Apostila de Microbiologia de AlimentosEliana Kamimura

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOUNIVERSIDADE DE SÃO PAULOUNIVERSIDADE DE SÃO PAULOUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Engenharia de AlimentosDepartamento de Engenharia de AlimentosDepartamento de Engenharia de AlimentosDepartamento de Engenharia de Alimentos

AAAAAAAAPPPPPPPPOOOOOOOOSSSSSSSSTTTTTTTTIIIIIIIILLLLLLLLAAAAAAAA DDDDDDDDEEEEEEEE AAAAAAAAUUUUUUUULLLLLLLLAAAAAAAASSSSSSSS PPPPPPPPRRRRRRRRÁÁÁÁÁÁÁÁTTTTTTTTIIIIIIIICCCCCCCCAAAAAAAASSSSSSSS

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Disciplina: Microbiologia dos Alimentos (ZEA-0463) Docente: Profª. Drª. Eliana Setsuko Kamimura

Técnica de laboratório: Roice Eliana Rosim

Colaboradores(as): Dra. Helena Fagundes Dra. Evelise Andreatta

Doutoranda Luciane Tavares da Cunha

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SUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIO NORMAS DE CONDUTA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA.................................03 NORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRAS ..........................................................................04 UTILIZAÇÃO DO BICO DE BUNSEN...................................................................................04 PREPARO DA AMOSTRA ...................................................................................................05 PREPARO DE MEIO DE CULTURA ....................................................................................05 CLASSIFICAÇÃO DE AGENTES BIOLÓGICOS POR NÍVEL DE SEGURANÇA.................08 NORMAS PARA ELABORAÇÃO DOS RELATÓRIOS .........................................................09 1ª Aula Prática: CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS (CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS) .................................................................................10 2ª Aula Prática: CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS .................................14 3ª Aula Prática: CONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NÃO-FILAMENTOSOS (LEVEDURAS) ........................................................................................23 4ª Aula Prática: CONTAGEM DE BACTÉRIAS LÁCTICAS ..................................................27 5ª Aula Prática: CONTAGEM DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA........................29 6ª Aula Prática: CONTAGEM DE Bacillus cereus EM ALIMENTOS.....................................32 7ª Aula Prática: CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTOR ....................................34 8ª Aula Prática: VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE Salmonella .........................................36

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NORMAS DE CONDUTA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIANORMAS DE CONDUTA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIANORMAS DE CONDUTA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIANORMAS DE CONDUTA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1. No laboratório, usar obrigatoriamente avental (jaleco branco) de manga, pois protege os braços e o vestuário de contaminação e de manchas provocadas pelos reagentes, bem como usar calça comprida e sapatos fechados para proteção individual e usar cabelos presos.

2. Colocar vestuário, livros e outros objetos de uso pessoal, não necessários ao trabalho prático, em locais apropriados, nunca nas áreas de trabalho.

3. Não comer, beber ou fumar no laboratório de Microbiologia.

4. Não levar à boca o material de trabalho (lápis, canetas, etc.) e evitar colocar as mãos na boca, nos olhos e no nariz.

5. Lavar cuidadosamente as mãos antes e depois do trabalho prático.

6. Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminação microbiana.

7. Limpar as bancadas de trabalho com álcool a 70º antes e depois do trabalho prático.

8. Transportar os meios de cultura nos suportes próprios.

9. Não pipetar produtos com a boca, usar sempre os dispositivos mecânicos.

10. Não levar o material usado nas aulas práticas para fora do laboratório.

11. Evitar a contaminação das bancadas de trabalho, chão e cestos de papéis. O material contaminado nunca deve ser esquecido em locais desapropriados, nem colocado inadvertidamente em cima das bancadas de trabalho.

12. Colocar o material contaminado (pipetas, espátulas, alças, lâminas e outros) após a sua utilização em recipientes próprios contendo desinfetante.

13. Esterilizar no bico de Bunsen os utensílios (alça de platina e alça de Drigalsky) antes e após a sua utilização.

14. O material a analisar deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estéreis e nunca com as mãos.

15. Identificar as amostras antes de iniciar a análise e em geral, não descartar até obter os resultados.

16. Relatar imediatamente ao docente qualquer acidente que provoque lesão corporal ou que origine derrame dos microrganismos para fora dos respectivos meios de cultura.

17. No final da sessão, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo e arrumado. Verificar se o microscópio fica desligado, limpar as objetivas e colocar a capa protetora.

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18. Verificar ainda se o gás ficou desligado.

19. O material utilizado deve seguir a seguinte seqüência de tratamento: esterilização, lavagem, secagem, esterilização e armazenamento. 20. Analisar produtos esterilizados somente em câmaras assépticas e fluxos laminares.

NORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRASNORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRASNORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRASNORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRAS 1. Se possível as amostras devem ser enviadas ao laboratório em sua embalagem original para evitar modificações e resultados errôneos. 2. As amostras para exame microbiológico deverão ser acondicionadas em recipientes estéreis e íntegros (sem perfurações, rachaduras, etc.) na quantidade mínima de 400 gramas. Quando o peso unitário for menor, deverão ser colhidas tantas unidades quantas necessárias para se obter este valor quantitativo. 3. Amostras de produtos facilmente alteráveis deverão ser acondicionadas em recipientes isotérmicos, acompanhadas de gelo ou outra substância refrigerante, cuidando-se para que não haja contatos deste com a amostra, para evitar qualquer alteração nas mesmas até sua chegada ao laboratório. 4. O tempo decorrido entre a colheita da amostra e sua chegada ao laboratório deve ser o mais breve possível para que os resultados das análises sejam válidos.

UTILIZAÇÃO DO BICO DE BUNSENUTILIZAÇÃO DO BICO DE BUNSENUTILIZAÇÃO DO BICO DE BUNSENUTILIZAÇÃO DO BICO DE BUNSEN

• A função do bico de Bunsen é formar uma barreira contra contaminação através do calor;

• Sempre que manipular algum material infectado faça-o próximo do bico de Bunsen acesso;

• O bico possui uma regulagem que torna possível selecionar a chama ideal para o trabalho;

• A chama utilizada em microbiologia é a chama azul, pois esta atinge maior temperatura e não forma fuligem;

• A chama apresenta três zonas (Figura 1): � Zona neutra: zona fria (próximo ao bico) não se utiliza para a flambagem; � Zona redutora: meio da chama, boa para flambagem;

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� Zona oxidante: extremidade da chama, boa para flambagem.

Figura 1. Desenho esquemático da chama em um Bico de Bunsen.

PREPARO DA AMOSTRAPREPARO DA AMOSTRAPREPARO DA AMOSTRAPREPARO DA AMOSTRA

Produtos sólidos:Produtos sólidos:Produtos sólidos:Produtos sólidos: com o auxílio de pinça estéril, pesar assepticamente 10 g representativos da amostra em copos homogeneizador, adicionar 90 mL de água peptonada a 0,1%, homogeneizar. Esta é a diluição 10-1. Homogeneizar e pipetar 1 mL para um tubo contendo 9 mL de mesmo diluente (diluição 10-2). E assim, preparar as diluições desejadas, segundo o tipo de análise a ser realizada. Produtos congelados devem ser descongelados em refrigerador 2-5oC, por um tempo máximo de 18 h antes da análise. Produtos líquidos e água:Produtos líquidos e água:Produtos líquidos e água:Produtos líquidos e água: agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, pipetar assepticamente 1 mL da amostra, transferindo para um tubo contendo 9 mL de água peptonada a 0,1% (diluição 10-1). Homogeneizar e pipetar 1 mL para um tubo contendo 9 mL de mesmo diluente (diluição 10-2). Preparar assim as diluições sucessivas necessárias às análises a serem efetuadas. Produtos em pó, granulado, pastoso, etc.:Produtos em pó, granulado, pastoso, etc.:Produtos em pó, granulado, pastoso, etc.:Produtos em pó, granulado, pastoso, etc.: com auxílio de espátula ou colher estéreis, pesar assepticamente 10 g da amostra em copos de homogeneizador, adicionar 90 mL de água peptonada a 0,1%, homogeneizar e preparar as diluições necessárias.

PREPARO DE MEIOPREPARO DE MEIOPREPARO DE MEIOPREPARO DE MEIO DE CULTURA DE CULTURA DE CULTURA DE CULTURA

Existem três tipos de meio: os líquidos que são obtidos pela dissolução de nutrientes em água; os sólidos obtidos pela adição de um agente solidificante sendo o agar-agar

Zona neutraZona neutraZona neutraZona neutra

Zona redutoraZona redutoraZona redutoraZona redutora

Zona oxidaZona oxidaZona oxidaZona oxidantententente

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geralmente preferido (funde-se à 80-100oC e se solidifica à 40-45oC, com um concentração em meios sólidos de 1,5 a 2%). No comércio há diferentes meios de cultura sintéticos e sua composição depende das exigências nutritivas do microrganismo em estudo (Tabela 1). Meios em pó, por exemplo, são solúveis em água, dissolvidos e esterilizados para uso.

Tabela 1. Exemplos de meios de cultura e seus respectivos microrganismos relacionados.

MEIOS DE CULTURAMEIOS DE CULTURAMEIOS DE CULTURAMEIOS DE CULTURA MICRORGANISMOSMICRORGANISMOSMICRORGANISMOSMICRORGANISMOS RELACIONADOS RELACIONADOS RELACIONADOS RELACIONADOS

Agar-agar Agente gelificante para meios de cultura

Agar Baird Parker com telurito e gema de ovo

Detecção e enumeração de Staphylococcus coagulase positiva

Agar batata ou Potato dextrose agar (PDA) + Ácido tartárico

Fungos, bolores e leveduras. Adiciona-se ácido tartárico ao PDA para tornar o meio seletivo

Agar Chapman Seletivo para isolamento de Staphylococcus

Agar citrato de Simons Prova bioquímica

Agar contagem padrão/Agar plate count (ACP/APC)

Padrão para contagem de bactérias

Agar EMB-Levine Base para detecção de coliformes e outros bacilos entéricos

Agar glicosado Vários microrganismos

Agar lisina-ferro (LIA) Prova bioquímica

Agar manitol Isolamento de Staphylococcus patogênicos

Agar motilidade para cereus Diferenciação entre as espécies de Bacillus cereus

Agar nutritivo/nutriente Para cultura de microrganismos pouco exigentes

Agar Salmonella-Shigella Isolamento e identificação de bacilos entéricos, em especial Salmonella e Shiguella

Agar seletivo para cereus Isolamento de Bacillus cereus (gema de ovo e polimixina B)

Agar TCBS Isolamento e cultivo de Vibrio cholerae e outros víbrios enteropatogênicos

Agar três açúcares e ferro (TSI) Prova bioquímica para identificação de bacilos

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entéricos Gram-negativos

Agar XLD Isolamento e diferenciação de enterobactérias patogênicas, em especial Salmonella e Shiguella

Caldo verde brilhante e bile bovina 2% (brila)

Para enriquecimento seletivo e numeração de coliformes

Caldo BHI (Brain heart infusion broth) Diversos microrganismos

Caldo E. C. Isolamento de coliformes em materiais líquidos

Caldo enriquecido para Listeria Seletivo para Listeria monocytogenes

Caldo lactosado Enriquecimento para salmonelas/Prova bioquímica

Caldo lauril sulfato Seletivo para isolamento e enriquecimento para coliformes

Caldo lisina-descarboxilase Bactérias que descarboxilam lisina

Caldo MR-VP (vermelho de metila - Voges Proskauer)

Prova bioquímica

Caldo nitrato Prova bioquímica

Caldo púrpura de bromocresol dextrose

Enterobacteriaceae

Caldo tetrationato Enriquecimento seletivo de Salmonella

Caldo triptona Substrato para a produção de indol

Caldo uréia Prova bioquímica

Caldo selenito-cistina Detecção e identificação de Salmonella

D-glicose anidra P.A. Enriquecimento e prova bioquímica

Extrato de carne Enriquecimento

Frutose puríssima (levulose) Prova bioquímica

LPM agar base Isolamento de Listeria monocytogenes

Manitol P.A. Enriquecimento e prova bioquímica

Oxford medium base Isolamento de Listeria monocytogenes

Peptona de carne Enriquecimento

Sacarose P.A. Enriquecimento e prova bioquímica

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Possíveis erros no preparo de meios de cultura desidratadosPossíveis erros no preparo de meios de cultura desidratadosPossíveis erros no preparo de meios de cultura desidratadosPossíveis erros no preparo de meios de cultura desidratados::::

• Escurecimento do meio devido ao superaquecimento na dissolução ou na esterilização do ágar;

• Problemas de gelificação do meio devido à mistura de forma ineficiente, peso errado do pó desidratado, pH do meio muito ácido, excesso de inóculo no ágar tornando-o diluído, recipiente muito pequeno para uma boa homogeneização do líquido e/ou fusão do meio repetidas vezes.

CLASSIFICAÇÃO DE AGENTES BIOLÓGICOS POR NÍVEL DE SEGURANÇACLASSIFICAÇÃO DE AGENTES BIOLÓGICOS POR NÍVEL DE SEGURANÇACLASSIFICAÇÃO DE AGENTES BIOLÓGICOS POR NÍVEL DE SEGURANÇACLASSIFICAÇÃO DE AGENTES BIOLÓGICOS POR NÍVEL DE SEGURANÇA

Segurança nível 1:Segurança nível 1:Segurança nível 1:Segurança nível 1: • Microrganismos que têm baixo risco de provocar doenças em seres humanos e de

alterar o meio ambiente; • Não são necessários equipamentos especiais de proteção; • O trabalho é feito com bancada aberta; • Exemplos: bactérias da microbiota normal e fungos não patogênicos.

Segurança de nível 2:Segurança de nível 2:Segurança de nível 2:Segurança de nível 2: • Microrganismos que apresentam risco moderado para o pessoal do laboratório; • É necessária a utilização de barreira individuais de proteção; • Neste nível estão incluídos todos os patógenos comuns que podem ser encontrados

no meio ambiente, bem como no homem e nos animais; • Exemplos: todas as espécies de Escherichia, Clostridium, Streptococcus,

Treponemas, Neisseria e outros. Segurança de nível 3Segurança de nível 3Segurança de nível 3Segurança de nível 3::::

• Microrganismos que apresentam risco infeccioso elevado e potencialmente letal; • A manipulação exige a utilização da capela de fluxo laminar e todas as barreiras de

proteção individual; • Exemplos: Todas as espécies de Bortonella, Brucella, Pseudomonas,

Mycobacterium, Francisella tularensis, Yersina pestis, os fungos Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum, dentre outros.

Segurança de nível 4Segurança de nível 4Segurança de nível 4Segurança de nível 4:::: • Microrganismos que apresentam risco grave em humanos e podem se propagar

facilmente de um indivíduo a outro; • A manipulação exige a utilização da capela de fluxo laminar e de todas as barreiras

de proteção individual e ambiental; • Exemplos: vírus ebola, vírus da febre hemorrágica, vírus da encefalomielite.

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NORMAS NORMAS NORMAS NORMAS PARA PARA PARA PARA ELABORAÇÃO DOS RELATÓRIOSELABORAÇÃO DOS RELATÓRIOSELABORAÇÃO DOS RELATÓRIOSELABORAÇÃO DOS RELATÓRIOS

De um modo geral, os relatórios são escritos com os objetivos de divulgar os dados obtidos e analisados, e registrá-los em caráter permanente. Os relatórios deverão se constituir dos seguintes elementos:

FFFFormatação do relatórioormatação do relatórioormatação do relatórioormatação do relatório:::: margem superior 2,5 cm, margem inferior 2,5 cm, margem direita 2,5 cm, margem esquerda 3,5 cm, entre linhas (espaço) 1,5 cm, tipo de letra Times New Roman ou Arial, tamanho de fonte 12 e formato de papel A4 (210 X 297 mm). Paginar a partir da segunda folha, no início ou fim da página à direita.

Capa:Capa:Capa:Capa: deve conter nome da instituição responsável; título; autor(es); local e ano, em algarismo arábico.

Introdução:Introdução:Introdução:Introdução: apresentar o assunto como um todo, sem detalhes, contendo no máximo uma folha.

Objetivos:Objetivos:Objetivos:Objetivos: em um parágrafo curto relacionar os objetivos a serem alcançados em cada aula. Evite copiar simplesmente o roteiro.

Revisão bibliográfica:Revisão bibliográfica:Revisão bibliográfica:Revisão bibliográfica: parte mais extensa que visa mostrar a importância do trabalho e as abordagens de outros autores sobre o referido tema. Citar os autores no texto*. Deve conter, em média, de 3 a 4 folhas.

Material e Métodos: Material e Métodos: Material e Métodos: Material e Métodos: relacionar o material utilizado e descrever, de modo sucinto e sem copiar do roteiro, os procedimentos realizados durante a aula. No máximo uma folha. RRRResultados e esultados e esultados e esultados e discussãodiscussãodiscussãodiscussão:::: comunicar os resultados obtidos na forma de texto, tabelas, gráficos, etc., e também comparar os resultados encontrados com os de outros autores (citar os autores no texto*). Deve conter o número de páginas necessário para haver coerência do conteúdo.

Conclusões:Conclusões:Conclusões:Conclusões: escrito em um único parágrafo, ressaltar o alcance e as conseqüências do estudo.

Referências bibliográficasReferências bibliográficasReferências bibliográficasReferências bibliográficas:::: relacionar as fontes bibliográficas utilizadas. Todas as obras citadas no texto deverão obrigatoriamente figurar nas referências bibliográficas. A padronização das referências é seguida de acordo com a NBR-6023/ago.1989 da ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas (www.abnt.org.br). * * * * Ver em Diretrizes para Elaboração de Dissertações e Teses, Biblioteca, em www.fzea.usp.br.

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1ª Aula Prática1ª Aula Prática1ª Aula Prática1ª Aula Prática

CONTAGEM TOTAL DE CONTAGEM TOTAL DE CONTAGEM TOTAL DE CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOSMICRORGANISMOSMICRORGANISMOSMICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS AERÓBIOS MESÓFILOS AERÓBIOS MESÓFILOS AERÓBIOS MESÓFILOS (CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS)(CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS)(CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS)(CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS)

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução

As técnicas de contagem em placas permitem a visualização da formação de colônias a partir de um número "fixo" de células viáveis. São utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) presentes na amostra sob análise. Pode ser usado para:

• Contagem de grandes grupos microbianos como aeróbios mesófilos, aeróbios psicrotrófilos, bolores e leveduras, e outros;

• Gêneros e espécies em particular como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, e outros.

Variando-se o tipo de meio de cultura e as condições de incubação é possível selecionar o grupo, o gênero ou a espécie que se deseja contar. A contagem padrão de microrganismos aeróbios mesófilos detecta, em um alimento, o número de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas presentes tanto sob forma vegetativa quanto esporulada. Essa contagem tem sido usada como indicador da qualidade higiênica dos alimentos. Sua presença em grande número indica:

• Matérias-prima excessivamente contaminadas; • Limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas; • Higiene inadequada na produção; • Condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou a

conservação dos alimentos, ou uma combinação dessas circunstâncias.

A aplicação das técnicas de contagem tem por base o uso de diluições seriadas, obtidas a partir da homogeneização de amostras sólidas e semi-sólidas ou de inoculações diretas de amostras líquidas e de suas diluições. A partir das diluições são cultivados os microrganismos para seu isolamento (Figura 2). MaterialMaterialMaterialMaterial:

• Tubos de diluição contendo 9 mL de água peptonada a 0,1% • Pipetas de 1 ou 2 mL estéreis • Placas de Petri estéreis vazias • Meio de cultura Ágar Padrão para Contagem (PCA) esterilizado • Estufa incubadora a 35ºC

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ProcedimentoProcedimentoProcedimentoProcedimentossss::::

AMOSTRAS LÍQUIDAS:AMOSTRAS LÍQUIDAS:AMOSTRAS LÍQUIDAS:AMOSTRAS LÍQUIDAS: � Pipetar assepticamente 1 mL da amostra; � Transferir para um tubo de diluição contendo 9 mL de água peptonada (diluição 10-1); � Preparar diluições subseqüentes da mesma forma, transferindo-se 1 mL da diluição

10-1 para um segundo tubo de água peptonada (diluição 10-2), e assim sucessivamente.

AMOSTRAS SÓLIDAS:AMOSTRAS SÓLIDAS:AMOSTRAS SÓLIDAS:AMOSTRAS SÓLIDAS: � Pesar 10 g da amostra em copo homogeneizador; � Acrescentar 90 mL de diluente água peptonada e homogeneizar (diluição 10-1); � Preparar a segunda diluição transferindo-se 1 mL da diluição 10-1 para um tubo

contendo 9 mL de água peptonada (diluição 10-2), e assim sucessivamente.

Proceder após o preparo das amostras: • Transferir assepticamente 1 mL de cada diluição preparada para Placas de Petri

devidamente identificadas com a diluição (10-1, 10-2,...); • Adicionar à cada placa cerca de 15 mL do ágar previamente fundido e aquecido a

45ºC; • Homogeneizar cuidadosamentecuidadosamentecuidadosamentecuidadosamente deslizando as placas sobre uma superfície plana

fazendo movimentos circulares em forma de 8; • Deixar em repouso para solidificar o ágar e incubar as placas, na posição invertidaposição invertidaposição invertidaposição invertida,

em estufa a 35ºC, por 48h; • Após a incubação, retirar as placas e proceder a contagem das colônias formadas

(em placas com 25-250 colônias); • Realizar o cálculo, de acordo com a diluição preparada, do número de colônias por

mL de amostra, usando a expressão:

• Calcular a média dos valores obtidos em cada diluição e expressar o resultado em unidades formadoras de colônias por mL ou g de amostra (UFC/mL ou g). Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.

nº de colônias/mL ou g = nº de colônias na placa x 1/diluição

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Figura 2. Diluições decimais seriadas da amostra e cultivo em meio de cultura.

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Bibliografia cBibliografia cBibliografia cBibliografia consultadaonsultadaonsultadaonsultada SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de métodos de análise Manual de métodos de análise Manual de métodos de análise Manual de métodos de análise microbiológica de alimentosmicrobiológica de alimentosmicrobiológica de alimentosmicrobiológica de alimentos. Varela. São Paulo, 2001. SIQUEIRA, R.S. Manual de Manual de Manual de Manual de Microbiologia de AlimentosMicrobiologia de AlimentosMicrobiologia de AlimentosMicrobiologia de Alimentos. EMBRAPA, MERCK, Brasília – DF, 1995.

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda 1) Qual é a diferença entre microrganismos fototróficos e quimiotróficos? E entre os autotróficos e os heterotróficos? 2) Quais as vantagens do uso de meios sintéticos em Microbiologia? Quais são suas desvantagens? 3) Quais são as etapas envolvidas na preparação de um meio bacteriológico? Por que são necessários meios diferentes? 4) Como se classificam as bactérias de acordo com suas temperaturas ótimas de crescimento? 5) Compare a eficácia do calor seco e do calor úmido como métodos de esterilização. 6) Qual é a significação da pressão na eficiência da autoclavagem como método de esterilização.

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2ª Aula Prática 2ª Aula Prática 2ª Aula Prática 2ª Aula Prática

CONTAGECONTAGECONTAGECONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAISM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAISM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAISM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS

IntroIntroIntroIntroduçãoduçãoduçãodução Na avaliação microbiológica de uma amostra é importante determinar a ausência ou presença de um microrganismo, chamado indicador, e sua respectiva população que esteja presente, devendo ser levado em consideração que, nem todos os microrganismos patogênicos encontrados são de origem fecal. A espécie Escherichia coli está presente na flora intestinal do homem e nas fezes (cerca de 3,0 x 108/g) sem causar nenhum sintoma, entretanto existem alguns sorotipos enteropatogênicos. A presença de E. coli na amostra pode ser um indicador microbiológico de contaminação fecal pertencendo ao grupo dos coliformescoliformescoliformescoliformes. No grupo dos coliformes pode haver presença de espécies de origem não fecal e os métodos de detecção podem estar sujeitos a falsos resultados negativos por interferência de Pseudomonas, e falsos positivos por ação sinergística de outras bactérias.

Há basicamente três métodos que podem ser utilizados para a detecção e/ou contagem de coliformes em água, leite e outros alimentos, com variações na escolha dos meios de cultura de forma a selecionar a microbiota alvo, são eles: Técnica dos tubos múltiplos (NMP), Teste de presença/ausência (P/A) e Técnica da membrana filtrante. 1.1.1.1. Técnica dos tubos múltiplosTécnica dos tubos múltiplosTécnica dos tubos múltiplosTécnica dos tubos múltiplos (NMP) (NMP) (NMP) (NMP) A técnica de Número Mais Provável (NMP) é um método que permite estimar a densidade de microrganismos viáveis presentes em uma amostra sob análise. Esta técnica não permite a contagem "fixa" de células viáveis ou de unidades formadoras de colônias (UFC), como acontece com a técnica de contagem em placas. A análise por NMP é recomendada quando:

• É esperado, no alimento em análise, um baixo número do microrganismo alvo (<100/g ou mL) ou quando, em função de limitações do método e das diluições necessárias para o alimento específico, o padrão de aceitação/rejeição não pode ser atendido por meio de provas de contagem.

• Quando, devido ao processo tecnológico sofrido pelo alimento, as células presentes estejam lesadas fisiologicamente (células estressadas), não tendo, portanto condições de formar colônias em meios sólidos seletivos.

A técnica de NMP deve ser realizada incluindo as seguintes etapas analíticas: • Teste presuntivo: leitura dos resultados obtidos na série de tubos múltiplos. • Teste confirmativo: subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de

maior impediência ou em ágar seletivo diferencial para o microrganismo pesquisado.

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• Teste completo: identificação bioquímica da(s) espécie(s) microbiana(s) presente(s).

Esta técnica tem por base a probabilidade estatística relacionada com a freqüência da ocorrência de resultados positivos mais prováveis em função do número real de microrganismos presentes. É necessário que a amostra seja preparada de modo que as bactérias não se encontrem agrupadas, que estejam aleatoriamente distribuídas na amostra; e que os meios e condições de incubação permitam a recuperação e detecção de ao menos uma célula viável do organismo alvo. Para a determinação do NMP, a amostra deverá ser diluída tantas vezes quantas necessárias para que a última diluição de 3, 5 ou 10 tubos apresente todos os resultados negativos. Quanto maior o número esperado do microrganismo pesquisado, maiores deverão ser as diluições usadas. Quando não se pode estimar qual a diluição da amostra que oferecerá essa situação, são inoculadas mais de 3 séries com diluições decimais (por exemplo 100 até 10-4, ou mais diluições). Entretanto, na leitura final do NMP deverão ser consideradas somente as 3 diluições mais significativas. Como esse procedimento aumenta em muito o volume de trabalho e de material a ser usado, normalmente são utilizadas apenas três diluições, considerando a estimativa do número esperado do microrganismo em estudo. Então, o número de células viáveis presentes é obtido por meio de 3 diluições decimais sucessivas e transferência de alíquotas determinadas (também decimais, como 10 e 1 mL) de cada diluição em séries de tubos. O número de tubos por série é variável, podendo ser de 2 a 10. Mais comumente são usadas séries de 3 ou 5 tubos por diluição. Quando houver necessidade de inocular grande volume (10 mL) da amostra diluída ou não, na primeira série de tubos, estes deverão conter meio em concentração dupla. O arranjo de número de tubos positivos das 3 diluições (ou as mais significativas) é transposto para tabelas estatísticas que informam o NMP para as diferentes combinações de tubos positivos e que também incluem os limites de confiança dos números mais prováveis dos microrganismos pesquisados em função da tabela em questão. Os intervalos de confiança 95% constantes das tabelas de NMP oferecem a informação de que, em pelo menos 95% das vezes, há a chance da concentração real do microrganismo alvo estar incluído no intervalo de confiança calculado para cada arranjo de tubos positivos. Por exemplo, o arranjo de tubos positivos 3-1-0 oferece como NMP o valor 43/g. Nesse caso, o intervalo de confiança 95% corresponde aos valores compreendidos entre 9 e 180. Isto significa que a chance do número real presente na amostra estar incluído no intervalo de valores entre 9 e 180 UFC/g é de 95%. A expressão do NMP é feita somente por meio do número mais provável que corresponda ao arranjo de tubos positivos por série. Em geral, as tabelas já estão corrigidas considerando g ou mL (e conseqüentemente, as diluições), para a obtenção do NMP.

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ProcedProcedProcedProcedimentoimentoimentoimentossss de Análise pela Técnica dos Tubos Múltiplos de Análise pela Técnica dos Tubos Múltiplos de Análise pela Técnica dos Tubos Múltiplos de Análise pela Técnica dos Tubos Múltiplos usando usando usando usando meios de fermentação meios de fermentação meios de fermentação meios de fermentação da lactoseda lactoseda lactoseda lactose

• Preparar as diluições seriadas: 1 mL 1 mL 1 mL AMOSTRA 9 mL de diluente* 9 mL de diluente 9 mL de diluente ...... (100) (10-1) (10-2) (10-3) (10-n) * Diluente = meio de cultura

Teste presuntivoTeste presuntivoTeste presuntivoTeste presuntivo:

• Inocular 1 mL de cada diluição em uma série de 3 tubos contendo meio de acordo com o esquema abaixo:

Inoculação de Quantidade de amostra inoculada em cada série

1,0 mL da diluição 10-1 na 1ª série 0,1 g ou mL



A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL (Tabela 2).

Meios que podem ser utilizados para semear: Caldo lactosado (CL) com tubos de Durham; Caldo Lactosado com Púrpura de Bromocresol (CL-BCP); Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durham [ou Caldo Lauril Sulfato Triptose com Púrpura de Bromocresol (LST-BCP)].

Incubar os tubos a 35ºC/24h e observar se há tubos com turvação e produção de gás dentro dos tubos de Durham, ou produção de ácido (nos meios contendo púrpura de bromocresol evidenciado pela viragem do indicador de púrpura para amarelo).

Em casos positivos passar aos itens subseqüentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48h e repetir a leitura, passando para os itens subseqüentes em caso de crescimento com produção de gás.

A não ocorrência de ácido e/ou gás após 48h de incubação indica ausência de coliformes (totais, fecais ou E. coli) nos 100 mL da amostra.

Confirmação de coliformes totaisConfirmação de coliformes totaisConfirmação de coliformes totaisConfirmação de coliformes totais

Transferir de cada tubo positivo uma alçada bem carregada da cultura para respectivos tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile (VBB).

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Incubar os tubos a 35ºC por 24-48h e observar se há crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes totais. Anotar o número de tubos de VBB com gás e determinar o NMP de coliformes totais/100 mL em uma tabela de NMP apropriadas às diluições inoculadas (Tabela 2).

A não ocorrência de gás após 48h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra.

Confirmação de coliformes fecaisConfirmação de coliformes fecaisConfirmação de coliformes fecaisConfirmação de coliformes fecais

Transferir de cada tubo positivo uma alçada bem carregada da cultura para respectivos tubos contendo Caldo E. coli (EC).

Incubar os tubos a 44,5ºC por 24h e observar se há crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes fecais. Anotar o número de tubos de VBB com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/100 mL em uma tabela de NMP apropriadas às diluições inoculadas (Tabela 2).

A não ocorrência de gás após 24h de incubação indica ausência de coliformes fecais na amostra.

Confirmação bioquímica de Confirmação bioquímica de Confirmação bioquímica de Confirmação bioquímica de E. coliE. coliE. coliE. coli

Se houver interesse na confirmação de presença/ausência de E. coli através de provas bioquímicas tradicionais, tomar uma alçada da cultura obtida em cada tubo de Caldo EC com produção de gás e estriar em respectivas placas de Agar Eosina Azul de Metileno (EMB).

Incubar as placas a 35ºC por 24h e observar se há desenvolvimento de colônias típicas de E. coli (nucleadas com centro preto, com ou sem brilho verde metálico).

Havendo colônias típicas, transferir duas colônias bem isoladas para tubos de Agar Nutriente (NA) ou outro meio adequado para inóculo de provas bioquímicas, inclinados, e incubar os tubos a 35ºC/24h.

A partir das culturas puras de NA, fazer coloração de Gram, prova de oxidase e inocular os meios teste para realização de provas bioquímicas de indol, VM, VP e citrato (IMVC).

Exemplo de cálculo doExemplo de cálculo doExemplo de cálculo doExemplo de cálculo do NMP NMP NMP NMP Suponha que foram selecionadas as séries de tubos 10-2, 10-3 e 10-4 para as inoculações e que após incubação tenha sido encontrado os seguintes resultados: 10-2 = 3 tubos positivos, 10-3 = 1 tubo positivo e 10-4 = nenhum tubo positivo, teríamos como resultado o número 3 1 0 , que na Tabela do NMP corresponderia à 40. Como na tabela o NMP é

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calculado à partir da diluição 1/10 (0,1), o resultado deverá ser multiplicado por dez, ou seja, o NMP seria igual à 400 microrganismos/g ou mL, ou ainda 4,0 x 102/ g ou mL.

Tabela 2. Número Mais Provável por grama ou mL, para séries de 3 tubos com

inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiança 95%.

Número de Tubos PositivosNúmero de Tubos PositivosNúmero de Tubos PositivosNúmero de Tubos Positivos Intervalo Confiança (95%)Intervalo Confiança (95%)Intervalo Confiança (95%)Intervalo Confiança (95%)

0,10,10,10,1 (10-1) 0,010,010,010,01 (10-2) 0,000,000,000,001111 (10-3) NMP/g ou NMP/g ou NMP/g ou NMP/g ou mLmLmLmL

Inferior Superior

0 1 0 3 <1 17

1 0 0 4 1 21

1 0 1 7 2 27

1 1 0 7 2 28

1 2 0 11 4 35

2 0 0 9 2 38

2 0 1 14 5 48

2 1 0 15 5 50

2 1 1 20 8 61

2 2 0 21 8 63

3 0 0 23 7 129

3 0 1 40 10 180

3 1 0 40 20 210

3 1 1 70 20 280

3 2 0 90 30 390

3 2 1 150 50 510

3 2 2 210 80 640

3 3 0 200 100 1400

3 3 1 500 200 2400

3 3 2 1100 300 4800

3 3 3 >1100

Obs: Para calcular o NMP de diluições maiores que as apresentadas na tabela, multiplicar o NMP pelo fator adequado: 10, 100, 1000, etc. Por exemplo, se os tubos selecionados correspondem às diluições 10-2, 10-3 e 10-4, multiplicar por 10; se as diluições são 10-3, 10-4 e 10-5, multiplicar por 100.

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2. 2. 2. 2. Teste de presença/ausência (P/A)Teste de presença/ausência (P/A)Teste de presença/ausência (P/A)Teste de presença/ausência (P/A) É uma simplificação do teste anterior, que NÃONÃONÃONÃO objetiva quantificar os coliformes nas

amostras, mas SIMSIMSIMSIM verificar a presença num determinado volume.verificar a presença num determinado volume.verificar a presença num determinado volume.verificar a presença num determinado volume. A principal aplicação é análise de águas destinadas ao consumo humano, para as quais a legislação brasileira estabelece como padrão a ausência de coliformes totais e fecais em 100 mL de amostra. Pode ser realizado com meios de cultura que utilizam a produção de ácido a partir da fermentação de lactose como característica diferencial presuntiva (Caldo P-A, Caldo Lactosado com Púrpura de Bromocresol ou Caldo Lauril Sulfato Triptose com Púrpura de Bromocresol). 3.3.3.3. Teste da membrana filtrante Teste da membrana filtrante Teste da membrana filtrante Teste da membrana filtrante É um método de análise quantitativo, permitindo determinar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) dos microrganismos alvo na amostra, baseado na filtração de um determinado volume através de um filtro membrana com poro de 0,45 µm. As bactérias, que possuem dimensão maior que os poros, ficam retidas na membrana, que é transferida para uma placa de Petri contendo meio de cultura seletivo e diferencial para visualização de colônias típicas.

A técnica não é restrita à análise de coliformes, podendo também ser aplicada na análise de Pseudomonas aeruginosaa, Enterococcus e Clostridium perfringens. Porém sua principal aplicação é a análise de água destinada ao consumo humano (filtração de 100 mL da amostra). O que determina o microrganismo a ser contado é a seleção do meio de cultura, que no caso dos coliformes, apresenta as seguintes opções, consideradas oficiais no Brasil:

� Agar m-Endo: seletivo diferencial para coliformes totais; � Agar m-FC: seletivo para coliformes fecais; � Agar m-TEC; � Agar m-TEC Indoxil.

Procedimento de Análise pela Procedimento de Análise pela Procedimento de Análise pela Procedimento de Análise pela Técnica da Membrana FiltranteTécnica da Membrana FiltranteTécnica da Membrana FiltranteTécnica da Membrana Filtrante Preparação do conjunto de filtraçãoPreparação do conjunto de filtraçãoPreparação do conjunto de filtraçãoPreparação do conjunto de filtração: Preparar o conjunto ajustando a membrana no porta-filtro (com face quadriculada para cima) e o copo de filtração sobre a membrana. Conectar o kitasato de coleta do líquido filtrado à bomba de vácuo. O conjunto deve ser montado próximo a chama de um bico de Bunsen ou no interior de uma câmara de fluxo laminar. Preparação da amostraPreparação da amostraPreparação da amostraPreparação da amostra: Homogeneizar a amostra por agitação, invertendo o frasco 25 vezes em ângulo de 45º. Medir 100 mL numa proveta estéril e verter cuidadosamente no copo do conjunto de filtração, evitando respingos. Se o copo do conjunto de filtração for

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graduado e a escala contiver a marcação de volume requerida, o volume da amostra pode ser medido diretamente sem a utilização da proveta. FiltraçãoFiltraçãoFiltraçãoFiltração: : : : Ligar a bomba de vácuo e proceder à filtração. Após passagem da amostra, ainda com a bomba ligada, enxaguar as paredes do copo com 20 a 30 mL de água de diluição (Tampão Fosfato com cloreto de magnésio), para recolher eventuais contaminantes aderidos. Repetir esse procedimento mais uma vez. Desligar a bomba de vácuo antes que a membrana seque excessivamente. Transferência e incTransferência e incTransferência e incTransferência e incubação da membranaubação da membranaubação da membranaubação da membrana: : : : Retirar o copo e com uma pinça flambada e resfriada, transferir a membrana para uma placa com meio de cultura adequado à contagem que se deseja efetuar, com a face quadriculada para cima. Ao colocar a membrana no meio de cultura é importante que toda a superfície fique completamente aderida ao meio, para que haja contado dos microrganismos com os nutrientes. Se houver formação de bolhas, deve-se levantar a borda da membrana mais próxima da(s) bolha(s) e recolocá-la de forma a eliminar a(s) bolha(s). Contagem das ColôniasContagem das ColôniasContagem das ColôniasContagem das Colônias: : : : Proceder à contagem das colônias com o auxílio de um microscópio estereoscópico, com aumento de 10 a 15 vezes e iluminação fluorescente perpendicular ao plano da membrana. Contar apenas as colônias típicas e selecionar para contagem as placas com número total de colônias inferior a 200 e número de colônias típicas entre 20 e 80 (20 e 60 no caso do Ágar m-FC, no qual as colônias são um pouco maiores).

Cálculo dos ResultadosCálculo dos ResultadosCálculo dos ResultadosCálculo dos Resultados 1- Nas situações normais, em que são filtrados 100 mL da amostra, o número total de colônias na placa não ultrapassou 200 e o número de colônias típicas manteve-se na faixa recomendada, o número de unidades formadoras de colônias (UFC)/100mL da amostra é dado diretamente pelo número de colônias presentes.

2- Se foi filtrado um número diferente de 100 mL, mas o número total de colônias na placa não ultrapassou 200 e o número de colônias típicas ainda se manteve na faixa recomendada, considerar o volume no cálculo do resultado, lembrando que, se foram utilizadas diluições, 1 mL da diluição 10-1 corresponde a 0,1mL da amostra original 1mL da 10-2 corresponde a 0,01mL da amostra original e assim subseqüentemente. Nesse caso, o número de UFC/100 mL é dado pela seguinte fórmula:

UFC/100 mL = Nº colônias típicas x 100

Volume da amostra original que foi filtrado

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3- Se houve necessidade de confirmar as colônias de coliformes totais no Ágar m-Endo ou Ágar m-Endo-LES, utilizando-se o método quantitativo, calcular o número de UFC/100 mL em função do volume filtrado e da porcentagem de colônias confirmadas, utilizando a fórmula abaixo, porém, atenção: se a confirmação foi feita pelo método qualitativo, reportar o resultado como presença ou ausência no volume filtrado.

Onde 4- Se foi filtrado mais de um volume da amostra e placas correspondentes a mais de um volume se apresentaram em condições adequadas para contagem, considerar a soma das colônias nas várias placas e a soma dos respectivos volumes no cálculo do resultado, de acordo com a fórmula abaixo:

5- Se não houver desenvolvimento de colônias típicas em nenhuma placa, expressar o resultado como ausência ou menor que 1/100 mL.

6- Se nenhuma placa apresentar contagem acima de 20 colônias típicas, utilizar o número obtido no cálculo de resultado.

7- Se as placas apresentarem mais de 80 colônias típicas, fazer a contagem desde que o número total de colônias na placa não exceda 200.

8- Quando a placa contiver um número de colônias superior a 200, impedindo a contagem, relatar o resultado como presença ou ausência, dependendo da presença de colônias típicas ou da confirmação observada.

UFC/100 mL = Nº colônias típicas x % de colônias confirmadas x 100

Volume filtrado

% colônias confirmadas = Nº colônias confirmadas x 100

Nº colônias submetidas à confirmação

UFC/100mL = Soma colônias típicas nas várias placas x 100

Soma volumes correspondentes às placas contadas

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Bibliografia cBibliografia cBibliografia cBibliografia consultadaonsultadaonsultadaonsultada

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm, arquivo capturado em 12/10/2002.

AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for the Compendium of methods for the Compendium of methods for the Compendium of methods for the

microbiological examination of foods.microbiological examination of foods.microbiological examination of foods.microbiological examination of foods. 3rd ed. Washington, APHA, 1992. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de

origem animal e seus ingredientes.origem animal e seus ingredientes.origem animal e seus ingredientes.origem animal e seus ingredientes. I – Métodos microbiológicos. Brasília, MA, 1981. ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L.R.; AZEVEDO, J.L. Tratado de MicrobiologiaTratado de MicrobiologiaTratado de MicrobiologiaTratado de Microbiologia. São

Paulo:Manole,1987, v.1, 183p. SILVA, N. da; NETO, R.C.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de métodos de Manual de métodos de Manual de métodos de Manual de métodos de

análise microbiológica da áganálise microbiológica da áganálise microbiológica da áganálise microbiológica da água.ua.ua.ua. Campinas:ITAL/Núcleo de Microbiologia, 2000. 99p. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de Alimentos. EMBRAPA, MERCK, Brasília – DF,

1995.

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda 1) Quais são as principais condições que devem ser consideradas no cultivo de microrganismos? 2) Descrever as várias fases de uma curva típica de crescimento de uma cultura microbiana em um sistema fechado.

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CONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NÃOCONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NÃOCONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NÃOCONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NÃO----FILAMENTOSOS FILAMENTOSOS FILAMENTOSOS FILAMENTOSOS (LEVEDURAS)(LEVEDURAS)(LEVEDURAS)(LEVEDURAS)

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução Os fungos encontram-se amplamente distribuídos em todos os habitats, podendo ser

parasitas, simbiontes ou saprófitos. Crescem onde existe matéria orgânica disponível, viva ou morta, geralmente exigindo calor e umidade. Água, solo, troncos, folhas, frutos, sementes, excrementos, insetos, alimentos frescos e processados, têxteis e inúmeros outros produtos fabricados pelo homem constituem substratos para o desenvolvimento de fungos.

O reino dos fungos inclui uma grande diversidade de microrganismos que podem ser microscópicos ou não. Os grupos mais importantes são os boloresboloresboloresbolores conhecidos como mofos, as levedurasleveduraslevedurasleveduras e os cogumeloscogumeloscogumeloscogumelos (Figura 3).

Figura 3. Reino Fungi: a) Bolores; b) Leveduras; c) Cogumelos.

Características fisiológicas dos fungos:

• Faixa de temperatura de crescimento: 0 – 35ºC • Temperatura ótima: 25 – 30ºC • Faixa de pH de crescimento: 2,0 - 8,5 (pH ótimo: 4,5 - 5,5)

Necessidades hídricas: Bolores < Leveduras < Bactérias • Aw (atividade de água) menor que 0,70 inibe o crescimento da maioria dos

bolores que causam a deterioração de alimentos. • Aw = estima a proporção de água disponível no sistema para reações

biológicas, bioquímicas e químicas. Os fungos podem ser: a) Fungos Filamentosos: BOLORES (Figura 4a)

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São fungos filamentosos, multicelulares, obtêm sua alimentação de matéria orgânica inanimada ou nutrem-se, como parasitas, de hospedeiros. Alguns destes fungos são benéficos aos homens, auxiliando na indústria alimentícia (maturação de queijos) bem como na indústria farmacêutica (produção de penicilina). Outros são

prejudiciais, causando doenças em vegetais, animais e homens, e dentro deste grupo há ainda aqueles produtores de micotoxinas como as aflatoxinas. b) Fungos não-Filamentosos: LEVEDURAS (Figura 4b)

As leveduras são fungos como os bolores, mas se diferenciam deles por se apresentarem predominantemente sob forma unicelular. Por serem células mais simples, elas crescem e se reproduzem mais rapidamente do que os bolores. Uma levedura típica consta de células ovais, que se multiplicam assexuadamente por brotamento ou gemulação. A maioria das leveduras, não vive no solo, mas adapta-se a ambientes com alto teor de açúcares, tal como néctar das flores e a superfície de frutas.

Figura 4. (a) bolores (b) leveduras Como os fungos filamentosos, certas leveduras são benéficas (produção de

cervejas, vinho, etc – leveduras fermentativas), sintetizam certas vitaminas e/ou outros produtos. Existem ainda as leveduras que deterioram os alimentos ou provocam doenças nos vegetais e animais.

As leveduras são classificadas em todas as três classes de fungos superiores: AscomicetosAscomicetosAscomicetosAscomicetos, BasidiomicetBasidiomicetBasidiomicetBasidiomicetosososos e Fungos ImperfeitosFungos ImperfeitosFungos ImperfeitosFungos Imperfeitos. O principal agente da fermentação alcoólica é a levedura ascomicética Saccharomyces cerevisae.

As leveduras de interesse em alimentos são: 1. Top yeast: leveduras de superfície; 2. Botton yeast: leveduras de profundidade.

Significado noSignificado noSignificado noSignificado nos alimentoss alimentoss alimentoss alimentos A presença de fungos filamentosos e leveduras viáveis e em índice elevado nos alimentos pode fornecer várias informações:

• Condições de higiene deficientes nos equipamentos;

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• Matéria-prima com contaminação excessiva; • Multiplicação no produto em decorrência de falhas no processamento e/ou

estocagem. Material:Material:Material:Material:

• Ágar batata dextrose 2%; • L(+) Ácido tartárico 10%; • Solução de água peptonada 0,1%. • Placas de Petri • Alça de Drigalsky

Procedimentos:Procedimentos:Procedimentos:Procedimentos: Preparo da amostraPreparo da amostraPreparo da amostraPreparo da amostra

• Pesar 10 g e adicionar 90 mL de solução de água peptonada 0,1% ou pipetar 1 mL da amostra e colocar no tubo com 9 mL de água peptonada.

• Homogeneizar. A partir da diluição inicial 10-1 proceder as diluições 10-2 e 10-3.

InoculaçãoInoculaçãoInoculaçãoInoculação • Inocular 0,1 mL das diluições selecionadas em placas de Petri contendo o ágar PDA

acidificado já solidificado. • Com o auxílio de uma alça de Drigalsky espalhar cuidadosamente o inóculo na placa

até sua completa absorção. IncubaçãoIncubaçãoIncubaçãoIncubação

• Incubar as placas, sem inverter, a 25 ± 1°C, por 5 a 7 dias. LeituraLeituraLeituraLeitura Transcorrido o período de incubação, considerar para contagem somente as placas que apresentarem de 15 a 150 colônias. Multiplicar o número de colônias obtido por 10 para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado na placa. OBSERVAÇÕES: Não abrir, em hipótese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminação ambiental por meio da dispersão dos seus esporos.

Bolores - colônias arredondadas, com bordas difusas. Leveduras – colônias ovaladas, bordas definidas, pequenas, de aparência cremosa.

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Bibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultada AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. http://www.anvisa.gov.br AZEVEDO, J.L. de Fungos. Fungos. Fungos. Fungos. http://www.biotecnologia.com.br/bio01/1hp_5.asp Texto capturado em 19/09/2003. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de ororororigem animal e seus ingredientes.igem animal e seus ingredientes.igem animal e seus ingredientes.igem animal e seus ingredientes. I – Métodos microbiológicos. Brasília, MA, 1981. PEREIRA, M.S.V. O Curioso Mundo dos Fungos. O Curioso Mundo dos Fungos. O Curioso Mundo dos Fungos. O Curioso Mundo dos Fungos. http://www.biologianaweb.com/micro/fuhttp://www.biologianaweb.com/micro/fuhttp://www.biologianaweb.com/micro/fuhttp://www.biologianaweb.com/micro/fungi.htngi.htngi.htngi.htmLmLmLmL Texto capturado em 19/09/2003. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de Alimentos. EMBRAPA, MERCK, Brasília – DF, 1995.

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda 1) Quais as características dos meios para cultivo de fungos? 2) Quais as diferenças entre as colônias de leveduras e as colônias de fungos filamentosos? 3) Esquematize e explique o ciclo de vida de um bolor.

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4ª Aula Prática 4ª Aula Prática 4ª Aula Prática 4ª Aula Prática CONTAGEM DE BACTÉRIAS LÁCTICASCONTAGEM DE BACTÉRIAS LÁCTICASCONTAGEM DE BACTÉRIAS LÁCTICASCONTAGEM DE BACTÉRIAS LÁCTICAS

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução Um dos mais importantes grupos de bactérias produtoras de ácidos em alimentos industrializados é o das bactérias lácticas, constituídos pelos principais gêneros:

• Lactobacillus • Streptococcus • Leuconostoc • Pediococcus

Significado nos alimentosSignificado nos alimentosSignificado nos alimentosSignificado nos alimentos As bactérias lácticas são importantes nas indústrias de laticínios, de produtos cárneos e de vegetais, por participarem no processamento de diversos alimentos tais como: leite fermentado, queijos, salames, produtos fermentados de soja e outros vegetais. Também podem provocar alterações como acidificação, turvação, estufamentos, modificações de odor e sabor. A contagem de bactérias lácticas é importante em determinados alimentos, especialmente naqueles em que a conservação está baseada no abaixamento do pH (acidificados) e nos produtos ácidos. Esta contagem fornece indicações sobre a higiene na produção bem como permite estimar o tempo de vida de prateleira dos alimentos.

Meios de CulturaMeios de CulturaMeios de CulturaMeios de Cultura Ágar soro de laranja:Ágar soro de laranja:Ágar soro de laranja:Ágar soro de laranja: Indicado para a contagem de microrganismos deteriorantes, ácidos tolerantes, em suco de frutas e frutos cítricos. Por conter extratos de laranja, este meio oferece boas condições para crescimento da microflora existente no suco cítrico tais como Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, fungos filamentosos, leveduras e outros, sendo recomendado para o controle de fabricação de sucos de frutas e refrigerantes.

Ágar seletivo para o Ágar seletivo para o Ágar seletivo para o Ágar seletivo para o LactobacillusLactobacillusLactobacillusLactobacillus (meio Rogosa): (meio Rogosa): (meio Rogosa): (meio Rogosa): Este meio é recomendado para o isolamento e contagem de Lactobacillus de carne e produtos cárneos, leite e produtos lácteos bem como outros alimentos. A seletividade do meio está baseada na elevada concentração de acetato e o pH baixo, os quais inibem a microbiota acompanhante.

Ágar para Ágar para Ágar para Ágar para LactobacillusLactobacillusLactobacillusLactobacillus dededede M M M Man, R, R, R, Rogosa e S e S e S e Sharpe (Ágar MRS):Ágar MRS):Ágar MRS):Ágar MRS): Este meio é utilizado para contagem dos lactobacilos em todos os alimentos e em virtude da pouca seletividade deste meio, podem crescer também espécies de Pediococcus,

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Leuconostoc, dentre outras. A seletividade deste meio deve-se ao poli-sorbato, acetato, magnésio (fatores estimulantes do crescimento de Lactobacillus) da formulação, que é rica em nutrientes.

Metodologia:Metodologia:Metodologia:Metodologia: AMOSTRAS LÍQUIDAS:AMOSTRAS LÍQUIDAS:AMOSTRAS LÍQUIDAS:AMOSTRAS LÍQUIDAS:

• Pipetar 1mL; • Colocar 9 mL de diluente água peptonada (diluição 10-1).

AMOSTRAS SÓLIDAS:AMOSTRAS SÓLIDAS:AMOSTRAS SÓLIDAS:AMOSTRAS SÓLIDAS: • Pesar 10 g da amostra em copo homogeneizador; • Acrescentar 90 mL de diluente água peptonada e homogeneizar (diluição 10-1).

Proceder após preparo das amostras:Proceder após preparo das amostras:Proceder após preparo das amostras:Proceder após preparo das amostras: • Preparar as diluições, sendo que para leites fermentados e iogurtes pode-se utilizar

10-6, 10-7 e 10-8. Lembre-se de agitar os tubos entre uma diluição e outra. • Plaquear por profundidade (colocando 1 mL da amostra e vertendo o meio MRS em

cima). Homogeneizar amostra e meio de cultura fazendo movimentos na forma de 8. • Depois que o meio estiver solidificado colocar as placas invertidas na estufa, a 37oC

por 48 horas. OBS: Incubar placas 10-6, 10-7 e 10-8. Resultados: Valor da Contagem MínimaResultados: Valor da Contagem MínimaResultados: Valor da Contagem MínimaResultados: Valor da Contagem Mínima

Será utilizado A contagem mínima destas bactérias deve ser de 106 UFC/mL de células viáveis no alimento durante o tempo de vida de prateleira do mesmo.

Bibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultada

Siqueira, R. S. Manual de MicroManual de MicroManual de MicroManual de Microbiologia de Alimentosbiologia de Alimentosbiologia de Alimentosbiologia de Alimentos, Embrapa-MERCK, 1995.

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. http://www.anvisa.gov.br

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda

1) O que é cultura "starter" e dê suas aplicações.

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CONTAGEM DE CONTAGEM DE CONTAGEM DE CONTAGEM DE Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus COAGULASE PCOAGULASE PCOAGULASE PCOAGULASE POSITIVAOSITIVAOSITIVAOSITIVA

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução Staphylococcus são cocos Gram positivos, agrupados em forma de cacho de uva, esporulados, imóveis, produtores de toxina (algumas cepas), patogênicos, anaeróbios facultativo, mas crescem melhor em condições aeróbias. Sua faixa de pH para crescimento é de 4,2-9,3 (ótimo entre 7,0 e 7,5), faixa de temperatura ótima para crescimento é de 30 e 37ºC e atividade de água mínima – 0,86. Seu habitat natural são as cavidades nasais, garganta e trato intestinal. Estes cocos incluem S. aureus (Figura 5), espécie que é o agente causador de várias síndromes patológicas no homem, incluindo as gastroenteritesgastroenteritesgastroenteritesgastroenterites transmitidas por alimentos. Esta bactéria produz toxina, enterotoxinasenterotoxinasenterotoxinasenterotoxinas, que são proteínas simples, facilmente solúveis em água e em soluções salinas, resistentes a ação de enzimas e termorresistentes. Nos alimentos não são totalmente inativadas pela cocção normal, pasteurização e outros tratamentos térmicos correntes. Estima-se que, para produzir intoxicação no homem, seja necessário de 0,015 a 0,357µg de enterotoxina por kg de peso corporal. O período de incubação, geralmente, é de 2 a 4 horas após a ingestão do alimento contaminado, apresentando náuseas, vômitos, diarréia, contrações abdominais e cefaléia, com duração de 1 a 2 dias.

Figura 5.Staphylococcus aureus Os alimentos propícios para crescimento são produtos de origem animal industrializados, carnes, ovos, leite, pescado, massas alimentícias, cremes, maionese, doces de confeitaria com ou sem recheio. A presença de S. aureus nos alimentos é interpretada, em geral, como indicativo de contaminação a partir da pele, boca e das fossas nasais dos manipuladores de alimentos, bem como da limpeza e da sanificação inadequada dos materiais e dos equipamentos. No geral, é possível que os estafilococos vivam, mesmo que em número escasso, em qualquer ou em todos os produtos alimentícios de origem animal ou

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aqueles manipulados diretamente por pessoas, a não ser que seja aplicado tratamento térmico aos produtos. Meios de culturaMeios de culturaMeios de culturaMeios de cultura Ágar BairdÁgar BairdÁgar BairdÁgar Baird----Parker Parker Parker Parker –––– Neste meio, as colônias de S. aureus são negras, lustrosas, convexas, 1 a 5mm de diâmetro, rodeados por halo claro de 2 a 5 mm de largura. Ágar VogelÁgar VogelÁgar VogelÁgar Vogel----Johnson Johnson Johnson Johnson –––– Este meio tem coloração vermelha, devido ao vermelho fenol, onde as colônias de S. aureus apresentam-se negras, pequenas e com halo amarelo ao redor. ÁgaÁgaÁgaÁgar Chapman r Chapman r Chapman r Chapman –––– meio para meio para meio para meio para StaphylococcusStaphylococcusStaphylococcusStaphylococcus número 110 número 110 número 110 número 110 –––– Neste meio crescem apenas microrganismos que possuam elevada tolerância ao NaCl. Entre estes, o S. aureus são diferenciados pela formação de pigmento amarelo dourado (as não pigmentadas são brancas), e desenvolvimento de uma zona clara ao redor das colônias. Procedimentos paraProcedimentos paraProcedimentos paraProcedimentos para análise análise análise análise

• Triturar a amostra sólida, pesar 10 g da amostra de forma asséptica; OBS: As amostras de maionese serão pesadas (10 g) e misturadas em recipiente com rosca e agitadas manualmente.

• Misturar as 10g em 90 mL de água peptonada (0,1%);

Considerado 10-1

• Homogeneizar bem durante alguns minutos; • Preparar as demais diluições decimais seriadas (10-2 e 10-3) adicionando 1 mL

em 9mL de água peptonada (0,1%); • Retirar de cada diluição, alíquotas de 0,1mL e colocá-las em placa de Petri

contendo o meio ágar Baird-Parker;

10 g amostra + 90 mL 10101010----2222 10 10 10 10----3333

água peptonada (10101010----1111) placa de Petri placa de Petri com ágar + 0,1 mL com ágar + 0,1 mL da diluição 10101010----2 2 2 2 da diluição 10101010----3333

• Fazer o espalhamento do inóculo na placa com auxílio da alça de Drigalsky;

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• Incubar, invertendo as placas, a 35-37ºC/48 horas; • Como resultado prévio obtém:

• Transcorrido este tempo, transferir um número representativo de colônias típicas, para caldo BHI (um tubo para cada colônia);

• Incubar a 35-37ºC/24 horas; • Transcorrido o tempo, comprovar bioquimicamente, utilizando-se os testes:

DNAse, coagulase (enumeração e confirmação de colônias típicas de estafilococos), catalase.

Bibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultada

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA).

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm, arquivo capturado em 30/09/2003.

JAY, J.M. Microbiología moderna de los alimentos.Microbiología moderna de los alimentos.Microbiología moderna de los alimentos.Microbiología moderna de los alimentos. Ed. Acribia S.A.: Zaragoza. 3ed., 804p.

MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Métodos analíticos oficiais para controle de Métodos analíticos oficiais para controle de Métodos analíticos oficiais para controle de Métodos analíticos oficiais para controle de produtosprodutosprodutosprodutos de origem animal e seus ingredientes. de origem animal e seus ingredientes. de origem animal e seus ingredientes. de origem animal e seus ingredientes. I – Métodos microbiológicos. Brasília, MA, 1981.

SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de Alimentos. EMBRAPA, MERCK, Brasília – DF, 1995.

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda 1) O que é um microrganismo coagulase positiva? 2) Relacione os principais teste bioquímicos para a diferenciação de espécies bacterianas.

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6666ª Aula Prática ª Aula Prática ª Aula Prática ª Aula Prática

CONTAGEM DE CONTAGEM DE CONTAGEM DE CONTAGEM DE Bacillus cereusBacillus cereusBacillus cereusBacillus cereus EM ALIMENTOSEM ALIMENTOSEM ALIMENTOSEM ALIMENTOS IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução O microrganismo Bacillus cereus é o agente causador da doença gastroenterite que

produz exoenterotoxina e seu modo de transmissão ocorre através da ingestão de alimentos mantidos em temperatura ambiente por longo tempo, depois de cozidos, o que permite a multiplicação dos microrganismos. Surtos com vômitos predominantes são mais comumente associados ao arroz cozido que permaneceu em temperatura ambiente. Uma variedade de erros na manipulação de alimentos tem sido apontada como causa de surtos com diarréia. Os alimentos associados com este microrganismo são aqueles implicados em surtos tais como carnes, leite, vegetais e peixes. Os surtos por vômitos estão mais associados a produtos à base de arroz; entretanto, outros produtos têm sido implicados em surtos como batatas, massas e queijos. Misturas com molhos, pudins, sopas, assados e saladas têm sido implicadas. Uma variedade de métodos de análise é recomendada para a recuperação, identificação e confirmação do B. cereus em alimentos. Mais recentemente, um método sorológico foi desenvolvido para identificação da enterotoxina diarréica do B. cereus para alimentos suspeitos. Estudos recentes sugerem que a toxina do vômito pode ser detectada por modelos em animal (gatos, macacos) ou possivelmente por cultura de células. O período de incubação da doença é de 8 a 16 horas e os sintomas são náuseas, espasmos abdominais, diarréia aquosa, e às vezes vômitos. Nos períodos de incubação mais curtos a náusea e os vômitos predominam, semelhante à intoxicação por S. aureus, com duração de um dia ou menos. Como medidas de controle têm-se procedimentos como resfriar alimentos rapidamente em pequenas porções, manter os alimentos em temperatura superior a 55°C, reaquecer os alimentos em temperaturas de no mínimo 75°C, praticar higiene pessoal e manipulação em condições sanitárias, e evitar sobras, principalmente, de arroz, milho e purê de legumes.

MaterialMaterialMaterialMaterial • Estufa bacteriológica regulada a 30±1°C; • Bastão de vidro em L ou alça de Drigalski; • Placas de petri contendo ágar base para Bacillus cereus suplementado com gema de

ovo e polimixina B; • Pipetas de 1 ou 2 mL; • Tubos para diluição contendo 9 mL de água peptonada;

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• Copos homogeneizadores e frascos com 90 mL de água peptonada para amostras sólidas

ProcedimentoProcedimentoProcedimentoProcedimentossss –––– PlaqueamentoPlaqueamentoPlaqueamentoPlaqueamento Spread PlateSpread PlateSpread PlateSpread Plate InoculaçãoInoculaçãoInoculaçãoInoculação

• Preparar três diluições da amostra (10-1, 10-2 e 10-3); • Semear em superfície as duas últimas diluições (colocar 0,1 mL de cada diluição na

respectiva placa contendo o meio de cultura e espalhar com a alça de Drigalsky previamente flambada e esfriada).

IncubaçãoIncubaçãoIncubaçãoIncubação • Incubar as placas invertidas em estufa a 30ºC durante 24 a 48 horas.

Contagem Contagem Contagem Contagem das colôniasdas colôniasdas colôniasdas colônias • Contar as placas contendo de 10 a 100 colônias. As colônias típicas de B. cereus

são esféricas, com bordas perfeitas, planas, secas e cerosas, rodeadas por um grande halo de precipitação devido à reação com a gema de ovo.

OBS: Multiplicar o resultado obtido por 10. Exemplo: diluição 10-2 = 12 colônias => 12 X 102 X 10

Bibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultada AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA).

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm, arquivo capturado em 30/09/2003.

JAY, J.M. Microbiología moderna de los alimentos.Microbiología moderna de los alimentos.Microbiología moderna de los alimentos.Microbiología moderna de los alimentos. Ed. Acribia S.A.: Zaragoza. 3ed., 804p MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de

origem animal e seus ingredieorigem animal e seus ingredieorigem animal e seus ingredieorigem animal e seus ingredientes.ntes.ntes.ntes. I – Métodos microbiológicos. Brasília, MA, 1981.

SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de AlimentosManual de Microbiologia de Alimentos. EMBRAPA, MERCK, Brasília – DF, 1995.

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda 1) Que forma latente a gênero Bacillus pode produzir? 2) Esquematize e explique as alterações estruturais que ocorrem na célula bacteriana quando o microrganismo produz sua forma latente.

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CONTAGEM DE CONTAGEM DE CONTAGEM DE CONTAGEM DE ClostridiumClostridiumClostridiumClostridium SULFITO REDUTORSULFITO REDUTORSULFITO REDUTORSULFITO REDUTOR

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução Microrganismos anaeróbios são organismos que toleram baixas concentrações ou nenhum oxigênio livre e não o utilizam para obtenção de energia. Durante anos as bactérias anaeróbias foram cultivadas na camada profunda de um meio solidificado, pois podiam crescer no fundo desses tubos onde a camada de ágar da superfície exclui o oxigênio atmosférico. Posteriormente foram desenvolvidas técnicas, como a adição de um agente redutor ao meio que remove o oxigênio para produzir o que se chama de meio reduzido. O tioglicolato de sódio é comumente utilizado como um agente redutor; que se combina quimicamente com o oxigênio dissolvido em um meio e torna-o não disponível para os microrganismos. Para o cultivo de bactérias anaeróbias, o oxigênio deve ser eliminado da atmosfera. Podem ser realizados cultivos em Tubos de Ágar em cama da alta; através de incubadoras chamadas Câmara de anaerobiose ou Glove box, onde a atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio, dióxido de carbono e nitrogênio; e também em meios inoculados em uma jarra de anaerobiose juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono propício para o crescimento de anaeróbios. Existem vários meios de cultura para enumeração de C. perfringens em alimentos, sendo que o ágar TSC (Ágar Triptose Sulfito Cicloserina) tem sido o mais utilizado no plaqueamento direto. Os clostrídios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro, produzindo colônias pretas. É importante ressaltar que os meios de cultura utilizados nessa técnica permitem o crescimento e produção de toxina de C. botulinum, devendo ser observados cuidados durante a execução dos testes para garantir a segurança pessoal e do laboratório.

MaterialMaterialMaterialMaterial:::: • Diluente para amostras sólidas: frascos com 90 mL de água peptonada a 0,1%; • Tubos de diluição com 9 mL de água peptonada a 0,1%; • Pipetas de 1 e 2 mL; • Câmaras de anaerobiose e geradores de anaerobiose; • Placas de Petri; • Ágar TSC.

ProcedimentoProcedimentoProcedimentoProcedimentossss:::: • Preparar duas diluições 10-1 e 10-2;

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• Colocar 1 mL de cada diluição nas placas devidamente identificadas; • Colocar o ágar TSC e homogeneizar cuidadosamente; • Esperar solidificar totalmente e cobrir com mais uma fina camada do ágar TSC; • Incubar as placas em anaerobiose a 37ºC por 18 a 20 horas; • Contar as colônias; • Selecionar colônias típicas para realização das provas bioquímicas; • Repicar as colônias típicas para o caldo tioglicolato, incubar a 37ºC por 24 horas.

Prova da fermentação da lactose e hidrólise da gelatinaProva da fermentação da lactose e hidrólise da gelatinaProva da fermentação da lactose e hidrólise da gelatinaProva da fermentação da lactose e hidrólise da gelatina

• A partir do tubo contendo o caldo tioglicolato, inocular uma alçada em um tubo contendo o meio lactose gelatina e incubar a 37ºC por 24 horas;

• Observar se houve viragem ácida do indicador vermelho de fenol alterando a cor do meio para amarelo e se houve hidrólise da gelatina.

OBS: as cepas de C. perfringens fermentam a lactose e hidrolisam a gelatina.

Bibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultada SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A., SILVEIRA, N.F.A. Manual de métodos de análise Manual de métodos de análise Manual de métodos de análise Manual de métodos de análise microbiológica de alimentosmicrobiológica de alimentosmicrobiológica de alimentosmicrobiológica de alimentos. Varela. São Paulo, 2001.

Pesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e respondaPesquise e responda 1) Explique o modo de ação da toxina produzida por Clostridium. 2) Explique as características de um alimento enlatado deteriorado por Clostridium.

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8888ª Aula Prática ª Aula Prática ª Aula Prática ª Aula Prática

VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE SalmonellaSalmonellaSalmonellaSalmonella

A técnica tradicional de detecção de Salmonella em alimentos é um método cultural clássico, desenvolvido com a finalidade de garantir sua detecção mesmo em situações extremamente desfavoráveis, como é o caso de alimentos com uma microbiota competidora muito maior do que a população de Salmonella; e/ou alimentos em que as células de Salmonella se encontram em um número muito reduzido; e/ou alimentos em que as células se encontrem injuriadas pelo processo de preservação, como a aplicação de calor, o congelamento e/ou secagem, por exemplo. A metodologia segue basicamente quatro etapas que podem ser aplicadas em qualquer tipo de alimento. PréPréPréPré----enriquecimenenriquecimenenriquecimenenriquecimento em caldo não seletivoto em caldo não seletivoto em caldo não seletivoto em caldo não seletivo Objetiva a recuperação de células injuriadas e é conseguida pela incubação da amostra em condições não seletivas por pelo menos 18 horas.

• Homogeneizar 10 mL da amostra líquida com 90 mL de solução de água peptonada a 1%. No caso de amostra sólida, pesar 10 g em copos autoclavados, juntar água peptonada a 1% e utilizar o homogeneizador.

• Incubar a 35ºC por 24 horas. Enriquecimento seletivoEnriquecimento seletivoEnriquecimento seletivoEnriquecimento seletivo Objetiva inibir a multiplicação da microbiota acompanhante e promover a elevação preferencial do número de células de Salmonella, incubando-se a amostra pré-enriquecida em caldo seletivo por 18 a 24 horas. Recomenda-se a utilização de dois meios de enriquecimento diferentes porque a resistência de Salmonella aos agentes seletivos varia de cepa para cepa.

• Transferir 1 mL do caldo pré-enriquecido para 1 tubo contendo caldo tetrationato e 1 mL para um tubo contendo caldo selenito-cistina.

• Incubar a 41ºC por 24 horas, em banho-maria. Plaqueamento seletivo diferencialPlaqueamento seletivo diferencialPlaqueamento seletivo diferencialPlaqueamento seletivo diferencial Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colônias de Salmonella, com características típicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmação bioquímica e sorológica. Também nessa etapa recomenda-se a utilização de mais de um tipo de meio de cultura para o plaqueamento.

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• A partir dos caldos terationato e selenito-cistina, repicar para placas de ágar bismuto-sulfito e ágar Hectoen;

• Incubar a 35ºC por 24 horas; • Verificar a presença de colônias típicas:

o ágar bismuto-sulfito: colônias marrons, cinzas ou negras, com brilho metálico. o ágar Hectoen: colônias transparentes, verde azuladas, com ou sem centro

preto. Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de lactose podem apresentar-se de cor salmão e não transparentes.

ConfirmaçãoConfirmaçãoConfirmaçãoConfirmação Objetiva verificar se as colônias típicas obtidas nas placas são realmente colônias de Salmonella, através de provas bioquímicas e sorológicas.

• Repicar as colônias típicas em ágar TSI (tríplice açúcar ferro); • Incubar por 24 horas a 35ºC; • Reação típica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido

(amarelo) com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Bibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultadaBibliografia consultada SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A., SILVEIRA, N.F.A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. Livraria Varela. São Paulo, 2001.

PesPesPesPesquise e respondaquise e respondaquise e respondaquise e responda 1) Quais os fatores intrínsecos e extrínsecos ideais para crescimento de Salmonella? 2) Qual é a dose infectante e o período de incubação do microrganismo causador da salmonelose? 3) Como é feito o diagnóstico laboratorial em pacientes acometidos por Salmonella?

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Apostila de Microbiologia de AlimentosEliana Kamimura