Investigação do Potencial Terapêutico das Células ...· Lesão Hepática Crônica ... Cirrose

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CINCIAS E SADE INSTITUTO DE BIOFSICA CARLOS CHAGAS FILHO

Investigao do Potencial Teraputico das Clulas

Mesenquimais de Medula ssea em um Modelo de

Leso Heptica Crnica

ADRIANA BASTOS CARVALHO

TESE SUBMETIDA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

VISANDO A OBTENO DO GRAU DE

DOUTOR EM CINCIAS BIOLGICAS FISIOLOGIA

Rio de Janeiro 2008

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FICHA CATALOGRFICA

Carvalho, Adriana Bastos Investigao do Potencial Teraputico das Clulas Mesenquimais de Medula ssea em um Modelo de Leso Heptica Crnica Tese (Doutorado em Cincias Biolgicas Fisiologia) Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho IBCCF, 2008. Orientadores: Campos de Carvalho, Antonio Carlos e Goldenberg, Regina Coeli dos Santos.

1. Cirrose heptica 2. Medula ssea 3. Clulas Mesenquimais 4. Terapia Celular

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho. II. Ttulo.

2

Este trabalho foi realizado nos Laboratrios de Cardiologia Celular e

Molecular e Eletrofisiologia Cardaca Antnio Paes de Carvalho do Instituto de

Biofsica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ,

sob orientao do Professor Doutor Antonio Carlos Campos de Carvalho e da

Professora Doutora Regina Coeli dos Santos Goldenberg. Recebeu o apoio

financeiro das entidades: CNPq, FAPERJ, CAPES, IMBT e FUJB.

Contou ainda com a grande colaborao da Professora Doutora Christina

Maeda Takyia do Laboratrio de Patologia Celular do Departamento de Histologia e

Embriologia da UFRJ, do Professor Doutor Guilherme Ferreira da Mota Rezende do

Servio de Hepatologia do Hospital Universitrio Clementino Fraga Filho HUCFF

e da Doutora Clia Maria Coelho Resende do Departamento de Radiologia do

HUCFF.

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AGRADECIMENTOS Ao meu pai, que alm de professor e inspirao profissional, me ensinou que o mundo sempre ser pequeno para tudo o que possvel sonhar em fazer.

minha me, absolutamente iluminada, que sempre me guiou pelo caminho certo mesmo que eu no percebesse.

minha irm pelo exemplo de persistncia e de coragem.

Aos meus irmos pela pacincia e pelo carinho.

Ao meu amor por ter trilhado esse caminho desde o incio ao meu lado, pelo apoio, compreenso e dedicao.

Beba minha admirao por ser uma batalhadora e por seu talento nato para

o laboratrio. minha av por transmitir sua sabedoria sobre as voltas da vida. Professora Regina Goldenberg, mola-mestra do laboratrio, pelo exemplo

de profissionalismo. Aos Professores Guilherme Rezende e Christina Takyia e Doutora Clia

Resende por me ensinarem tanto sobre o fgado. Aos amigos: Luiz Fernando, Elida, Juliana e Bruno por toda a ajuda nesses

dois anos de muito trabalho. A todos os outros amigos do laboratrio pela boa convivncia e pacincia:

Esporcatte, Karina, Renato, Andreza, Tais, Leandro, Juliana Silva, Juliana Passipieri, Luiza, Ramon, Patrcia Fidelis, Fernanda, Dbora Frana, Joo Pedro, Mrcia, Jos Carlos, Conceio e Tiago.

A todos que de alguma forma ajudaram na realizao deste trabalho.

4

Imagination is more important than knowledge

Albert Einstein

5

RESUMO

O objetivo do nosso estudo foi avaliar o potencial teraputico das clulas

mesenquimais do estroma de medula ssea (MSC) em um modelo de leso

heptica crnica. Quatorze ratos fmea da cepa Wistar foram alimentadas

exclusivamente com uma dieta alcolica lquida e receberam injees intraperitoniais

de tetracloreto de carbono em dias alternados durante 15 semanas. Aps esse

perodo, 8 animais (grupo tratado) tiveram 1x107 clulas injetadas pela veia porta,

enquanto 6 animais (grupo placebo) receberam veculo. Foi realizada bioqumica do

sangue para avaliar os nveis de alanina aminotransferase (ALT), aspartato

aminotransferase (AST) e albumina antes e 1 e 2 meses aps a infuso das clulas.

A presena de fibrose foi avaliada antes e 1 ms aps a injeo das clulas por

meio de bipsias hepticas. Dois meses aps a terapia, os animais foram

sacrificados para anlise histolgica dos tecidos. A fibrose foi quantificada por

histomorfometria. Bipsias obtidas previamente infuso das clulas mostraram

intensa deposio de colgeno e a presena de septos interconectando ndulos de

regenerao. Um ms aps a injeo das clulas, esse resultado manteve-se

inalterado e no havia diferenas significativas entre os grupos placebo e tratado na

quantificao de fibrose. ALT e AST retornaram a valores normais 2 semanas aps

a infuso das clulas, sem diferenas significativas entre os grupos experimentais.

Dois meses aps a terapia, a albumina tambm retornou a valores normais,

enquanto os resultados da histologia mantiveram-se inalterados, novamente sem

diferena entre os grupos tratado e placebo. Portanto, em nossas condies

experimentais, as MSC no foram capazes de reduzir fibrose ou melhorar funo em

um modelo animal de leso heptica crnica.

6

ABSTRACT

The objective of our study was to evaluate the therapeutic potential of bone

marrow mesenchymal stromal cells (MSC) in a rat model of severe chronic liver

injury. Fourteen Wistar female rats were fed exclusively an alcoholic liquid diet and

received intraperitonial injections of carbon tetrachloride every other day during 15

weeks. After this period, 8 animals (MSC group) had 1x107 cells injected into the

portal vein while 6 animals (placebo group) received vehicle. Blood analysis was

performed to evaluate alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase

(AST) and albumin before and 1 and 2 months after cell or placebo infusion. Fibrosis

was evaluated before and 1 month after cell or placebo injection by liver biopsies.

Two months after cell delivery, animals were sacrificed and histological analysis of

the livers was performed. Fibrosis was quantified by histomorphometry. Biopsies

obtained before cell infusion showed intense collagen deposition and septa

interconnecting regenerative nodules. One month after cell injection, this result was

unaltered and differences in fibrosis quantification were not found between MSC and

placebo groups. ALT and AST returned to normal values 2 weeks after cell or

placebo infusion, without significant differences between experimental groups. Two

months after cell or placebo injection, albumin had also returned to normal values

and histological results were maintained, again without differences between MSC

and placebo groups. Therefore, under our experimental conditions, MSC were

unable to reduce fibrosis or improve liver function in a rat model of severe chronic

liver injury.

7

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 p 13

Figura 2 p 14

Figura 3 p 16

Figura 4 p 17

Figura 5 p 18

Figura 6 p 20

Figura 7 p 21

Figura 8 p 25

Figura 9 p 27

Figura 10 p 35

Figura 11 p 40

Figura 12 p 52

Figura 13 p 53

Figura 14 p 54

Figura 15 p 56

Figura 16 p 57

Figura 17 p 60

Figura 18 p 61

Figura 19 p 61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 p 52

8

LISTA DE ABREVIATURAS

99mTc: Tecncio-99m

ALT: alanina aminotransferase

AST: aspartato aminotransferase

BSS: soluo salina balanceada

CCl4: tetracloreto de carbono

CD: molcula de diferenciao celular

CMMO: clulas mononucleares de

medula ssea

CMO: clulas de medula ssea

DMEM: Meio de Eagle modificado por

Dulbecco

ECM: matriz extracellular

EGF: fator de crescimento epitelial

FAH: fumaril-acetoacetato hidrolase

FGF: fator de crescimento de

fibroblastos

FITC: isotiocianato de fluorescena

GFP: protena fluorescente verde

HE: hematoxilina & eosina

HemSC: clulas tronco

hematopoiticas

HGF: fator de crescimento de

hepatcitos

HSC: clulas estreladas

KC: clulas de Kupffer

MMP: metaloproteinases

MSC: clulas mesenquimais

estromais

OMS: organizao mundial da

sade

PBS: salina tamponada com

fosfato

PDGF: fator de crescimento

derivado de plaquetas

PE: ficoeritrina

SCF: fator de clulas tronco

SCID: imunodeficincia

combinada grave

SnCl2: cloreto estanhoso

TGF-: fator de crescimento

transformante

TIMP: inibidores teciduais das

metaloproteinases

9

SUMRIO 1. Introduo p 12

1.1. O Fgado p 12

1.1.1. Anatomia p 12

1.1.2. Histologia p 15

1.1.3. Tipos Celulares e suas Funes p 19

1.2. Fisiopatologia da Fibrose Heptica p 24

1.2.1. Definies p 24

1.2.2. A Cascata Fibrognica p 26

1.2.3. Remodelamento Tecidual e Disfuno Heptica p 28

1.2.4. Resoluo Espontnea da Fibrose