulação nesta vasculite) e (III) outras vasculites (como

Behçet) são muito associadas com eventos trombóticos e embólicos (77-81).

É importante discutir o efeito do tratamento imunossupressor na

histopatologia pulmonar da GW. Em um estudo realizado com 20 biópsias

pulmonares provenientes de pacientes com GW e em uso de corticóide ou

ciclofosfamida, os principais achados foram fibrose e inflamação inespecífica

(74). Achados sugestivos da vasculite só foram descritos em 20% dos casos,

tal como necrose geográfica ou micronodular. Os autores sugeriram que os

16


granulomas se converteram em cicatrizes nodulares, e que a capilarite pode

propiciar o desenvolvimento de fibrose pulmonar, como já bem descrito na

poliangeíte microscópica, um outro tipo de vasculite ANCA associada (74,76).

Por último, vale à pena mencionar os achados do lavado broncoalveolar

(LBA) na GW. Estes achados são debris necróticos, células gigantes,

macrófagos com hemossiderina, aumento da percentagem de linfócito e/ou

neutrófilo, aumento da mieloperoxidase e do ANCA (82-84). Entretanto, com o

tratamento imunossupressor, o LBA pode mostrar diminuição dos neutrófilos,

do ANCA e da mieloperoxidase, corroborando o papel fisiopatológico destes na

GW (82-85). Além disso, o papel do ANCA na GW foi também demonstrado em

modelo experimental, ao se induzir vasculite e granuloma nos pulmões de ratos

após injeção sistêmica do ANCA (86). Uma relação de dose-resposta foi

também detectada entre a concentração do anticorpo injetado e as alterações

pulmonares descritas previamente, reenfatizando o papel fisiopatológico do

ANCA (86). Outro importante ponto deste estudo é a ausência de hemorragia

alveolar neste modelo experimental, o que pode ser visto (I) como um potencial

modelo para estudar o papel da anticoagulação na vasculite ANCA associada e

(II) como mais uma evidência de que a hemorragia alveolar não faz parte da

apresentação mais freqüente da GW (87-89). Na verdade, a hemorragia

alveolar acontece em menos de 5% dos pacientes com GW (1,87,88).

17


1.4. Elevada incidência de eventos trombo-embólicos na granulomatose

de Wegener

Dois recentes trabalhos encontraram uma alta incidência de eventos

trombo-embólicos (ETE) nesta população de paciente com GW (90,91).

Inclusive, esta incidência foi similar a encontrada no grupo de pacientes com

história prévia de TVP/TEP idiopático e maior do que a descrita no lúpus

eritematoso sistêmico (LES), doença classicamente relacionada com ETE.

Sendo assim, iremos discutir tais estudos.

O estudo de Merkel e colaboradores teve como objetivo determinar a

incidência de ETE (representado por TVP e/ou TEP) nos pacientes com GW

(90). Para isso, analisaram todos os pacientes que participaram do estudo

‘Wegener’s Granulomatosis Etanercept Trial (WGET)’, que foi um trabalho

multicêntrico, randomizado, duplo-cego, placebo controlado para determinar a

eficácia do etanercept (dose subcutâneo de 25mg duas vezes por semana)

associada à terapia padrão (corticóide mais ciclofosfamida ou MTX) no

tratamento de GW (14).

No referido estudo (WGET), os pacientes eram avaliados a cada 3

meses (14). A coleta de dados incluía o escore de atividade de GW, exame

18


físico, exames laboratoriais e anotação de efeitos adversos relacionados ao

etanercept. Ainda nesse estudo, todos os casos sintomáticos de TVP e/ou TEP

foram avaliados em separado, o que resultou no trabalho de Merkel et al (90).

Os casos sintomáticos de ETE foram definidos como edema assimétrico de

membro inferior, dispnéia, hipoxemia, dor torácica ou hemoptise; e foram

confirmados por exames complementares, tais como ultrassonografia com

Doppler, cintilografia pulmonar de ventilação-perfusão, TC helicoidal ou

angiografia. Este estudo encontrou 16 casos de TVP e/ou TEP em 228

paciente-anos. Dessa forma, a incidência de ETE foi de 7 casos / 100 paciente-

anos (95% IC: 4,0 a 11,4), não diferindo entre o grupo em uso de etanercept e

o grupo placebo. Vale ressaltar que 13 dos 16 casos de ETE (81%) ocorreram

quando o paciente estava em atividade de doença, e que tais pacientes não

tinham história prévia de TVP e/ou TEP. Na comparação dos pacientes com

GW que tiveram ou não ETE, não houve diferença significativa em importantes

pontos, como uso de aspirina, número de hospitalizações e tempo de

hospitalização (90).

Para contemporizar esta alta incidência de ETE em GW (7 casos / 100

paciente-anos), comparou-se este dado com outras populações. A incidência

de TVP e/ou TEP em população saudável é de apenas 0,31 casos / 100

pessoa-anos; já em LES, de 1,0 caso / 100 paciente-anos (92,93). Além disso,

19


a incidência de ETE em população com artrite reumatóide tratada com

etanercept é de apenas 0,26 casos / 100 paciente-anos (95% IC: 0,1 to 0,5);

logo a alta incidência de ETE encontrada na GW não pode ser atribuída ao uso

de etanercept (tabela 1) (90).

Tabela 1. Incidência de eventos trombo-embólicos (ETE) em diferentes

populações.

População Casos de ETE / 100 paciente-anos

GW 7,00

Vasculite ANCA associada 4,30

História prévia de ETE idiopáticos 7,20

LES 1,00

Artrite reumatóide - Etanercept 0,26

Pessoas saudáveis 0,31

20


Dessa forma, este trabalho de Merkel e colaboradores sugere um risco

aumentado de ETE em pacientes com GW (90). Além disso, tal risco

compartilha uma importante relação com atividade de doença em GW. Por fim,

a possível implicação clínica deste estudo é alertar os médicos para a

possibilidade de TEP, e não só de hemorragia alveolar, em pacientes com GW

apresentando dispnéia e hemoptise.

Faz-se importante também discutir o estudo de Weidner e colaboradores

(91). Diante dos dados do estudo de Merkel e colaboradores, Weidner avaliou

a incidência de ETE em um grupo de pacientes com vasculite ANCA associada

(GW, poliangeíte microscópica e vasculite ANCA associada limitada ao rim)

acompanhado na University of Erlangen-Nurnberg na Alemanha de 1986 a

2001 (91). Esta avaliação foi realizada através de análise retrospectiva dos

prontuários médicos de tais pacientes. Em relação à investigação de TVP e/ou

TEP, ultrassonografia com Doppler foi realizada em todos os pacientes com

suspeita clínica de ETE. Já o diagnóstico de TEP foi estabelecido com

cintilografia pulmonar de ventilação-perfusão ou TC helicoidal. Foram ainda

avaliadas a presença de história prévia de TVP/TEP, a atividade de doença e

os fatores de riscos para ETE.

Nesse estudo, foram encontrados 105 pacientes com vasculite ANCA

associada. Todos tinham acometimento renal, sendo também freqüentes as

21


manifestações pulmonares e otorrinolaringológicas. Treze pacientes

apresentaram ETE durante atividade de doença (detectado TVP em 12 e TEP

em 6 pacientes), sendo duas embolias pulmonares com evolução fatal. Além

disso, ocorreram 3 casos de TEP em pacientes fora de atividade de doença.

Na contabilidade final, ocorreram 16 casos de ETE em 367,5 paciente-anos,

correspondendo a uma incidência de 4,3 casos / 100 paciente-anos (95% IC:

1,6 a 10,2). Porém, os próprios autores consideraram que esta incidência

poderia ser maior caso não tivessem incluído pessoas com vasculite limitada

ao rim, pois tais pacientes não apresentam inflamação/disfunção vascular

sistêmica, o que propiciaria ainda mais o surgimento de ETE (91). Além disso,

novamente correlacionou-se a alta incidência de ETE nas vasculites ANCA

associada (dentre elas, a granulomatose de Wegener) com a atividade de

doença (91). A base fisiopatológica para tal achado será discutido a seguir,

num tópico separado.

Em relação aos fatores de risco trombo-embólico, estes não foram

encontrados em nenhum dos pacientes (91). Vale à pena ressaltar que os

fatores pesquisados foram neoplasia, cirurgia, trauma, gestação, uso de

anticonceptivo oral, terapia de reposição hormonal, imobilização, obesidade,

proteinúria em nível nefrótico e distúrbios da coagulação, tais como deficiência

22


de proteína C e S, deficiência de antitrombina III e ainda anticorpos

antifosfolípides.

Assim, este trabalho corrobora o dado de risco aumentado de ETE em

pacientes com vasculite ANCA associada, especialmente com GW (91). Por

fim, tal risco novamente compartilha uma importante relação com atividade de

doença (em 13 dos 16 casos de TVP/TEP), não estando associado a outros

fatores de risco tromboembólico, como neoplasia ou trombofilia (89-91).

23


1.4.1. Base fisiopatológica para o estado pró-trombótico na


São várias as bases fisiopatológicas para o achado de trombose in situ e

de elevada incidência de ETE na GW. Até então, esta doença era

estigmatizada pela hemorragia alveolar. Conforme visto, há forte associação

entre ETE e atividade de doença, pois vários marcadores séricos de atividade

de doença na GW, tais como ANCA, proteinase 3 (PR3), célula endotelial

apoptótica (CEAp) e trombomodulina (TM), determinam, em última instância,

um estado pró-trombótico (Figura 1) (90,91,94-100).

Primeiramente, o ANCA induz uma ativação prematura dos neutrófilos

(Figura 1). Com isso, a interação neutrófilo-endotélio é perturbada, com

conseqüente lesão endotelial (97,101,102). Neste momento, vale à pena

relembrar que um dos elementos da tríade de Virchow, a qual propõe os

mecanismos responsáveis pela trombose, é a injuria endotelial.

Outro importante marcador sérico de atividade em GW é PR3 (100).

Esta é produzida pelos neutrófilos ativados e causa apoptose de célula

endotelial (100). Tal apoptose na vasculite ANCA associada foi demonstrada

tanto em modelo experimental, quanto em biópsia renal e pulmonar de

24


pacientes com a referida vasculite sistêmica (103,104). As conseqüências do

fenômeno apoptótico endotelial são o aumento da expressão de fator tecidual

(FT - um fator pró-trombótico), e diminuição de TM (um fator anticoagulante) na

superfície endotelial; favorecendo-se novamente um estado pró-trombótico. Tal

dado é corroborado pelos achados de fibrina e de trombose em biópsias renais

realizadas em pacientes com GW (77-79).

Não se deve esquecer da dosagem sérica de CEAp (Tabela 2). Esta se

correlaciona positivamente com atividade de doença em GW e com quantidade

de células apoptóticas no endotélio, com sua conseqüente repercussão pró-

trombótica (98).

Por fim, a TM sérica representa um fragmento inativo da TM liberado

das células endoteliais após uma injúria/lesão (Tabela 2) (99). Logo, a TM

sérica não possui propriedade anticoagulante; e pelo contrário, surge em

situações de dano endotelial, com conseqüente propensão a formação de

trombos. Dessa forma, o aumento de TM sérica deve ser encarado como

marcador de um estado pró-trombótico, e não apenas como marcador de

atividade em GW (99,105,106).

25


Figura 1. Representação da complexa interação entre neutrófilo, célula

endotelial e trombose in situ.

26


Tabela 2. Correlação entre marcadores séricos da GW e atividade de

doença.

Marcador sérico da GW Correlação entre nível sérico do

marcador e escore de atividade de

doença

CEAp r:0,7*

TM r:0,4*

ANCA r:0,2*

*p<0,05

27


2. HIPÓTESE DO ESTUDO

28


Presença de trombose in situ nas artérias pulmonares de pequeno /

médio calibre na GW, tendo em vista o estado pró-trombótico descrito nesta

vasculite.

29


3. OBJETIVOS

30


Estudar a freqüência da trombose in situ em artérias pulmonares de

pequeno / médio calibre em tecido pulmonar de pacientes portadores de GW,

bem como quantificar tais trombos, em comparação com controles normais na

microscopia confocal a laser.

31


4. MÉTODOS

32


4.1. Delineamento e local do estudo

Este estudo quantitativo e controlado consistiu da análise de 24 artérias

pulmonares de pequeno / médio calibre (diâmetro externo de 20 a 300 µm)

obtidas de amostras teciduais de biópsia pulmonar cirúrgica de seis pacientes

que preencheram os critérios diagnósticos de GW do Colégio Americano de

Reumatologia e que são acompanhados no ambulatório de vasculites

pulmonares da Disciplina de Pneumologia do InCor-HC-FMUSP (12). As

amostras foram comparadas com 16 artérias pulmonares de pequeno / médio

calibre provenientes de tecido pulmonar histologicamente normal de necrópsias

de pacientes cuja causa de óbito foi não pulmonar.

A preparação das lâminas foi realizada no Laboratório de Investigação

Médica 05 (LIM-05) do Departamento de Patologia e no LIM-17 da Disciplina

de Reumatologia da FMUSP. Já a análise das lâminas foi realizada no

Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do ICB-USP, através

de microscopia confocal a laser (ZEISS-LSM510 com três fontes de laser

ARGON-488nm/HeNe1-543nm/He-Ne2-633 nm, associado a um microscópio

de fluorescência ZEISS Axiovert). Este estudo foi aprovado pela Comissão de

Ética para análise de projetos de pesquisa do HC-FMUSP.

33


DELINEAMENTO DO

ESTUDO

LÂMINAS DE GW LÂMINAS DE PULMÃO

NORMAL

IMUNOFLUORESCÊNCIA ANTI-

CD34

MICROSCOPIA CONFOCAL A

LASER

ARTÉRIAS DE PEQUENO/MÉDIO

CALIBRE:

20µm≤DIÂMETRO≤300µm

CÁLCULO DA ÁREA: TROMBO, LÚMEN DO

VASO, LIVRE DO LÚMEN DO VASO, TOTAL

DO VASO

ANÁLISE ESTATÍSTICA

34


4.2. Preparo das amostras de tecido pulmonar

As amostras de pulmões utilizadas neste estudo foram obtidas através

de biópsia pulmonar a céu aberto de pacientes que preencheram os critérios

diagnósticos de GW recomendados pelo Colégio Americano de Reumatologia

(12). Foram também incluídas, com grupo Controle, amostras de tecido

pulmonar histologicamente normal de necrópsias de pacientes cuja causa de

óbito foi não pulmonar

Os dois grupo (GW e Controle) tiveram blocos de parafina de tecido

pulmonar separados, tendo a face pleural representada. Após a seleção, os

blocos foram cortados em espessura de 7 µm para posterior coloração em

Hematoxilina-Eosina (H&E), para confirmar o diagnóstico de GW no grupo GW

e para atestar a normalidade do tecido pulmonar no grupo Controle.

35


4.3. Imunofluorescência utilizada para o estudo das artérias pulmonares

de pequeno e médio calibre

Após a revisão histológica, cortes de 20 µm de espessura foram

realizados nos blocos de parafina. Logo após, eles foram desparafinados e

então aquecidos em buffer de citrato a 10mM / pH:6,0 por 50 minutos, com o

intuito de expor os antígenos. Após isso, o tecido foi incubado com anticorpo

monoclonal de rato anti-célula endotelial humana (marcador de antígeno CD34

ou marcador de endotélio) (NOVOCASTRA LABORATORIES-United Kington,

clone: QBEnd/10) na diluição de 1/80 e em alta temperatura. Finalmente, o

tecido foi revelado com anticorpo monoclonal de rato conjugado com isômero

de isocianato de fluoresceína (FITC) anti-anticorpo de rato, em diluição de 1/40

(Sigma Chemical Co), funcionando como anticorpo secundário / revelador, e

montado em meio aquoso.

36


4.4. Quantificação da área do trombo, da área do lúmen, da área livre do

lúmen e da área total das artérias pulmonares de pequeno e médio calibre

Após a preparação descrita, cada amostra de tecido pulmonar (tanto do

grupo GW, quanto do Controle) foi analisada através de microscopia confocal a

laser (ZEISS-LSM510,com três fontes de laser ARGON-488nm, HeNe1-543nm

e He-Ne2-633 nm) acoplado a um microscópio de fluorescência (ZEISS

Axiovert 100M) (figura 2).

A análise das lâminas no grupo GW foi iniciada no centro da lesão

pulmonar relacionada a esta vasculite. Percorremos a referida lesão em forma

de espiral até encontrarmos 4 artérias pulmonares. Já a análise das lâminas no

grupo Controle foi iniciada no centro da lâmina, e percorremos a lâmina em

forma de espiral até encontrarmos 4 artérias pulmonares. Todas as imagens

das artérias pulmonares geradas pela microscopia confocal foram

armazenadas no computador. Os únicos critérios de inclusão das referidas

artérias pulmonares, tanto no grupo GW quanto no grupo Controle, eram que a

relação entre o menor diâmetro externo e o maior diâmetro externo da artéria

pulmonar fosse maior que 0,6 (para garantir um corte transversal ao maior eixo

do vaso), e que o maior diâmetro externo da artéria fosse maior que 20 µm e

37


menor que 300 µm (para garantir que trabalhávamos com artérias de

pequeno/médio calibre). Vale mencionar que o uso do anticorpo marcador de

endotélio foi importante, pois facilitava o encontro dos vasos no tecido

pulmonar.

Figura 2. Sistema de microscopia confocal a laser.

38


Posteriormente, as imagens armazenadas no computador foram

analizadas com o programa ZEISS-LSM Image Browser. Este se encontra

disponível gratuitamente na página da internet do Departamento de Biologia

Celular e do Desenvolvimento-ICB-USP (http://www.biocel.icb.usp.br/). Para

determinar a ausência ou a presença de trombo nas artérias em estudo,

utilizamos o critério visual, como classicamente descrito na literatura (figura 3)

(71-75). A freqüência de trombo no grupo GW foi comparado a do grupo

Controle. Já para quantificarmos a área do trombo (AT), a área do lúmen do

vaso (AL), a área livre do lúmen do vaso (ALL) e a área total do vaso (ATV),

utilizamos um cursor para marcar e circundar a área específica em estudo;

como feito similarmente no analisador de imagem da microscopia óptica (figura

4) (107). O programa ZEISS-LSM Image Browser nos dava automaticamente o

tamanho da área marcada em µm2. Além disso, fizemos a relação de correção

da AT pela ATV [(AT/ATV)x100%], da AL pela ATV [(AL/ATV)x100%], da ALL

pela ATV [(ALL/ATV)x100%]. Dessa forma, as áreas e as relações de correção

obtidas no grupo GW foram comparadas às do grupo Controle.

Por último, dividimos o grupo GW em dois subgrupos, denominados

GW1 e GW2. Calculamos a mediana da ATV no grupo GW, e então, as artérias

com ATV abaixo da mediana ficaram no subgrupo GW1, e as artérias com ATV

acima da mediana foram alocadas no subgrupo GW2. Em cada subgrupo,

39


calculamos a AT, AL, ALL, ATV, bem como a relação de correção AT pela ATV

[(AT/ATV)x100%], da AL pela ATV [(AL/ATV)x100%], da ALL pela ATV

[(ALL/ATV)x100%].

Figura 3. A. Artéria pulmonar sem trombo (grupo contole), com barra

branca correspondendo a um tamanho de 300 µm. B. Artéria pulmonar

com trombo (grupo GW).

A B

40


Figura 4. A. O círculo branco contorna a parede externa do vaso, obtendo-

se a ATV. B. O círculo branco delimita a parede interna do vaso,

determinando-se a AL. C. O círculo branco contorna o trombo, obtendo-se

a AT.

A B

C

41


5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

42


A análise estatística foi realizada com o programa estatístico SPSS

(SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Os dados foram expressos como freqüência e

percentagem para variáveis categóricas, e como média ± desvio padrão para

variáveis contínuas. Foi usado o teste exato de Fisher para análise dos dados

categóricos, sendo calculado também o odds ratio. Adicionalmente, foi testada

a distribuição normal dos dados contínuos com o teste Kolmogorov-Smirnov.

Após isso, foi usado o teste de Mann-Whitney para comparação entre as

variáveis não-paramétricas, não-pareadas. A significância estatística foi

considerada como p<0,05.

43


6. RESULTADOS

44


Os trombos estiveram presentes em 22 de 24 (91,67%) artérias

pulmonares de pequeno/médio calibre do grupo GW e em nenhuma das 16

(0%) artérias do grupo Controle (p<0,0001). Dessa forma, encontrou-se um

odds ratio de 297,00 (95% IC: 13,34-6612).

A média da ATV do grupo GW e do grupo Controle foram similares

(32604 ± 17830 µm2 versus 32970 ± 11356 µm2, p:0,8793) (tabela 3, tabela 4,

figura 5). Essa ausência de diferença na área total nos permite dizer que

estamos trabalhando com vasos de mesmo calibre no grupo GW e Controle,

como pretendido pelo desenho deste estudo. Já quando comparamos a AT e a

relação AT/ATV(x100%), encontramos um valor maior no grupo GW em

relação ao Controle (10068 ± 9525 µm2 versus 0,00 ± 0,00 µm2, p<0,0001; e

31,86 ± 20,40 % versus 0,00 ± 0,00 %, p<0,0001). Além disso, a AL e a relação

AL/ATV(x100%) foi significantemente menor no grupo GW do que no grupo

Controle (16184 ± 10592 µm2 versus 24707 ± 8717 µm2, p:0,0135; e 48,82 ±

14,95 % versus 75,44 ± 7,10 %, p<0,0001); demonstrando indiretamente que

as artérias na GW tem uma parede mais espessada, provavelmente devido a

infiltração destas paredes por células inflamatórias. Por último, a ALL e a

relação ALL/ATV(x100%) foi também significantemente menor no grupo GW do

que no grupo Controle (6116 ± 5956 µm2 versus 24707 ± 8717 µm2, p<0,0001;

45


e 16,96 ± 15,30 % versus 75,44 ± 7,10 %, p<0,0001), demonstrando a

obstrução do leito vascular nesta vasculite.

Em relação aos subgrupos, o subgrupo GW1 apresentou ATV menor do

que o subgrupo GW2 (18082 ± 9374 µm2 versus 47126 ± 10806 µm2,

p<0,0001), como pretendido pela divisão dos subgrupos (figura 6). Já a AT foi

menor no subgrupo GW1 do que no GW2 (4436 ± 2826 µm2 versus 15700 ±

10609 µm2, p:0,0094) , entretanto essa diferença desaparece quando se

corrige a AT pela ATV [(AT/ATV)x100%], 31,60 ± 21,41 % versus 32,13 ± 20,31

% (p:0,9539). A AL também foi menor no subgrupo GW1 do que no GW2 (8138

± 4203 µm2 versus 24232 ± 8698 µm2, p:0,0002), entretanto esta diferença

desaparece com a correção da AL pela ATV [(AL/ATV)x100%], 46,61 ± 15,67

% versus 51,03 ± 14,53 % (p:0,5067). Novamente, a ALL foi menor no

subgrupo GW1 do que no GW2 (3702 ± 4881 µm2 versus 8531 ± 6134 µm2,

p:0,0194), e novamente essa diferença desaparece quando se corrige a ALL

pela ATV [(ALL/ATV)x100%], 15,01 ± 16,27 % versus 18,90 ± 14,71 %

(p:0,3408). Assim, o acometimento das artérias pulmonares é

proporcionalmente similar nos dois subgrupos GW1 e GW2.

46


Tabela 3. Áreas (em µm2) de cada artéria no grupo granulomatose de

Wegener.

Paciente ATV AL AT ALL1 11344,83 4376,67 3843,59 533,08 68979,19 24175,78 7771,92 16403,86 41761,15 28591,03 11119,24 17471,79 49351,64 32112,14 30354,53 1757,61

2 51631,11 32611,73 19215,60 13396,13 30473,77 13686,23 0,00 13686,23 35412,97 16600,98 0,00 16600,98 17697,77 6856,32 6194,89 661,43

3 31540,42 14954,77 4152,30 10802,47 61820,08 33110,59 27008,97 6101,62 50393,78 23044,54 22084,37 960,17 53692,86 34985,55 29430,26 5555,29

4 37816,26 10788,41 5966,08 4822,33 41866,56 27688,65 20484,02 7204,63 17946,73 11683,01 11165,83 517,18 10906,45 6491,35 6094,65 396,70

5 7220,48 4980,19 4413,37 566,82 19951,20 12680,84 4190,36 8490,48 37192,96 11912,28 1535,06 10377,22 13478,50 6277,83 5195,03 1082,80

6 10029,20 1794,12 1165,68 628,44 11474,78 4840,50 4663,20 177,30 34925,54 9039,75 2156,81 6882,94 35598,79 15156,56 13432,15 1724,41

47


Tabela 4. Áreas (em µm2) de cada artéria no grupo Controle.

Paciente Controle ATV AL AT ALL

1 30580,44 22192,55 0,00 22192,55

50305,63 39337,74 0,00 39337,74

23963,48 18359,02 0,00 18359,02

39477,12 31837,27 0,00 31837,27

2 29898,45 23323,02 0,00 23323,02

24795,34 18799,99 0,00 18799,99

20058,94 16427,72 0,00 16427,72

59227,84 45659,25 0,00 45659,25

3 34455,89 27783,00 0,00 27783,00

41996,94 32490,03 0,00 32490,03

17689,50 14294,97 0,00 14294,97

20003,96 16103,19 0,00 16103,19

4 37955,05 23663,10 0,00 23663,10

26682,97 20780,07 0,00 20780,07

37747,85 21157,49 0,00 21157,49

32684,22 23104,92 0,00 23104,92

48


Figura 5. Gráficos do grupo GW e Controle em relação à ATV, AT e ALL.

49


Figura 6. Gráficos dos subgrupos GW1 e GW2 sobre as relações da

AT/ATV, AL/ATV e ALL/ATV.

50


7. DISCUSSÃO

51


O presente estudo demonstrou uma alta freqüência (91%) de trombo

nas artérias pulmonares de pequeno / médio calibre na GW, sendo

significantemente maior do que no grupo Controle. Vale ressaltar que a

freqüência de trombose in situ na Hipertensão Arterial Pulmonar Idiopática

(HAPI) é de 20-50%. A análise estatística também mostrou uma forte

associação entre trombos na microcirculação e GW, com odds ratio de 297

(95% IC: 13,34-6612). Quanto à área do trombo e da área livre do lúmen do

vaso, estas também mostraram diferenças significativas. A média da AT foi

10068 µm2 no grupo GW e 0,00 µm2 no grupo Controle (p<0,0001); e a média

da ALL foi 6116 µm2 no grupo GW e 24707 µm2 no Controle (p<0,0001),

demonstrando a obstrução do leito vascular pela trombose. Esses dados

corroboram o estado pró-trombótico nesta vasculite ANCA associada.

Além disso, o acometimento das artérias menores ou maiores da

microcirculação pulmonar (diâmetro externo ≤300µm) aconteceu de forma

similar neste estudo.

52


7.1. O paradoxo: eventos trombo-embólicos numa vasculite (às vezes)

hemorrágica

Paradoxalmente, vem crescendo o conceito de um estado pró-

trombótico numa doença até então estigmatizada pela hemorragia alveolar (89-

91,108). Essa idéia tomou mais forma com o trabalho publicado em 2005 que

mostrou uma elevada incidência de ETE na GW (7 casos / 100 paciente-anos)

(90). Isso significa que o paciente com GW tem um risco de mais de 20 vezes

de ter um ETE em comparação com uma pessoa saudável, e um risco 7 vezes

maior de ter TVP/TEP em comparação com um doente portador de lúpus

eritematoso sistêmico. Dessa forma, é fundamental colocar, no diagnóstico

diferencial de um paciente com GW e com dispnéia súbita e/ou hemoptise, a

hipótese de TEP.

Quanto à investigação de TEP, esta normalmente se inicia com a

dosagem de d-dímero. Entretanto, vale mencionar que a quantidade de d-

dímeros falsos positivos na GW será bem maior do que na população geral,

baseando-se no estudo publicado em 1996 que avaliou 26 pacientes com

vasculite ANCA associada e 47 controles saudáveis (109). No referido trabalho,

a dosagem do d-dímero foi significativamente maior nos pacientes com doença

53


em atividade em relação ao grupo controle (mediana de 2200 ng/ml versus 200

ng/ml, p<0,01). Nos doentes com vasculite ativa, apenas um dos 26 (3,8%)

apresentou d-dímero negativo (<500ng/ml), enquanto mais de 50% deles

passaram a ter d-dímero negativo com a remissão da doença (p<0,01);

lembrando-se que este exame foi negativo em 100% dos controles saudáveis

(p<0,01). Porém, acreditamos que o valor preditivo negativo deste teste

laboratorial continua muito bom, servindo para excluir a hipótese de embolia

pulmonar em casos de baixa / média probabilidade.

Caso o resultado do d-dímero seja positivo num paciente com GW e

com suspeita de TEP, será necessário realizar uma angiotomografia de tórax

ou uma cintilografia pulmonar de ventilação/perfusão, a depender da função

renal do paciente e da disponibilidade do exame. Outro exame que pode ser

útil na investigação de embolia pulmonar é a angiorressonância de tórax,

especialmente em pacientes com alergia a contraste iodado. Vale lembrar que

a ressonância possui uma sensibilidade menor que os dois exames

mencionados anteriormente para a detecção de TEP (110).

54


7.2. Esquematizando as alterações fisiopatológicas da granulomatose de

Wegener para explicar os achados trombo-embólicos

Já vimos que vários marcadores (séricos) de atividade de doença na

GW são também relacionados com um estado pró-trombótico. Estes são,

especialmente, o ANCA, PR3 e TM. Vale relembrar que o início do processo

nesta vasculite ocorre com a ativação de neutrófilos pelo TNF, cuja produção

pode estar relacionada a um processo infeccioso (1). Assim, o neutrófilo

ativado expressa em sua membrana proteínas que permitem a ligação desta

célula com o ANCA. Após isso, ocorre a liberação da enzima PR3 pelos

neutrófilos, e esta irá causar uma lesão na superfície endotelial, com

conseqüente liberação de TM e de CEAp para a corrente sangüínea.

Entretanto, com a lesão endotelial, a interação endotélio-plaqueta-fatores de

coagulação fica perturbada, causando ativação da cascata de coagulação, e

culminando com a formação da trombose in situ.

Essa complexa interação foi mais bem detalhada no trabalho de

Hergesell e colaboradores publicado em 1996. Estes autores demonstraram

que, na GW, existe uma correlação entre TM sérica e atividade de doença (AD)

(r:0,46; p<0,05). Outras correlações também foram vistas neste mesmo

55


trabalho, como complexo trombina-antitrombina III sérico (TAT) e AD (r:0,58;

p<0,05), e d-dímero sérico e AD (r:0,43; p<0,05). Vale ainda ressaltar que a TM

sérica denota lesão endotelial, enquanto TAT e d-dímero representam uma

coagulação ativada. Neste mesmo estudo, houve também uma forte correlação

entre a coagulação ativada e a lesão endotelial, ao se analisar TAT versus TM

(r:0,94; p<0,05) e d-dímero versus TM (r:0,87; p<0,05) (109). Dessa forma, o

referido autor sugeriu um estado subclínico de coagulação intravascular

disseminada (CIVD) durante a fase ativa desta vasculite ANCA associada.

Esta situação de coagulação disseminada foi recentemente descrita

também por outros autores. Saito e colaboradores descreveram um caso de

hemorragia gastrointestinal e cerebral secundária à CIVD, a qual decorria da

atividade da GW (111). Com uso de corticóide, ciclofosfamida e plasmaférese,

houve controle do processo vasculítico, e conseqüentemente dos

sangramentos.

Por último, durante a formação da trombose in situ, ocorre liberação de

várias moléculas que podem modular / perpetuar a resposta inflamatória / pró-

trombótica (figura 7). Estas substâncias são representadas principalmente pela

serotonina, fibrinogênio, fibronectina, tromboxano A2 e fator de crescimento

derivado de plaqueta (PDGF). Na figura a seguir, esquematizamos estas

interações que culminam com a formação de trombo.

56


Figura 7 - Efeito de feeback positivo entre inflamação vascular - dano

endotelial - trombose in situ.

57


7.3. Possível papel da trombose in situ na fisiopatologia da


Depois dos achados deste estudo, consideramos que a trombose in situ

tem um importante papel na fisiopatologia da GW. Embora o processo

trombótico possa acontecer secundariamente a uma cascata de alterações

existentes no plasma, nos neutrófilos e no endotélio, ele atua, no mínimo, como

um perpetuador do cascata inflamatória. Isso ocorre porque a ativação

plaquetária existente na trombose tem relação estreita com a ativação da

resposta leucocitária e inflamatória, fechando assim um ciclo de feedback

positivo, como pode ser visto na figura anterior (112-115).

Além disso, o possível papel da trombose in situ na GW é corroborado

pelos recentes casos descritos de hipertensão pulmonar associada a esta

doença inflamatória (115). Em um destes casos, o paciente apresentou

melhora em sua sintomatologia e nos parâmetros do cateterismo cardíaco

direito apenas com a introdução da anticoagulação oral. Tal fato corrobora a

nossa idéia de estudar / comprovar o benefício da anticoagulação nesta

doença, desde que não haja contra-indicação a tal terapêutica, tais como

hemorragia alveolar ou outros sangramento internos ativos, plaquetopenia,

58


deficiência de fatores de coagulação congênita ou adquirida, insuficiência

hepática moderada-grave e história prévia de má adesão a tratamentos (89).

Além disso, outro paciente deste mesmo artigo melhorou da hipertensão

pulmonar com a intensificação do tratamento imunossupressor. Tal dado serve

para demonstrar a íntima relação entre inflamação-disfunção endotelial-

trombose nesta vasculite ANCA associada (115). Esta interação também foi

sugerida em outras doenças com importante componente

inflamatório/vasculítico, como os casos de hipertensão pulmonar relacionada à

doença mista do tecido conectivo e a lúpus eritematoso sistêmico. Nestes

casos, houve melhora clínica com o tratamento baseado em corticóide e/ou

drogas citotóxicas. Entretanto, esta terapêutica imunossupressora geralmente

não é efetiva nas situações de hipertensão pulmonar associada à

esclerodermia, tendo em vista que esta doença não apresenta a inflamação

como um importante componente de sua fisiopatologia.

59


7.4. Considerações sobre o potencial benefício da anticoagulação no

tratamento da granulomatose de Wegener.

A anticoagulação na GW pode ser vista sob três aspectos. Primeiro, tal

terapêutica pode ser estudada nesta doença como um meio de atuar no

processo inflamatório vigente. Em 2004, um estudo, avaliando possíveis vias

fisiopatológicas de ativação plaquetária e inflamação em hipertensão pulmonar,

demonstrou o efeito antiinflamatório dos dicumarínicos (116). Esse efeito pode

ser muito importante na GW, pois cerca de 10% dos pacientes continuam em

atividade de doença a despeito do uso da ciclofosfamida (17). Isso nos

demonstra que pesquisas de novos tratamentos para a GW devem continuar a

ser realizadas. Segundo, a anticoagulação pode ser uma importante

ferramenta terapêutica na GW por atuar de forma importante em doenças com

trombose in situ, como o acometimento pulmonar na síndrome antifosfolípide e

a hipertensão arterial pulmonar idiopática (HAPI) (112-118). Na HAPI, o uso de

dicumarínico está associado a aumento de sobrevida, e vale mencionar que a

freqüência de trombose in situ na HAPI é menor do que a encontrada neste

estudo de GW (20-50% versus 91%, respectivamente) (112,117,118). Terceiro,

a anticoagulação na GW pode ser vista como profilaxia de ETE, considerando

60


que (I) a incidência de ETE nesta vasculite é similar a encontrada em

população com evento prévio de TVP/TEP, e (II) que nesta população, já está

demonstrado o benefício da anticoagulação profilática (89,119, 120).

Além disso, já existem experiências iniciais e bem sucedidas do uso de

anticoagulante no manejo de pacientes com glomerulonefrite relacionada à GW

(77,78). Esse dado encontra um racional nos estudos histopatológicos renais

realizados nesta vasculite, demonstrando uma importante presença de

trombose e de deposição de fibrina, a qual deriva da ativação do sistema de

coagulação (77-79). Em nosso ambulatório, também temos quatro casos de

GW em uso de anticoagulação devido a eventos trombóticos, evoluindo bem e

sem complicações hemorrágicas (108).

61


7.5. Eventos trombo-embólicos em outras vasculites

Os ETE são também marcantes em outras doenças vasculíticas. Estas

são principalmente a doença de Behçet e o lúpus eritematoso sistêmico. Na

primeira, a prevalência de trombose venosa chega a ser de 30%, sendo o sexo

masculino um fator de risco (121). Em nossa casuística de pacientes com

Behçet e acometimento pulmonar, a incidência de TEP foi de 5,11 casos/100

paciente-anos, bem maior do que a de uma população normal (0,31/100

paciente-anos) (80,92). As bases fisiopatológicas para tal achado são o estado

pró-trombótico relacionado à doença de Behçet, como ativação do sistema de

coagulação (aumento do fator de von Willebrand, do fator tecidual e da

trombomodulina) e inibição do sistema de fibrinólise (aumento do inibidor do

ativador do plasminogênio) (80). Como na GW, a inflamação vascular presente

na doença de Behçet tem íntima relação com a ativação do sistema de

coagulação, sendo descrito até resolução de trombo intracardíaco apenas com

o uso de imunossupressor (122).

O lúpus eritematoso sistêmico também tem importantes achados

trombo-embólicos associados. Um exemplo disso é a significativa incidência de

ETE, que é de 1,00/100 paciente-anos (93). Os fatores de risco descritos nesta

62


doença são anticoagulante lúpico, anticardiolipina, inflamação vascular com

conseqüente disfunção endotelial, estado de ativação plaquetária e síndrome

nefrótica, dentre outras (123).

Vale lembrar que os pacientes com lúpus e síndrome antifosfolípide

devem receber anticoagulação oral por períodos prolongados / indefinidos,

devido ao elevado risco de novos ETE, como publicado recentemente (124).

Além disso, esta revisão sistemática mostrou que incidência de novos ETE é

maior nos pacientes com trombose arterial do que com tromboembolismo

venoso, sugerindo que o primeiro grupo de pacientes deve ter como alvo o RNI

>3,0 ao usarmos dicumarínico. Isso se baseia ainda no fato de que 86% dos

re-eventos trombo-embólicos aconteceram com o RNI entre 2,0 e 2,9, e apenas

14% deles com o RNI ≥3,0. Quanto ao risco de sangramento, este só causou

óbito em uma pessoa, embora seja sabido que o risco de hemorragia aumente

conforme se aumente o RNI. Por outro lado, aconteceram 18 mortes

relacionadas a ETE, reenfatizando o benefício de anticoagular adequadamente

os pacientes com síndrome antifosfolípide, sendo às vezes necessário atingir

um RNI ≥3,0 e/ou associar um antiplaquetário (124).

63


8. CONCLUSÃO

64


A freqüência de trombos nas artérias pulmonares de pequeno / médio

calibre é muito alta no grupo GW, e significantemente maior do que no grupo

Controle. Além disso, esse estudo mostrou uma forte associação entre trombos

na microcirculação pulmonar e GW.

65


9. PERSPECTIVAS FUTURAS

66


Os achados deste estudo mostram um importante componente de

trombose in situ no acometimento pulmonar da GW. Porém, esse dado não

havia sido descrito até então. Dessa forma, abre-se a perspectiva para o uso

nesta vasculite de novas terapêuticas que atuem no sistema de coagulação,

tais como dicumarínicos, heparina, ácido acetilsalicílico e clopidogrel.

Aprofundando a discussão dos antiplaquetários na GW, vale mencionar

um estudo realizado por Hergesell e colaboradores (109). Neste, foi mostrado

que o fator de von Willebrand (FVW) encontra-se aumentado tanto na fase de

atividade de doença, quanto na fase de remissão da GW, quando comparado a

pessoas saudáveis. Logo, lembrando que o FVW é um marcador de ativação

plaquetária, os autores sugerem que a ativação plaquetária é um fato existente

e marcante na GW, assim como acontece no lúpus eritematoso sistêmico.

Conseqüentemente, considerando que o ácido acetilsalicílico é um dos

importantes medicamentos utilizados no lúpus (juntamente com prednisona e

ciclofosfamida), parece-nos racional também questionar/investigar o papel dos

antiplaquetários nesta vasculite ANCA associada (125).

É também importante discutir sobre os possíveis dados adicionais que

podemos obter com a continuação deste estudo com o auxílio do microscópio

confocal a laser. Este sistema de microscopia nos permite fazer até 3

marcações de imunofluorescência ao mesmo tempo. Como exemplo, podemos

67


utilizar o anti-CD34 (marcador de endotélio), anti-ICAM e anti-VCAM

(marcadores de ativação endotelial) para estudar os vasos com e sem ativação

endotelial e sua possível associação com a trombose in situ. Dessa forma, se

os trombos acontecessem somente / preferencialmente nos vasos com

marcação de ICAM e/ou VCAM, poderíamos imaginar que o problema de

trombose na microcirculação pulmonar aconteceria especialmente no subgrupo

de GW com dosagem sérica alta de ICAM e/ou VCAM, selecionando melhor os

pacientes para um posterior estudo sobre o potencial beneficio de

anticoagulação no manejo terapêutico de pacientes com GW. Vale lembrar que

já está demonstrado desde 1994 que o nível sérico de ICAM tem importância

para marcar o prognóstico da evolução do acometimento renal nesta vasculite

ANCA associada (126).

68


10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8.

96


11. ANEXO I

97


Tabela dos dados dos seis pacientes com granulomatose de Wegener

incluídos neste estudo.

Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 Caso 5 Caso 6 Sexo F F F M M F Idade 30 42 52 36 37 44 Inflamação oral / nasal

+ + + +

Alteração na radiografia de tórax

+ + + + + +

Hematúria microscópica no sedimento urinário

Biópsia- inflamação granulomatosa arterial ou periarterial

+ + + + + +

ANCA + + + + + + Outros órgãos acometidos

Olho Pele

Boa resposta à ciclofosfamida

+ + + + + +

F: Feminino; M: Masculino.

Idade média do grupo Controle: 38,2 ± 8,2 anos.

Documents

Alfredo Nicodemos da Cruz Santana Estudo da trombose ... Aos Professores Francisco Vargas, Mário Terra e Rogério de Souza, pela belo trabalho realizado junto à pós-graduação