REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)

PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os

elementos básicos do processo de replicação natural do DNA

ou cDNA.

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da

década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993,

atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho.

Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporationpatentearam este processo.

Bactéria Thermus aquaticus

(Taq-polimerase).

PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR

A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chainreaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação doDNA ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de umareação enzimática catalizada pela polimerase (enzimatermoestável) cuja atividade depende de ions Mg++

Ocorre em 3 etapas: Ocorre em 3 etapas:

a) “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado),

b) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado),

c) “extension” (extensão ou seja a polimerizaçãopropriamente dita)

Depende:Alternância de temperaturas a cada ciclo:

Replicação in vitro do DNA

• DESNATURAÇÃO• ANELAMENTO• POLIMERIZAÇÃO

Alternância de temperaturas a cada ciclo

1:Denaturaçao94 ° C -96 ° CSepara a fita dupla do DNA molde em duas fitas simples2.Anelamento:37 ° C -65 ° C37 ° C -65 ° CPrimers se ligam aos sitios específicos na fita simples3. Extensão: 72 °DNA polymerase acrescenta os dNTPs à fita, de acordo com o pareamneto de bases

Inicialmente é necessário que as duasfitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. Aelevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove aseparação da fita dupla de DNA em duas fitas simples.Muitas vezes a temperatura de desnaturação édeterminada empiricamente e depende de alguns fatorescomo a quantidade de guanina e citosina (GC) dofragmento DNA alvo ou de interesse.

a)Desnaturação

A polimerase para anexar as bases complementares,transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento deDNA já ligado na região previamente escolhida. Para isso adicionam-se, àsolução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticosde DNA de fita simples, oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas decomprimento, que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA aser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNAde interesse. Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA dedupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing”(do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 70°°°°C).

b) Anelamento-

- Quando os “primers” encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNA-Polimeraseliga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitassimples e tornando-as duplas (extensão). A DNA-Polimerase não reconhece apenas o bloco de iníciocomo também consegue diferenciar as duasextremidades dos “primers” (3’ e 5’). Ela inicia a reaçãosempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a

c) Extensão

fita simples daí em diante, portanto, sempre na direçãodo fragmento procurado.

Automação da PCR

Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o correspondente Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o correspondente a programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a amplificação

Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilização.

Para cada situação experimental, novas modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é muito difícil descrever um único procedimento para um uso generalizado.

Por outro lado, é fundamental o conhecimento básico das etapas envolvidas na técnica, para um desenho experimental com sucesso

É um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases,geralmente baseado na sequência já conhecida doácido nucleico, sintetizado quimicamente porinstrumentos automáticos, que podem ser adquiridosno comércio para fins já definidos ou se escolhe aregião desejada do DNA ou RNA a ser amplificada.

Primer:

É um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas,, substratos antigenicos, substâncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequência complementar do ácido nucleico alvo (escolhido).

Sonda (probe):

EFICIÊNCIA NA AMPLIFICAÇÃO:

Modelo teórico eficiência do processo de amplificaçãocorresponde a 100%, o que não é observado na prática.

Experimentalmente de 78% a 97%, dependendo dofragmento amplificado.

Os principais problemas para a padronização:a) Não detecção do produto,

b) Baixo rendimento do produto desejado,

c) Presença de bandas não específicas devido a “misextension” dos“primers”,

d) Formação de dímeros dos “primers” que competem pelaamplificação com o produto desejado, mutação ou heterogeneicidadedevido a erro de incorporação.

Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um

formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128...de tal forma que pode ser definida matematicamente por:

PCR REAÇÃO EM CADEIA

de tal forma que pode ser definida matematicamente por:

N = No ×××× 2n

N = número de moléculas amplificadas

No = número de moléculas iniciais

n = número de ciclos de amplificação

Primeiro Ciclo da PCR

Após sucessivos ciclos...

A polimerização é feita por uma DNApolimerase termoestável = sínteseexponencial de moléculas de DNA.São utilizados dois primers que delimitamo segmento amplificado

� Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partirdos primers serve como molde para a síntese de umanova fita. Isso garante o aumento exponencial donúmero de novas fitas

� Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tem a sequência dos primers na extremidade 5’ e a tem a sequência dos primers na extremidade 5’ e a sequência complementar aos primers na posição 3’.

Polimerização 5’ 3’

Todas as DNA-polimerasesTodas as DNA-polimerasesrequerem para seufuncionamento:� Molécula de DNA molde� Primer de oligonucleotídeos� Magnésio� dNTPs

Qualquer sequência alvo de DNA pode ser

amplificada por PCR

•A localização da sequencia-alvo é feita pelos primers.• Oligonucleotídeos com 20-24 pares de bases sãoseletivos o suficiente para localizar um sítio único em umgenoma de alta complexidade.

• O pareamento dos primers com a sequencia –alvo se fazpelo estabelecimento de pontes de hidrgênio, segundoWatson e Crick

• Tampão:Mantém o pH ótimo para a atividade da enzima

• Sais: fornecem condições ótimas para a máximaeficiência da enzima. influenciam na cinetica dehibridizaçao do DNA ou na Tm dos primers.

Componentes da PCR

• Magnésio (Mg++): ions de Mg são necessários paraestimular a Taq polimerase

Mg++: 1 a 4 mM

Cinética da PCR

•Fase de screening- ciclos iniciais

Os primers procuram o molde de DNA com as sequencias que lhes são complementares . Encontrar a sequencia complementar não é dificil, pois os primers estão em considerável excesso em relação ao molde.• Fase intermediária:

O processo de amplificação está ocorrendo levando ao acúmulo O processo de amplificação está ocorrendo levando ao acúmulo exponencial do fragmento de DNA.O pareamento do primer com a sequencia ja está facilitada, pois ja existem várias cópias da sequencia-alvo• Fase tardia ou fase de platô:

A amplificaçào ja é sub-ótima devido à limitaçao dos reagentes e a competição dos produtos gerados com os primers disponíveis.

O aumento exponencial do no de cópias ocorre até umdeterminado no de ciclos, que será variavel de reação parareação.

Causas do platô (Desvio do ideal teórico):• Perda de atividade da enzima• Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese deDNA• Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si,• Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si,em detrimento do pareamento com os “primers”. Aumentapossibilidade de amplificação de produtos inespecíficos.• Gasto dos reagentes, especialmente de primers, mas também dedeoxinucleotídeos.• Acúmulo de pirofosfato, resultante das ligações fosfodiésteres.• Competição com outros produtos que vinham sendo amplificadoscom eficiência menor mas também foram se acumulando.

Fidelidade na PCR

• Fidelidade:Acuracia na replicação

•Fidelidade na PCRAlto % dos produtos da PCR tem seqüências idênticas ao alvoAlto % dos produtos da PCR tem seqüências idênticas ao alvo• Alta fidelidade

Condições que afetam a fidelidade da PCR

Fatores Aumenta Fidelidade Reduz fidelidade

dNTPs Balanceado

40-50µM de cada

Desbalanceado

1-2mM de cada

Mg++ 1:1 com os dNTPs 6-8 mM Mg++

Temp. anelamento

Enzima ou tempo de

extensão

Ciclos

Otimização da PCR• Aumenta a eficiência da reação (produção)• Aumenta a especificidade• Melhora a reprodutibilidade

Parâmetros a serem considerados na otimização

• Desenho de primersConteúdo de GC, Evitar longas regiões ricas em GC ou AT, Temperatura de anelamento (Tm – 4oC)

• Condições dos ciclos• Concentração dos reagentes•Componentes do tampão

Parâmetros dos ciclos:

1. Temperatura e Tempo de desnaturação

• Falta de desnaturação do molde é uma causacomum de falha na PCRcomum de falha na PCR

• Tipicamente 94oC por 30 s

• Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vidada enzima

Parâmetros dos ciclos:

2. Temperatura e Tempo de anelamento

• Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primersdos primers

• Tempo de anelamento = 15 a 30 s

• Tempo de extensão: função tamanho do AMPLICON– 1 minuto é suficiente 1,2 kb– Longo, reduz a meia vida da enzima

DNA Polimerases TermoestáveisThermos aquaticus (Taq polymerase)

• Taxa de incorporação de bases erradas pode variar entre 10-3 a

10-6, dependendo das concentrações de Mg2+ e dNTPs

• A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade

da interação da enzima com o DNA, favorecendo a interrupção

da polimerização.

• Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de

dNTPs favorecem a extensão de primers com pareamento

imperfeito e a extensão após mismatch.

Inibem a PCR

•Contaminantes da amostra de DNA (limitante)

Inibidores da Polimerase

•Fenol•Proteinase K•Proteinase K•Agentes quelantes em excesso (EDTA)•SDS•Elevadas concentrações de sais