TCC Posoqueria latifolia

7/25/2019 TCC Posoqueria latifolia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMATICASDEPARTAMENTO DE QUMICA

ESTUDO FITOQUMICO E BIOLGICO DE Posoquer ialatiflia

Projeto de Estgio Supervisionado II (QMC 5512)

apresentado ao Departamento de Qumica da

Universidade Federal de Santa Catarina.

MARCOS PEREIRA

PROF. DR. INS MARIA COSTA BRIGHENTE

FlorianpolisJunho/2015


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Marcos Pereira

ESTUDO FITOQUMICO E BIOLGICO DE Posoqu eria lati fo l ia

Projeto de Estgio Supervisionado II (QMC 5512)

apresentado ao Departamento de Qumica da

Universidade Federal de Santa Catarina.

FlorianpolisJunho/2015


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Marcos Pereira

ESTUDO FITOQUMICO E BIOLGICO DE Posoq ueria lat i flia

____________________________________

Prof. Dr. Ins Maria Costa Brighente

Banca Examinadora:

____________________________________

Dra. Lizandra Bretanha

____________________________________

Dra. Dalila Venzke

Florianpolis

Junho/2015


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SUMRIO

1. INTRODUO...................................................................................... 1

2. REVISO DA LITERATURA................................................................ 3

2.1.Famlia Rubiaceae............................................................................ 3

2.2. Gnero Posoquer ia.......................................................................... 5

2.3. Posoq ueria lat i fol ia.......................................................................... 5

3. OBJETIVOS.......................................................................................... 9

3.1. Objetivo Geral................................................................................... 9

3.2. Objetivos Especficos...................................................................... 9

4. MATERIAIS E MTODOS.................................................................... 10

4.1. Reagentes e Equipamentos............................................................. 10

4.2. Material Vegetal................................................................................ 10

4.3. Fracionamento do Extrato Bruto.................................................... 11

4.4. Fracionamento cromatogrfico da amostra vegetal..................... 12

4.5. Testes biolgicos............................................................................. 13

4.5.1. Determinao do potencial redutor......................................... 13

4.5.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH......................................................................................................... 14

4.5.3. Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase.................... 14

5. RESULTADOS E DISCUSSO............................................................ 16

5.1. Anlise da atividade biolgica........................................................ 165.1.1. Atividade antioxidante.............................................................. 16

5.1.1.1. Determinao do potencial redutor.................................. 17

5.1.1.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH......................................................................................................... 18

5.1.2. Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase.................... 18

5.2. Fracionamento cromatogrfico da frao insolvel de

Posoq ueria lati fol ia.................................................................................. 20


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5.3. Elucidao estrutural dos compostos............................................ 21

5.3.1. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-33...................... 22

5.3.2. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-65...................... 26

6. CONCLUSES..................................................................................... 35

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................... 36


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Alcaloides de espcies de Rubiaceae........................................ 4

Figura 2 - Posoqueria latifoliarvore e partes da planta......................... 6

Figura 3 - Estruturas dos iridoides encontrados em P. latiflia................... 7

Figura 4 - Fluxograma de particionamento lquido-lquido do EB das

folhas de P. latifolia..................................................................................... 11

Figura 5 - Marcha analtica......................................................................... 12

Figura 6 - Estruturas do radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazil.......................... 18

Figura 7 - Espectro de RMN de 1H da FIn em CD3OD (200 MHz) ................ 21

Figura 8 - Estrutura do composto sitosterol........................................... 22

Figura 9 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em CDCl3

(200 MHz) .................................................................................................. 23

Figura 10 - Ampliaes do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em CDCl3 (200 MHz) ...................................................................... 24

Figura 11 - Espectro infravermelho do composto Pla-INS-65.................... 26

Figura 12 - Estrutura do composto cido urslico...................................... 27

Figura 13 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 empiridina-D5 (200MHz) ................................................................................. 28

Figura 14 - Regies ampliadas do espectro de RMN de 1H do composto

Pla-INS-65 em piridina-D5 (200MHz) ........................................................ 29

Figura 15 - Espectro de RMN 13C do composto Pla-INS-65 em piridina-

D5................................................................................................................ 31

Figura 16 - Espectro de DEPT 90 do composto Pla-INS-65 em piridina-

D5................................................................................................................ 31Figura 17 - Espectro de DEPT 135 do composto Pla-INS-65 em piridina-

D5................................................................................................................ 32


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificao botnica de P. latifolia.......................................... 6

Tabela 2 - Massa obtida para as fraes da planta P. latifliaatravs daextrao lquido-lquido.............................................................................. 16

Tabela 3 - Resultados dos testes de poder redutor, determinao da ao

sequestradora do radical livre DPPH e inibio da acetilcolinesterase

com o extrato bruto e as fraes de P. latifolia............................................ 20

Tabela 4 - Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33

em comparao com a literatura................................................................ 26

Tabela 5 - Dados do espectro de RMN de1

H do composto Pla-INS-65em comparao com a literatura................................................................ 30

Tabela 6 - Dados espectrais de RMN de 13C junto aos de DEPT 90 e

DEPT 135 do composto Pla-INS-65 em piridina-D5................................... 33

Tabela 7 - Dados do espectro de RMN de 13C do composto Pla-INS-65

em comparao com a literatura................................................................ 34


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LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviaes

Abs AbsorbnciaAcOEt Acetato de Etila

br s - Simpleto de sinal amplo

CCD - cromatografia em camada delgada

d - Dupleto

DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPPH - 1,1-difenil-2-picril-hidrazil

DTNB - cido 5,5ditio-bis-2-nitrobenzicoEB - Extrato Bruto

EtOH - Etanol

FAe - Frao acetato de etila

FAq - Frao aquosa

FHe - Frao hexano

FIn - Frao Insolvel

FRA - Frao rica em alcaloides

IV - Infravermelho

g - Grama

HzHertz

JConstante de acoplamento

KBrBrometo de potssio

m - Multipleto

mg - Micrograma

ppm - Partes por milho

RMN de 1H - Ressonncia magntica nuclear de Hidrognio

RMN de 13C - Ressonncia magntica nuclear de Carbono 13

s - Simpleto

UV - Luz ultravioleta

UV-Vis - Luz ultravioleta e luz visvel

LMicrolitro

g - Micrograma


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RESUMO

Posoqueria latifolia, conhecida como laranja-de-macaco, pertence famlia

Rubiaceae, encontrada desde o norte da Amrica do Sul at o Rio Grande do

Sul no Brasil. Na medicina tradicional esta planta relatada como antissptica e

cicatrizante. Existem poucos estudos biolgicos sobre a espcie e um estudo

fitoqumico, onde este relatou a presena de diterpenos iridodicos.

Considerando os diversos compostos obtidos da famlia Rubiaceae,

principalmente os alcaloides, este trabalho visou um estudo fitoqumico com a

expectativa de isolamento de novos compostos, assim como a avaliao das

atividades antioxidante e inibidora da enzima acetilcolinesterase do extrato e

fraes de P. latifolia. A planta foi coletada no morro da Lagoa da Conceio,

Florianpolis. As folhas foram secas, trituradas e extradas com etanol 96%,

obtendo-se o extrato bruto (EB). O EB foi solubilizado em uma soluo de cido

clordrico em etanol 20% a pH~2,0 e armazenado em geladeira por 24 horas.

Obteve-se um precipitado denominado de frao insolvel (FIn). O filtrado

resultante foi particionado com solventes orgnicos de diferentes polaridades,

rendendo as fraes hexano (FHe) e acetato de etila (FAe). A frao aquosa

restante foi alcalinizada com hidrxido de amnio at pH~10 e extrada

novamente com acetato de etila, obtendo-se a frao rica em alcaloides (FRA),

A frao restante foi neutralizada, gerando a frao aquosa (FAq). A partir do

fracionamento cromatogrfico da FIn, foram isolados o esteroide -sitosterol e o

triterpeno cido urslico, que tiveram sua estrutura elucidada atravs de tcnicas

espectroscpicas de RMN baseadas na literatura. A FRA mostrou a maior

atividade antioxidante avaliada pelo teste do potencial redutor. O teste relativo a

captura de radicais livres com DPPH teve resultados no significantes quanto aatividade antioxidante. O EB e fraes de P. latifoliaapresentaram uma fraca

inibio da enzima acetilcolinesterase, com um valor mximo de 53% para a FAe

na concentrao de 100 g/mL. Os testes biolgicos no apresentaram

resultados to promissores, mas a presena dos compostos-sitosterol e cido

urslico em P. latifoliaincentivam a continuao dos estudos na busca de outros

compostos, alm da possibilidade de ainda serem encontrados alcaloides.

Palavras-chave: Posoqueria latifolia, antioxidantes, acetilcolinesterase


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1. INTRODUO

O estudo dos compostos naturais obtidos de plantas tem fundamental

importncia na qumica, principalmente devido a sua ligao com a rea

medicinal. Pode-se explicar isto devido a capacidade de plantas produziremdiversos compostos qumicos que esto presentes em qualquer espcie de

vegetal, pois so essenciais para sua sobrevivncia e desenvolvimento, os

chamados metabolitos primrios; alm de compostos que esto presentes

apenas em determinadas espcies e no so diretamente necessrios para a

sobrevivncia celular, mas que possuem grande importncia como meio de

proteo e sobrevivncia para a reproduo da planta, chamados metablitos

secundrios. Esta ltima classe de metablitos geralmente apresenta potencialatividade biolgica para os seres humanos e cumprem funes altamente

especficas nas espcies onde ela est presente, como atrair insetos para a

transferncia do plen, agir como pesticidas naturais de defesa contra

herbvoros ou microrganismos patognicos, ter funo como agente aleloptico,

proteo contra a luz ultravioleta, entre outras diversas funes. Devido

variedade de atividade biolgica existente, percebe-se que muitos destes

compostos tm grandes chances quanto a sua insero no mercado atual defrmacos e na indstria qumica.

Entre a diversidade de metablitos secundrios encontrados em plantas

podemos citar como exemplo a morfina, forte analgsico usado no tratamento

de pacientes com cncer em fase terminal, extrados da planta Papaver

somniferum; eugenol, utilizado como antissptico e anestsico, encontrado em

diversas plantas do gnero Cinnamomum; vanilina, aromatizante usado

largamente na indstria de alimentos, presente em sementes de algumasespcies do gnero Vanilla; e o paclitaxel, com nome comercial de Taxol,

frmaco usado para tratamento de cncer de pulmo, mamas e ovrios, que foi

extrado primeiramente das cascas da espcie Taxus brevifolia.

Alm da descoberta direta de diversos compostos provenientes de plantas

que so biologicamente ativos em seres humanos, outros compostos obtidos

atravs da modificao estrutural de produtos naturais podem levar a novas

substncias e medicamentos que possuam menos efeitos colaterais que os


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compostos que os originaram. Um exemplo clssico a modificao estrutural

da salicilina, proveniente da planta Salix alba, que aps hidrlise da ligao

glicosdica, oxidao do lcool salicilado e reao de acetilao com o cido

saliclico resultante, d origem ao cido acetilsaliclico, um dos remdios mais

conhecidos na atualidade, a Aspirina.

Assim, este projeto apresenta como proposta o estudo biolgico e

fitoqumico de uma espcie vegetal pouco descrita at o momento na literatura,

pertencente famlia Rubiaceae, a espcie Posoqueria latifolia.

.


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2. REVISO DA LITERATURA

2.1. Famlia Rubiaceae

A famlia Rubiaceae, pertencente s Angiospermas, constituda porrvores de grande, mdio e pequeno porte, arbustos, subarbustos e ervas anuais

ou perenes, distribudas em regies tropicais dos dois hemisfrios. composta

por 650 gneros e 13.000 espcies, sendo a quarta maior famlia de plantas

presente no Brasil, ficando atrs apenas das famlias Asteraceae, Orchidaceae

e Fabacea (ROBBRECHT et al., 2013). A famlia Rubiaceae tem grande

importncia econmica, pois representante de diversas espcies como o caf

(Coffeaspp.), gro de onde produzida a bebida mais consumida no mundo; ojenipapo, fruto de grande uso nos estados do nordeste brasileiro; Cinchona

pubescens, planta utilizada para a produo de quinina; eIxora spp. (hortnsia

japonesa) e Mussaenda spp. (mussaenda), espcies de cunho ornamental

devido a quantidade de flores que suas plantas apresentam. As espcies de

Rubiaceae so encontradas com maior frequncia em reas tropicais e

subtropicais, mas por vezes tambm achada em reas temperadas

(CRONQUIST, 1981).Em diversos estudos de suas espcies h relatos cientficos sobre a

presena de compostos como esteroides, flavonoides, iridoides, saponinas,

taninos e triterpenos (CHAO e SVOBODA, 1980; MARTINS et al., 2013;

MOREIRA et al., 2010; TAN et al., 2011; FERREIRA et al., 2012). Porm, o que

mais atrai os pesquisadores o fato da famlia Rubiaceae ter como metablitos

secundrios mais representativos os alcaloides (LORENZI,1982).

Os alcaloides, segundo a definio apresentada pela IUPAC, so

compostos que apresentam nitrognio bsico (na sua maioria heterocclicos) e

quase sempre tem origem no reino vegetal (IUPAC, 1987). Porm, sabe-se que

esta definio no abrange todas as classes de alcaloides, j que nem todos

possuem essas caractersticas. Dessa forma, os alcaloides podem ser melhor

definidos quando divididos em trs grupos; alcaloides verdadeiros, os quais so

derivados de aminocido e possuem um heterociclo com tomo de nitrognio

bsico; protoalcaloide, os quais so derivados de aminocido e possuem

nitrognio bsico fora de um heterocclico; e pseudoalcaloides, os quais


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possuem nitrognio bsico na molcula, mas no so derivados de aminocidos.

Tambm podem ser classificados quanto a sua estrutura base, como os

alcaloides purnicos, que tem como base a estrutura da purina, alcaloides

pirrolizidnocos, com base pirrolizidina, alcaloides indolicos, com base de indol,

entre outros mais.

Entre os alcaloides encontrados na famlia Rubiaceae podemos citar

diversos exemplos. O gnero Coffea, principal representante da famlia e nativo

do continente africano, contm o alcaloide cafena (1), que usado como

estimulante do sistema nervoso central (JOLY, 1979); as espcies do gnero

Cinchona que produzem o alcaloide quinina (2) (NOGUEIRA et al., 2009),

utilizado no tratamento da malria e de arritmias cardacas; a Psychotria

ipecacuanha, conhecida popularmente como ipeca, possui em suas razes os

alcaloides cefaelina (3) e emetina (4) (HASEGAWA et al., 2002; EISENHUT et

al., 2005), que so usados na produo de xaropes expectorantes e vermfugos.

As estruturas destes alcaloides so mostradas na Figura 1.

Figura 1- Alcaloides de espcies de Rubiaceae


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2.2. Gnero Posoqueria

Plantas do gnero Posoqueriapodem ser encontradas em matas midas,

principalmente no Brasil (MACIAS, 1988). Elas so caracterizadas pela presena

de inflorescncias pndulas, com botes florais curvos no pice e anteras pilosas

(PEREIRA e BARBOSA, 2004). Atualmente h poucos estudos publicados sobre

o gnero na literatura. A espcie Posoqueria acutifolia, apontada na medicina

popular com propriedades antimicrobianas, cicatrizantes e anti-inflamatrias

(SOUZA et al., 2013), o extrato etanlico de suas frutas apresentou atividade

antioxidante (RIBEIRO et al., 2013). Na espcie Posoqueria grandiflora foi

constatado a presena de alcaloides no extrato de suas folhas (SOTO-SOBENIS

et al., 2001). Visando contribuir com a taxonomia deste gnero, estudaremos

neste projeto a espcie Posoqueria latifolia.

2.3 Posoqueria latifolia

A espcie Posoqueria latifoliapode ser encontrada no Mxico, Antilhas,

Colmbia, Venezuela, Guiana, Suriname, Guiana Francesa, Equador, Peru,

Bolvia e Brasil (TAYLOR et al., 2004). Distribui-se principalmente na mata

atlntica de encosta, floresta estacional semidecdua submontana, floresta de

restinga e mata ciliar em matas de cerrado (MACIAS e KINOSHITA, 2007).

Em Santa Catarina esta planta encontrada no interior de florestas

primrias situadas no incio das encostas e plancies aluviais, estando

preferivelmente entre o nvel do mar e 900 metros de altitude. No Brasil,

encontra-se em todos os estados (DELPETRI et al., 2005).

Posoqueria latifolia conhecida popularmente como baga de macaco,aucena-do-mato, ara-da-praia, ara-de-coroa, bacupari-de-capoeira, flor-

de-mico,maria-peidorreira,papa-terra,posoqueriaepuro (FERREIRA, 1986).

uma rvore ornamental e pode atingir at 15 metros de altura com extremidade

dos ramos levemente achatada, estriada e glabra. As folhas so simples e

opostas. Suas flores so brancas e perfumadas. O fruto umabagaamarela

(Figura 2).


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Figura 2 Posoqueria latifolia rvore e partes da planta.

P. latifolia apresenta a seguinte classificao botnica (Tabela 1).

Classificao Botnica

Reino Plantae

Filo Tracheophyta

Classe Magnoliopsida

Ordem GentianalesFamlia Rubiaceae

Gnero Posoqueria

Espcie Posoqueria latifolia

Tabela 1. Classificao botnica de P. latifolia

Na medicina popular esta espcie indicada como antissptica e

cicatrizante de feridas (FENNER et al., 2006), alm do uso como antidiarreico(FORERO, 1980).


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Um estudo fitoqumico em P. latifoliarelatou a presena de dois iridoides,

posoquenin (5) e latifonin (6) (Figura 3) nos extratos de clorofrmio e de acetato

de etila, respectivamente (CHAO e SVOBODA, 1980). Apesar da ocorrncia de

iridoides na forma glicosilada em plantas da famlia Rubiaceae ser comum, estes

dois no foram encontrados na forma de glicosdeos.

Os iridoides so compostos pertencentes a classe de terpenos e so

formados por duas unidades de isopreno, com sua estrutura apresentando um

anel ciclopentano fundido a um anel heterociclo de seis membros com um

oxignio. A estrutura pode apresentar 10 carbonos, 9 ou o menos comum, 8

carbonos. A clivagem da ligao entre os carbonos 7 e 8 podem levar ao

chamado secoiridoide (SAMPAIO-SANTOS & KAPLAN, 2001).

Figura 3 Estruturas dos iridoides encontrados em P. latifolia.

O extrato das flores da planta, obtido atravs de extrao com Soxhlet, foi

analisado atravs de cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de

massas, onde se determinou a presena de hidrocarbonetos em sua maioria

(aproximadamente 50%) e compostos oxigenados na forma de steres (20%)

(ARIZA et al., 2007).

Em outro estudo (ELYA et al., 2012), o extrato etanlico das folhas de P.

latifoliafoi submetido ao ensaio de uma marcha analtica. O ensaio compostode diversos testes simples de bancada, usados para detectar a presena de

certas classes de compostos, onde este estudo apresentou resultado positivo

para a presena de terpenoides glicosdicos e taninos. O mesmo estudo tambm

mostrou que o extrato apresenta inibio da enzima -glicosidase semelhante

ao frmaco acarbose, usado no controle de diabetes (ELYA et al., 2012).

Os terpenos so compostos presentes em leos essenciais de plantas e

com grande diversidade estrutural. Muitas deles apresentam ligaes duplas

entre carbonos, podendo possuir tomos de oxignio ligados a carbonos que se


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apresentam na forma de cadeia aberta ou anis. Apesar das diferentes

estruturas, os terpenos so conhecidos pela regra do isopreno, segundo o qual,

estes so formados por ligaes entre molculas de isopreno (2-metil-1,3-

butadieno). Os terpenos so classificados de acordo com o nmero de isoprenos

presentes, sendo chamado de monoterpeno, o composto formado por duas

unidades de isopreno, diterpeno, o composto formado por 4 unidades de

isopreno, triterpeno, aquele formado por 6 unidades de isopreno e assim em

diante (MCMURRY, 2008).

Os taninos so compostos fenlicos, que apresentam solubilidade em

gua e possuem habilidade de formar complexos insolveis com protenas ou

alcaloides quando em meio aquoso. So classificados em taninos hidrolisveis

e taninos condensados. Taninos hidrolisveis so formados por uma molcula

de acar no centro (frutose, glicose), onde suas hidroxilas so esterificadas com

cidos fenlicos. Foram assim chamados pois, estas ligaes esterificadas

podem sofrer hidrlise por enzimas ou em meio cido. Taninos condensados

incluem os outros taninos, onde suas molculas so mais resistentes a

fragmentao. Sua estrutura formada por polmeros de flavan-3-ol ou flanvan-

3,4-diol (MONTEIRO et al., 2005).

Um estudo sobre plantas da famlia Rubiaceae presentes no Panam

revelou que o extrato alcalodico de folhas e flores de P. latifolia apresentou

resultados positivos para a presena de alcaloides indlicos e no indlicos

(SOTO-SOBENIS et al., 2001). Porm esse teste contradiz o estudo de Elya e

colaboradores (2012), no qual no se observou a presena de compostos

alcalodicos na espcie.

Considerando-se os poucos estudos fitoqumicos at o momento para o

gnero Posoqueria, vamos desenvolver um projeto que visa o estudo da espcieP. latifolia com o intuito de descobrir compostos inditos ou mesmo compostos

j identificados, contribuindo para a taxonomia do gnero. Espera-se tambm

encontrar alcaloides, j que os mesmos foram detectados analiticamente em

estudos realizados anteriormente.


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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

O objetivo geral deste projeto o estudo biolgico e fitoqumico de

Posoqueria latifolia na busca de compostos com atividade antioxidante e

inibidora da enzima acetilcolinesterase.

3.2. Objetivos Especficos:

3.2.1. Coletar e obter o extrato bruto das folhas da espcie Posoqueria

latifolia;

3.2.2. Aplicar uma marcha analtica preliminar ao extrato bruto de

Posoqueria latifolia;

3.2.3. Efetuar o particionamento lquido-lquido do extrato bruto usando

cido e base visando a obteno de uma frao alcalodica;

3.2.4. Aplicar os ensaios antioxidantes atravs do teste que avalia o poder

redutor e aquela que avalia a captura de radicais livres pelo DPPH ao extrato

bruto e diferentes fraes;

3.2.5. Aplicar o ensaio de inibio da enzima acetilcolinesterase ao extrato

bruto e as diferentes fraes;

3.2.6. Submeter aa frao insolvel obtida do fracionamento do extrato

bruto cromatografia em coluna de slica gel visando o isolamento dos

compostos majoritrios;

3.2.7. Estudar as anlises espectroscpicas de IV e de RMN

unidimensionais (1H, 13C e DEPT) e bidimensionais (COSY, HMQC e HMBC),conforme a necessidade, a fim de elucidar as estruturas dos compostos obtidos

atravs do estudo minucioso dos espectros dos respectivos compostos;

3.2.8. Preparar o relatrio final de estgio.


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4. METODOLOGIA

4.1. Reagentes e Equipamentos

Os solventes utilizados foram lcool etlico, lcool metlico, acetona,

hexano, acetato de etila, diclorometano, cido actico e lcool de cereais, todos

obtidos comercialmente. Foi utilizado tambm sulfato de sdio anidro,

ferricianeto de potssio, DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil), cloreto frrico, cido

glico e cido ascrbico. Todos os reagentes usados foram de grau analtico,

sendo obtidos de diferentes fontes comerciais.

Na realizao deste projeto foram utilizados estufa, rota evaporador,

balana analtica, espectrofotmetro UV-VIS PERKIN ELMER Lambda2S,

cmara com luz UV e um aparelho digital Micro Qumica MQA PF 301 para

medir o ponto de fuso. Os espectros de IV foram analisados atravs de um

espectrmetro ABB FTLA 2000 e as anlises de RMN de 13C e 1H foram

realizadas nos equipamentos VARIAN NMR AS 400 (400 MHz) e BRUKER

AC200 (200 MHz).

Para a cromatografia em camada delgada (CCD) analtica, usou-se

cromatoplacas de alumnio cobertas com slica gel 60 em uma camada de 0,2

mm de espessura (Merck). Como revelador foi utilizada uma soluo de

anisaldedo sulfrico 5% em metanol.

Para a realizao do ensaio de inibio da acetilcolinestera utilizou-se as

seguintes solues tampes: Tampo A soluo de Tris-HCl 50 mM pH = 8,0;

Tampo B soluo de Tris-HCl 50 mM pH = 8,0 acrescido de 0,1 % de soro

albumina bovina; Tampo C soluo de Tris-HCl 50 mM pH = 8,0 acrescido de

NaCl 0,1 M e MgCl2.6H2O 0,02 mol/L. Foram utilizados tambm solues de

iodeto de acetiltiocolina, reagente de Ellman (cido 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoico-DTNB) e a enzima acetilcolinesterase liofilizada (Tipo VI-S obtida de

Electroparius electricous). Todos estes reagentes foram obtidos da Sigma

Aldrich.

4.2. Material Vegetal

A espcie de Posoqueria latifolia foi primeiramente coletada no alto do

morro da Lagoa da Conceio, em Florianpolis, Santa Catarina, e identificada


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pelo botnico taxonomista, professor Dr. Ademir Reis do Departamento de

Botnica da Universidade Federal de Santa Catarina. O material vegetal

recolhido foi seco por 3 dias a 50C, modo, e macerado em etanol 96% por trs

vezes seguidas com intervalos de 7 dias. Aps a evaporao do solvente, foi

obtido o extrato bruto (EB).

4.3. Fracionamento do Extrato Bruto

O extrato bruto das folhas da planta obtido foi ento particionado atravs

de extrao lquido-lquido, sendo inicialmente solubilizado em uma soluo de

HCl em H2O:EtOH 8:2, pH ~ 2,0 e armazenado em geladeira por 24 horas. Aps

esta etapa foi iniciada uma filtrao, de onde obteve-se uma frao insolvel

(FIn). O filtrado foi ento particionado atravs de extrao lquido-lquido, onde

primeiramente usou-se o solvente hexano e durante a segunda extrao o

solvente acetato de etila, obtendo-se a frao hexano (FHe) e a frao acetato

de etila (FAe). A soluo restante foi alcalinizada com NH4OH at pH~10 e

extrada novamente com acetato de etila, gerando assim a frao rica em

alcaloides (FRA). Por ltimo, a frao aquosa restante foi neutralizada com

Na2CO3, resultando na frao aquosa (FAq). O mtodo para a extrao

ilustrado atravs da Figura 4.

Figura 4 Fluxograma de particionamento lquido-lquido do EB das folhas deP. latifolia.


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Quando se trabalha com plantas, a diversidade de compostos presente

em folhas, caule ou razes muito grande. Dessa forma, pode-se aplicar testes

rpidos de bancada a partir diversos ensaios definidos previamente em literatura,

a fim de obter resultados positivos e negativos para classes de compostos

presentes em uma amostra vegetal. Assim, aplicamos a marcha analtica,

mtodo descrito previamente por Matos (1997), sobre o extrato bruto da planta,

tendo como objetivo detectar as principais classes de metablitos secundrios

que possam estar presentes em suas folhas. A figura 5 representa como ser

conduzida a marcha analtica e quais classes de compostos que podem ser

encontradas.

Legenda: A: gua; B: 1 HCl 1%, 2 filtrar; C: NH4OH, pH = 10, extrao comclorofrmio; D: 1 Na2SO4, 2 secar; E: Extrao com clorofrmio/etanol (3:2);

F: 1 Na2SO4, 2 secar; G: 1 secar, 2 Etanol; H: 1 metanol/gua (1:1), 2

HCl, pH = 1, 3 extrao com ter etlico.

Figura 5 Marcha analtica

4.4. Fracionamento cromatogrfico da amostra vegetal

Com o objetivo de isolar compostos majoritrios, a frao insolvel foisubmetida a cromatografia em coluna de slica gel, usando-se assim eluentes de


22/49

13

diferentes polaridades para sua fase mvel, sendo estes o hexano, acetato de

etila e etanol, os quais foram aplicados de modo gradiente. Analisaram-se as

fraes obtidas atravs de cromatografia em camada delgada, onde foram juntas

aquelas que apresentaram perfil semelhante. A partir dessas fraes foram

utilizadas tcnicas de recristalizao visando a purificao dos compostos.

Conforme necessrio, foi repetido o fracionamento cromatogrfico em coluna em

slica gel ou foi aplicada a tcnica de cromatografia em coluna com slica flash

para a obteno de novas fraes.

Por fim, os compostos isolados foram submetidos anlises por

espectrometria de IV, e RMN unidimensionais (1H, 13C e DEPT) e bidimensionais

(COSY, HMQC e HMBC), conforme a necessidade.

4.5. Testes biolgicos

Baseando-se que diversos compostos descobertos em plantas

apresentam atividades biolgicas, o extrato bruto e as diferentes fraes obtidas

do particionamento lquido-lquido foram submetidos a ensaios biolgicos que

avaliam o poder redutor e a captura de radicais livres pelo DPPH de uma

amostra, alm do teste que avalia a atividade inibitria da enzima

acetilcolinesterase.

4.5.1. Determinao do potencial redutor

Para a anlise da atividade antioxidante atravs da determinao do

potencial redutor, foi seguido a metodologia de Moresco et al. (2012). Em

triplicata, preparou-se as misturas reacionais contendo 100 mL de soluo de

amostra vegetal diludas em metanol (1000 ppm), 8,5 mL de gua deionizada e

1,0 mL de uma soluo de FeCl30,1 mol/L em HCl 0,1 M. Aps trs minutos,

adicionou-se 1,0 mL de uma soluo de ferricianeto de potssio 0,008 mol/L.

Aps 15 minutos foi feita a leitura da absorbncia das misturas em

espectrofotmetro a 720 nm. O aparecimento da cor azul da Prssia indicativo

de potencial redutor. Como branco, utilizou-se uma soluo preparada conforme

o procedimento anterior, porm sem a amostra vegetal. Os dados finais foram


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14

obtidos construindo-se uma curva de calibrao utilizando soluo de cido

ascrbico, onde o potencial redutor expresso equivalente a massa de cido

ascrbico (mg cido ascrbico/g de extrato ou frao).

4.5.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH

A avaliao da ao sequestradora de radicais livres usando o DPPH

baseia-se no mtodo descrito por Moresco et al. (2012). Adicionou-se uma

alquota de 2 mL de soluo de DPPH em metanol (0,004%) a 1 mL de amostra

vegetal diluda em concentrao de 333 ppm (333 L/mL). A mistura em seguida

foi agitada e deixada repousar por 30 minutos. A absorbncia do DPPH nas

solues foi determinada em um espectrofotmetro a 517 nm. A absorbncia de

cada soluo com a amostra (Absamostra) foi convertida em porcentagem da

atividade antioxidante usando a frmula:

AA% = 100 [(Absamostra Absbranco)x100]/Abscontrole

Como branco (Absbranco), foram utilizadas solues de metanol (2 mL) junto

com as solues das amostras diludas (1 mL). Como controle (Abscontrole), foram

utilizadas solues com DPPH (2 mL) e metanol (1 mL). A anlise foi feita em

triplicata. Determinou-se a capacidade antioxidante das amostras com base na

diminuio da absoro da amostra controle comparada a cada soluo, onde

obteve-se um valor da porcentagem de atividade antioxidante (AA%) atravs da

equao demonstrada anteriormente.

4.5.3.Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase

A metodologia apresentada por Magina et al. (2012) foi usada para a

aplicao deste teste. Inicialmente, as amostras das fraes e extrato bruto

foram dissolvidas em etanol (100 g/mL), e ento uma frao de 100 L desta

foi adicionada com 325 L do tampo tris-HCl 50 mmol/L pH = 8 em uma cubeta,

seguida da adio de 25 L da enzima acetilcolinesterase. Aps 15 minutos,acrescentou-se 75 L iodeto de acetiltiocolina e 475 L do reagente de Ellman.


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15

A leitura foi efetuada em espectrofotmetro UV-Vis a 405 nm aps 30 minutos.

Como branco, usou-se apenas o tampo junto as amostras. Como controle

positivo, onde a atividade enzimtica inibida, foi utilizado o frmaco Reminyl na

concentrao de 0,01 mg/mL, o qual contm galantamina em sua composio.

Como controle negativo, onde a atividade enzimtica considerada 100%,

adicionou-se 100 L de etanol em vez das amostras. A taxa de inibio

calculada usando a frmula:

I(%)= 100 [(Aamostra-Abranco)/Acontrole]x100

Aamostrarepresenta a absorbncia da amostra junto aos reagentes e enzima;

Abrancorepresenta a absorbncia obtida do valor branco, o qual foi descontado

da absorbncia obtida das amostras; e Acontrole representa a absorbncia dos

controles negativos medidos para cada amostra. Os testes foram realizados em

triplicata e os valores de porcentagem de inibio foram determinados atravs

dos dados obtidos aplicados a equao representada anteriormente.


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16

5. RESULTADOS E DISCUSSO

As folhas de Posoqueria latifolia, aps coletadas e secas em estufa,

renderam um valor de 538,0 gramas de planta seca. O procedimento para

obteno do extrato bruto (EB) rendeu a massa de 59,39 gramas. A partir deste,

temos como resultado um rendimento de 11,03% (m/m) sobre as folhas secas.

O procedimento da marcha analtica, segundo metodologia de Matos

(1997), o qual tem objetivo de detectar a presena de diferentes classes de

metablitos secundrios em P. latifolia, gerou resultados positivos para a

presena de alcaloides, esteroides, flavonoides, leucoantocianidinas e taninos

no EB obtido anteriormente. A presena de alcaloides j era esperada para estaplanta, tendo em vista a quimiotaxonomia discutida sobre a famlia Rubiaceae.

Na sequncia, o EB foi submetido a um particionamento lquido-lquido

com solventes de diferentes polaridades, fornecendo a frao insolvel (FIn),

frao hexano (FHe), frao acetato de etila (FAe), frao rica em alcaloides

(FRA) e frao aquosa (FAq), cujos rendimentos so apresentados na tabela 2.

Frao Massa obtida Rendimentos (a)

FIn 28,80 g 54,92FHe 49,9 mg 0,16

FAe 2,12 g 6,76

FRA 547,7 mg 1,74

FAq 11,425 g 36,42Tabela 2 - Massa obtida para as fraes da planta P. latifoliaatravs da

extrao lquido-lquido.(a) % m/m a partir do extrato bruto

Devido ao alto rendimento obtido da FIn no procedimento de extrao,

esta foi a frao escolhida para o fracionamento cromatogrfico e isolamento de

compostos.

5.1. Anlise da atividade biolgica

5.1.1. Atividade antioxidante

Reaes envolvendo oxidao, as quais possuem um modelo de

transferncias de eltrons, so essenciais para a manuteno do funcionamento


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de organismos em seres vivos aerbicos. Porm, isto pode se tornar um

problema quando h a formao de um excesso de eltrons desemparelhados

em molculas, os tambm chamados radicais livres. O grupo alcxi (RO), como

exemplo, altamente reativo e tem meia vida de poucos segundo, podendo

atacar rapidamente clulas prximas, causando danos a macromolculas como

lipdeos, protenas ou DNA (AMES et al., 1993). Sendo assim, a descoberta de

molculas com capacidade antioxidante se torna importante, uma vez que elas

podem retardar a velocidade de oxidao atravs de mecanismos de inibio de

radicais livres ou complexao de metais (PIETTA, 2000). Entre alguns

compostos naturais descobertos que possuem capacidade antioxidante

podemos citar o cido ascrbico, vitamina E e -caroteno (RICE-EVANS et al.,

1996).

5.1.1.1. Determinao do potencial redutor

Existem diversos mtodos capazes de avaliar a capacidade antioxidante

de uma amostra, onde cada ensaio apresenta mecanismos diferentes. O poder

redutor tem como objetivo detectar compostos com potencial de reduo de

valores menores que 0,7 V, de acordo com o potencial apresentado pelos ctionsde ferro (PRIOR et al., 2005). Este ensaio baseado na reao de reduo de

ons frricos (Fe+3) a ons ferrosos (Fe+2) pelo substrato, devido a presena de

compostos eltrons-doadores. Dessa forma, os ons ferricianeto so reduzidos

a ferrocianeto que, por sua vez, formam um complexo (Fe4[Fe(CN)6]3) de

colorao azul intensa (azul da Prssia) com os ons ferro III, apresentando pico

de absoro em 720 nm.

Atravs dos resultados obtidos para a espcie P. latifolia, identificados naTabela 3, pode-se observar que a frao acetato de etila apresentou a maior

capacidade redutora sobre ons frricos, resultando em valores de atividade

equivalentes a 52,28 mg de cido ascrbico/g de amostra.

Porm, quando estes resultados so comparados a outras plantas da

famlia Myrtaceae, por exemplo (MAGINA et al., 2010), P. latifoliaapresentou

baixa atividade antioxidante.


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18

5.1.1.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH

A atividade antioxidante do extrato e fraes da planta foi tambm

determinada utilizando o teste com o radical livre estvel DPPH (figura 5). Estamolcula tem como caracterstica solubilidade em solventes orgnicos, no qual

sua soluo apresenta cor violeta intensa. Se uma substncia presente no

extrato ou fraes capaz de sequestrar o radical presente na molcula, ela

causa o descoramento da soluo. O sequestro de radical pode ser promovido

pela abstrao de um tomo de hidrognio pelo radical DPPH, promovendo

assim sua reduo. Dessa forma, consegue-se obter compostos mais estveis

que os presentes anteriormente, e a partir desse princpio, determinar a suaatividade antioxidante atravs de espectroscopia de UV-VIS (517 nm).

Figura 6Estruturas do radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazil

O teste foi realizado com as amostras do extrato bruto e fraes na

concentrao de 333 ppm. Os resultados referentes a porcentagem de atividade

antioxidante so apresentados na tabela 3. De acordo com a tabela, observa-se

que para espcie P. latifolia, a frao que apresentou a maior capacidade de

sequestro de radicais livres foi a FAe, com valor de 19,3% de atividade, seguida

da frao FRA, com 13,7%.Como observado para os valores quanto a determinao do potencial

redutor, os valores obtidos para as concentraes foram baixos, demonstrando

que a espcie no tem, ou possui baixa atividade antioxidante.

5.1.2. Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase

A doena de Alzheimer costuma aparecer em indivduos de idade maisavanada e responsvel por grande parte dos casos de demncia nessa faixa


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19

etria (FRANCIS et al., 1999). Ela est associada a diferentes rotas bioqumicas,

onde uma das suas causas mais aceitas relacionada a diminuio de

neurotransmissores no crebro, entre eles a acetilcolina (ZAROTSKY et al.,

2003). A acetilcolina, aps ser usada na sinapse nervosa, hidrolisada pela

enzima acetilcolinesterase, transformando-a em colina e um grupo acetil. Como

exemplo, o alcaloide galantamina (Reminyl) tem sido um excelente tratamento

para esta doena, inibindo a enzima acetilcolinesterase no crebro, retardando

o avano da doena e prolongando a vida do paciente (HEINRICH & TEOH,

2004).

Alm da galantamina, existem diversos inibidores da acetilcolinesterase

conhecidos no mercado, como os frmacos tacrina (Cognex), donepezil

(Aricept) e riastigmina (Exelon). Apesar destes frmacos apresentarem efeito

satisfatrio em pacientes, eles acabam sendo caros e alguns apresentam muitos

efeitos colaterais (VIEGAS JUNIOR et al., 2004). Por isso, se incentiva a busca

de produtos naturais que possam substitui-los, tendo-se uma opo de menor

custo com tratamento mais eficiente para a doena.

Assim, o extrato e fraes da espcie P. latifolia foram avaliados em

relao ao potencial inibidor sobre a enzima acetilcolinesterase. O teste para a

avaliao desta atividade baseado na hidrlise do substrato acetiltiocolina pela

enzima, gerando como produto a tiocolina, que reage com o DTNB cido 5,5

ditio-bis-2-nitrobenzico (reagente de Ellman), produzindo o nion 2-

nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e o cido 2-nitro-5-tiobenzico, sendo o nion

facilmente identificado pela colorao amarela. Deste modo, se houver na

amostra compostos que inibam a ao da enzima, esta no degradar a

acetiltiocolina e no formar um cromforo amarelo. Quanto mais intensa a

colorao amarela, maior a hidrlise do substrato realizada pela enzima e menora concentrao de compostos vegetais que possuem a propriedade de inibir a

enzima.

De acordo com os resultados obtidos para a espcie P. latiflia,podemos

observar que o teste obteve os melhores resultados para a frao acetato de

etila e frao insolvel, apresentando atividade acima de 50% na concentrao

de 100 g/mL, segundo os resultados apresentados na Tabela 3.


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20

Frao Poder Redutor (a) % Ativididade Antioxidante (b) Acetilcolinesterase (c)EB 24,44 10,8 49,3Fin 18,83 10,4 50,75FHe 16,35 6,00 46,21

FAe 52,28 19,3 53,84FRA 9,10 13,7 38,5FAq 17,09 0,03 39,88Tabela 3 - Resultados dos testes de poder redutor, determinao da ao

sequestradora do radical livre DPPH e inibio da acetilcolinesterase com o

extrato bruto e as fraes de P. latifolia

(a) mg de cido ascrbico/g amostra, (b) % AA (333 ppm), (c) % inibio (100ppm)

5.2. Fracionamento cromatogrfico da frao insolvel dePosoq ueria lati fol ia

Devido ao grande nmero de compostos que esto presentes no extrato e

fraes obtidos de plantas, so utilizados tcnicas de separao para que se

possa isol-los. Na espcie P. latifolia,esta tcnica foi utilizada com o objetivo

de obter compostos presentes na frao insolvel.Dessa forma, inicialmente foi

impregnado 25,09 g da frao em cerca de 50 g de slica gel. Uma coluna devidro de 5,5 cm de dimetro foi recheada com slica gel (cerca de 15 cm de

altura), e posteriormente eluda com os solventes hexano, acetato de etila e

metanol, obtendo-se um gradiente de polaridade. Foram coletadas 80 fraes de

100 mL cada. O fracionamento foi monitorado atravs de cromatografia em

camada delgada.

A frao 33 foi obtida em eluente de Hex:AcOEt 80:20, aps recristalizao

em metanol. Obteve-se um slido cristalino em forma de agulhas, com faixa deponto de fuso de 134,3-137,4C. Este slido foi encaminhado para anlises de

RMN de 1H e 13Ce foi nomeado de Pla-INS-33.

As fraes 65-67 foram obtidas em um eluente de AcOEt:Hex 75:25. Elas

foram reunidas de acordo com o perfil na CCD e recristalizadas com metanol,

onde foi obtido um slido branco com faixa de ponto de fuso de 224-226C.

Este slido foi encaminhado para anlises de RMN e foi nomeado de Pla-INS-

65.


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21

5.3. Elucidao estrutural dos compostos

Os compostos obtidos de P. latifolia tiveram suas estruturas elucidadas

atravs de tcnicas de espectrometria de IV e anlise com RMN unidimensionais

(1H, 13C e DEPT).Previamente, foi analisado atravs de RMN de 1H a frao insolvel (FIn)

com o propsito de encontrar quais tipos de compostos esto presentes na

frao. O resultado est presente na figura 7.

5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intensity

Methanol-d4

Methanol-d4

5

.26

4.78

3.23

1.51 0

.69

Figura 7 - Espectro de RMN de 1H da FIn em CD3OD (200 MHz)

Os picos encontrados esto em sua maioria na faixa de 0,69 ppm a 1,51

ppm, o que sugere que os compostos nesta frao apresentem hidrognios

ligados a carbonos primrios e secundrios.

Em 5,26 ppm tambm pode ser visto picos na linha base do espectro.Hidrognios que aparecem nessa faixa de espectro geralmente esto

relacionados a prtons ligados a carbonos com duplas ligaes, os quais, por

estarem mais desprotegidos, so facilmente alterados pelo campo magntico

aplicado pelo equipamento de RMN.

A seguir sero discutidas como foram feitas as elucidaes estruturais dos

compostos isolados atravs do fracionamento cromatogrfico da frao insolvel

de P. latifolia.


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22

5.3.1. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-33

Este composto apresentou uma faixa de fuso tpica de esteroides e, assim

como previsto no resultado da marcha analtica, as anlises de RMN de 1H

confirmaram esta suspeita. Atravs dos espectros de RMN, foi observado que

se trata do esteroide -sitosterol (Figura 8). Este esteroide frequentemente

isolado em fraes de plantas atravs de cromatografia em coluna, onde

geralmente est presente em fraes menos polares, e tem sua estrutura citada

diversas vezes na literatura junto ao esteroide estigmasterol (CHATURVEDULA

& PRAKASH, 2012; KAMBOJ & SALUJA, 2011; YAHYA et al., 2011; AHMED et

al., 2013).

Figura 8 - Estrutura do compostositosterol

Atravs do espectro de RMN de 1H, percebe-se que ele no se encontra

junto ao outro esteroide, j que pode ser destacado o multipleto em 3,54 ppm

referente ao hidrognio hidroximetnico em C3, que a prncipio poderia estar

presente em ambos os compostos e no entanto observa-se integrao para

apenas 1 tomo de hidrognio; o dupleto centrado em 5,36 ppm (J= 5,2 Hz),

atribudo ao hidrognio vinlico em C6 presente no -sitosterol, tambm com

integrao para 1 tomo de hidrognio; e a ausncia dos dois duplos dupletos

centrados em 5,01 ppm (J22-21~ 8,0 Hz; J22-23~ 15,0 Hz) e 5,17 ppm (J23-24~ 8,0

Hz; J23-22~ 15,0 Hz) atribudos aos hidrognios vinlicos do estigmasterol em C20

e C21, respectivamente. Na faixa entre 0,69 ppm e 1,02 ppm podem ser vistos

os picos referentes as metilas presentes na molcula. So encontrados 3

dupletos (0,93 ppm, J = 6,4 Hz; 0,85 ppm, J = 6,8 Hz e 0,82 ppm, J = 6,7 Hz)

referentes aos hidrognios presentes nos carbonos C19, C26 e C27,

respectivamente, e um tripleto (0,87 ppm, J= 7,2 Hz) em C24. As contantes de


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acoplamento esto na faixa de 6,4 Hz e 7,2 Hz, de acordo com o esperado para

metilas ligadas a carbonos secundrios e tercirios. Em 0,69 ppm e 1,02 ppm

podem ser encontrados dois simpletos referentes aos hidrognios nos carbonos

C28 e C29, os quais tem valor de integrao de 3 hidrognios.

Todos os dados foram confirmados atravs de comparao com a literatura

citada anteriormente. A Figura 9 e 10 mostra o espectro de RMN de 1H obtido e

suas regies ampliadas e a Tabela 4 rene todos os dados obtidos destes

espectros em comparao com dados da literatura.

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5


-0.005

0

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.050

Intensity

2.97 2.872.811.83 1.821.101.00

Chloroform-d

5.38

5.35

3.62

3.59

3.56

3.54

3.51

3.49

3.46

2.3

0

2.27

2.242.05 1.99 1.88

1

.83

1.59

1.48

1

.30 1.19

1.18

1.02

0.94 0.86

0.77

0.69

Figura 9 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em CDCl3 (200MHz)


33/49

24

Pla-INS-33 1H (200MHz)2.esp

3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45 3.40 3.35Chemical Shift (ppm)

0

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

NormalizedIntensity

1.10

3.62

3.59

3.5

6

3.54

3.51

3.49

3.46

Pla-INS-33 1H (200MHz)2.esp

5.40 5.35 5.30 5.25 5.20 5.15 5.10 5.05Chemical Shift (ppm)

-0.0005

0

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

NormalizedIntensity

1.12

5.38

5.35

Figura 10 - Ampliaes do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em

CDCl3 (200 MHz)


34/49

25

PLA-INS-33 1H (200MHZ)2.ESP

1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65


0

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

NormalizedIntensity

2.872.97

1.30 1

.26

1.23

1.221.191.18

1.02

0.94

0.91

0.89

0.88

0.86

0.850.84

0.83

0.80

0.77

0.77

0

.69

Figura 10 - Ampliaes do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 emCDCl3 (200 MHz)

C

sitosterol

1H (YAHYA et al.,2011)

1H(CHATURVEDULA& PRAKASH, 2012)

1H (AHMED etal., 2013)1H Pla-INS-33

03 3,53(1H; m) 3,53 (1H; m) 3,51(1H; m) 3,54(1H; m)

065,36(1H; d;J=4,8Hz)

5,36 (1H; t;J=6,4HZ)

5,34(1H; d;J=5,2Hz)

5,36 (1H; d;J=5,2 HZ)

190,93 (3H; d;

J=6,6Hz)0,93 (3H; d;

J=6,5Hz)0,83 (3H; d;

J=6,0Hz)0,93 (d;

J=6,4Hz)

240,87 (3H; t;J=7,7Hz)

0,84 (3h; t;J=7,2Hz)

0,85 (3H; d;J=8,0Hz)

0,87 (t;J=7,2Hz)

260,85 (3H; d;

J=7,0Hz)

0,83 (3H; d;

J=6,4Hz)

0,83 (3H; d;

J=7,2Hz)

0,85 (d;

J=6,8Hz)


35/49

26

270,81 (3H d;J=7,0Hz)

0,81 (3H; d;J=6,4Hz)

0,79 (3H; d;J=7,2Hz)

0,82 (d;J=6,7Hz)

28 1,02 (3H; s) 0,68 (3H; s) 0,67 (3H; s) 0,69* (3H; s)29 0,69 (3H; s) 1,01 (3H; s) 1,00 (3H; s) 1,02* (3H; s)

Tabela 4. Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 emcomparao com a literatura

*Os dois valores podem estar trocados para literaturas diferentes.

5.3.2. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-65

O composto Pla-INS-65 foi inicialmente analisado atravs de

espectrometria por infravermelho em pastilha de KBr. Atravs dessa anlise

podemos ver uma banda larga entre 3300 cm-1 e 3600 cm-1, o qual corresponde

a um grupo funcional OH ligado a carbono saturado. Entre 2800 cm-1 e 2950 cm-

1 h outra banda larga, referente a grupo CH alifticos. Em 1692 cm-1 temos uma

banda intensa e fina, representando um grupo C=O de cido carboxlico. O

espectro pode ser observado na figura 11.

3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

Wavenumber (cm-1)

0

8

16

24

32

40

48

56

64

72

%Transmittance

3435.21

2926.01

2871.04

16

92.53

Figura 11 - Espectro infravermelho do composto Pla-INS-65

De acordo com as anlises de infravermelho, RMN de 1H e 13C, DEPT 90

e 135, o triterpeno cido urslico (Figura 12) foi elucidado como provvel

composto presente em Pla-INS-65, conforme explicado a seguir.


36/49

27

Figura 12 - Estrutura do composto cido urslico

No espectro de RMN de 1H deste composto pode-se observar um duplo

dupleto centrado em 3,46 ppm caracterstico de triterpenos, referente ao

hidrognio ligado ao C3 com integrao para 1 hidrognio e constante de

acoplamento J = 6,6 e 9,4 Hz. Este duplo dupleto o que os diferencia de

esteroides. Observa-se ainda um simpleto de sinal amplo em 5,49 ppm atribudo

a hidrognio vinlico ligado ao carbono C12, um dupleto em 2,64 ppm (J= 11,7

Hz) atribudo ao hidrognio metnico ligado ao carbono C18, cinco simpletos em

1,22; 1,05; 0,88; 1,02 e 1,24 ppm com valor de integrao para 3 hidrognios,

referentes s metilas ligadas a carbonos no hidrogenados (C23; C24; C25; C26;

C27) e dois dupletos em 1,00 ppm (J= 6,3 Hz) e 0,94 ppm (J= 5,5 Hz) referentes

a hidrognios ligados aos carbonos C29 e C30 repectivamente, caractersticos

de um esqueleto ursano.

No espectro de RMN de 13C podem ser observados sinais para 30

carbonos, sendo destacados os sinais mais deslocados em 78,21 ppm referente

ao carbono hidroximetnico (C3), 139,30 ppm e 125,69 ppm referentes aos

carbonos sp2 (C12 e C13), o sinal em 179,95 ppm referente a carbono de cido

carboxlico (C28). Os picos referentes aos carbonos das metilas (C23, C24, C25,

C26, C27, C29 e C30) se se concentram em deslocamento qumico menores, na

faixa de 15,72 ppm a 28,86 ppm. Os carbonos secundrios se concentram na

faixa de 23,57 ppm at 39,11 ppm, enquanto os carbonos tercirios tm

deslocamento qumico na faixa de 39,44 ppm e 55,86 ppm.

Atravs do espectro de DEPT 90 e DEPT 135 possvel concluir que tipo

de carbonos esto presentes na molcula a ser elucidada. O DEPT 90 identifica


37/49

28

apenas os carbonos tercirios (-CH), sendo formado um pico referente a cada

carbono, de acordo com os valores obtidos pelo espectro de RMN de 13C. O

espectro de DEPT 135 tem o mesmo princpio, porm so encontrados dois tipos

diferentes de picos, sendo os picos negativos referentes a carbonos secundrios

(-CH2) e os picos positivos referentes a carbonos tercirios (-CH) ou primrios (-

CH3). Como os carbonos tercirios foram encontrados atravs do espectro de

DEPT 90, consegue-se distinguir os carbonos primrios no espectro de DEPT

135. Os carbonos quaternrios no aparecem nos dois espectros e podem ser

localizados por simples comparao com o espectro de RMN de 13C. Os

resultados obtidos das anlises de DEPT para o composto em Pla-INS-65 podem

ser encontrados na tabela 6.

Atravs dos espectros de infravermelho, RMN de 1H, RMN de 13C, DEPT

90 e DEPT 135 em comparao com a literatura (SEEBACHER et al., 2003; LEE

et al., 2005; UDDIN et al., 2011; PREZ et al., 2014; BABALOLA & SHODE,

2013) foi possvel concluir a elucidao estrutural do composto Pla-INS-65 como

sendo coerente para o cido urslico.

As Figuras 13, 14, 15, 16 e 17 mostram, respectivamente, os espectros de

RMN de 1H e ampliaes, RMN de 13C, DEPT 90 e DEPT 135. As Tabelas 5, 6

e 7 renem os dados espectromtricos em comparao com a literatura citada.

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0Chemical Shift (ppm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intens

ity

3.323.131.061.05 1.04 0.96

Pyridine-d5

Pyridine-d5

Pyridine-d5

8.7

1

7.5

6

7.1

9

5.4

9

3.4

7

3.4

6

3.4

3

2.6

5

2.6

2

2.3

2

2.1

4

2.1

2

2.1

1

1.9

7

1.9

4

1.8

3

1.5

5

1.3

7

1.2

4

1.0

2

0.8

8

0.8

4

Figura 13 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 em piridina-D5(200MHz)


38/49

29

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

Intens

ity

1.05 1.04 0.96

5.4

9

3.4

7

3.4

6

3.4

5

3.4

3

2.6

5

2.6

2

2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Intensity

3.323.173.13 3.041.06

2.352.33

2.32

2.30 2

.142.12

2.11

2.09

1.97 1.94

1.83

1.65 1.62

1.55

1.53 1

.37

1.341.28

1.24

1.22

1.05

1.02

1.00

0.990.95

0.94

0.88

0.84

Figura 14 - Regies ampliadas do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 em piridina-D5 (200MHz)


39/49

30

Tabela 5 - Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 emcomparao com a literatura

C cido Urslico

1H (UDDIN et al.,2011)

1H (PEREZ et al.,2014)

1H (BABALOLA&SHODE, 2013)

1H PLA-INS-65

03 3,43 (1H; br s)3,49 (1H; dd; J=6,0;

10,0Hz)3,43 (1H; br s)

3,46 (1H; dd;J=6,6; 9,4Hz)

12 5,50 (1H; br s) 5,52 (1H; s) 5,50 (1H; br s) 5,49 (1H; br s)

182,52 (1H; d;J=11,0Hz)

2,68 (1H; d;J=11,0Hz)

2,52 (1H; d;J=11,0Hz)

2,64 (1H; d;J=11,7Hz)

23 1,24 (3H; s) 1,27 (3H; s) 1,24 (3H; s) 1,22 (3H; s)24 1,02 (3H; s) 0,91 (3H; s) 1,02 (3H; s) 1,05 (3H; s)25 0,93 (3H; s) 1,08 (3H; s) 0,93 (3H; s) 0,88 (3H; s)

26 1,05 (3H; s) 1,05 (3H; s) 1,05 (3H; s) 1,02 (3H; s)27 1,22 (3H; s) 1,25 (3H; s) 1,22 (3H; s) 1,24 (3H; s)

29 0,97 (3H; s)1,03 (3H; d;

J=6,0Hz)0,97 (3H; s)

1,00 (3H; d;J=6,3Hz)

300,99 (3H; d;

J=6,1Hz)0,98 (3H; d;

J=6,0Hz)0,99 (3H; d;

J=6,0Hz)0,94 (3H; d;

J=5,5Hz)


40/49

31

Figura 15 -Espectro de RMN 13C do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

Figura 16 -Espectro DEPT 90 do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

PLA-INS-65_PIRIDINA_DEPT90(2).ESP

180 160 140 120 100 80 60 40 20


-0.5

0

0.5

1.0

NormalizedIntensity

125.69

78.16 5

5.85

53.58

48.08 39.52

3

9.44

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intens

ity

Pyridine-d5

Pyridine-d5

15

.72

16

.63

17

.50

23

.96

28

.86

37

.32

39

.42

39

.53

40

.01

42

.54

48

.09

53

.59

55

.86

78

.16

12

3.5

6

1

25

.69

135

.59

139

.30

149

.9

0

179

.95


41/49

32

PLA-INS-65_PIRIDINA_DEPT135(2).ESP

180 160 140 120 100 80 60 40 20


-0.5

0

0.5

1.0

NormalizedIntensity

125.69

78.16

55.86 53.59

48.08

39.53 39.45

39.1

237.4

9 33.

62

31.11

28.86

28.17

24.

96

23.96

23.

6

8

21.48

18.

82

16.64

15.73

Figura 17 -Espectro de DEPT 135 do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

cido UrslicoC 13C Pla-INS-65 DEPT 90 DEPT 1351 39,11 - CH22 28,16 - CH23 78,16 CH CH4 39,42 - -5 55,86 CH CH6 18,82 - CH27 33,62 - CH28 40,01 - -9 48,09 CH CH

10 37,32 - -11 23,67 - CH2


42/49

33

12 125,69 CH CH13 139,30 - -14 42,54 - -15 28,73 - CH216 24,96 CH2

17 48,09 - -18 53,59 CH CH19 39,53 CH CH20 39,44 CH CH21 31,11 - CH222 37,49 - CH223 28,86 - CH324 16,63 - CH325 15,72 - CH326 17,50 - CH327 23,96 - CH3

28 179,95 - -29 17,57 - CH330 21,47 - CH3

Tabela 6 - Dados espectrais de RMN de 13C junto aos de DEPT 90 e DEPT 135do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

cido Urslico

C 13C (SEEBACHERet al., 2003) 13C (BABALOLA&SHODE, 2013)

13C Pla-INS-651 39,2 38,4 39,112 28,2 28,1 28,163 78,2 78,1 78,164 39,6 38,4 39,425 55,9 55,8 55,866 18,8 18,8 18,827 33,7 33,6 33,628 40,1 40,0 40,019 48,1 48,3 48,09

10 37,5 37,4 37,3211 23,7 23,6 23,67


43/49

34

12 125,7 125,6 125,6913 139,3 139,7 139,3014 42,6 42,5 42,5415 28,8 28,7 28,7316 25,0 24,9 24,96

17 48,1 48,0 48,0918 53,6 53,5 53,5919 39,5 39,5 39,5320 39,4 39,1 39,4421 31,1 31,1 31,1122 37,4 37,3 37,4923 28,8 28,8 28,8624 16,5 15,7 16,6325 15,7 16,6 15,7226 17,5 17,4 17,5027 24,0 23,8 23,96

28 179,7 180,0 179,9529 17,5 17,5 17,5730 21,4 21,4 21,47

Tabela 7 - Dados do espectro de RMN de 13C do composto Pla-INS-65 emcomparao com a literatura

Portanto, a partir da frao insolvel obtida do extrato bruto hidroalcolico

de P. latifolia, pode-se isolar o esteroide -sitosterol e um triterpeno, o cido

urslico.


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35

6. CONCLUSES

O estudo fitoqumico e biolgico de Posoqueria latifolia permitiu obter as

seguintes concluses:

1. Aps a aplicao da marcha analtica preliminar ao extrato bruto,

observou-se que a espcie forneceu resultados positivos para compostos da

famlia dos alcaloides, esteroides, flavonoides, leucoantocianidinas e taninos.

2. A atividade antioxidante concentrou-se na frao acetato de etila obtida

do particionamento lquido-lquido do extrato bruto. Quanto a frao insolvel, o

fato de isolar-se compostos que no tem alta atividade antioxidante prova porque

o teste no rendeu bons resultados para essa frao.

3. A ao inibitria da acetilcolinesterase foi mais acentuada na frao

acetato de etila e frao insolvel, exibindo uma atividade inibitria maior que

50%. As fraes demonstraram menor atividade quando comparado com o

frmaco galantamina, porm incentivida a aplicao de outros testes devido a

alta atividade apresentada.

4. O fracionamento cromatogrfico da frao insolvel permitiu o

isolamento e identificao do esteroide - sitosterol e do triterpeno cido

urslico.

Os estudos fitoqumicos promovidos at o momento sobre a planta

renderam novos compostos para a taxonomia da espcie, mas sem ainda

possibilitar a descoberta de alcaloides. Porm, o estudo da frao rica em

alcaloides pode representar novos compostos a serem isolados e elucidados na

continuao deste projeto. Quanto aos efeitos biolgicos, embora os testes

apresentados no sejam to promissores, incentiva-se a aplicao de novos

testes com objetivos diferentes, de modo a ser observada em P. latifoliauma

provvel aplicao biolgica.


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36

7.REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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