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Enzimas Imobilizadas

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DEFINIÇÕES E HISTÓRICO

Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente associada a um suporte ou matriz, usualmente sólida, insolúvel em

água e inerte, que não seja essencial a sua atividade.

Objetivos da imobilização :

1- Reutizar a enzima

2-Aumento da estabilidade

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Histórico do Uso de Enzimas Imobilizadas

1916 - ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada (invertaseem carvão vegetal) por Nelson e Griffin.

1960 - Katchalski introduziu os primeiros suportes úteis.

1978 - os processos com enzimas imobilizadas também têm utilização industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada em DEAE–Sephadex para produção L-aminoácidos.

Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes de frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada em grande escala nos Estados Unidos

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Resolução de Misturas Racêmicas de Aminoácidos

aminoacilase - tanto L como D-aminoácidos são completamente convertidos a L-aminoácidos.

Produção de Ácido 6-Aminopenicilâmico (6-APA)

peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada .

Produção de leites e soros deslactosados

lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso ativado.

Produção de xaropes de frutose a partir de glicose

glicose isomerase utilizando como suporte proteínas entrecruzadas ou vidro poroso ativado.

USOS EM ESCALA INDUSTRIAL DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS

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Vantagens e Desvantagens

Vantagens Desvantagens

Desenvolvimento de sistemas

contínuos

Custo adicional de suportes,

reagentes e da operação de

imobilização

Maior estabilidade enzimática Perdas de atividade durante a

imobilização

Uso mais eficiente do catalisador

através de reutilizações

Possíveis exigências adicionais de

purificação do catalisador

Flexibilidade no projeto de reatores Técnica pouco adequada a substratos

insolúveis ou de alto peso molecular

Efluentes livres de catalisadores Maiores riscos de contaminação na

operação contínua dos reatores

Maior versatilidade na etapa de

separação

Restrições difusionais e impedimento

estéreo

Menor custo de mão de obra

Facilidade de Automação e controle

Possibilidade de utilização das

enzimas “in-natura”

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ESCOLHA DE MÉTODOS E DO SUPORTE DE IMOBILIZAÇÃO

Dependerá das características da enzima e das condições de uso da enzima imobilizada.

Para uma escolha econômica do método de imobilização é necessário o conhecimento da reação desejada, o processo de aplicação da

enzima imobilizada, condições do meio, modificações causadas na estabilidade, atividade, pH e demais fatores.

O binômio suporte–método mais adequado será aquele que propiciar uma maior atividade após imobilização.

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Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários suportes e por diferentes métodos

SUPORTE MÉTODO POROS

(A)

UI/g

Acetato de celulose Microencapsulamento 0,02 45

Poliacrilamida Microencapsulamento 2,5 50

Pérolas de vidro Ligação covalente 0,2-1,0 200

DEAE-Sephadex

A25

Adsorção 0,1 650

Dowex 1X1 Adsorção 0,4 820

DEAE- Celulose Adsorção 0,06 4200

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Suportes de Imobilização

Os suportes podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais.

Suportes necessitam de mudanças ou inclusão de grupos reativos – ativação do suporte.

Classificação dos suportes utilizados na Imobilização de Enzimas

TIPO DE

SUPORTE

MATERIAIS POROSIDADE ESTABILIDADE

Não poroso Vidro, sílica, aço - Alta

Microencapsulado Triacetato de celulose 35 A Moderada

Entrelaçado Poliacrilamida, PVP Variada Baixa

Macroporoso Alumina, sílica 200-1000 A alta

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Tipos de Suporte para Imobilização

Vidro

Poliacrilamida

Aluminasílica

tela de nylon Fibra de casca de coco

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Critérios para avaliação de um sistema enzima-suporte

Estabilidade de fixação a enzima deve estar bem fixa ao suporte.

Estabilidade enzimática a enzima não deve sofrer modificações como desnaturação.

Resistência mecânica o suporte deve resistir a várias condições desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator.

Capacidade de carga o suporte deve fixar um número elevado de unidades enzimáticas por unidade de área - um pequeno reator uma grande capacidade catalítica.

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Por Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento

Oclusão em matrizes: Podem ser géis (amido, borracha, nylon, poliacrilamida, sílica, alginato de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou fibras. Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços intersticiais da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas), enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades.

Métodos de Imobilização da enzima por encapsulamento em gel de ágar

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Microencapsulamento:

A enzima é oclusa em membranas poliméricas de porosidade de 300 µm (celulose, policarbonato, colágeno, politereftalato, polímeros em geral), semi-permeáveis esféricas de pequeno diâmetro.

Microencapsulamento de enzima em material polimérico

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Reticulação ou Ligação Cruzada

Método que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multi-funcionais, em geral diaminas alifáticas (di-isocianato) ou glutaraldeído, que induzem a auto-reticulação das enzimas, resultando assim na formação de uma rede tridimensional de moléculas de enzima

Ligação Covalente

A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte, matrizes como vidro, cerâmica, polímeros sintéticos, celulose, nylon e alumina, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima ligação de grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em condições fisiológicas brandas, baixa temperatura, baixa força iônica, pH ótimo e muitas vezes na presença do substrato, a fim de proteger o sítio ativo da enzima evitando que haja diminuição da atividade da mesma

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Adsorção FísicaUtiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia na adsorção física em

superfícies sólidas, como alumina, carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por ligações iônicas, polares ou de Van der Waals.

Ligação IônicaLigação de grupos com cargas opostas através de forças eletrostáticas. Processo

simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo inclusive desprezíveis os efeitos difusionais.

Ligação MetálicaForma quelatos pela ativação da superfície do suporte por meio do metal ou por seu

óxido.

Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são fracas levando a pequenas modificações conformacionais na enzima e, conseqüente, possibilidade de

dissolução da mesma (perda).

De uma forma geral, os processos de imobilização por ligação são preferidos quando se confronta eficiência, apesar da inclusão em géis ou matrizes ser mais barato.

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Imobilização de -amilase por adsorção física em

carvão de casca de coco

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EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO

Retenção da Atividade Enzimática

- algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em uma configuração que impede completamente o acesso do substrato ao centro ativo;

- o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação ao suporte (a proteção do sítio ativo da enzima através de um inibidor reversível durante a ligação pode resultar em aumento na retenção da atividade;

- moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração que as torne inativas;

- as condições de reação no processo de imobilização podem causar desnaturação ou inativação.

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Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase na forma solúvel e imobilizada em três diferentes suportes (alginato de cálcio, quitina e polietileno ativado, respectivamente)

PARÃMETRO INVERTASE SOLÚVEL INVERTASE IMOBILIZADA

Km 26,0 mM 8,1 mM52,2 mM32,2 mM

Vmáx 1,10 U 0,25 U

0,74 U

0,32 U

pH

(para atividade máxima)

4,6 4,6

4,0

4,6

pH

(maior estabilidade)

4,0-4,6 4,5 – 6,5

5,0 – 6,0

4,6

T

(para atividade máxima)

55-60 C 60 C

60 C

70C

T

(maior estabilidade)

25-37 C 45-50 C

25-40 C

25-40 C

Ea

(energia de ativação a 37C)

27,8 kJ/mol 24,4 kJ/mol

51,9 kJ/mol

37,5 kJ/mol

H

(variação de entalpia a 37C)

25,2 kJ/mol 21,9 kJ/mol

49,3 kJ/mol

34,9 kJ/mol

G

(variação de energia livre de

Gibs a 37C)

-13,6 kJ/mol -13,9 kJ/mol

-11,5 kJ/mol

-14,7 kJ/mol

S

(variação de entropia a 37C)

0,125 kJ/mol 0,115 kJ/mol

0,196 kJ/mol

0,160 kJ/mol

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Efeitos Difusionais

Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na solução através de um filme líquido estacionário presente nas superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de reação

velocidade de difusão do substrato < velocidade de transformação pela enzima

Vmáx mais baixa

não se atinge a saturação.

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Resistência Difusional Externa

Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catalise, devendo, por conseguinte

atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de

um gradiente.

A difusão do substrato e produtos dos centros ativos para a solução (ou vice-versa) ocorre através de mecanismos de difusão molecular e

convectiva.

Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de

substrato, caso do reator pistonado (PFR).

Efeitos Difusionais Internos

Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio catalítico - difusão e reação ocorre simultaneamente

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Efeitos Microambientais

A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto da solução.

Efeitos Estereoespecíficos

Existem situações onde a atividade da enzima frente a um substrato com elevado peso molecular é reduzida durante o processo de imobilização, de uma forma mais extensa que frente a um substrato com menor peso molecular - resultado de impedimento estéreo, formado pelo suporte, ao acesso de moléculas grandes ao centro ativo da enzima (impedimento estérico).