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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
JULIANA PAES
CONCENTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS DE RESÍDUOS DE MIRTILO
(VACCINIUM MYRTILLUS L.) USANDO EXTRAÇÃO COM CO2 SUPERCRÍTICO E
NANOFILTRAÇÃO
CAMPINAS
2016
JULIANA PAES
CONCENTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS DE RESÍDUOS DE MIRTILO
(VACCINIUM MYRTILLUS L.) USANDO EXTRAÇÃO COM CO2 SUPERCRÍTICO E
NANOFILTRAÇÃO
Tese apresentada à
Faculdade de Engenharia de Alimentos/
Departamento de Engenharia de Alimentos
da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para
obtenção do título de Doutora em
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Orientador: JULIAN MARTÍNEZ
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE Á VERSÃO FINAL
DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA PAES
E ORIENTADA PELO PROF. DR. JULIAN MARTÍNEZ
CAMPINAS
2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 2952/2011
Ficha catalográfica Universidade
Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de
Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB
8/5816
Paes, Juliana, 1980-
P138c Concentração de compostos bioativos de resíduos de mirtilo
(Vaccinium myrtillus L.) usando extração com CO2 supercrítico e
nanofiltração / Juliana Paes. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
Orientador: Julian Martínez.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
1. Mirtilo. 2. Extração supercrítica. 3. Antocianinas. 4.
Membranas. I. Martínez, Julian. II. Universidade Estadual de
Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Concentration of bioactive components from blueberry´s
waste (Vaccinium myrtillus L.) using supercritical CO2 extraction and nanofiltration.
Palavras-chave em inglês:
Blueberry
Supercritical
extraction
Anthocyanins
Membrane
Área de concentração: Engenharia de Alimentos
Titulação: Doutora em Engenharia de Alimentos
Banca examinadora:
Julian Martínez [Orientador]
Haiko Hense
Marco Di Luccio
Miriam Dupas Hubinger Rodrigo
Nunes Cavalcanti
Data de defesa: 19-08-2016
Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof. Dr. Julian Martínez DEA – FEA – UNICAMP (Orientador)
____________________________________________ Prof. Dr. Haiko Hense
Universidade Federal de Santa Catarina (Membro Titular)
____________________________________________ Prof. Dr. Marco Di Luccio
Universidade Federal de Santa Catarina (Membro Titular)
____________________________________________ Profa. Dra. Miriam Dupas Hubinger
DEA – FEA – UNICAMP (Membro Titular)
____________________________________________ Dr. Rodrigo Nunes Cavalcanti
DEA – FEA – UNICAMP (Membro Titular)
____________________________________________ Prof. Dr. Flávio Luis Schmidt
DTA – FEA – UNICAMP (Membro Suplente)
____________________________________________ Profa. Dra. Juliana Martin do Prado
Universidade Federal de São Carlos- Campus Lagoa do Sino (Membro Suplente)
____________________________________________ Profa. Dra. Michele Cristiane Mesomo
Universidade Estadual do Centro-Oeste (Membro Suplente)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do aluno.
Á Deus, pelo crescimento,
força e esperança. Á minha família e amigos.
Ao meu esposo Beto, filhos Roberto e Julio
pela confiança e amor que nos une.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser onipresente, onisciente e onipotente em todos os momentos.
Agradeço ao meu orientador Julian pela excelência na orientação, além da paciência,
compreensão, amizade e confiança depositados em mim.
Agradeço ao meu esposo Roberto, pela compreensão e pelo amor, companheirismo e
motivação. Sem você não chegaria até aqui!
Agradeço à minha mãe Izete pela motivação. Mãe, obrigada pela dedicação!
À toda minha família, que me apoiou com muito carinho.
Aos amigos do LAPEA, especialmente a Ana Carolina, pela ajuda, incentivo, motivação
tão importante para a execução deste trabalho.
À técnica do laboratório, Camila Bucci, agradeço pela ajuda na realização do trabalho
experimental.
Aos amigos Érika, Fábio, Rodrigo, Flávia e Candice pela amizade, companheirismo e
incentivo.
Agradeço aos colegas do DEA pela convivência e pelos momentos de descontração.
À Unicamp, em especial à Faculdade de Engenharia de Alimentos pelas facilidades
recebidas.
À CAPES pela concessão da bolsa.
À todos que de uma forma ou de outra, contribuíram e incentivaram para a conclusão
deste trabalho, o meu muito obrigada!
RESUMO
Este trabalho explorou as vantagens do emprego de dióxido de carbono
supercrítico e de líquidos pressurizados na extração de compostos bioativos do resíduo
do mirtilo (Vaccinium myrtillus L.), seco e in natura. Na extração com líquidos
pressurizados foram utilizados água, água acidificada e etanol em diferentes
proporções, porém com temperatura, pressão e vazão constantes de 40 ºC, 20 MPa
e 10 mL/minuto, respectivamente. Os extratos foram analisados e os melhores
resultados foram encontrados nas condições de etanol e etanol + água, para as
análises de compostos fenólicos e capacidade antioxidante. As antocianinas foram
identificadas em maior quantidade nas amostras extraídas com água acidificada. Na
extração com fluido supercrítico, foram utilizadas diferentes proporções de CO2, água,
água acidificada e etanol e verificou-se que a melhor condição foi encontrada no
experimento com 90% CO2, 5% água e 5% etanol, por apresentar maiores
concentrações de compostos fenólicos, antioxidantes e antocianinas no extrato obtido,
porém com menor rendimento. A quantificação de antocianinas por espectrofotometria
resultou em concentrações superiores às encontradas por cromatografia líquida de
ultra alta performance (UPLC). Posteriormente, os extratos obtidos nas condições com
maior rendimento de antocianinas, e o resíduo de mirtilo, foram submetidos a
nanofiltração. Entre as membranas testadas, a membrana de nanofiltração NF 270
apresentou maior retenção de compostos fenólicos, antioxidantes e, especificamente,
a retenção de antocianinas foi maior que 90% pelos dois métodos de análise
empregados, pH diferencial e UPLC.
Palavras-chave: mirtilo, extração com líquidos pressurizados, extração supercrítica,
antocianinas, membranas.
ABSTRACT
This work explored the advantages of using supercritical carbon dioxide and
pressurized liquids in the extraction of bioactive compounds from dry and fresh
blueberry (Vaccinium myrtillus L.) residues. In pressurized liquid extraction liquids
water, acidified water and ethanol were used as solvents at different ratios, but with
temperature, pressure and flow rate constant at 40 °C, 20 MPa and 10 mL/minute,
respectively. The extracts were analyzed and best conditions found with pressurized
ethanol and water + ethanol, for phenolic compounds and antioxidant capacity.
Anthocyanins were identified in greater amounts in the samples extracted with acidified
water. In supercritical fluid extraction, different ratios of CO2, water, acidified water and
ethanol were used, and the best condition was found in the experiment with 90% CO2,
5% water and 5% ethanol, due to the higher concentrations of phenolic compounds,
antioxidants and anthocyanins in the extract. The spectrophotometric method for the
quantification of anthocyanins showed higher concentrations compared to those
obtained by ultra performance liquid chromatography (UPLC). Next, the extracts
obtained at the conditions with increased yield of these compounds, and the blueberry
residue, were subjected to nanofiltration. Among the tested membranes, the
nanofiltration membrane NF 270 achieved higher retention of phenolic compounds,
antioxidants and, specifically, the retention of anthocyanins was greater than 90%
when evaluated by both differential pH and UPLC methods.
Keywords: blueberry, pressurized liquid extraction, supercritical extraction,
anthocyanins, membranes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1. A fruta mirtilo (Vaccinium myrtillus L.).....................................................24
Figura 3.2. Estrutura base dos flavonoides. (REIN, 2005)..........................................30
Figura 3.3 - Estrutura química do cátion flavílio (REIN, 2005).....................................34
Figura 3.4. Estrutura das antocianinas (GUEDES, 2004) ........................................34
Figura 3.5. Diagrama de fases de um composto puro. (Adaptado de BRUNER,1987)
....................................................................................................................................40
Figura 3.6. Curvas globais de extração (OEC) tipo I e II (adaptado de QUISPE-
CONDORI, et al. 2005; BRUNNER, 1994).................................................................44
Figura 3.7. Principais características dos processos que utilizam diferença de pressão
como força motriz (HABERT et al., 2006)...................................................................47
Figura 3.8. Diagrama de filtração tangencial em membranas (Adaptação de ilustração
apresentada por Hanhui et al., 2004) .........................................................................52
Figura 3.9. Estágios do declínio do fluxo de permeado com o tempo (MARSHALL e
DAUFIN, 1995)...........................................................................................................54
Figura 4.1. Diagrama de fluxo das atividades realizadas na tese .......................................61
Figura 4.2. Diagrama esquemático da unidade de extração com líquidos
pressurizados (PLE). R- Recipiente (solvente); B- Bomba de solvente; M- Manômetro;
V- Válvula de bloqueio; CE - Célula de extração com aquecimento; BP- Válvula back
pressure; T- Controlador e indicador de temperatura; VC- Vaso de coleta...............74
Figura 4.3. Unidade PLE. A - Bomba de HPLC; B - Manômetro; C - Válvula de
bloqueio; D - Célula de extração com aquecimento; E - Válvula back pressure........75
Figura 4.4. Diagrama esquemático da unidade de extração supercrítica; V-1, V-2, V-
3, V-4 e V-5 – Válvulas de bloqueio; V-6 – Válvula micrométrica; C - Compressor; F -
Filtro de ar comprimido; BR – Banho de refrigeração; B - Bomba (Booster); BA – Banho
de aquecimento; I-1 e I-2 – Indicadores de pressão e temperatura, respectivamente;
IC-1 e IC-2 – Temperatura da célula de extração e temperatura da válvula
micrométrica, respectivamente; CE – Célula de extração (300 mL); S – Sonda
ultrassônica................................................................................................................78
Figura 4.5. (a) Sistema de filtração 1 - Onde: V1 - Válvula abre/fecha do cilindro de
nitrogênio, M1 - Manômetro 1: fornece a leitura da pressão interna do cilindro de
nitrogênio quando V1 está aberta, V2 - Válvula de regulagem: regula a pressão no
interior da célula, M2 -Manômetro 2: fornece a leitura da pressão no interior da célula,
V3 - Válvula de 3 vias (escape), V4 - Válvula de saída de permeado. (b) Sistema de
filtração 2 – Onde (1) entrada e saída da camisa de aquecimento, (2) entrada de gás
nitrogênio para pressurização da célula, (3) suporte do bastão magnético, (4) suporte
do disco de membrana, (5) saída de permeado e (6) agitador
magnético...................................................................................................................81
Figura 5.1. Curvas globais de SFE de resíduo de mirtilo fresco obtidas a 15 MPa (a),
20 MPa (b) e 25 MPa (c) e 40 °C................................................................................95
Figura 5.2. Cromatograma dos íons das antocianinas analisadas: 1) Delfinidina-3-O-
galactosídeo, 4) Delfinidina-3-O-arabinosídeo, 5) Cianidina-3-O-glucosídeo, 6)
Petunidina-3-O-galactosídeo, 7) Cianidina-3-O-arabinosídeo, 13) Peonidina-3-O-
arabinosídeo, 14) Malvidina-3-O-glucosídeo, 15) Malvidina-3-O-arabinosídeo, 16)
Malvidina-3-O- xilosídeo...........................................................................................107
Figura 5.3. Cromatograma dos íons das antocianinas analisadas no mirtilo fresco e
não identificadas no resíduo: 1) Petunidina-3-O-(6-acetil)-glucosídeo, 2) Malvidina-3-
O-(6-acetil)-glucosídeo, 3) Cianidina-3-O- (6-acetil)-glucosídeo, 4) Delfinidina-3-O-(6-
acetil) glucosídeo......................................................................................................108
Figura 5.4. Cromatograma das antocianinas identificadas no resíduo de mirtilo (Lote
2), nos extratos de resíduo de mirtilo e nos produtos obtidos nas separações por
membranas. 1- Delfinidina-3-O-galactosídeo, 2-Cianidina-3-O-galactosídeo,
3- Cianidina-3-O-glucosídeo, 4-Petunidina-3-O-galactosídeo, 5-Cianidina-3-O
arabinosídeo, 6-Petunidina-3-O-glucosídeo, 7-Peonidina-3-O-galactosídeo,
8- Petunidina-3-O-arabinosídeo, 9-Peonidina-3-O-glucosídeo, 10-Malvidina-3-O-
galactosídeo, 11-Peonidina-3-O-arabinosídeo, 12-Malvidina-3-O-glucosídeo,
13- Malvidina-3-O-arabinosídeo e 14-Malvidina-3-O-xilosídeo ...............................123
Figura 5.5. Curvas de fluxo de permeado em função do tempo de todas as
concentrações (NF 10, 30, 90 e 270 do resíduo e extrato) por nanofiltração
(∆P=4MPa)...............................................................................................................128
Figura 9.1. Perfil cromatográfico da Cianidina-3-O-glucosídeo................................159
Figura 9.2. Perfil cromatográfico da Petunidina-3-O-glucosídeo..............................159
Figura 9.3. Perfil cromatográfico da Peonidina-3-O-glucosídeo...............................160
Figura 9.4. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-glucosídeo................................160
Figura 9.5. Perfil cromatográfico da Delfinidina-3-O-glucosídeo..............................161
Figura 9.6. Perfil cromatográfico da Cianidina-3-O-galactosídeo.............................161
Figura 9.7. Perfil cromatográfico da Petunidina-3-O-arabinosídeo..........................162
Figura 9.8. Perfil cromatográfico da Delfinidina-3-O-arabinosídeo..........................162
Figura 9.9. Perfil cromatográfico da Petunidina-3-O-galactosídeo..........................163
Figura 9.10. Perfil cromatográfico da Cianidina-3-O-arabinosídeo..........................163
Figura 9.11. Perfil cromatográfico da Peonidina-3-O-galactosídeo.........................164
Figura 9.12. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-arabinosídeo..........................164
Figura 9.13. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-xilosídeo.................................165
Figura 9.14. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-galactosídeo...........................165
Figura 9.15. Perfil cromatográfico da Peonidina-3-O-arabinosídeo..........................166
Figura 9.16. Perfil cromatográfico da Delfinidina -3-O- galactosídeo.......................166
Figura 9.17. Perfil cromatográfico da Delfinidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo ..........167
Figura 9.18. Perfil cromatográfico da Malvidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo ...........167
Figura 9.19. Perfil cromatográfico da Cianidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo ............168
Figura 9.20. Perfil cromatográfico da Delfinidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo...........168
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Pontos críticos e dados de segurança para seleção de fluidos (Adaptado
de GUPTA e SHIM, 2007)..........................................................................................41
Tabela 4.1. Análises realizadas em todos as matérias-primas e produtos obtidos das
extrações (Soxhlet, PLE e SFE) e concentrações por membranas...........................64
Tabela 4.2. Planejamento de extrações por PLE e respectivos solventes................76
Tabela 4.3. Condições experimentais de SFE com cossolventes.............................80
Tabela 4.4. Principais propriedades das membranas utilizadas................................83
Tabela 4.5. Planejamento dos processos de concentração por membranas.............84
Tabela 5.1. Características físico-químicas dos resíduos de mirtilo fresco fornecidos
pela empresa Orgânicos Pérolas da Terra..................................................................86
Tabela 5.2. Compostos fenólicos, capacidade antioxidante (DPPH e ABTS) e
antocianinas nos resíduos de mirtilo dos Lotes 1 e 2 fresco, liofilizado e seco em
estufa..........................................................................................................................87
Tabela 5.3. Rendimento e caracterizações (fenólicos totais, capacidade antioxidante
DPPH e ABTS e antocianinas monoméricas) dos extratos obtidos de resíduo de mirtilo
por PLE a 20 MPa ......................................................................................................90
Tabela 5.4. Resultados das análises de fenólicos totais, capacidade antioxidante
DPPH e ABTS e antocianinas monoméricas das amostras extraídas por Soxhlet com
metanol.......................................................................................................................93
Tabela 5.5. Fenólicos totais, capacidade antioxidante DPPH e ABTS e antocianinas
monoméricas dos extratos obtidos por SFE do resíduo de mirtilo fresco
....................................................................................................................................96
Tabela 5.6. Rendimento global, compostos fenólicos, capacidade antioxidante DPPH
e ABTS e antocianinas monoméricas dos extratos obtidos por SFE com cossolventes
e das extrações com resíduo de mirtilo liofilizado e mirtilo fresco macerado, todos
utilizando o Lote 1.......................................................................................................98
Tabela 5.7. Resultados da quantificação de antocianinas por UPLC e pH diferencial
dos resíduos de mirtilo fresco e liofilizado, dos extratos PLE, SFE e mirtilo fresco
macerado..................................................................................................................105
Tabela 5.8. Antocianinas encontradas na uva,amora e mirtilo e antocianinas
encontradas no resíduo de mirtilo e extratos obtidos por PLE e SFE do Lote 1......110
Tabela 5.9. Resultados dos testes preliminares de concentração de extratos de
resíduo de mirtilo em membranas............................................................................112
Tabela 5.10. Umidade, teor de fenólicos totais, capacidade antioxidante, concentração
de antocianinas monoméricas e suas respectivas porcentagens de retenção nas
alimentações, retidos e permeados das concentrações por membranas.................114
Tabela 5.11. Concentrações de antocianinas identificadas por UPLC das amostras do
resíduo de mirtilo, dos retidos e permeados das separações por membranas..........124
Tabela 5.12. Concentrações de antocianinas identificadas por UPLC das amostras do
extrato SFE, dos retidos e permeados das separações por membranas..................125
Tabela 5.13. Fluxos de permeados das concentrações com as membranas NF 10, 30,
90 e 270....................................................................................................................130
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................18
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................22
2.1.Objetivo Geral ................................................................................................22
2.2. Objetivos específicos ...................................................................................22
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................24
3.1. Mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) ...................................................................24
3.1.1. Processos de extraçãode suco de mirtilo ............................................27
3.1.1.1. Despolpamento ..............................................................................27
3.1.1.2. Arraste a vapor ...............................................................................28
3.2. Compostos fenólicos ...................................................................................29
3.2.1. Efeitos dos compostos fenólicos na saúde .........................................31
3.2.2. Taninos ...................................................................................................32
3.2.3. Antocianinas ..........................................................................................33
3.3. Métodos de extração ....................................................................................36
3.3.1. Extração com sistema Sohxlet .............................................................37
3.3.2. Extração com Líquidos Pressurizados ................................................38
3.3.3. Extração supercrítica ............................................................................38
3.4. Tecnologia de Separação em Membranas ..................................................45
3.4.1. Microfiltração, Ultrafiltração e Nanofiltração ......................................48
3.4.2. Fenômenos envolvidos no processo de separação em membranas
...........................................................................................................................51
3.4.3. Parâmetros de controle e eficiência do processo de separação em
membranas ......................................................................................................54
3.4.4. Fluxo de permeado (J) ...........................................................................56
3.4.5. Fator de concentração (FC) ..................................................................56
3.4.6. Pressão aplicada à membrana (PM) ou Pressão transmembrana
(Pt).....................................................................................................................57
3.4.7. Índice de Retenção (IR)..........................................................................57
3.5. Processos Acoplados ..................................................................................58
3.6. Considerações sobre o estado da arte ........................................................60
4. MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................61
4.1. Matérias-primas ........................................................................................... 62
4.2. Limpeza e acondicionamento do resíduo ...................................................62
4.3. Liofilização e secagem em estufa do resíduo produzido pelo processo de
despolpamento (Lote 1) ......................................................................................62
4.4. Caracterização dos resíduos de mirtilo e do mirtilo fresco .......................63
4.4.1. Teor de polifenois totais ........................................................................65
4.4.2. Capacidade antioxidante (AA).............................................................. 66
4.4.2.1. Determinação da capacidade antioxidante total pela captura do
radical livre DPPH .......................................................................................66
4.4.2.2. Determinação da capacidade antioxidante total pela captura do
radical livre ABTS+ ......................................................................................67
4.4.3. Taninos ...................................................................................................68
4.4.4. Determinação do teor de antocianinas pelo método pH diferencial
...........................................................................................................................68
4.4.5. Identificação e e quantificação das antocianinas por UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography) ..........................................................69
4.4.5.1. Materiais e solventes utilizados ....................................................70
4.4.5.2. Identificação das Antocianinas por UPLC-QToF-MS ...................70
4.4.5.3. Separação e quantificação das antocianinas por UPLC ..............72
4.5. Métodos de Extração ....................................................................................72
4.5.1. Extração Soxhlet ....................................................................................73
4.5.2. Extração por PLE (Lote1) .....................................................................74
4.5.3. Extrações por SFE (Lotes 1 e 2) ............................................................76
4.5.4. Extrações por SFE com cossolventes (Lotes 1 e 2) ............................79
4.6. Separação por membranas ......................................................................... 80
4.6.1. Sistemas de filtração ............................................................................ 80
4.6.2. Processos de separação por membranas ........................................... 83
4.6.3. Análises estatísticas ............................................................................. 85
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 86
5.1. Caracterização das matérias-primas ...........................................................86
5.1.1. Características físico-químicas das matérias-primas .......................86
5.1.2. Teor de fenólicos totais, capacidade antioxidante e antocianinas nas
matérias-primas ..............................................................................................87
5.2. Resultado das extrações ............................................................................. 89
5.2.1. Extrações por PLE (Lote1) ....................................................................89
5.2.2. Extração Soxhlet (Lote1) .......................................................................92
5.2.3. Extrações por SFE .................................................................................94
5.2.3.1. Treinamento e ensaios preliminares (Lote 1) ..............................94
5.2.3.2. Cinéticas de SFE (Lote 1)...............................................................94
5.2.3.3. SFE com cossolventes (Lote 1) .....................................................97
5.3. Identificação e quantificação de antocianinas por UPLC (Lote 1) ..........104
5.4. Concentração por membranas ..................................................................111
5.4.1. Resultados dos testes preliminares ...................................................111
5.4.2. Resultados das nanofiltrações de resíduo de mirtilo e do extrato SFE
.........................................................................................................................113
5.4.3. Identificação e quantificação de antocianinas por UPLC (Lote 2) ....122
5.4.4. Fluxo de permeado ..............................................................................127
6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 134
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................. 136
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................137
9. APÊNDICES ....................................................................................................... 159
9.1. Perfis cromatográficos das antocianinas identificadas nos resíduos do
Lote 1, nos extratos de resíduos de mirtilo e nos produtos da nanofiltração
.............................................................................................................................159
9.2. Perfis cromatográficos das antocianinas identificadas no mirtilo fresco
............................................................................................................................. 167
9.3. Atividades realizadas no doutorado ......................................................... 169
18
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento científico a respeito da utilização de produtos naturais com
propriedades funcionais e compostos nutracêuticos na prevenção e/ou tratamento de
doenças tem crescido cada vez mais nos últimos anos. Os benefícios fisiológicos,
nutricionais e medicinais à saúde humana, atribuídos ao uso de produtos naturais,
bem como os potenciais riscos associados à utilização de produtos sintéticos, aliados
às ações legislativas restritivas ao uso desses produtos, têm motivado o significante
aumento no consumo de produtos de origem natural com propriedades funcionais em
detrimento dos produtos sintéticos (CAVALCANTI et al., 2013).
As indústrias cosmética, farmacêutica, alimentícia, têxtil e de perfumaria
utilizam os extratos naturais como aditivos ou insumos, proporcionando diversas
características ao produto final de acordo com as suas funções e aplicações. A maioria
dos extratos naturais possui mais do que uma ou duas funções, podendo ser utilizados
como corantes naturais, nutracêuticos, alimentos funcionais, agentes conservantes,
aromas e fragrâncias, medicamentos, suplementos vitamínicos, padrões químicos,
perfumes, entre outros (HERRERO, CIFUENTES e IBAÑEZ, 2006).
O mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) é uma pequena fruta nativa da América do
Norte, onde é denominada “blueberry”. No Brasil sua cultura ainda é recente e pouco
conhecida, porém as pesquisas sobre esta fruta têm se intensificado cada vez mais
(RASEIRA e ANTUNES, 2004). Do grupo das pequenas frutas que abrange, entre
outras, morango, framboesa e amora preta, o mirtilo é classificado como a fruta fresca
mais rica em antioxidantes já estudada, tendo um conteúdo elevado de polifenóis tanto
na casca quanto na polpa. Sua disponibilidade, versatilidade, e variedade de formas
durante quase todo o ano permitem que o mirtilo seja incorporado em uma ampla
variedade de formulações (PAYNE, 2005).
Os flavonoides se acumulam nas cascas e folhas das plantas porque a sua
síntese é estimulada pela luz. Isso pode explicar a possível diferença de composição
entre frutos de uma mesma planta, ou seja, os frutos que recebem uma maior
quantidade de luz tendem a ter uma síntese pronunciada desses compostos (PRICE
et al., 1995). Dentre os compostos fenólicos, os flavonoides constituem um importante
subgrupo (FENNEMA, 2010). O grupo mais comum dos flavonoides pigmentados
19
consiste das antocianinas, que se caracterizam por um dos grupos de pigmentos mais
largamente distribuídos na natureza (FENNEMA, 1996; TAIZ; ZEIGER, 2004).
As antocianinas são glucosídeos de antocianidinas, também denominadas
agliconas. Seu espectro de cor vai do vermelho ao azul, apresentando-se também
como uma mistura de ambas as cores, resultando em tons de purpura. A coloração
atrativa de muitos frutos, folhas e flores, se deve a estes pigmentos, que se encontram
dispersos nos vacúolos celulares. Dentre as antocianidinas encontradas na natureza,
apenas seis estão presentes nos alimentos: pelargonidina, cianidina, delfinidina,
peonidina, petunidina e malvidina, que diferem entre si quanto ao número de hidroxilas
e à metilação no anel B (FENNEMA, 1993).
Frutas coloridas são fontes potencialmente ricas em diversos fenólicos,
possuindo um papel importante na prevenção do estresse oxidativo (ARTS e
HOLLMAN, 2005). Antocianinas frequentemente são responsáveis por grande parte
do conteúdo fenólico de frutas e vegetais coloridos. Porém, flavanois, procianidinas,
ácidos fenólicos e elagitaninos são os fenólicos mais predominantes em geral
(EINBOND, 2004).
Resíduos de frutas processadas na indústria de alimentos podem
apresentar alto valor comercial e nutricional. O isolamento de substâncias bioativas a
partir destes resíduos apresenta uma alternativa de aproveitamento dos mesmos, o
que pode resultar em novas alternativas empresariais, além de minimizar o impacto
ambiental causado pelo seu acúmulo.
A recuperação de compostos fitoquímicos a partir de resíduos sólidos tem
sido relatada utilizando tecnologias convencionais e alternativas. Como exemplo das
primeiras tem-se: extração pelo método Soxhlet, extração por maceração, por infusão
e por arraste de vapor d’ água; e entre as segundas destacam-se a extração com
fluido supercrítico (SFE – Supercritical Fluid Extraction), extração com líquido
pressurizado (PLE – Pressurized Liquid Extraction) e extração com fluidos
pressurizados assistida com ultrassom.
A SFE vem ganhando cada vez mais espaço na indústria. Na indústria
alimentícia a grande vantagem dos extratos obtidos por esse processo é o fato de
serem de origem natural, não apresentarem resíduo de solvente orgânico e cuja
composição pode ser monitorada. Essa postura das indústrias de alimentos se deve
20
ao fato de os consumidores estarem cada vez mais preocupados com a saúde, o que
tem impulsionado a indústria a disponibilizar no mercado produtos para a prevenção
de doenças (MEIRELES, 2008).
A PLE, também denominada extração acelerada com solventes (ASE –
Accelerated Solvent Extraction), surgiu como uma alternativa para a extração e
fracionamento de produtos naturais, através de uma tecnologia limpa e com a
possibilidade de ajustar parâmetros visando à seletividade do processo para um grupo
de compostos a serem extraídos, o que é uma boa opção para agregar valor a
subprodutos da indústria processadora do mirtilo. A PLE utilizando água como
solvente é um dos métodos mais interessantes, já que a água é atóxica, não
inflamável, barata e ambientalmente segura (WIBOONSIRIKUL, 2008; MONRAD et
al., 2010; OLIVEIRA, 2010). A PLE permite a extração rápida em um ambiente fechado
e inerte em alta pressão e temperatura. Uma grande vantagem da PLE sobre os
métodos convencionais de extração conduzidos em pressão atmosférica é que os
solventes em alta pressão permanecem no estado líquido, mesmo estando
submetidos a temperaturas acima dos seus pontos de ebulição, permitindo, dessa
maneira, trabalhar a altas temperaturas de extração. Estas condições ajudam a
aumentar a solubilidade dos compostos alvo no solvente e a cinética de dessorção
destes a partir de matrizes (SANTOS, 2011).
Nos últimos anos, as separações químicas apresentam um papel crucial
nos processos da indústria química, petroquímica, farmacêutica e de alimentos.
(MARCHETTI, et al., 2014). Os processos de separação em membranas têm atraido
a atenção significativa nas aplicações industriais devido às suas vantagens em
relação aos processos de separações tradicionais, como a destilação e extração. Isto
se deve principalmente ao seu melhor desempenho na separação, o tamanho menor
dos poros, os custos dos equipamentos utilizados e maior eficiência energética
(CHENG, et al., 2014, HILAL, et al., 2004, HERMANS et.al., 2015).
Quando comparada aos processos convencionais, a tecnologia de
separação em membranas apresenta a vantagem de, geralmente, ser aplicada em
temperatura ambiente, favorecendo, portanto, a preservação de nutrientes e
constituintes do sabor, atributos importantes para a qualidade do produto final
(STRATHMANN, 1990).
21
Diante deste contexto, o presente trabalho procurou aplicar as tecnologias
de extração com líquidos pressurizados e fluidos supercríticos para obter extratos
ricos em compostos fenólicos a partir de resíduos de mirtilo do gênero Vaccinum e,
posteriormente, concentrar os compostos bioativos dos extratos por separação em
membranas, viabilizando o seu uso em alimentos e fármacos.
22
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho foi a obtenção de produtos ricos em
antocianinas por extração com fluido supercrítico (SFE) e extração com líquido
pressurizado (PLE) a partir do resíduo de mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) e a posterior
purificação/concentração dos compostos bioativos dos extratos através de separação
por membranas.
O resíduo de mirtilo foi utilizado por apresentar altas concentrações destes
compostos de interesse na indústria de alimentos como corantes naturais. A utilização
de resíduos é uma alternativa interessante, visto que estes subprodutos são
reaproveitáveis.
2.2. Objetivos específicos
a) Avaliar as etapas do pré-processamento dos resíduos de mirtilo: estudo
de métodos de secagem (liofilização e estufa), definição de um método de pré-
processamento a fim de maximizar os rendimentos de SFE, PLE e a concentração
dos compostos fenólicos, capacidade antioxidante e antocianinas.
b) Estudar a extração de componentes funcionais a partir do resíduo de
mirtilo por PLE a temperatura constante, avaliando diferentes combinações de
solventes (água e etanol).
c) Estudar a extração de componentes funcionais a partir do resíduo de
mirtilo por SFE: avaliação do efeito da pressão e da temperatura no rendimento e
qualidade dos extratos obtidos com CO2 puro e usando água e etanol como
cossolventes.
d) A partir da melhor condição de extração, realizar o processo de
nanofiltração nos extratos obtidos e resíduo macerado, simulando um processo
sequencial de extração e concentração por membranas.
23
e) Realizar o processo de nanofiltração nos extratos diluídos em água, água
acidificada (pH = 2,0) e mistura de água e etanol.
f) Caracterizar os extratos, permeados e retidos quanto à concentração de
compostos fenólicos, capacidade antioxidante e antocianinas.
24
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Mirtilo (Vaccinium myrtillus L.)
Do ponto de vista botânico, um “berry” é o tipo mais comum de um fruto
carnudo que amadurece com um pericarpo comestível. O mirtilo é suculento, redondo
e com coloração do azul brilhante a vermelhos intensos. A procura e a disponibilidade
de mirtilos têm aumentado substancialmente nos últimos anos, impulsionado em parte
pelas suas propriedades funcionais (CARDEÑOSA et al., 2016).
O mirtilo é um arbusto perene do gênero Vaccinium, família Ericaceae e é
popular devido ao seu sabor e às quantidades abundantes de antocianinas.
Numerosos estudos foram publicados sobre a composição química e os benefícios
para a saúde com aplicações do mirtilo na alimentação (BARNES et al., 2009). A fruta
mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) está ilustrada na Figura 3.1.
Figura 3.1. A fruta mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) (HEATHER KOLICH. MIRTILO, 2013)
Atualmente, a produção comercial de mirtilos ocorre principalmente na
América do Norte (EUA e Canadá), na Europa (Polônia, Alemanha) e também em
países do Hemisfério Sul (Chile, Argentina, Uruguai, Austrália). Em todas as regiões,
25
a produção de mirtilos tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Entre
1998 e 2011, a produção mundial de mirtilos aumentou significativamente, de 143.704
para 467.048 toneladas (BRAZELTON, 2013; FAO, 2016), devido ao maior consumo
de mirtilos no Hemisfério Norte, impulsionado pela crescente demanda de alimentos
com alto valor nutritivo e nutracêutico.
A tradição do consumo de mirtilo nos EUA e Canadá é grande e faz destes
países os principais importadores da fruta na entressafra, entre setembro e abril.
Nesse período, a grande demanda interna de mirtilos destes países é atendida por
frutos produzidos no Hemisfério Sul, principalmente no Chile, Argentina, e mais
recentemente, no Uruguai. Os mirtileiros do tipo highbush têm apresentado as maiores
produções dentre todas as variedades atualmente cultivadas. A América do Norte é
responsável por 66% da produção mundial de mirtilos tipo highbush, seguida da
América do Sul (21%) e da Europa (11%) (CANTUARIAS-AVILÉS et al., 2014).
Países como Filipinas, Angola, Coreia do Sul, Ucrânia, Romênia, Áustria,
Dinamarca, Holanda, Irlanda, Suécia, Suíça e Inglaterra vêm ganhando espaço no
mercado mundial de produção de mirtilo. Outros países que também estão iniciando
a produção de mirtilos são México, Peru, Colômbia, África do Sul e Brasil. Dos países
produtores emergentes, a África do Sul foca sua produção no mercado europeu e com
isso, concorre com a produção brasileira de mirtilos, sendo que o país tem tradição na
produção e comercialização de frutas de qualidade para esse mercado (BRAZELTON,
2013). Brazelton (2013) também menciona que o aumento na produção mundial de
mirtilos é motivado pelo crescente aumento na demanda, incentivada por campanhas
de promoção do consumo nos EUA, Canadá e na Europa, conduzidas por empresas
privadas e organizações governamentais. Com isso, os operadores comerciais de
mirtilos também promovem campanhas de divulgação da fruta nos mercados
asiáticos, principalmente na China, Japão, Coreia e Taiwan, e também nos países
escandinavos.
A cultura do mirtilo foi introduzida na década de 1980 no Brasil,
especificamente no Rio Grande do Sul. Motivada pela crescente demanda mundial e
pelos preços altos da fruta fresca na Europa, a expansão do cultivo na região sul do
Brasil se iniciou somente na década de 2000. Porém, comparado a outros países
produtores do Hemisfério Sul, o Brasil conta com importantes vantagens para a
26
exportação de mirtilos frescos, como a possibilidade de produção precoce na
entressafra do Hemisfério Norte, a proximidade dos mercados europeus e a
disponibilidade de água e terras aptas para o cultivo do mirtilo (CANTUARIAS-
AVILÉS, 2010). Entre 2003 e 2009, tanto o volume como o valor das importações e
exportações brasileiras de mirtilo aumentaram significativamente. Atualmente, as
plantações de mirtilo estão concentradas nos Estados do Rio Grande de Sul, Santa
Catarina, Paraná, São Paulo e Minas Gerais. Apesar de não existirem estatísticas
oficiais atualizadas, estima-se que a área plantada com mirtilos no Brasil seja de
aproximadamente 400 hectares. A produção de mirtilos no Brasil ocorre
principalmente em pequenas propriedades, com poucos empreendimentos em grande
escala. A tecnologia utilizada por pequenos produtores brasileiros tem sido adaptada
de outros países, por se tratar de uma cultura ainda desconhecida.
As variedades do tipo Rabbiteye são a maior parte dos mirtileiros plantados
no Sul do Brasil, que são variedades antigas e de mediana exigência de frio hibernal,
com bom desempenho para os fruticultores locais. Nos últimos 10 anos, tem-se
iniciado o plantio de variedades mais antigas do tipo Southern Highbush como 'Misty'
e 'O'Neal', introduzidas na década de 2000 a partir de mudas micropropagadas,
importadas do Uruguai. Essas variedades apresentam menor exigência em frio
hibernal, sendo destinadas à produção precoce da fruta, nos meses de outubro e
novembro, visando atingir melhores preços nos mercados externos. Estas variedades
precisam de pelo menos 100 horas de frio hibernal para produzir e, portanto, não têm
boa adaptação em regiões de clima quente. (CANTUARIAS-AVILÉS et al., 2014).
A introdução de recentes variedades e estudos fitotécnicos confirma o
grande potencial produtivo das plantas do mirtileiro e a alta qualidade dos frutos, que
possibilita a expansão do cultivo para regiões sem frio e permite a inclusão como uma
alternativa interessante de diversificação produtiva para a fruticultura nacional.
(CANTUARIAS-AVILÉS et al., 2014).
O consumo do mirtilo é favorecido por suas cores e conteúdo elevado de
pigmentos naturais, como compostos fenólicos de natureza antociânica, que
apresentam capacidade de absorção de radicais de oxigênio, atuando como
antioxidantes naturais (WANG et al., 2000). O mirtilo também contém outros
compostos, tais como elagitaninos, os quais também apresentam um efeito preventivo
27
do câncer. Os pigmentos de origem antociânica do mirtilo nativo europeu (Vaccinum
myrtillus) têm sido largamente utilizados no melhoramento da acuidade visual e no
tratamento de desordens circulatórias (SKREDE et al., 2000).
Wang et al. (2015) associaram estes benefícios com o aumento na
propagação do mirtilo ao redor do mundo. No entanto, concluem que há uma grande
quantidade de resíduos sendo descartados e explorar seu conteúdo de nutrientes e
suas aplicações seria benéfico tanto para a agricultura como para a indústria.
3.1.1. Processos de extração de suco de mirtilo
O suco é um dos mais importantes derivados do mirtilo, porém o
processamento tradicional apresenta elevadas perdas de compostos nutracêuticos
durante a extração, dentre eles estão o despolpamento e o arraste a vapor. A técnica
de arraste a vapor é mais comumente utilizada, porém as altas temperaturas podem
degradar os compostos sensíveis ao calor como, compostos fenólicos e antocianinas.
A escolha da melhor técnica para obtenção do suco de mirtilo e
consequentemente do resíduo, depende das características do produto que se deseja
obter e também do custo de processamento. O conhecimento destas técnicas é
importante a fim de obter um produto de melhor qualidade (KECHINSKI, 2011).
3.1.1.1. Despolpamento
Para obter o suco de uma determinada fruta, é necessário fazer um
processo de extração que, consequentemente, gera resíduos como o material
estudado neste trabalho. O processo de despolpamento, em geral, ocorre em dois
estágios. No primeiro, faz-se a retirada da casca e/ou sementes (as sementes são
retiradas inteiras, pois a sua desintegração pode conferir sabor indesejável ao
produto). No segundo momento, refina-se a polpa. No estágio de refinamento, a polpa
passa por peneiras com furos de diâmetros diferentes e específicos para cada caso.
Com a goiaba, por exemplo, peneiras com furos da ordem de 0,060 a 0,045 polegadas
28
são suficientes para reter as sementes inteiras. No caso da manga, a mesma peneira
separa grande porção das fibras existentes. Para o mirtilo, utiliza-se despolpador
horizontal com peneira acoplada.
3.1.1.2. Arraste a vapor
O método de arraste a vapor é uma derivação do Método Welch,
considerado o primeiro processo de extração através do calor. O Método Welch foi
desenvolvido em 1869, quando um dentista, Dr. Thomas Welch, cozinhou uvas do
cultivar Concord e utilizou sacos de pano para extrair o suco, em seguida o engarrafou
e utilizou a pasteurização para a conservação (MARZAROTTO, 2010). O método de
extração por arraste a vapor está muito difundido nas propriedades rurais do Estado
do Rio Grande do Sul, tanto para produção de suco de mirtilo para consumo próprio,
como para comercialização.
O conjunto extrator é formado por um depósito de água, que é aquecido
para geração do vapor, sobre o qual é colocado um recipiente com abertura cônica no
centro para passagem do vapor e uma abertura lateral para escoamento do suco e
acima é sobreposto um recipiente perfurado onde os frutos são colocados. Para
obtenção do suco pode-se utilizar apenas uma panela, ou é possível dispor um maior
número de panelas em série, reduzindo o tempo de processamento. O rendimento
neste processo fica entre 50 e 60% em relação ao máximo de suco extraível (RIZZON
et al., 1997).
Mesmo sendo o método mais utilizado por obter maior rendimento de
extração, com o calor do processamento os compostos fenólicos se perdem, em
grande parte devido à degradação das antocianinas. Consequentemente, tanto o suco
quanto os resíduos gerados pelo processo de arraste a vapor apresentam degradação
dos compostos termossensíveis, que são objeto de interesse neste trabalho. Venturin
(2004) realizou diversos tratamentos com e sem controle de temperatura na extração
de suco de uva pelo método de arraste a vapor e concluiu que na temperatura mais
baixa (60 ºC) e acima de 85 ºC, os sucos apresentam aromas desagradáveis e gosto
29
ruim, com pouca acidez; o tratamento a 80 ºC apresentou os melhores resultados na
análise sensorial.
3.2. Compostos Fenólicos
Os mirtilos apresentam grandes quantidades de polifenóis comparados aos
demais frutos silvestres. Os estudos se intensificam principalmente nas quantidades
de compostos fenólicos e capacidade antioxidante. No entanto, pouco é relatado no
desenvolvimento destes compostos durante o processo de maturação dos frutos, bem
como durante e a pós-colheita.
A maturação e o amadurecimento de mirtilos são acompanhados por
alterações fisiológicas características, que incluem mudança de cor, amolecimento do
tecido, aumento do índice de maturidade, etc. Durante as diferentes fases fisiológicas
do fruto, a mudança no perfil dos compostos fenólicos consiste, no aumento de
antocianinas durante o amadurecimento, enquanto os teores de flavonóis e ácidos
hidroxicinâmico diminuem (EICHHOLZ et al., 2015).
Os compostos fenólicos são largamente distribuídos no reino vegetal,
fazendo parte da composição da dieta de forma significativa, e são particularmente
importantes como agentes profiláticos e também pelo seu efeito plurifarmacológico
(BAHORUN et al., 2004; SOOBRATTEE et al., 2005). São classificados em dois
grandes grupos, os flavonoides e os não flavonoides.
Os flavonoides representam o maior grupo de polifenóis encontrados em
alimentos, além de serem considerados os mais potentes antioxidantes entre os
compostos fenólicos (SHAHID et al., 1992; SOOBRATTEE et al., 2005). Os
flavonoides se acumulam nas cascas e folhas das plantas porque a sua síntese é
estimulada pela luz. Isso pode explicar a possível diferença de composição entre
frutos de uma mesma planta. Isto é, os frutos que recebem uma maior quantidade de
luz tendem a ter uma síntese pronunciada desses compostos (PRICE et al., 1995).
Os flavonoides são responsáveis por uma grande variedade de cores
presentes em vegetais, flores, frutas e produtos derivados. Oriundos do metabolismo
secundário das plantas, ambos compostos são de grande importância para sua
sobrevivência, e quando ingeridos são responsáveis por diversos benefícios à saúde
30
devido às suas atividades biológicas. Entre tais benefícios encontram-se a redução
da incidência de muitas doenças oxidativas, inflamatórias, entre outras
(REYNERTSON et al., 2008; ARTS; HOLLMAN, 2005). A Figura 3.2 apresenta a
estrutura base dos flavonoides.
Figura 3.2 - Estrutura base dos flavonoides. (REIN, 2005)
Considerados compostos secundários produzidos por plantas, os
compostos fenólicos apresentam pelo menos um grupo fenol. Apresentam atividade
de proteção contra o estresse oxidativo por meio da capacidade de atuar como
sequestrador de radicais livres e na quelação de metais de transição. Sua estrutura
química, tipo e grau de metoxilação e número de hidroxilas são alguns parâmetros
que qualificam sua atuação como agentes redutores. (SANTOS et al., 2016).
Wright et al. (2008) fizeram estudos epidemiológicos e estabeleceram que
os polifenóis, principalmente o ácido fenólico e flavonoides presentes nas frutas, são
eficazes na redução do risco de doenças crônico-degenerativas. Já Simon-Graoa et
al. (2014) afirmam que os polifenóis são metabólitos de plantas e participam em
funções metabólicas, incluindo a assimilação de nutrientes e formação de
componentes estruturais na defesa contra condições ambientais adversas.
A ação dos compostos fenólicos reduz o risco de câncer, doenças
cardiovasculares e problemas associados ao envelhecimento (LEONG & SHUI, 2002).
Porém, a composição dos polifenóis e as quantidades presentes na fruta determinam
a eficiência de sua atividade contra os radicais livres. Muitos estudos sugerem que a
composição e o conteúdo de polifenóis nas frutas variam de acordo com a cultivar,
condições ambientais, localização e fatores agronômicos (NACZK & SHA HIDI, 2006).
31
Os fatores que proporcionam a degradação oxidativa destes pigmentos
naturais são a luz, temperatura, pH, entre outros, limitando não só a sua aplicação
final, mas também restringindo toda a cadeia do processo, desde a escolha do método
de extração do pigmento da fonte vegetal até o tratamento que o produto final irá sofrer
após a sua formulação, passando pela escolha do método de redução do tamanho
(micronização) e/ou encapsulação das partículas visando à melhora da taxa de
dissolução, biodisponibilidade e estabilidade destes compostos (SANTOS e
MEIRELES, 2009).
Dentro da classe de compostos fenólicos estão as antocianinas, que têm
atraído cada vez mais atenção devido a sua capacidade antioxidante. As antocianinas
presentes nos extratos de plantas promovem a redução do stress oxidativo, prevenção
de algumas doenças inflamatórias, prevenção de doenças cardíacas, proteção contra
a obesidade e hipoglicemia; melhoria da memória e a proteção de tecido cerebral fetal
(DE BRITO et al., 2007).
3.2.1. Efeitos dos Compostos Fenólicos na Saúde
A autoxidação em alimentos e em sistemas biológicos tem diversas
implicações não somente para a grande área da ciência e da tecnologia de alimentos,
mas também para o estado nutricional e para a saúde humana (MADHAVI et al.,
1996). Madhavi et al. (1996) ainda afirma que, nos sistemas celulares, a peroxidação
lipídica leva à produção de radicais livres. Este sistema biológico é dotado de
mecanismos de inativação desses radicais livres, pela ação de enzimas endógenas e
quando ocorre um desequilíbrio entre a produção de radicais livres, induz-se o
estresse oxidativo que pode ser ocasionado ou pela queda de ação do sistema
enzimático ou pelo excesso de produção de espécies radicalares. O estresse oxidativo
está diretamente relacionado a diversos distúrbios do organismo como doenças
coronárias, aterosclerose, câncer e processos de envelhecimento e de doenças
degenerativas.
Antioxidantes naturais ou sintéticos têm sido amplamente estudados e têm
um papel importante na prevenção ou retardamento das reações de autoxidação. Os
antioxidantes naturais são, principalmente, compostos fenólicos ou polifenólicos,
32
sendo que os mais comuns são os tocoferóis, flavonoides e compostos relacionados
como cumarinas, derivados do ácido cinâmico e chalconas, diterpenos fenólicos e
ácidos fenólicos que estão presentes nos extratos de plantas e de frutos
(OREOPOULOU, 2003).
Recentemente, a literatura indica que frutos com maior teor de cianidina,
como framboesas pretas e mirtilos, são mais susceptíveis a produzir um efeito anti-
inflamatório. Esta observação pode ser verdadeira considerando a hipótese de que
um ou mais metabolitos estáveis de ácido fenólico contribuem para os efeitos anti-
inflamatórios de frutas ricas em antocianinas. Com isso, são necessários mais
estudos, mas pode-se concluir que frutas ricas em cianidina, peonidina ou
pelargonidina têm melhores efeitos anti-inflamatórios (FANG, 2015).
Pesquisas com base populacional revelaram uma associação entre
antocianinas e a redução da incidência de doenças cardiovasculares, diabetes
mellitus e câncer (LIU et al., 2014; WANG et al., 2014). Estudos mostraram uma
melhora nos quadros clínicos de indivíduos que ingerem frutas e/ou alimentos ricos
em antocianinas. (JOSEPH, et al., 2014). Em estudos realizados com seres humanos,
menos que 0,1% das antocianinas são excretadas na urina. A literatura sugere que a
baixa biodisponibilidade de algumas antocianinas no organismo está relacionada ao
seu metabolismo pré-sistêmico e não com a má absorção do lúmen gastrointestinal
(FANG, 2014).
3.2.2. Taninos
Distribuídos em muitas espécies de plantas, os taninos são metabólitos
secundários amplamente sintetizados. Desempenham um papel na regulação do
crescimento das plantas e também na proteção contra a predação, por caracterizar
uma adstringência nos tecidos vegetais, tornando-os não comestíveis. Os taninos são
divididos em quatro grupos, sendo os dois maiores: os taninos condensados ou
proantocianidinas e os taninos hidrolisáveis (KY et al., 2016).
Os taninos hidrolisáveis liberam ácidos fenólicos por hidrólise ácida: gálico,
caféico, elágico e um açúcar (SGARBIERI, 1996). Esses ácidos fenólicos, assim como
33
os demais compostos fenólicos existentes em diversos vegetais, apresentam
capacidade antioxidante, a qual é considerada uma importante função fisiológica.
Considerados como compostos fenólicos solúveis em água, os taninos
apresentam alta massa molecular, e contêm grupos hidroxila fenólica capazes de
complexar e precipitar proteínas em soluções aquosas (SILVA e SILVA, 1999). Podem
ter sua concentração variando de acordo com os tecidos vegetais, bem como em
função da idade e tamanho da planta, da parte coletada, da época ou, ainda, do local
de coleta (MONTEIRO et al., 2005).
Além de moléculas mais simples como os ácidos fenólicos e os flavonoides,
os taninos são encontrados em muitas frutas, sendo caracterizados como compostos
fenólicos de alta massa molecular, que precipitam proteínas, incluindo proteínas
salivares da cavidade oral. Essas propriedades são fundamentais para explicar o
papel dos taninos na proteção vegetal contra patógenos e na detenção de herbívoros
que se alimentam destas plantas.
3.2.3. Antocianinas
O grupo mais importante de pigmentos hidrossolúveis encontrados na
natureza é o das antocianinas (do grego anthos, flor, e kyanos, azul) sendo
responsáveis por cores que vão desde laranja, passando pelo vermelho e violeta até
azul-escuro de muitas flores, frutos, folhas, raízes e caules comumente encontrados
na natureza (DELGADO-VARGAS et al., 2000; ANDERSEN e JORDHEIM, 2006).
Pertencentes ao grupo dos flavonoides, caracterizadas pela estrutura
básica C6-C3-C6 (WILSKA-JESZKA, 2006), as antocianinas são constituídas de
derivados polimetil e/ou polihidroxi glicosilados do núcleo básico flavílio (cátion 2-
fenilbenzopirílio) (Figura 3.3) (BROUILLARD, 1982), e contêm ligações duplas
conjugadas responsáveis pela absorção de luz em torno de 500 nm, caracterizando a
cor típica destes pigmentos (REIN, 2005).
34
Figura 3.3 - Estrutura química do cátion flavílio (REIN, 2005).
A estrutura básica das antocianinas (Figura 3.4) é constituída por uma
aglicona (antocianidina), um grupo de açúcares e um grupo de ácidos orgânicos
(FRANCIS, 1989). Aproximadamente 22 agliconas são conhecidas, das quais 18
ocorrem naturalmente e apenas seis (pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina,
petunidina e malvidina) são importantes em alimentos (FRANCIS, 2000; MALACRIDA
e MOTTA, 2005).
As diferenças entre as antocianinas resultam do número de grupos
hidroxilas na molécula, do grau de metilação desses grupos, da natureza e do número
de açúcares ligados à molécula e também, da posição da ligação e da natureza e do
número de ácidos alifáticos e aromáticos ligados aos açúcares na molécula (Figura
3.4) (GUEDES, 2004).
Figura 3.4. Estrutura das antocianinas (GUEDES, 2004).
As antocianinas contribuem para a cor de flores e frutas e atuam como filtro
das radiações ultravioleta nas folhas. Em algumas espécies de plantas, as
35
antocianinas estão associadas à resistência aos patógenos e atuam melhorando e
regulando a fotossíntese (MAZZA e MINIATI, 1993). Existem aproximadamente 400
diferentes antocianinas (KONG, 2003). Contudo, sua maior aplicação é como corante
natural em produtos alimentícios, cosméticos, fármacos, tecidos, tintas, dentre outros.
Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros,
desencadeiam a degradação oxidativa das antocianinas, que são mais estáveis em
meios ácidos do que em alcalinos. A natureza da estrutura iônica das antocianinas
possibilita mudanças na estrutura molecular de acordo com o pH, resultando em
diferentes cores. Em pH abaixo de 3, a antocianina cianidina-3-glicosídeo, por
exemplo, existe primariamente como uma estrutura molecular que resulta na cor
vermelha. Aumentando o pH do meio, novas formas moleculares são produzidas,
resultando em cores que vão desde o violeta a uma forma incolor. Han et al. (2009)
sugerem que a degradação da cianidina-3-glicosídeo se inicia devido à facilidade de
se hidrolisar o grupo glicosídeo ligado à estrutura base.
Devido às suas propriedades de promoção de saúde, tais como efeitos
antioxidantes e anti-inflamatórios, as antocianinas presentes nos alimentos têm
recebido atenção considerável (BOWEN-FORBES et al., 2010 e LIM et al., 2013). As
antocianinas predominantes nos alimentos são a malvidina, a delfinidina, e a
peonidina (BOGNAR et al., 2013), podendo ser encontradas em muitos vegetais,
incluindo as berries, batata roxa e derivados da uva.
Além da identificação dos tipos de antocianinas presentes nos extratos, a
determinação da sua concentração, bem como de outros compostos co-extraídos, é
de extrema importância, pois elas estão associadas às funções biológicas destes
produtos. Para a determinação da concentração de antocianinas nos extratos, os
métodos baseados nas transformações estruturais das antocianinas em função do pH,
gerando soluções coloridas, têm propiciado resultados confiáveis, sendo o método do
pH diferencial descrito por Giusti e Wrolstad (2001) um dos mais utilizados.
Outro método para identificação e quantificação de antocianinas é a
cromatografia líquida de ultra-alta pressão (UPLC - Ultra Performance Liquid
Chromatography), uma tecnologia recente que combina a utilização de colunas com
partículas de diâmetro menor do que 2 mm e instrumentação que permitem operar
com altas pressões da fase móvel (6.000 – 15.000 psi), o que possibilita diminuição
36
significativa do tempo de análise em comparação com a cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) convencional. Esta é uma importante vantagem na análise de
extratos vegetais complexos em medicamentos fitoterápicos ou em programas de
triagem para busca de substâncias bioativas (“high throughput screening”) em extratos
vegetais (YARIWAKE et.al., 2006).
3.3. Métodos de extração
Existem vários métodos de obtenção de extratos de vegetais, utilizando
vários solventes, empregando ou não altas pressões e temperaturas ou até mesmo
associando métodos no intuito de obter um ou mais extratos com perfil fitoquímico
desejável, com alto rendimento e que não possua características indesejáveis como
a presença de compostos co-extraídos como ceras e clorofila e a presença residual
de solventes (BRAGA, 2005).
De acordo com Tzia e Liadakis (2003) e Velasco et al. (2007), os processos
de extração consistem na separação de determinados compostos a partir de uma
matriz através de processos químicos, físicos ou mecânicos. O estado de agregação
da matriz resulta em três tipos básicos de processos extrativos: extração sólido-
líquido, extração líquido-líquido e extração gás-líquido.
Comumente, métodos convencionais como Soxhlet, agitação, percolação
em leito fixo, entre outros, são utilizados nos processos de extração de antocianinas.
Entretanto, estes métodos geralmente consomem muito tempo, grande quantidade de
solventes e podem degradar estes compostos durante o processo. Segundo Pinedo
(2007), a hidrólise completa dos açúcares ligados a antocianinas, que propiciam maior
estabilidade destes pigmentos após a extração, ocorre em uma hora a 40 oC na
presença de etanol acidificado com 1% de HCl.
Extrações convencionais e não convencionais são aplicadas para a
obtenção de compostos de alto valor agregado. As tecnologias não convencionais
representam uma ferramenta promissora para recuperar compostos de alto valor
agregado a partir de resíduos ou subprodutos. No entanto, vários parâmetros
influenciam na escolha da tecnologia utilizada para recuperar estes compostos, tais
37
como a matriz a ser processada, a seletividade, o consumo de energia, o custo do
equipamento e o valor do extrato (BARBA et al., 2016).
3.3.1. Extração com sistema Soxhlet
A extração Soxhlet é considerada uma das técnicas mais populares para
extração de analitos a partir de materiais sólidos. Desde a sua descoberta em 1879,
a técnica tem sido rotineiramente aplicada em quase todos os laboratórios de análises.
Atualmente, a extração Soxhlet continua sendo uma técnica padrão para efeito de
comparação com as técnicas não convencionais (ZYGLER et al., 2012).
A extração Soxhlet, assim como a maceração e a percolação, tem sido
usada com finalidades diferentes durante décadas. Considerando a eficiência destes
métodos tradicionais, os mesmos são descritos como processos de extração química
universal. No entanto, estes métodos requerem grandes tempos de extração e
quantidades de solventes (HELENO et.al, 2016).
A extração Soxhlet utiliza o refluxo de solvente em um processo
intermitente. O solvente é inicialmente aquecido e o vapor gerado pelo aquecimento
é condensado. O solvente no estado líquido cai no cilindro confeccionado de papel de
filtro, no qual se encontra a amostra, e o enche lentamente. A solubilização das
substâncias a serem extraídas da amostra ocorre até se preencher totalmente cilindro.
Em seguida, a mistura de solvente e extrato é sifonada para o balão onde o solvente
se encontrava inicialmente. O processo se reinicia até que a extração seja completa.
Xu et al. (2010) determinaram que 60% do óleo da semente de amora preta
é encontrado no embrião e endosperma, enquanto 90% dos compostos fenólicos são
encontrados no tegumento da semente. Também reportaram que o rendimento da
extração de compostos fenólicos com etanol em sistema Soxhlet é menor ao obtido
por extração em leito agitado, porém a capacidade antioxidante parece não ser
afetada pelas temperaturas elevadas de extração.
38
3.3.2. Extração com líquidos pressurizados
A fim de extrair determinados compostos de matrizes sólidas ou semi-
sólidas com pouca quantidade de solvente em um curto tempo, a extração com
líquidos pressurizados (PLE - Pressurized Liquid Extraction) se baseia na utilização
de solventes submetidos a alta temperatura e pressão (HUIE, 2002). O método PLE
emprega menor volume de solvente que as extrações convencionais (Soxhlet, etc.) e
é mais rápido (o tempo de extração varia entre 10 e 20 minutos). Setyaningsih et al.
(2016) afirmam que a eficiência da PLE, depende da temperatura de extração,
pressão, tempo e do solvente utilizado. A extração deve ser realizada utilizando uma
adequada relação de solvente/amostra a fim de proporcionar uma força motriz
suficiente para ocorrer a transferência do analito.
Além dos solventes comumente utilizados nos processos de PLE, como
metanol, etanol, isopropanol, acetona, hexano, éter dietílico, a água tem sido cada vez
mais utilizada na extração de compostos fenólicos, como ácidos fenólicos e
flavonoides, devido à sua alta polaridade, constante dielétrica e capacidade de
intumescimento (ONG et al., 2006; HERRERO et al., 2006). A extração com água
pressurizada normalmente utiliza temperaturas acima do seu ponto de ebulição
normal e, por esta razão, o processo é mais conhecido como extração com água
quente pressurizada (PHWE - Pressurized Hot Water Extraction) ou extração com
água subcrítica (SWE - Subcritical Water Extraction). O aumento da temperatura
acarreta em diminuição da polaridade aparente da água. Dessa maneira, para a
extração de compostos relativamente polares, bons rendimentos podem ser obtidos
em torno de 100 °C enquanto que para compostos menos polares temperaturas acima
de 200 °C devem ser utilizadas (HERRERO et al., 2006).
3.3.3. Extração supercrítica
Um método de extração é considerado ideal quando é rápido, tem
rendimento de recuperação quantitativa sem degradação e os extratos são facilmente
separados a partir do solvente. É interessante o desenvolvimento e aplicação de
tecnologias alternativas para substituir os métodos convencionais de extração com
39
melhor eficiência de extração e baixo impacto ambiental para a determinação de
compostos bioativos naturais, e a tecnologia de fluidos supercríticos oferece recursos
que superam as limitações dos métodos convencionais de extração (DA SILVA et al.,
2016).
Fluidos são supercríticos quando comprimidos acima de sua pressão crítica
(Pc) e aquecidos acima de sua temperatura crítica (Tc). Perto da região crítica,
pequenas mudanças na pressão podem dar origem a grandes variações na
densidade. Além da densidade, a difusividade em fluidos supercríticos é muito maior
do que em solventes líquidos, e pode ser facilmente alterada. A viscosidade típica de
fluidos supercríticos é da ordem de 10-4 g/cm.s, cerca de 100 vezes menor que a de
líquidos. A combinação de alta difusividade e baixa viscosidade proporciona equilíbrio
rápido e penetração do solvente nos microporos de uma matriz (GUPTA e SHIM,
2007). Estas propriedades tornam altas as taxas de extração e rendimentos da SFE,
uma vez que as altas densidades conferem grande poder de solvatação, enquanto as
baixas viscosidades combinadas com difusividades intermediárias resultam em alto
poder de penetração na matriz sólida (AGHEL, 2004).
O diagrama de fases de um composto puro pode ser representado pela
Figura 3.5, na qual se destacam as regiões subcrítica e supercrítica.
40
Figura 3.5: Diagrama de fases de um composto puro. (Adaptado de BRUNNER,
1987).
No processo de extração com fluidos supercrítcos (SFE – Supercritical
Fluid Extraction) a partir de sólidos, o solvente escoa através de um leito fixo
constituído pelas partículas da matéria prima, solubilizando componentes nela
presentes. O esgotamento do sólido ocorre na direção do escoamento, enquanto a
concentração de extrato na fase solvente aumenta na mesma direção. O solvente
atravessa o leito fixo, saindo carregado de soluto e, após a saída do extrator passa
através de uma válvula de expansão, passando ao estado gasoso e, finalmente, o
soluto é coletado (BRUNNER, 1987; REVERCHON e DE MARCO, 2007).
O dióxido de carbono (CO2) é amplamente empregado como fluido
supercrítico por não ser inflamável, ser atóxico e por sua temperatura crítica ser
moderada (Tc 31 C ). Assim, grande parte da atenção na tecnologia de fluidos
supercríticos tem sido dada ao CO2 (GUPTA e SHIM, 2007). O CO2 também apresenta
outras vantagens, como: ser seguro, abundante, de baixo custo e permitir operações
de SFE em pressões relativamente baixas em relação a outros solventes supercríticos
e em temperaturas próximas à ambiente, conforme mostrado na Tabela 3.1
(VASAPOLLO et al., 2004).
REGIÃO
SUBCRÍTICA
41
Tabela 3.1: Pontos críticos e dados de segurança para seleção de fluidos
(adaptado de GUPTA e SHIM, 2007)
Fluido Tc (K) Pc (bar) Riscos à segurança e
informações relevantes
Etileno 282,4 50,4 Gás inflamável
Trifluorometano (Fluorofórmio ou Freon 23)
299,1 48,2 Superexposição a inalação causa asfixia
Clorotrifluorometano (Freon 13) 301,8 38,8 Superexposição a inalação causa confusão, tontura e dor de cabeça
Etano 305,4 48,8 Gás inflamável
Dióxido de Carbono 304,1 73,8 Solvente GRAS pode causar tontura e sonolência se inalado em excesso
Monóxido de dinitrogênio (gás do riso)
309,6 72,4 Não combustível, mas favorece a combustão de outras substâncias
Hexafluoreto de Enxofre 318,1 37,6 Superexposição a inalação causa asfixia
Clorodifluorometano (HCFC 142b) 410,2 40,5 Combustível sob condições específicas
Propano 369,8 42,5 Extremamente inflamável
Amônia 405,4 113,0 Inflamável e Tóxico
Éter dimetílico (éter de madeira) 400,0 52,4 Extremamente inflamável
Triclorofluorometano (Freon 11, R11) 471,2 44,1 Agride a camada de ozônio
Isopropanol 508,3 47,6 Altamente inflamável
Ciclohexano 553,8 40,7 Altamente inflamável
Tolueno 591,8 41,0 Altamente inflamável
Água 647,3 221,2 Solvente GRAS
Devido a sua natureza apolar, o CO2 dissolve preferencialmente compostos
apolares. Entretanto, substâncias de alta polaridade também podem ser extraídas
com CO2 supercrítico em altas densidades (altas pressões) e/ou pelo emprego de
cossolventes, com os quais é possível aumentar o espectro de substâncias solúveis
no CO2 (VASAPOLLO et al., 2004).
42
A seletividade é uma das principais vantagens da SFE e pode ser
controlada mediante o ajuste das condições de temperatura e pressão do processo
dentro da região supercrítica. A definição das condições de extração indica o poder
de solvatação do solvente e, quanto maior o poder de solvatação, maior a solubilidade
de um determinado composto, assim como o número de compostos solubilizáveis de
uma mistura. Desta forma, a alta solubilidade resulta em baixa seletividade e vice-
versa (FRANÇA et al., 1999; BRUNNER, 1987), sendo que a definição da seletividade
do solvente ou de misturas de solventes pelas condições de processo determinam a
qualidade dos extratos.
Alguns parâmetros importantes na SFE são vazão de solvente, tamanho
de partícula de sólido e tempo de extração. Outros fatores determinantes do processo
de extração são o poder de solubilização e a seletividade do solvente quanto aos
componentes de interesse e à capacidade de difusão destes no fluido supercrítico. A
seleção correta destes parâmetros é crucial para a otimização da extração dos
compostos desejados em menor tempo (REVERCHON e DE MARCO, 2007).
A SFE tem muitas vantagens quando comparada aos métodos
convencionais de extração. Além de o solvente poder ser facilmente removido do
soluto através da redução da pressão e/ou ajuste da temperatura, o processo requer
menor energia com rápida extração devido à baixa viscosidade, alta difusividade e
adequado poder de solvatação do fluido supercrítico. Além disso, a SFE usa pouco
ou nenhum solvente orgânico, por isso é considerada como uma tecnologia segura e
ecologicamente correta, pois industrialmente, o CO2 é recirculado no sistema
(VASCONCELLOS, 2007).
A molécula de CO2 é apolar, com uma pequena polaridade devido à
presença de um momento quadrupolar. O CO2 supercrítico pode ser descrito como
solvente hidrofóbico com polaridade comparável à do n-hexano. Assim, moléculas
apolares ou leves são facilmente dissolvidas em CO2 supercrítico, enquanto
moléculas polares ou pesadas (por exemplo, polímeros, corantes, ácidos graxos
alifáticos e seus ésteres, ácidos aromáticos, proteínas, complexos de metal, etc.) têm
baixa solubilidade. Alguns compostos orgânicos leves, polares ou apolares podem ser
usados como cossolventes para aumentar o poder de solvatação e polaridade do CO2
(GUPTA e SHIM, 2007). O CO2 supercrítico tem sido utilizado industrialmente em
43
vários processos, incluindo descafeinização de café e chá, extração de ácidos graxos
a partir de cevada e especiarias, além da extração de aromas (óleos essenciais) e
óleos (GUPTA e SHIM, 2007).
É importante salientar que as propriedades lipofílicas do CO2 no estado
supercrítico tornam este solvente inadequado para a extração de compostos polares,
tais como compostos fenólicos glicosilados. No entanto, a adição de pequenas
quantidades de cossolventes, tais como água ou etanol (< 5% w/w) pode aumentar a
polaridade do CO2 supercrítico, melhorando a solubilidade de compostos mais
polares. Nestas condições, o sistema se apresenta em duas fases no estado
subcrítico (REVERCHON e DE MARCO, 2006; CAMPARDELLI et al., 2015). Com
isso, a utilização de água como cossolvente apresenta como vantagens menor custo
de processo e impacto ambiental, além da facilidade de manuseio (MEIRELES, 2003).
Campos (2005) utilizou etanol como cossolvente a 10, 15 e 20% (m/m) para
condição operacional de 15 MPa e 40 ºC, a fim de melhorar o perfil de composição o
rendimento da SFE do óleo de bagaço de uva Cabernet Sauvignon. Utilizando CO2
puro, um rendimento de 2,39% foi obtido, enquanto que ao adicionar etanol 15% (m/m)
o rendimento passou para 9,20%. Kitzberger et al., (2009) empregou etanol,
diclorometano e acetato de etila como cossolventes na SFE de óleo de cogumelo
shiitake (Lentinula edodes) a 20 MPa e 40 ºC, visando à extração de compostos
antioxidantes. Ao utilizar CO2 puro foi obtido rendimento de 0,65%, e ao adicionar
etanol 15% (m/m) o rendimento passou para 3,81%.
Já Babova et al. (2016) extraíram antocianinas do mirtilo por CO2
supercrítico seguido por CO2 subcrítico com 10% v/v de etanol como cossolvente.
Compostos fenólicos e antocianinas foram quantificados e caracterizados
quimicamente por meio de HPLC-DAD-ESI-MS/MS. Foram extraídas cianidina-3-O-
glucosídeo e cianidina-3-O-arabinosídeo com CO2 no estado subcrítico. Delfinidina-3-
O-glucosídeo e diversos glucosídeos de quercetina também foram extraídos. Os
autores concluíram que a extração subcrítica do mirtilo é um método eficiente para
recuperar seletivamente compostos com uma alta capacidade antioxidante e um
elevado potencial para aplicações farmacológicas. Porém, nenhum resultado com
resíduo de mirtilo foi estudado anteriormente.
44
Um parâmetro importante na extração supercrítica é o rendimento global
(X0) de um processo e pode ser expresso pela razão entre a massa de extrato obtida
e a massa de matéria prima usada. De modo geral, na SFE a partir de matérias primas
vegetais usando CO2 como solvente, a porcentagem de material extraível é da ordem
de 1 a 10% (RODRIGUES et al., 2002). O rendimento global da SFE não depende
apenas das características da matéria-prima, mas também da forma com que os
compostos nela presentes interagem com o solvente, ou seja, as propriedades do
solvente também têm influência no valor de X0.
A cinética do processo de SFE é caracterizada pela curva global de
extração (OEC - Overall Extraction Curve), que consiste no gráfico da massa de
extrato acumulada em função do tempo de extração ou da massa de solvente utilizada
(BRUNNER, 1994). Uma OEC fornece informações sobre o comportamento cinético
da extração, possibilitando a determinação do tempo mais viável para um processo
de SFE.
Diversos comportamentos podem ser observados para as OECs pois a taxa
de extração não é uma função linear do tempo. Dois tipos de OEC são observados na
literatura, e esquematizados na Figura 3.6 (QUISPE-CONDORI et al., 2005;
BRUNNER, 1994).
Figura 3.6 - Curvas globais de extração (OEC) tipo I e II (adaptado de QUISPE-
CONDORI et al., 2005; BRUNNER, 1994).
I II
45
Observa-se na OEC tipo I uma taxa de extração constante incial seguida
de um decréscimo no final do processo. Curvas deste tipo representam cinéticas de
extração a partir de matrizes vegetais com quantidades altas de material extraível e/ou
de fácil acesso ao solvente. Na OEC tipo II ocorre a diminuição progressiva da taxa
de extração desde o início da extração. Este tipo de curva representa a extração a
partir de substratos com baixo teor de material extraível e/ou de difícil acesso ao
solvente (QUISPE-CONDORI et al., 2005).
3.4. Tecnologia de Separação em Membranas
A filtração é definida como a separação de dois ou mais componentes de
um fluxo de fluido. Em termos convencionais, refere-se à separação sólido-fluido, na
qual se força um líquido ou gás a atravessar um material poroso que retém o sólido.
A separação por membranas estende ainda mais esta aplicação, para incluir a
separação de solutos dissolvidos em correntes fluidas (CHERYAN, 1998).
Membranas podem ser definidas como barreiras entre duas fases, que
permitem a passagem de certos componentes de uma mistura, retendo outros de
forma seletiva (CHERYAN, 1998). Os métodos de filtração utilizados nos processos
de separação por membranas são o convencional (dead end) e o tangencial. No
processo convencional o fluido escoa perpendicularmente à superfície da membrana,
fazendo com que solutos se depositem sobre a mesma, sendo necessária a
interrupção do processo para limpeza ou substituição do filtro. No processo tangencial
(crossflow filtration), o escoamento do fluido é paralelo à superfície da membrana e
em altas velocidades, possibilitando o arraste dos solutos que tendem a se acumular
na sua superfície, o que torna esse processo mais eficiente (RENNER e SALAN,
1991).
O mecanismo de separação em membranas é mais complexo do que a
retenção ou passagem das partículas ou moléculas determinadas pelo diâmetro dos
poros da membrana. Muitas outras variáveis, como composição da membrana,
método de fabricação, estrutura espacial ou morfologia e configuração das moléculas,
interações entre moléculas e com a superfície da membrana, dinâmica do fluxo na
46
unidade de filtração, pressão, temperatura e velocidade da alimentação, influenciam
o processo de separação (KOSEOGLU e ENGELGAU, 1990). Para compreender o
princípio do processo, considera-se que a membrana, quando colocada entre as duas
fases, permite a permeação de solvente e/ou soluto, desde que haja uma força motriz
que provoque este fluxo (BHATTACHARJEE et al., 1999). Para serem efetivas em um
processo de separação, as membranas devem possuir as seguintes propriedades:
alta permeabilidade e seletividade, estabilidade mecânica e térmica e resistência
química (RAUTENBACH e ALBRECHT, 1989). A seletividade à passagem de solutos
presentes em soluções homogêneas está relacionada com as dimensões da molécula
ou partícula, o tamanho dos poros da membrana, a difusividade do soluto no material
que constitui a membrana e as cargas elétricas associadas (PORTER, 1990).
Os processos de separação por membranas se destacam como
alternativas aos processos convencionais de separação nas indústrias químicas,
farmacêuticas, biotecnológicas e de alimentos. Em muitos casos, os principais
atrativos são a seletividade (característica própria da membrana a ser utilizada), o
baixo consumo de energia (separação de componentes sem que ocorra mudança de
fase dos mesmos), separação de compostos termolábeis (o processo ocorre em
temperatura ambiente), simplicidade de operação e aumento de escala, redução no
número de etapas do processamento, maior eficiência na separação e maior
qualidade do produto final (STRATHMANN, 1990; CHERYAN, 1998; HABERT et al.,
2006).
Segundo Mulder (2003), a maioria das aplicações dos processos de
separação por membranas são para concentração, purificação e fracionamento. Esse
transporte pode ocorrer por difusão ou convecção e é induzido por um gradiente de
potencial químico (concentração) ou de potencial elétrico. O fator que distingue os
processos mais comuns de separação por membranas (microfiltração, ultrafiltração,
nanofiltração e osmose inversa) é a aplicação de pressão hidráulica para acelerar o
processo de transporte. Entretanto, a natureza da membrana controla quais
componentes permeiam e quais ficam retidos, uma vez que estes são
diferencialmente separados de acordo com suas massas molares ou tamanho de
partícula (CHERYAN, 1998). Os diferentes processos de separação por membranas
estão esquematizados na Figura 3.7.
47
Figura 3.7. Principais características dos processos de separação em
membranas que utilizam diferença de pressão como força motriz (HABERT et al.,
2006).
Comparando a tecnologia de membranas com métodos tradicionais
utilizados para a concentração de polifenóis, as membranas oferecem novas
possibilidades, devido às suas vantagens de alta recuperação, baixo consumo de
energia, condições de funcionamento brandas (temperaturas e pressões baixas),
ausência de transição de fases, fácil integração com outras unidades operacionais,
além de ser uma tecnologia alternativa de separação molecular (CONIDI et al., 2012).
Os processos de filtração por membranas oferecem perspectivas
interessantes e algumas vantagens comparadas às tecnologias convencionais no
tratamento de efluentes nas indústrias de alimentos em termos de baixo consumo de
energia, maior eficiência de separação e, consequentemente, melhora no produto
final. Operações com membranas conduzidas em alta pressão, tais como
microfiltração, ultrafiltração, nanofiltração e osmose inversa, são tecnologias já
estabelecidas para o tratamento de águas residuais que visam à produção de água
purificada para reciclagem ou reutilização e a recuperação de compostos valiosos
(GALANAKIS et al., 2010, GALANAKIS et al., 2014, MURO et al., 2012, SUÁREZ et
48
al., 2006 e TYLKOWSKI et al., 2011). Atualmente os estudos relacionados à
tecnologia de membranas se baseiam em associações de processos, permeação de
gases, utilização de CO2 no estado supercrítico associado às membranas,
dessalinização da água do mar, reutilização de energia sustentável, purificação de
biodiesel, tratamento de resíduos e principalmente o tratamento de águas residuais e
reutilização da água.
3.4.1. Microfiltração, Ultrafiltração e Nanofiltração
A microfiltração e a ultrafiltração envolvem a separação de um grande
número de macromoléculas. Estes processos se diferenciam pelo tamanho do poro
da membrana, e consequentemente pela pressão de operação. A ultrafiltração exige
maiores pressões para a separação, pois apresenta poros menores em relação aos
da microfiltração.
A microfiltração na indústria de alimentos é amplamente utilizada para a
separação de partículas e/ou microorganismos em bebidas como sucos de frutas.
Porém, como em muitas outras aplicações, uma previsão precisa de filtração em
sucos ainda não foi validada; testes de filtração em unidades laboratoriais são
contestados por deficiências frequentes comparados com filtrações em escala
industrial (LAYAL et al., 2015).
Os processos de filtração por membrana, especialmente a ultrafiltração,
estão em amplo crescimento nas indústrias de processamento de alimentos nos
últimos 25 anos. Estima-se que 20 a 30% do mercado global do processamento por
membranas estão na indústria de alimentos e bebidas. O potencial das membranas
de ultrafiltração para o processamento de alimentos é realçada por meio do sucesso
de vários tipos de aplicações nas cinco grandes áreas, a saber, produtos lácteos,
proteínas vegetais, adoçantes naturais, bebidas, peixes e indústrias de aves
(MOHAMMAD e TEOW, 2016). A ultrafiltração é também utilizada para separar
compostos de alta massa molecular daqueles de baixa massa molecular. As
membranas de ultrafiltração apresentam diâmetro de poro de 0,001 a 0,1 μm. O
diâmetro de poro na ultrafiltração é normalmente expresso em massa molecular de
49
corte, definida como a massa molecular de proteínas globulares que sãoretidas pela
membrana em 90% (PORTER, 1990). O valor citado corresponderia à faixa de 500 a
300.000 Daltons (DZIEZAK, 1990).
Nanofiltração é um processo de separação com membranas capaz de
efetuar separações de moléculas com massa molar média entre o limite superior da
ultrafiltração e o limite inferior da osmose inversa. Trata-se, portanto, de um processo
que utiliza uma membrana “fechada” de ultrafiltração ou uma membrana “aberta” de
osmose inversa. Além disso, as membranas de nanofiltração são diferentes das de
ultrafiltração e osmose inversa, pois possuem filmes finos na superfície, que contêm
grupos carregados. As membranas utilizadas na nanofiltração permitem a passagem
de espécies iônicas e moléculas de baixa massa molar.
O princípio básico da nanofiltração é o mesmo dos demais processos, com
gradiente de pressão como força motriz, onde a solução a ser processada escoa sob
pressão em contato com uma membrana microporosa. Sob o efeito da pressão, o
solvente, em geral água, atravessa a membrana e dá origem ao fluxo de permeado,
carregando sais e moléculas de baixa massa molar, enquanto as moléculas de maior
massa molar não permeiam a membrana (HABERT et al., 2006).
As membranas de nanofiltração são feitas para concentrar componentes
com massa molar acima de 300 Da e são mais seletivas que as membranas de
osmose inversa. As primeiras retêm as moléculas dissolvidas e íons polivalentes, mas
deixam permear os íons monovalentes. Dessa forma, o processo de nanofiltração
requer pressões de operação menores que a osmose inversa, sendo então mais
econômico (MAROULIS e SARAVACOS, 2003).
A eficiência do processo de nanofiltração pode ser atribuída a uma soma
dos efeitos estéricos (convecção e difusão) e eletrostáticos (efeito de cargas) na
superfície da membrana. Segundo Hilal et al. (2004), membranas que apresentam
menor rejeição a componentes dissolvidos e elevada permeabilidade a água
representam uma grande melhora para os processos de separação tecnológicos que
utilizam a nanofiltração.
Segundo Geens et al. (2005), os fatores condicionantes da retenção da
membrana na filtração tangencial são diferentes daqueles da filtração tradicional e
ainda não são totalmente conhecidos. No trabalho realizado por estes autores, para
50
uma melhor compreensão, os fatores foram divididos entre os que influenciam a
membrana e os que influenciam o líquido a filtrar. Os parâmetros que influenciam a
membrana são a permeabilidade dos solventes, a hidrofobicidade e a porosidade da
membrana. Por outro lado, os fatores que mais influenciam o comportamento do
líquido são a sua viscosidade e polaridade. Além destes, foram ainda apontados três
efeitos resultantes das interações soluto-solvente que condicionam o desempenho da
membrana. O primeiro está ligado à porosidade da membrana, pois quanto maior for
o diâmetro dos poros, menos resistência haverá à permeação do soluto. Em segundo,
pode ocorrer uma grande afinidade entre soluto e solvente, que origina um aumento
do tamanho molecular e assim aumenta a rejeição da membrana. Por fim, com o
avanço do processo de filtração pode ocorrer um “inchamento” da membrana, que
consequentemente diminui o tamanho seus poros.
A nanofiltração pode também ser utilizada para aplicações que envolvem o
fracionamento em vez da purificação. O seu potencial no processamento de alimentos
relacionados à alta qualidade, tratamento de águas residuais, processamento de óleo
vegetal, produtos lácteos, bebidas e açúcar vem sendo estudado recentemente
(SALEHI, 2014).
Conidi et al. (2012) descrevem a nanofiltração como um processo
conduzido por pressão e eficiente no fracionamento e na concentração de solutos a
partir de soluções complexas, com fluxos mais elevados comparados à osmose
inversa e melhor retenção que a ultrafiltração. Também afirmam que a principal
vantagem da nanofiltração é purificar compostos naturais, ou seja, fracionar moléculas
de massa molecular de 150-1000 Da.
Diversos trabalhos utilizando nanofiltração na concentração de
antocianinas têm sido realizados. Couto et al. (2010) estudaram o processo de
nanofiltração para reter as antocianinas de açaí, e concluíram que a membrana
NF 270 apresentou a melhor relação entre fluxo de permeado e coeficiente de
retenção de antocianinas. Martinez (2012) estudou a obtenção de um concentrado
rico em antocianinas a partir da polpa de juçara por microfiltração seguida de
nanofiltração e extração do óleo. Vieira (2015) também estudou a concentração de
antocianinas de diferentes extratos de juçara e concluiu que a melhor condição
operacional foi a 35 °C e 3,5 MPa, que resultou nos maiores valores de fluxo, retenção
de antocianinas e capacidade antioxidante dos extratos.
51
3.4.2. Fenômenos envolvidos no processo de separação em membranas
A permeabilidade de uma membrana representa a capacidade de um
solvente atravessá-la, podendo ser definida como a quantidade de solvente que
permeia a membrana em função da temperatura, velocidade do fluxo e pressão
aplicada (CHERYAN, 1998).
A seletividade, outra propriedade importante das membranas, está
relacionada à sua capacidade de retenção de determinados solutos, que pode ser
afetada pelos seguintes fatores: tamanho e forma das partículas, tipo do material e
configuração da membrana, concentração de substâncias retidas e adsorção de
solutos na membrana. Uma medida da seletividade é a rejeição ou retenção aparente,
pela qual se assume que a probabilidade de uma partícula atravessar a membrana é
máxima quando a sua rejeição é de 0% (MULDER, 2003; CHERYAN, 1998).
Nos processos de separação por membranas há uma redução importante
no fluxo de permeado com o tempo. Para que não haja uma diminuição da
produtividade, é importante minimizar a ocorrência dos fenômenos que limitam o fluxo
de permeado, que são: a polarização da concentração, formação de camada
polarizada e incrustação (CHERYAN, 1998). Estes fenômenos limitantes ocorrem
devido à presença de espécies no fluido de alimentação que não podem passar para
o permeado. Na polarização da concentração, as espécies acumuladas na parede da
membrana se encontram dispersas na solução, enquanto na camada polarizada as
espécies se depositam na superfície da membrana, e na incrustação estas aderem
dentro da matriz da mesma (CHERYAN, 1998).
A polarização por concentração é um fenômeno reversível, resultante do
acúmulo de solutos na superfície da membrana, cuja concentração aumenta com o
tempo de processo. Este fenômeno pode ser definido pelo gradiente de concentração
formado entre a região próxima à membrana, com alta concentração de solutos, e a
região por onde passa a solução de alimentação. Esse gradiente é compensado por
uma difusão desses solutos no sentido contrário ao do solvente, formando a camada
polarizada, e provocando diminuição no fluxo (SCHÄFER et al., 2006). Segundo
Sablani et al. (2001), a polarização da concentração, juntamente com a adsorção de
52
soluto e a formação da camada polarizada, causa a redução do fluxo de permeado.
Consequentemente, a predição do desempenho da membrana é difícil para as
diferentes aplicações. Modelos matemáticos têm avançado na direção da
compreensão destes fenômenos.
Como mostra a Figura 3.8, os problemas da polarização da concentração,
camada polarizada e da incrustação estão associados à passagem do retido na
superfície da membrana (HANHUI et al., 2004).
Figura 3.8. Diagrama de filtração tangencial em membranas (Adaptação de
ilustração apresentada por Hanhui et al. (2004)).
De acordo com Cheryan (1998), cinco fatores afetam o fluxo através de
uma membrana: pressão de operação, temperatura, velocidade de escoamento do
fluido, concentração e origem da alimentação. O aumento da temperatura reduz a
viscosidade do fluido e aumenta a difusividade, aumentando assim o fluxo de
permeado. Porém, em temperaturas muito altas pode haver precipitação de sais na
superfície da membrana, intensificando a incrustação e, consequentemente,
diminuindo o fluxo de permeado. Ainda segundo Cheryan (1998), um acréscimo na
velocidade de escoamento ou na turbulência do fluido a ser permeado causa o arraste
53
das partículas retidas na superfície da membrana, diminuindo a espessura da camada
gel polarizada e provocando o aumento do fluxo de permeado. O fluxo decresce
exponencialmente com a concentração de alimentação, devido ao aumento na
viscosidade.
Cassano et al. (2006) descrevem a incrustação de membranas como um
fator que afeta a viabilidade comercial do processo, do qual depende o fluxo de
permeado e sua estabilidade com o tempo. Incrustações de sucos de frutas são
causadas principalmente por polissacarídeos da parede celular do fruto, tais como
pectinas, celuloses, hemiceluloses e ligninas.
Apesar de grandes avanços na tecnologia de membrana (ou seja, a
melhoria das propriedades da membrana relacionadas com fluxo de permeado e
resistência da incrustação), o procedimento de sistemas integrados de membranas
como ultrafiltração seguida de nanofiltração é ainda limitada pela incrustação causada
por adsorção, acumulação ou precipitação dos componentes orgânicos e inorgânicos
na superfície da membrana (CHON et al., 2012), o que consequentemente, diminui o
fluxo de permeado.
O declínio do fluxo de permeado com o tempo ocorre em três estágios,
como mostra a Figura 3.9. No primeiro estágio, que ocorre nos minutos iniciais, há
uma rápida diminuição no fluxo, causada pela polarização da concentração. O
segundo estágio, que é uma etapa intermediária, se deve à incrustação. Por fim,
ocorre a consolidação da incrustação no terceiro estágio, caracterizado por um
declínio contínuo e lento do fluxo (MARSHALL e DAUFIN, 1995).
54
Figura 3.9. Estágios do declínio do fluxo de permeado com o tempo (MARSHALL
e DAUFIN, 1995).
Os fenômenos que interferem no fluxo de permeado têm sido estudados.
Machado et al. (2012) avaliaram os efeitos do tratamento enzimático com pectinase
da polpa de açaí no desempenho do fluxo cruzado de microfiltração e nas
características fitoquímicas e funcionais de seus compostos. As análises dos
mecanismos incrustantes foram realizadas através da resistência em série. Os
resultados mostraram que o tratamento enzimático teve um efeito positivo sobre o
processo do desempenho de fluxo cruzado de polpa de açaí. Camelini et al. (2014)
estudaram o fluxo de permeado influenciado por pressão e temperatura de
polissacarídeos a partir do extrato da biomassa miceliana de A. subrufescens e
quantificaram os fenômenos responsáveis pela diminuição do fluxo de permeado.
Concluíram que a nanofiltração pode ser utilizada para a concentração dos
polissacarídeos, conseguindo-se fluxos compatíveis com a realidade industrial.
3.4.3. Parâmetros de controle e eficiência do processo de separação em
membranas
Para fluidos que não contêm muitos componentes causadores de
incrustação, altas pressões podem aumentar o fluxo de permeado, pois a força motriz
55
será maior. Porém, em casos nos quais a camada polarizada e a incrustação se
formam com facilidade, o aumento na pressão resulta na compactação das partículas
sobre a superfície da membrana, ocasionando um declínio acelerado do fluxo de
permeado. Assim, utilizando pressões mais baixas, tem-se um fluxo inicial menor, mas
que é mantido com o tempo (PORTER, 1990). De acordo com Cheryan (1998), o
aumento da pressão transmembrana tende a aumentar o fluxo de permeado até a
consolidação da camada polarizada, após a qual o fluxo se torna independente da
pressão, apenas aumentando a espessura desta camada.
O fluxo de permeado é diretamente proporcional à pressão aplicada e
inversamente proporcional à viscosidade do fluido de alimentação. A viscosidade é
primariamente controlada por dois fatores: concentração de sólidos da solução de
alimentação e temperatura. O aumento da temperatura ou da pressão aumentaria o
fluxo de permeado. Isto depende de certas condições, tais como baixa pressão, baixa
concentração de sólidos no fluido de alimentação e alta velocidade do fluido
(CHERYAN, 1998). A relação entre pressão e fluxo de permeado se deve aos efeitos
da polarização de concentração. Em baixas pressões, baixa concentração da
alimentação e alta velocidade do fluido, os efeitos da polarização de concentração são
mínimos, sendo o fluxo de permeado afetado pela pressão transmembrana (PT).
Desvios da relação linear entre fluxo e pressão são observados em altas pressões,
independentemente de outros parâmetros operacionais (CHERYAN, 1998).
A polarização de concentração pode ser atenuada se a hidrodinâmica de
escoamento da corrente de alimentação for alterada, pela criação de um fluxo
turbulento ou através da utilização de módulos vibratórios (BAKER, 2004). Esta
camada é dinâmica, e alterando condições operacionais, como pressão, concentração
da alimentação ou velocidade da alimentação, pode-se reverter o sistema ao regime
operacional controlado pela pressão. No entanto, se a incrustação está consolidada,
o fluxo de permeado não retornará aos níveis originais, exceto após a limpeza da
membrana (CHERYAN, 1998).
As membranas utilizadas na nanofiltração e osmose não são, na verdade,
membranas com poros definidos e, portanto, são classificadas como membranas
semi-porosas (ALLGEIER et al., 2005). Assim, a medida utilizada para caracterizar a
56
permeabilidade de cada membrana é a massa molecular de corte da membrana
(MMC).
Existem alguns constituintes que, em quantidades relativamente pequenas,
conseguem passar para o permeado, além de água e etanol, que são os solventes
utilizados nos experimentos deste trabalho. Este fato está intimamente ligado à
relação entre a massa molecular dos constituintes e a MMC. A MMC não é uma
medida linear e está sujeita a alterações ao longo do processo. Logo, existem algumas
porcentagens de compostos que, apesar de apresentarem massas moleculares
superiores à MMC, passam para o permeado (ALLGEIER et al., 2005).
3.4.4. Fluxo de permeado (J)
O fluxo de permeado é definido como a quantidade de permeado obtida,
expressa em massa ou volume, por área de permeação da membrana por tempo. O
fluxo de permeado está expresso na Equação 1 (CHERYAN, 1998).
𝐽 =𝑀𝑝
𝐴𝑝 (1)
Onde: Mp é a massa de permeado no tempo t e Ap é a área de permeação.
3.4.5. Fator de Concentração (FC)
O fator de concentração quantifica a redução de massa atingida pela
separação por membranas. É calculado como a razão entre a massa inicial na
alimentação e a massa final de retido, como mostra a Equação 2.
𝐹𝐶 =𝑀𝑎
𝑀𝑟 (2)
Onde: Ma = massa da alimentação e Mr = massa do retido.
57
3.4.6. Pressão aplicada à membrana (PM) ou pressão transmembrana (Pt)
A pressão transmembrana é definida como o gradiente de pressão entre os
lados do retido e do permeado, calculada pela Equação 3.
𝑃𝑡 = 𝑃𝑟 − 𝑃𝑝 (3)
Onde Pr e Pp são, respectivamente, as pressões nas correntes do retido e
do permeado.
Geralmente, o gradiente de pressão entre a corrente de retido e o
permeado varia ao longo do comprimento da membrana. Assim, o valor da pressão
aplicada à membrana é calculado pela média aritmética da pressão na entrada e na
saída da membrana. Quando a saída do permeado for aberta para o ambiente, a
pressão Pp é nula, e a pressão aplicada à membrana é calculada conforme a Equação
4 (CHERYAN, 1998).
𝑃𝑡 =𝑃𝑒+𝑃𝑠
2 (4)
Onde Pe e Ps, as pressões de entrada e de saída da membrana no lado do
retido, respectivamente.
3.4.7. Índice de Retenção (IR)
Para avaliar o grau de retenção de um componente pela membrana se
utiliza o índice de retenção (ou rejeição), calculado conforme a Equação 5 (GIRARD
e FUKUMOTO, 2000). Este índice fornece uma medida da capacidade da membrana
58
em reter moléculas ou componentes específicos, sob determinadas condições de
operação.
𝑅 = (1 −𝐶𝑝
𝐶𝑟) . 100 (5)
Onde: Cp e Cr são as concentrações no permeado e no retido,
respectivamente.
O índice de retenção é afetado por fatores como tamanho e formato das
partículas presentes, concentração dos compostos rejeitados, pH e força iônica da
solução, tipo de material que constitui a membrana e sua configuração.
3.5. Processos acoplados
Dióxido de carbono supercrítico tem sido amplamente utilizado para
extração e recuperação de componentes de alto valor a partir de matérias-primas e
subprodutos industriais. Tem havido um progresso significativo em termos de
comercialização desta tecnologia associada às suas vantagens sobre a utilização de
solventes orgânicos (TEMELLI, 2009). Baixa viscosidade e alta difusividade do
solvente, baixa temperatura do processo, propriedades de solvatação ajustáveis,
facilidade de remoção de componentes extraídos, baixos custos e disponibilidade são
algumas das principais vantagens que dão origem a inúmeras aplicações do CO2
supercrítico. Por outro lado, o custo de recompressão de CO2 gasoso para condições
supercríticas é alto (CARLSON et al., 2005).
A integração de um sistema de separação por membranas ao processo de
extração com CO2 supercrítico tem o objetivo de eliminar a etapa de despressurização
e, consequentemente, reduzir os custos de recompressão. Processos de separação
por membranas são bem conhecidos e, atualmente, utilizados em muitas aplicações
industriais. Estes processos são fáceis de ampliar e economicamente favoráveis em
relação aos processos convencionais de separação. O principal problema associado
com processos de separação de membranas é o baixo fluxo de permeado, quando é
necessária uma elevada seletividade.
59
O uso do CO2 como solvente tem sido efetivo para aumentar o fluxo de
permeado pela redução da viscosidade durante a permeação através da membrana
(SARRADE et al., 2003). Muitas aplicações de separação de componentes de solutos,
incluindo óleos essenciais, ácidos graxos e cafeína, foram investigadas com
separação de etanol e processamento de produtos petrolíferos usando extração com
CO2 supercrítico integrada a processos de separação por membranas, empregando
membranas orgânicas e inorgânicas (SEMENOVA et al., 1992). Os efeitos da
viscosidade e do transporte do CO2 através da membrana foram também avaliados
(PATIL et al., 2006; VERKERK et al., 2001). Porém, estes estudos focaram na
permeabilidade e seletividade de membranas sob condições extremas de
processamento associadas com o uso do CO2.
Alguns trabalhos têm sido desenvolvidos nessa área. Rezzadori et al.
(2015) estudaram o efeito do CO2 na permeação de membranas poliméricas de
osmose inversa e nanofiltração utilizando misturas de óleo de macaúba (Acrocomia
aculeata) e CO2, e concluiram que a seletividade não foi alterada e que é possível a
utilização de membranas poliméricas comerciais em sistemas supercríticos para
regeneração do CO2 e fracionamento parcial dos ácidos graxos.
Uma vez que a utilização de membranas orgânicas é comum devido à sua
disponibilidade e baixo custo, a estabilidade é ainda o fator mais importante quando
membranas poliméricas são empregadas em um sistema acoplado com CO2. As
interações entre o CO2 e a estrutura do polímero da membrana podem afetar
adversamente o desempenho da membrana, dependendo do material polimérico e
condições de processamento. Estas interações foram relatadas em estudos
anteriores, visando a diferentes grupos funcionais associados a diferentes materiais
poliméricos (KANEHASHI et al., 2007). O efeito do CO2 na estrutura da membrana
polimérica pode ser descrito em duas partes: comportamento de inchaço durante o
processamento e reorganização da rede de polímero mediante a despressurização.
Muitas aplicações desta abordagem têm sido relatadas, como
descafeinazação e recuperação do produto de interesse, utilizando membranas de
poliamida de filme fino com CO2 (SARRADE et al., 2003; SARMENTO et al., 2004;
SPRICIGO et al., 2001; CARLSON et al., 2005; PIETSCH et al., 1998). A fim de avaliar
o efeito do CO2 sobre membranas poliméricas, as propriedades físico-químicas da
membrana e os fenômenos envolvidos devem ser bem entendidos (SARMENTO et
60
al., 2008; ARTZ et al., 2005; BOS et al., 1999; PETROPOULOS, 1992; REIJERKERK
et al., 2011). A solubilidade dos polímeros no CO2 depende das interações específicas
entre eles. Essas interações são a principal razão para as alterações químicas e
morfológicas na estrutura do polímero da membrana e o fator determinante para a
eficiência de processos que envolvem o CO2 como solvente.
3.6. Considerações sobre o estado da arte
O estudo da concentração de compostos bioativos do resíduo de mirtilo
utilizando líquidos pressurizados, extração com fluidos supercríticos, e posterior
nanofiltração é de extrema importância, pois não há na literatura trabalhos realizados
com estes procedimentos. Existem muitos trabalhos com mirtilo, porém realizados
com a fruta inteira ou suco. Para o resíduo das indústrias não existem trabalhos
vinculados às tecnologias propostas nesta tese.
A concentração de antocianinas, compostos fenólicos e antioxidantes do
resíduo de mirtilo utilizando SFE, PLE e separação em membranas é de grande
interesse, pois as temperaturas moderadas envolvidas nestes processos diminuem a
degradação térmica destes compostos. Além disso, o fracionamento e a purificação
subsequente e a concentração das antocianinas são uma questão de interesse
econômico para a indústria de alimentos. Através deste estudo, outros poderão ser
realizados para aplicações de processos integrados de reaproveitamento de resíduos
de frutas ricas em antocianinas.
61
4. MATERIAIS E MÉTODOS
A Figura 4.1 apresenta o diagrama de fluxo das atividades realizadas
nesta tese. As atividades encontram-se detalhadas nas seções a seguir:
Resíduo de mirtilo
fresco
Limpeza de
impurezas dos
resíduos
Secagem: Estufa e
Liofilização
Resíduo fresco
Resíduo LiofilizadoAnálises
Composição química por UPLC
Teor de Fenóis Totais
Atividade Antioxidante:
DPPH e ABTS
Antocianinas
Extrações teste:
Resíduo de mirtilo
Lote 1
Extrações SFE:
Resíduo de mirtilo
fresco e liofilizado
(Lote 1) e mirtilo
fruta fresca
Escolha: temperatura, pressão e vazão;
Rendimento global;
Cinéticas de extração
Análises
Composição química por UPLC
Teor de Fenóis Totais
Atividade Antioxidante:
DPPH e ABTS
Antocianinas
Testes preliminares na
Unidade de
membranas 1
Alimentações diluídas em:
Água
Água acidificada (pH:2,0)
Solução água e etanol
Testes preliminares
na Unidade de
membranas 1
Melhor condição de concentração
Unidade de membranas 2
Nanofiltração:
Extrato SFE (melhor condição) e
resíduo fresco (Lote 2)
Composição química por UPLC
Teor de Fenóis Totais
Atividade Antioxidante:
DPPH e ABTS
Antocianinas
Figura 4.1. Diagrama de fluxo das atividades realizadas na tese.
Fenóis Totais
Antocianinas
62
4.1. Matérias-primas
Os resíduos de mirtilo utilizados neste trabalho foram adquiridos da
empresa “Orgânicos Pérolas da Terra”, localizada na cidade de Antônio Prado, no
estado do Rio Grande do Sul. Foram utilizados dois lotes diferentes de matéria-prima.
O Lote 1 é de resíduo de mirtilo das variedades clímax, bluegen e flórida, produzido
através do processo de extração por despolpadeira (marca: Biancheta, modelo: semi-
industrial, ano de fabricação: 2005, fabricante: Mecânica Três Eixos e capacidade de
produção de 200 kg/h). O Lote 2 é de resíduo composto das mesmas variedades do
primeiro, porém obtido por processo de extração por arraste de vapor (marca da
extratora: Stampa Inox, modelo: Conjugado, ano de fabricação: 1995, fabricante:
Stampa Inox e capacidade de produção de 100 kg/h).
Além disso, foi usado mirtilo fresco proveniente do mercado local de
Campinas-SP e suco concentrado de mirtilo, fornecido pela empresa San Leon,
Amparo –SP –Brasil.
4.2. Limpeza e acondicionamento do resíduo
Os resíduos do mirtilo dos dois lotes, constituídos de casca e semente,
passaram por um processo manual de seleção e limpeza para retirada de impurezas
e sujidades grosseiras. Após esta etapa, foram acondicionados em embalagens
plásticas comuns e estocados em freezer doméstico a -18 °C.
4.3. Liofilização e Secagem em estufa do resíduo produzido pelo
processo de despolpamento (Lote 1)
Uma parte da matéria-prima (Lote 1) foi submetida à liofilização em
liofilizador de bancada (L101-LioTop/Liobrás, São Carlos, SP, Brasil) com o tempo
variando de 48 a 72 horas. Outra parte (também do Lote 1) foi seca em estufa de
secagem (Fanem, 320-se, São Paulo, SP, Brasil), com tempo variando entre 4 a 5
63
dias a 40 ºC, dependendo da quantidade de amostras. Após as secagens, as amostras
foram moídas em moinho de facas com objetivo de homogeneizá-las e diminuir a
resistência à transferência de massa durante as etapas posteriores de extração. Os
resíduos de mirtilo liofilizado, seco em estufa e fresco foram acondicionados em
embalagens plásticas e estocados em freezer doméstico a -18 °C.
4.4. Caracterização dos resíduos de mirtilo e do mirtilo fresco
Os resíduos de mirtilo passaram pelo processo de extração por maceração
(somente maceração física, sem adição de solvente) antes das determinações
analíticas.
Os resíduos frescos dos Lotes 1 e 2 foram submetidos à caracterização
química pela realização das seguintes análises: sólidos solúveis e acidez pelo método
titulométrico, pH, vitamina C, umidade (AOAC, 2005), concentração de polifenóis
totais pelo método colorimétrico de SINGLETON et al. (1999) (Seção 4.4.1),
capacidade antioxidante por DPPH e ABTS (RUFINO et al., 2007) (Seção 4.4.2),
antocianinas monoméricas pelo método de pH diferencial (GIUSTI e WROLSTAD,
2003) (Seção 4.4.4) e taninos (somente para os resíduos frescos do Lote 1), (AOAC,
2005) (Seção 4.4.3). Além disso, foi realizada a identificação e quantificação de
antocianinas por UPLC (Seção 4.4.5). As mesmas caracterizações foram realizadas
nas amostras liofilizada e seca em estufa, com exceção de sólidos solúveis, acidez,
pH e vitamina C. Todas as amostras foram mantidas protegidas da luz solar. Para a
amostra da fruta fresca, foi realizada somente a caracterização por UPLC.
A Tabela 4.1 detalha as análises realizadas nos resíduos de mirtilo fresco,
liofilizado, seco em estufa, nos extratos obtidos pelas extrações Sohxlet, PLE e SFE
e nos produtos obtidos da concentração por membranas (permeado, retido e
alimentação).
64
Tabela 4.1. Análises realizadas em todos as matérias-primas e produtos obtidos
das extrações (Soxhlet, PLE e SFE) e concentrações por membranas.
Polifenois
Totais
Capacidade Antioxidante
DPPH
Capacidade Antioxidante
ABTS
Antocianinas Monoméricas Taninos
Antocianinas por UPLC
Resíduo fresco
(Lote 1)
X X X X X X
Resíduo Liofilizado
(Lote 1) X X X X X X
Resíduo Seco Estufa
(Lote 1) X X X X - -
Mirtilo fruta fresca X X X X X X
Extratos Soxhlet
(Lote 1)
X X X X - X
Extratos PLE
(Lote 1) X X X X - X
Extratos SFE
(Lote 1) X X X X X X
Resíduo fresco
(Lote 2)
X X X X - X
Extratos SFE
(Lote 2) X X X X - X
Alimentações membrana
(Lote 2)
X X X X - X
Permeados membrana
(Lote 2)
X X X X - X
Retidos membrana
(Lote 2)
X X X X - X
65
4.4.1. Teor de polifenóis totais
A determinação de polifenóis totais foi realizada através do método de
Folin-Ciocalteu, segundo procedimento de SINGLETON et al. (1999), e os teores de
polifenóis totais foram expressos em mg equivalente de ácido gálico (EAG)/g de
matéria-prima.
Para a construção da curva padrão de ácido gálico, uma alíquota de 1 mL
foi retirada do extrato apropriadamente diluído em metanol (1g/10mL) ou das soluções
aquosas padrão de ácido gálico (> 99%, Vetec, Brasil, lote 0806387) (0 – 100 mg/L) e
transferidas para um balão volumétrico de 25 mL, contendo 9 mL de água. O reagente
de Folin-Ciocalteu (1 mL) (Dinâmica, Brasil) foi adicionado e a mistura agitada. Após
5 minutos foram adicionados 10 mL de uma solução de Na2CO3 7% (Reagentes Carlo
Erba, Itália) e o volume foi completado com água. Após permanecer 90 minutos a
23 ºC na ausência de luz, a absorbância foi determinada a 750 nm em
espectrofotômetro (UV-VIS lambda 40, Perkin Elmer, EUA). A solução referência
utilizada como branco no espectrofotômetro foi acondicionada da mesma forma, com
1 mL de água ultra pura (Milli-Q). A curva padrão foi obtida a partir de testes em
triplicata.
Para a determinação do teor de polifenóis totais nas amostras dos extratos
secos, estes foram inicialmente diluídos em etanol (pureza 99,5 % v/v, Synth, Brasil)
em proporção de 20 mg/mL etanol. A partir do extrato diluído foi preparada a diluição
aquosa, tomando quantidade apropriada do extrato e depositando-a em um balão
volumétrico de 5 mL, completando o volume com água ultra pura (Milli-Q). O mesmo
procedimento foi seguido conforme descrito no parágrafo anterior, verificando se o
valor obtido de absorbância permaneceu dentro da faixa de absorbância da curva
padrão. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
66
4.4.2. Capacidade antioxidante (AA)
4.4.2.1. Determinação da capacidade antioxidante total pela captura do
radical livre DPPH
A capacidade antioxidante das amostras foi avaliada utilizando o método
do sequestro de radicais livres do DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidrazil), seguindo o
método descrito por Brand-Williams et al. (1995) e Mensor et al. (2001) e pela captura
do radical livre ABTS de acordo com o método descrito por Rufino et al. (2010).
O método DPPH (BRAND-WILLIAMS et al., 1995) é baseado na captura
do radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) por antioxidantes, produzindo um
decréscimo da absorbância a 515 nm. O DPPH é um radical livre que pode ser obtido
diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico. A curva padrão foi
construída a partir de uma solução inicial do reagente DPPH (60 µM) com metanol,
preparada em balões volumétricos de 10 mL, gerando soluções com concentrações
de 10 a 50 µM. Em ambiente escuro, transferiu-se uma alíquota de aproximadamente
4 mL de cada solução de DPPH (10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM e 60 μM) para
cubetas de vidro e realizou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro (Hach,
Modelo DR/400, USA) a 515 nm. Utilizou-se álcool metílico, como branco, para calibrar
o espectrofotômetro.
A partir do extrato, prepararam-se em tubos de ensaio no mínimo três
diluições diferentes em triplicata. Em ambiente escuro, transferiu-se uma alíquota de
0,1 mL de cada diluição do extrato para tubos de ensaio com 3,9 mL do radical DPPH
e homogeneizou-se a solução em agitador de tubos. Utilizou-se 0,1 mL da solução
controle de álcool metílico com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizou-se a solução.
As leituras de absorbância a 515 nm foram monitoradas a cada 10 minutos, de forma
que foi observada a redução da absorbância até sua estabilização. A capacidade
antioxidante pela captura do radical livre DPPH foi expressa em µmol TE/g (trolox/g)
matéria-prima.
67
4.4.2.2. Determinação da capacidade antioxidante total pela captura do
radical livre ABTS+
Um dos métodos mais utilizados para medir a capacidade antioxidante é
baseado na captura do radical 2,2´- azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)
(ABTS+), que pode ser gerado por uma reação química, eletroquímica ou enzimática.
Com esse método, pode-se medir a atividade de compostos de natureza hidrofílica e
lipofílica (KUSKOSKI et al., 2005).
O radical ABTS+ foi preparado a partir da reação de 5 mL de uma solução
estoque de ABTS com 88 µL da solução de persulfato de potássio. Metanol foi utilizado
como solvente. Manteve-se a mistura no escuro, à temperatura ambiente, por 16
horas. Em seguida, diluiu-se 1 mL desta mistura em álcool etílico até se obter uma
absorbância de 0,70 ± 0,05 a 734 nm. A solução foi preparada e utilizada no dia da
análise. Dissolveu-se 25 mg de trolox em álcool etílico e completou-se o volume para
50 mL em um balão volumétrico com álcool etílico, homogeneizou-se e transferiu-se
para um frasco de vidro âmbar, devidamente etiquetado.
Para o preparo da curva padrão a partir da solução padrão de trolox (2.000
µM), foram utilizados balões volumétricos de 10 mL, com soluções de concentrações
variando de 100 a 1.500 µM. Em ambiente escuro, transferiu-se uma alíquota de 30
μL de cada solução de trolox (100 μM, 500 μM, 1.000 μM, 1.500 μM e 2.000 μM) para
tubos de ensaio, misturou-se com 3,0 mL da solução do radical ABTS+ e
homogeneizou-se em agitador de tubos. A leitura da absorbância a 734 nm foi
realizada após 6 minutos da mistura e foi utilizado álcool etílico como branco para
calibrar o espectrofotômetro.
A partir do extrato, prepararam-se em tubos de ensaio, no mínimo três
diluições diferentes, em triplicata. Em ambiente escuro, transferiu-se uma alíquota de
30 μL de cada diluição do extrato para tubos de ensaio com 3,0 mL do radical ABTS+
e homogeneizou-se em agitador de tubos. A leitura da absorbância a 734 nm foi
realizada após 6 minutos da mistura e utilizou-se o álcool etílico, como branco, para
calibrar o espectrofotômetro (Hach, Modelo DR/400, USA).
A capacidade antioxidante pela captura do radical livre ABTS foi expressa
em µmol TE/g matéria-prima.
68
4.4.3. Taninos
A determinação do teor de taninos nos extratos foi realizada pelo método
Folin Denis, ref.11, n°9098 (AOAC, 2005). Esta determinação foi realizada somente
nos extratos obtidos por SFE com cossolventes a partir da matéria-prima do Lote 1.
4.4.4. Determinação do teor de antocianinas pelo método pH diferencial
A determinação dos teores de antocianinas monoméricas foi realizada pelo
método de pH diferencial descrita por Giusti e Wrolstad (2003). Foi introduzida uma
etapa de filtração da amostra em papel de filtro de rápida filtração, para eliminar os
sólidos em suspensão e, deste modo, possibilitar a determinação da absorbância das
soluções.
Prepararam-se duas soluções tampão, sendo uma com pH 1,0 e outra com
pH 4,5. Em seguida, pesou-se entre 0,05 e 0,1 g de amostra em 6 balões volumétricos
âmbar de 25 mL, sendo três massas para pH 1,0 e três para pH 4,5. Completou-se o
volume com tampão adequado, homogeneizou-se em vórtex por 10 s e manteve-se a
mistura em repouso por 25 min. Posteriormente, as amostras foram filtradas e as
leituras de absorbância foram feitas após 30 minutos da adição do tampão.
Para a leitura, primeiramente ajustou-se o comprimento de onda para
510 nm, zerou-se o equipamento com a solução tampão de pH 1,0 e fez-se a leitura
da absorbância da amostra em tampão de pH 1,0. Em seguida, ajustou-se o
comprimento de onda para 700 nm, zerou-se o espectrofotômetro e realizou-se
novamente a leitura da amostra em solução tampão de pH 1,0. Após a leitura com as
amostras de pH 1,0, o mesmo procedimento se repetiu com as amostras de pH 4,5.
O teor de antocianinas foi expresso em mg de antocianinas (cianidina-3-O-glucosídeo)
por 100 g de matéria-prima.
69
Para o cálculo da quantidade de antocianinas monoméricas, utilizou-se a
Equação 6 e para a concentração utilizou-se a Equação 7:
𝐴𝑏𝑠 = (𝐴𝑏𝑠510 − 𝐴𝑏𝑠700)𝑝𝐻1,0 − (𝐴𝑏𝑠510 − 𝐴𝑏𝑠700)𝑝𝐻4,5 (6)
𝐶 (𝑚𝑔
𝐿) =
𝐴𝑏𝑠 𝑥 𝑀𝑀 𝑥 𝐹𝐷 𝑥 1000
𝑒 (7)
Onde:
Abs: absorbância
Abs 510: absorbância na faixa de 510 nm
Abs 700: absorbância na faixa de 700 nm
MM = Massa molecular da cianidina-3-O-glucosídeo = 449,2 g/mol (*)
FD = Fator de diluição
e = absortividade molar da cianidina-3-O-glucosídeo = 26900 (*)
Obs: Os cálculos foram feitos considerando a cianidina-3-O-glucosídeo como a
antocianina principal das amostras.
(*) (FRANCIS e MARKAKIS, 1982)
4.4.5. Identificação e quantificação das antocianinas por UPLC (Ultra
Performance Liquid Chromatography)
Para a identificação das antocianinas foi utilizado um sistema de
cromatografia líquida de ultra eficiência ACQUITY UPLC® acoplado a um
espectrômetro de massas quadrupolo (UPLC-QToF-MS) (Synapt G2, Waters
Corp.,Milford, MA, USA) localizado nas dependências do Departamento de Química
Analítica da Universidade de Cádiz (Espanha).
70
Os picos das antocianinas individuais detectadas nas corridas
cromatográficas foram identificados pela comparação com os tempos de retenção do
respectivo padrão do mirtilo e analisados usando UPLC-QToF-MS. O padrão utilizado
e mais comum foi o cloreto de cianidina.
A concentração dos compostos identificados foi calculada pelas curvas de
calibração obtidas usando soluções do padrão puro, não hidrolisado, com
concentrações variando de 0 a 60 mg/L (ppm). As antocianinas foram quantificadas
comparando-as com a reta de calibração, levando em consideração a massa
molecular de cada uma das antocianinas. Como a fruta mirtilo apresenta 14 diferentes
antocianinas, se torna economicamente inviável fazer a calibração com todos os
padrões, portanto, foi escolhido o padrão mais comum. Os resultados foram expressos
como mg de antocianina/100 g de resíduo fresco (RF). Os resultados são
apresentados como a média ± desvio padrão de três diferentes injeções.
A Tabela 4.1, na Seção 4.4, informa para quais amostras foram realizadas
as análises de UPLC.
4.4.5.1. Materiais e solventes utilizados
Foram usados metanol (Merck, Darmstadt, Alemanha) e ácido fórmico
(Panreac, Barcelona, Espanha) grau HPLC. Água pura Mili-Q foi purificada em um
sistema de purificação de água Millipore (Bedford, MA, USA). O padrão de antocianina
para o Lote 1 (Pelargonidin Chloride) e Lote 2 (Cyanidin Chloride) foram adquiridos da
Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
4.4.5.2. Identificação das Antocianinas por UPLC-QToF-MS
O equipamento de UPLC usado na identificação das antocianinas é
composto pelos seguintes módulos: sistema de bomba quaternária ACQUITY UPLC,
detector de arranjo de diodos ACQUITY UPLC, injetor automático ACQUITY UPLC,
71
compartimento para a coluna e detector quadrupolo ACQUITY UPLC. Para o controle
do instrumento e o processamento dos dados foi utilizado o software Empower™
(versão 3.0, Waters). Extratos do Lote 1 foram passados através de um filtro de 0,20
µm de tamanho de poro (Chromafil® Xtra, PA-20/25, Alemanha). Já os extratos do Lote
2 foram filtrados com filtros de mesma porosidade (0,20 μm), porém de outra empresa
(Membrane Solutions, Dallas, USA).
Foi utilizada a coluna analítica ACQUITY UPLC® BEH C18, 1.7 µm, 2.1 ×
100 mm (Waters, Irlanda). As temperaturas da coluna e do injetor automático foram
mantidas a 50 e 15 °C, respectivamente. O volume de injeção dos extratos foi ajustado
para 3,0 µL.
A eluição da fração de antocianinas foi utilizada com fases móveis, água
(solvente A) e metanol (solvente B) com a primeira contendo 2 % de ácido fórmico. O
gradiente linear aplicado foi: 0 min, 15% B; 3,30 min, 20% B; 3,86 min, 30% B; 5,05
min, 40% B; 5,35 min, 55% B; 5,64 min, 60% de B, 5,94 min, 95% B; 7,50 min, 95%
B. O tempo de execução total da corrida foi de 12 min, incluindo 4 min para o equilíbrio
da coluna. A vazão de solvente foi de 0,4 mL/min. A determinação dos analitos foi
realizada por meio de uma fonte de eletrospray (ES), operando no modo de ionização
positivo nas condições que seguem: vazão de gás de dessolvatação = 700 L/h,
temperatura de dessolvatação = 500 °C, vazão de gás do cone = 10 L/h, temperatura
da fonte = 150 °C e voltagem do capilar 700 V. A voltagem do cone para o Lote 1 foi
de 30 V, e a energia de colisão foi de 20 eV e modo de varredura completa foi utilizada
(m/z = 100 - 800). Para o Lote 2, a voltagem do cone foi de 20 V, a energia de colisão
foi de 4 eV e o modo de varredura completa foi utilizada (m / z = 100 - 1200). O efluente
do sistema cromatográfico também passou pelo detector de arranjo de diodos
(espectro UV-vis), onde as antocianinas foram monitoradas de 200 a 600 nm.
O equipamento UPLC-QToF-MS, tem um Photodiode Array (PDA) antes de
massa. Com isso, pode-se afirmar que os perfis do equipamento de identificação e
quantificação são os mesmos. Ambos estão em série.
Todo o método foi desenvolvido e com ensaios prévios nas dependências
do Departamento de Química Analítica da Universidade de Cádiz (Espanha).
72
4.4.5.3. Separação e Quantificação das Antocianinas por UPLC
A quantificação de antocianinas foi realizada em um cromatógrafo UPLC
Elite LaChrom (VWR Hitachi, Tóquio, Japão), consistindo de um injetor automático de
amostras (L-2200U), um forno para coluna (L2300), uma bomba (L-2160) e um
detector UV-Vis (L-2420U). O forno da coluna foi ajustado a 50 ºC para a
cromatografia. O detector UV-Vis foi fixado a 520 nm para as análises. As antocianinas
do Lote 1 foram analisadas em uma coluna C18 HaloTM Hitachi LaChrom (100 x 3 mm
de diâmetro, tamanho de partícula 2,7 µm). Um método de gradiente, usando água
acidificada (ácido fórmico a 5%, de solvente A) e metanol (solvente B), trabalhando a
uma vazão de 1,0 mL/min, foi utilizado para a separação cromatográfica. O gradiente
utilizado foi o seguinte: 0 min, 15% B; 1,50 min, 20% B; 3,30 min, 30% B; 4,80 min,
40% B; 5,40 min, 55% B; 5,90 min, 60% B; 6,60 min, 95% B; 9,30 min, 95% B, 10 min,
15% B. Já para o Lote 2, as antocianinas foram analisadas em uma coluna Kinetex
C18 100Å (50 x 2.1 mm I.D., tamanho de partícula 2.6 µm, Phenomenex Inc., UK). Um
método de gradiente, usando água acidificada (ácido fórmico a 5%, de solvente A) e
metanol (solvente B), trabalhando a uma vazão de 0,7 mL/min, foi utilizado para a
separação cromatográfica. O gradiente utilizado foi: 0 min, 5% B; 1,50 min, 5% B; 3,50
min, 15% B; 5,00 min, 25% B; 5,50 min, 40% B; 6,50 min, 45% B; 7,0 min, 100% B;
9,30 min, 100% B, 10 min, 10% B.
4.5. Métodos de extração
O processo de extração a baixa pressão pelo método Soxhlet foi realizado
a fim de comparar os resultados de rendimento e composição de extrato com os
obtidos por SFE e PLE.
73
4.5.1. Extração Soxhlet
As extrações pelo método Soxhlet foram realizadas na matéria-prima do
Lote 1 (fresca, liofilizada e seca em estufa) utilizando hexano e metanol como
solventes, e cerca de 5 g de amostra. Foram realizados ensaios preliminares a fim de
definir o tempo de extração.
Foram realizados treinamentos para conhecer o procedimento da extração
no aparelho Soxhlet. Inicialmente testou-se a manta de aquecimento para conhecer a
variação da temperatura do solvente durante a extração. Para isto foi colocado um
termômetro no interior da câmara Soxhlet preso por uma pinça na extremidade
superior do extrator e suspenso para evitar o contato direto com a parede da câmara,
pois a temperatura da parede da câmara é superior à temperatura do solvente
condensado.
Foram confeccionados cartuchos com papel filtro Qualy (JProlab, Cód.
3006-5, Curitiba-PR), e no seu interior foi colocada a amostra. Foram depositados
0,2 L de solvente em balão com capacidade de 0,25 L colocado em manta aquecedora
com controlador de voltagem (Fisaton, modelo 102, São Paulo, SP). A temperatura de
aquecimento foi determinada visando à obtenção de refluxos em intervalos de tempo
espaçados e o tempo de extração foi determinado. Após o resfriamento, o frasco
coletor foi acoplado a um sistema de rota evaporação (Heidolph Instruments modelo
Laborota 4001, Viertrieb, Alemanha) com bomba de vácuo (Heidolph Instruments,
modelo Rotavac Control, Viertrieb, Alemanha) a 40 ºC e 0,11 atm, para remover o
solvente.
A composição do extrato é função da temperatura de extração, mas
também do tempo. Assim, realizaram-se experimentos preliminares modificando o
tempo de extração e avaliando a sua influência na composição do extrato.
74
4.5.2. Extração por PLE (Lote 1)
A PLE foi realizada com a matéria-prima do Lote 1 (fresca e liofilizada). A
unidade de extração utilizada nos experimentos pode operar com células de extração
de três diferentes volumes (5, 50 ou 100 mL) revestidas por uma “camisa” de
aquecimento elétrico. A unidade conta com um recipiente para conter o solvente, uma
bomba de HPLC (Thermoseparation Products, Modelo 3200 ConstaMetric P/F,
Fremoni, EUA) que opera com vazões na faixa de 0,001 a 10,0 mL/min, um
manômetro, uma válvula que controla a vazão do solvente, um indicador e controlador
de temperatura, uma válvula back pressure responsável pelo controle e manutenção
da pressão e um recipiente de coleta. Todas as ligações dentro do sistema foram
feitas de tubos de aço inoxidável (1/16” e 1/8”). Esta unidade trabalha em temperaturas
e pressões nas faixas de 25 a 180 ºC e 0,5 a 40 MPa, respectivamente. A Figura 4.2
mostra um diagrama esquemático da unidade utilizada, e a Figura 4.3 mostra a
fotografia da unidade PLE que foi montada no Laboratório de Alta Pressão em
Engenharia de Alimentos (LAPEA /DEA/FEA/Unicamp).
Figura 4.2. – Diagrama esquemático da unidade de extração com liquidos
pressurizados (PLE). R - Recipiente (solvente); B - Bomba de solvente; M -
Manômetro; V - Válvula de bloqueio; CE - Célula de extração com aquecimento; BP –
Válvula back pressure; T – Controlador e indicador de temperatura; VC – Vaso de
coleta.
75
Figura 4.3. – Unidade PLE. A - Bomba de HPLC; B - Manômetro; C - Válvula
de bloqueio; D - Célula de extração com aquecimento; E - Válvula back pressure.
A utilização dos respectivos solventes, bem como suas combinações, se
baseou em estudos anteriormente realizados por Seabra et al. (2010).
As extrações por PLE foram realizadas fixando a temperatura, pressão e
vazão de solvente em 40 ºC, 20 MPa e 10 mL/min, respectivamente, e variando a
proporção volumétrica de solventes, como mostra a Tabela 4.2. Água acidificada com
pH 2,0 foi usada como solvente em alguns experimentos, por ser indicada para a
solubilização das antocianinas. Acetona também foi testada como solvente somente
na amostra fresca. As extrações foram realizadas usando uma célula de 5 mL, e em
duplicata. Para as amostras frescas foram utilizados 4 g e para a amostra liofilizada,
0,8 g, sendo o restante da célula preenchido por microesferas de vidro.
O solvente foi bombeado por uma bomba de HPLC (Thermoseparation
Products, Modelo 3200 ConstaMetric P/F, Fremoni, EUA) para a célula de extração
colocada em uma camisa de aquecimento elétrico na temperatura desejada até que a
pressão desejada fosse obtida. Após a PLE, os extratos foram resfriados rapidamente
até 5 oC em água gelada para evitar a degradação das antocianinas e de outros
76
compostos termolábeis. A PLE geralmente requer menos tempo (tempo de extração
varia entre 5 a 30 minutos) e menor consumo de solventes que as técnicas
convencionais (MENDIOLA et al., 2007). Com isso, as extrações por PLE foram
realizadas em 15 minutos e em duplicata.
O solvente foi evaporado da solução do extrato utilizando um evaporador
rotativo a vácuo (MARCONI, MODELO MA120) com bomba de vácuo (MARCONI,
MODELO MA 057/3, pressão máxima de 5,3 bar e 730 mmHg de vácuo. Todos os
extratos foram armazenados a -10 ºC no escuro até serem caracterizados.
Tabela 4.2. Planejamento de extrações por PLE e respectivos solventes.
H2O (%) Etanol (%) Acetona (%)
Amostra fresca
(4 g)
- 100 -
50 50 -
100 - - Água acidificada (*)
100
Amostra liofilizada
(0,8 g)
- 100 -
50 50 -
100 - - Água acidificada (*)
50 50 - Água acidificada (*)
(*) com ácido cítrico em pH = 2,0.
4.5.3. Extrações por SFE (Lotes 1 e 2)
O método dinâmico semi-contínuo de SFE foi empregado nos experimentos
cinéticos e na determinação do rendimento global de extração da amostra fresca. Este
método é caracterizado pela passagem contínua da solvente supercrítico pela matriz
sólida (FERREIRA, 1999).
Inicialmente foram realizados ensaios de SFE em uma unidade de extração
construída no LAPEA e detalhada na Figura 4.4, conforme procedimentos
determinados por Pascual-Martí et al. (2001) e limitações do equipamento. Estes
ensaios foram realizados com 40 g de amostra fresca utilizando CO2 (99,5% de
pureza, White Martins, Campinas/SP) para definir a melhor condição de pressão e
77
vazão de CO2 para as futuras etapas. Foram construídas OECs para as pressões de
10, 15, 20, 25 e 30 MPa e vazões de CO2 de 1,05 X 10-4 e 1,4 X 10-4 kg/s. Segundo
Khanal et al. (2009), a degradação de antocianinas durante o processo de extração
não ocorre a 40 °C. Por este motivo, essa foi a temperatura adotada em todas as
extrações.
Os testes foram realizados para verificar o funcionamento do equipamento
com a matéria-prima escolhida. As pressões avaliadas nos testes preliminares foram
de 10, 15, 20 e 25 MPa e a temperatura foi fixada em 40 ˚C. O solvente empregado
foi CO2 puro e todos os ensaios foram realizados em duplicata. O rendimento global
de extração, obtido usando uma determinada razão entre massas de solvente (S) e
de matéria-prima (F) (Xo, S/F), foi calculado relacionando a massa total de extrato
(Mextr) e a massa de alimentação de matéria-prima em base seca, de acordo com a
Equação 8.
(𝑋𝑜, 𝑆/𝐹) = (𝑀𝑒𝑥𝑡𝑟
𝐹) 𝑥100 (8)
O rendimento global foi calculado usando a soma das massas dos extratos
obtidos nos frascos de coleta. Os resultados são apresentados como médias
aritméticas de experimentos realizados em duplicata. Segundo Pereira (2005), se a
razão S/F for mantida constante para cada experimento de rendimento de extração, o
X0 é suficiente para determinar a extensão da influência de temperatura e pressão
sobre o rendimento. Portanto, no presente trabalho, as SFEs tiveram seus tempos de
extração calculados para cada experimento e a razão S/F foi fixada em 10 kg
solvente/kg matéria prima.
A unidade de SFE é composta por uma célula de extração de aço inoxidável
com volume de 300 mL, que suporta pressões de até 45 MPa. A unidade é equipada
com um banho de refrigeração que controla a temperatura do CO2 na entrada da
bomba, um banho de aquecimento e uma manta de aquecimento que mantêm a
temperatura da célula de extração. A unidade ainda conta com uma bomba de
cossolvente, um totalizador de vazão, termopares e manômetros. A Figura 4.4 mostra
o diagrama esquemático da unidade de SFE.
78
Figura 4.4. Diagrama esquemático da unidade de extração supercrítica; V-1,
V- 2, V-3, V-4 e V-5 – Válvulas de bloqueio; V-6 – Válvula micrométrica;
C - Compressor; F - Filtro de ar comprimido; BR – Banho de refrigeração; B - Bomba
(Booster); BA – Banho de aquecimento; I-1 e I-2 – Indicadores de pressão e
temperatura, respectivamente; IC-1 e IC-2 – Temperatura da célula de extração e
temperatura da válvula micrométrica, respectivamente; CE – Célula de extração (300
mL); S – Sonda ultrassônica.
O CO2 inicialmente estocado no reservatório, é resfriado até -10oC no
banho ultratermostatizado BR (Marconi, modelo MA184, Piracicaba-SP) que opera
com etileno glicol. Desta forma, o CO2 é liquefeito na entrada da bomba pneumática,
evitando a cavitação. Esta última, por sua vez, comprime o solvente até a pressão de
extração. O estado supercrítico é atingido por troca térmica em uma serpentina
instalada dentro de um banho de aquecimento, que está regulado para a temperatura
de extração (40 °C). A temperatura do processo é monitorada pelos termopares que
se encontram em contato com a parede externa e na saída do leito de extração.
Assume-se que a temperatura indicada seja a mesma do leito de partículas, uma vez
que o extrator é feito de aço inox, que possui alta condutividade térmica. O solvente
IC-1
IC-2
79
escoa através do leito de extração e a vazão é controlada por uma válvula
micrométrica (agulha), que se encontra na saída da linha. Esta válvula possui um
sistema de aquecimento elétrico monitorado por um termopar com o objetivo de
diminuir os efeitos da expansão Joule-Thomson. Na válvula micrométrica o solvente
é despressurizado até a pressão ambiente e o soluto é precipitado em um recipiente
de coleta de 100 mL. O CO2, agora na fase gasosa, passa pelo rotâmetro, que permite
medir a vazão de solvente no processo. Antes de ser liberado para o ambiente, o CO2
atravessa o totalizador de vazão (LAO, modelo G 0,6 ± 0,001 m³; São Paulo - SP) que
permite calcular o volume total de solvente usado no processo.
4.5.4. Extrações por SFE com cossolventes (Lotes 1 e 2)
Com base nas cinéticas de extração, no rendimento global e na
composição dos extratos obtidos por SFE com CO2 puro, foi definida a melhor
condição de extração. Nessa condição, um planejamento de extrações com
cossolventes foi realizado, a fim de obter maior rendimento dos extratos, conforme
descrito por Leal (2008) e Takeuchi (2009). O planejamento está apresentado na
Tabela 4.3.
Os experimentos de SFE com cossolvente foram realizados na unidade
descrita na Seção 4.5.3, utilizando uma célula de extração de 300 mL. As extrações
foram realizadas fixando a temperatura em 40 °C, a pressão em 20 MPa e a vazão de
CO2 em 1,4 x 10-4 kg/s. Já os cossolventes adicionados ao CO2 foram etanol, água e
água acidificada com ácido cítrico (pH 2,0). A razão S/F foi mantida em 10 kg
solvente/kg matéria prima. O tempo de extração estático (tE) (tempo em que o sistema
carregado de CO2 permanece à espera do equilíbrio termodinâmico) e dinâmico (tD)
(tempo da extração em si) e a vazão de cossolvente (Qcossolvente) foram calculados para
cada extração com base na densidade fornecida pelo site NIST (National Institute of
Standars and Technology, 2013). As concentrações dos cossolventes utilizados foram
selecionadas de acordo com estudos prévios de SFE de compostos fenólicos já
publicados na literatura (PEREIRA, 2005; ADIL et al., 2007; GHAFOORA et al., 2010)
e também com os resultados dos testes preliminares.
80
Tabela 4.3. Condições experimentais de SFE com cossolventes.
CO2 (%) H2O (%) Etanol (%) Adição de ácido cítrico
(pH = 2,0)
Experimentos com amostra fresca
90 10 - -
50 50 - -
90 10 - X
50 50 - X
90 - 10 -
50 - 50 -
50 40 10 -
90 5 5 -
90 8 2 -
95 4 1 -
Após as extrações, todos os extratos foram congelados e posteriormente
liofilizados em liofilizador de bancada (LioTop/LIOBRAS - São Carlos, SP, Brasil) com
o tempo variando de 48 a 72 horas, dependendo da umidade das amostras. Com a
melhor composição de solvente selecionada, com base nas análises realizadas e
condições do equipamento, realizou-se uma SFE com o resíduo de mirtilo liofilizado e
outra extração com o mirtilo fresco macerado sob o abrigo de luz, ambas em duplicata.
A partir da melhor condição de extração utilizando a matéria-prima do Lote
1, definida com base nos resultados obtidos nas análises físico-químicas (fenólicos
totais, capacidade antioxidante DPPH e ABTS e antocianinas) e no rendimento de
extração, foram realizadas mais 15 (quinze) extrações com a matéria-prima do Lote
2, para obtenção dos extratos a serem utilizados nos processos de separação com
membranas. Todos os extratos foram acondicionados em um mesmo frasco e
mantidos a -18 oC.
4.6. Separação por membranas
4.6.1. Sistemas de Filtração
Foram utilizados dois sistemas de filtração em escala laboratorial (1 e 2),
com volumes de alimentação diferentes, que simulam um processo de filtração dead-
81
end agitado, cujas ilustrações esquematizadas estão apresentadas na Figura 4.5.
Ambos os sistemas estão instalados no LAPEA/DEA/FEA/Unicamp.
(a) (b)
Figura 4.5. (a) Sistema de filtração 1: V1 - Válvula abre/fecha do cilindro de
nitrogênio, M1 - Manômetro 1: fornece a leitura da pressão interna do cilindro de
nitrogênio quando V1 está aberta, V2 - Válvula de regulagem: regula a pressão no
interior da célula, M2 -Manômetro 2: fornece a leitura da pressão no interior da célula,
V3 - Válvula de 3 vias (escape), V4 - Válvula de saída de permeado. (b) Sistema de
filtração 2: (1) entrada e saída da camisa de aquecimento, (2) entrada de gás
nitrogênio para pressurização da célula, (3) suporte do bastão magnético, (4) suporte
do disco de membrana, (5) saída de permeado e (6) agitador magnético.
Sistema de filtração 1: A célula laboratorial é construída em aço inox AISI 304,
constituída de um cilindro encamisado com capacidade de 800 mL e opera até
pressão de 4 MPa. Sobre a base (saída de permeado) é montado um suporte que
serve de apoio ao disco de membrana. Anéis de vedação (padrão sanitário) impedem
o vazamento entre as partes. Sobre a base é montado um suporte que serve de apoio
ao disco de membrana, que tem área efetiva de permeação de 15,2 cm². Abaixo da
base é acoplado um agitador magnético (IKA® KMO 2 Basic, Alemanha), que
100 1100
2
4
1
1
5
6
3
82
promove a agitação da solução alimentada com a finalidade de aumentar o fluxo de
permeado, diminuindo o efeito da resistência devido à camada polarizada que se
forma sobre a membrana e também simula uma corrente tangencial de alimentação à
membrana. Anéis de vedação impedem o vazamento entre as partes. Na parte
superior do cilindro, encontra-se uma entrada de gás nitrogênio (Air Liquide Brasil,
São Paulo-SP) para pressurização do sistema gerando a força motriz do processo. A
temperatura é controlada por meio da circulação de água na camisa do equipamento,
através de um banho termostático (Modelo NT2, Nova Técnica, Piracicaba, SP).
Sistema de filtração 2: A célula de filtração é construída em aço inoxidável, composta
de um cilindro encamisado com 20 cm de altura e 4,4 cm de diâmetro interno
apresentando um volume útil de 200 mL. A base do cilindro possui uma válvula que
permite a liberação do material permeado. Na tampa superior do equipamento existe
um eixo central fixo, em cuja extremidade inferior está encaixado o agitador
magnético, que promove a agitação da alimentação. Na parte superior está localizada
a entrada de gás nitrogênio para criar a pressão no interior da célula, gerando a força
motriz do processo. A temperatura é controlada por meio da circulação de água na
camisa do equipamento, através de um banho termostático (Modelo NT281 Nova
Técnica, Piracicaba, SP).
Foram testadas seis membranas planas de micro, ultra como pré-filtrações
(testes preliminares) e nanofiltração, cujas propriedades encontram-se na Tabela 4.4.
83
Tabela 4.4. Principais propriedades das membranas utilizadas.
Fabricante Membrana
Plana
MMC
(Da)1 Material
Pressão
Máxima
(MPa)
Temperatura
Máxima (°C)
Faixa
de
pH
Microdyn-
Nadir GmbH,
Wiesbaden,
Germany
MF 0,05
µm Polieterssulfona 0,1 a 1 95 1-14
UF 100000 Polieterssulfona 0,1 a 1 95 1-14
NF 10 1000 Polieterssulfona 4 95 0-14
NF 30 400 Polieterssulfona 4 95 0-14
Filmtec, Dow
Chemical
Company, São
Paulo, SP,
Brazil
NF 90 200-
300
Poliamida e
Polissulfona 4,1 45 3-10
NF 270 200-
300
Polipiperazina,
Poliamida e
Polisulfona
4,1 45 3-10
1-NADIR, MEMBRANE AND FORMATS (2014) e DOW WATER & PROCESS SOLUTIONS (2014).
4.6.2. Processos de separação por membranas
Após as extrações por SFE com cossolventes, foi estabelecido um
planejamento de processos de concentração por membranas. Todas as
concentrações foram feitas com membranas planas e em duplicata. Testes
preliminares foram realizados com as matéria-primas dos Lotes 1 (extrato, resíduo e
suco concentrado) e 2 (extrato e resíduo), conforme descrito na Tabela 4.5. Os
procedimentos das concentrações por membranas foram realizados a partir de duas
alimentações, somente com a matéria-prima do Lote 2, com diferentes fatores de
concentração, devido às quantidades de alimentação (NF10: 4, NF 30 e 270: 2 e NF
90: 1,5). As soluções de alimentação usadas foram as seguintes:
1- 40 g de resíduo de mirtilo do Lote 2, macerado com 40 mL de solução (50% água
e 50% etanol), filtrado em papel de filtro de 3 µm;
2- 40 mL de extrato obtido na melhor condição de SFE do Lote 2, ou seja, 90% CO2,
5% água e 5% de etanol, pressão de 20 MPa, temperatura de 40 oC e vazão de
solvente de 1,4 x 10-4 kg/s.
84
Tabela 4.5. Planejamento dos processos de concentração por membranas.
Alimentação Processo Membrana
TT (oC)
Pressão (MPa)
Área de permeação
(m2)
Teste
s p
relim
inare
s
Lo
te 1
9 g extrato SFE1/400 mL água acidificada 2
Ultrafiltração 100000 30 0,3 0,005024
*Nanofiltração NF 10 30 3 0,005024
9 g resíduo3/400 mL água acidificada 2
Ultrafiltração 100000 30 0,3 0,005024
*Nanofiltração NF 10 30 3 0,005024
60 g suco concentrado4/400 mL
água acidificada 2 Nanofiltração NF 10
20 0,3 0,005024
30 3 0,005024
L
ote
2
6 g extrato SFE1/400 mL água acidificada 2
Microfiltração 0,05 µm 25 0,1 0,005024
25 0,25 0,005024
6 g resíduo3/400 mL água acidificada 2
Ultrafiltração 100000
25 0,45 0,005024
25 0,3 0,005024
25 0,3 0,005024
25 0,3 0,005024
6 g resíduo3/400 mL água acidificada 2
Nanofiltração NF 10 25 1 0,005024
6 g resíduo3/400 mL água acidificada 2
Nanofiltração NF 30 25 2,5 0,005024
40 g resíduo3/40 mL solução5
Nanofiltração NF 10 40 3 0,005024
40 g resíduo3/40 mL solução5
Nanofiltração NF30 40 3 0,00152
Pro
ced
imen
tos
Lo
te 2
40 g resíduo3/40 mL solução5
Nanofiltração NF10 40 4 0,00152
40 g resíduo3/40 mL solução5
Nanofiltração NF 30 40 4 0,00152
40 g resíduo3/40 mL solução5
Nanofiltração NF 90 40 4 0,00152
40 g resíduo3/40 mL solução5
Nanofiltração NF 270 40 4 0,00152
40 mL extrato SFE1
Nanofiltração NF 10 40 4 0,00152
40 mL extrato SFE1
Nanofiltração NF 30 40 4 0,00152
40 mL extrato SFE1
Nanofiltração NF 90 40 4 0,00152
40 mL extrato SFE1 Nanofiltração NF 270 40 4 0,00152 1Extrato SFE obtido na melhor condição, 2(pH 2,0), 3 macerado, 4 Suco concentrado a 65o, 5Solução 50% etanol, 50% água (v/v).
*A alimentação da nanofiltração foi realizada com o permeado da ultrafiltração.
85
Para a obtenção da alimentação do resíduo, foi realizada a maceração do
mesmo e posteriormente a filtração em papel de filtro qualitativo Nalgon – Ref. 3400
– Diâmetro 18,5 cm e porosidade de 3 micras.
Após os processos de concentração, todas as amostras de permeados,
retidos e alimentações foram analisadas em duplicata. Nas amostras dos testes
preliminares, foram determinados os teores de compostos fenólicos e antocianinas
monoméricas, pelas metodologias descritas nas Seções 4.4.1 e 4.4.4,
respectivamente. Já nos produtos das nanofiltrações para o resíduo e extrato, foram
realizadas análises de antocianinas monoméricas, identificação e quantificação de
antocianinas por UPLC, compostos fenólicos, capacidade antioxidante (DPPH e
ABTS) e umidade.
Para todas as condições de separação em membranas foram calculados o
fluxo final de permeado (Equação 1), o índice de retenção dos compostos de interesse
(Equação 5) e foram construídas as curvas de fluxo do permeado.
4.6.3. Análises estatísticas
As análises de variância (ANOVA) foram realizadas utilizando o software
Minitab versão 8.1 de 2010 for Windows (LEAD Technologies, Inc.). Foi utilizado One-
way para encontrar uma diferença significativa entre dois ou mais resultados. A
hipótese nula para o teste é que todas as médias de resultados são as mesmas.
Utilizou-se o teste de Tukey para determinar diferenças estatisticamente significativas
ao nível de 5%. Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão.
86
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização das matérias-primas
5.1.1. Características físico-químicas das matérias-primas
As características físico-químicas dos resíduos de mirtilo (Lotes 1 e 2) estão
apresentadas na Tabela 5.1.
Tabela 5.1. Características físico-químicas dos resíduos de mirtilo fresco
fornecidos pela empresa Orgânicos Pérolas da Terra.
Atributos de Qualidade
Lote 1
Lote 2
Resultados da literatura
(mirtilo fresco)
°Brix (sólidos solúveis) 10,33 11,27 11,8 – 14,0* Acidez (% ácido cítrico) 0,48 0,52 0,76 – 1,28*
Ratio (relação brix/acidez) 21,52 21,67 - pH 3,33 3,09 2,56 – 3,20*
Vitamina C (mg/100g) 74,75 54,90 - Umidade (%) 84,0 ± 0,2 75,1 ± 0,1 87,68**
*(REDIES et al., 2006), **(SILVEIRA et al., 2007)
Observa-se que os resíduos de ambos os lotes apresentam características
físico-químicas semelhantes às da fruta fresca, descritas por Redies et al. (2006). Os
resíduos frescos apresentam umidade muito próxima à da fruta fresca, que é de
87,68%, segundo Silveira et al. (2007).
Os resíduos do Lote 1, após o processo de secagem, apresentaram
redução de umidade chegando a 11,3 ± 0,1% na amostra liofilizada e 11,3 ± 0,2% na
amostra seca em estufa.
87
5.1.2. Teor de fenólicos totais, capacidade antioxidante e antocianinas nas
matérias-primas.
A Tabela 5.2 apresenta os teores de compostos fenólicos, capacidade
antioxidante (DPPH e ABTS) e antocianinas monoméricas obtidos das amostras de
resíduos liofilizado, seco em estufa e fresco.
Tabela 5.2. Compostos fenólicos, capacidade antioxidante (DPPH e ABTS) e
antocianinas nos resíduos de mirtilo dos Lotes 1 e 2 fresco, liofilizado e seco em
estufa.
Umidade
(%)
Compostos fenólicos
(mg GAE*/g resíduo)
DPPH (µmol TE**/g
resíduo)
ABTS (µmol TE**/g
resíduo)
Antocianinas (mg/100g resíduo)
Liofilizado (Lote 1) 11,3 ± 0,1 66,5 ± 0,4 1284 ± 2 49,8 ± 0,7 301 ± 29 Seco em estufa (Lote 1) 11,3 ± 0,2 57 ± 2 1082,0 ± 0,7 27 ± 1 134 ± 10
Fresco (Lote 1) 84,0 ± 0,2 11,7 ± 0,6 446,0 ± 0,7 17 ± 1 175 ± 17 Fresco (Lote 2) 75,1 ± 0,1 2,0 ± 0,1 74,8 ± 1,5 4,1 ± 0,2 49,7 ± 0,6
*GAE – Equivalente de ácido gálico **TE –Equivalente de Trolox.
Pode-se verificar que a amostra liofilizada apresenta maior concentração
de compostos fenólicos que as amostras frescas. Isso se deve à conservação destes
compostos no decorrer do processo de liofilização, que protege os componentes
termossensíveis da degradação térmica. Para a amostra seca em estufa, a
concentração de compostos fenólicos diminui em relação à liofilização. Isso se deve
à perda destes compostos durante o aquecimento.
Severo et al. (2009) fizeram análises de compostos fenólicos da polpa de
mirtilo e obtiveram teores inferiores aos encontrados neste trabalho para o resíduo
fresco (Lote 1). Isso pode ocorrer, pois os flavonoides se acumulam nas cascas e
folhas das plantas, já que a sua síntese é estimulada pela luz. Entretanto, os
resultados apresentados por esses autores são semelhantes aos encontrados no
resíduo do Lote 2. Isso pode explicar a possível diferença de composição entre frutos
de uma mesma planta, ou seja, os frutos que recebem uma maior quantidade de luz
tendem a ter uma síntese pronunciada desses compostos (PRICE et al., 1995.) Além
88
disso, os Lotes 1 e 2 apresentam diferenças por terem passado por diferentes tipos
de processamento: arraste a vapor (quente) e despopadeira (frio).
A capacidade antioxidante (DPPH) do resíduo de mirtilo fresco (Lote 1) foi
metade da reportada por Reque (2012), que encontrou 919,21 µmol TE/g no resíduo
e 480,84 µmol TE/g no suco. Essa diferença pode ser explicada pela variedade
utilizada em cada caso ou até mesmo pela quantidade de suco presente no resíduo.
Já para o produto liofilizado, a capacidade antioxidante aumentou 2,9 vezes e se
repetiu para a amostra seca em estufa. Pode-se perceber que a capacidade
antioxidante (DPPH) do resíduo do Lote 2 é muito inferior às demais, sugerindo que o
processo de obtenção do resíduo por arraste de vapor degradou grande parte dos
compostos responsáveis pela capacidade antioxidante.
A capacidade antioxidante do resíduo do Lote 1, determinada por ABTS, é
cerca de três vezes maior que a encontrada por Vendruscolo (2011), o que pode ser
explicado por diferença de variedade e safra. Porém, esta capacidade é semelhante
à encontrada no Lote 2. Já para o resíduo liofilizado, a capacidade antioxidante
aumentou em 65% em relação ao resíduo fresco. Para a amostra seca em estufa, a
capacidade antioxidante apresentou valor menor que o da amostra liofilizada, o que
pode ser explicado pelas perdas de compostos antioxidantes durante o processo de
secagem.
O resíduo do Lote 1 apresentou teor de antocianinas compatível com o
encontrado por White et al. (2010), que encontrou de 121,4 a 362,5 mg/100 g de
antocianinas em resíduos de mirtilo. Nota–se que no Lote 2 os resultados foram
inferiores, evidenciando a degradação das antocianinas pelo método de extração do
suco. Os teores de antocianinas encontrados por Reque (2012) no resíduo de mirtilo
são mais que o dobro (375,48 mg/100 g), sendo majoritária a cianidina-3-glucosídeo.
Para as amostras liofilizadas, a concentração de antocianinas foi cerca de duas vezes
maior que na amostra fresca, e para a amostra seca em estufa o teor de antocianinas
caiu para 134 ± 10 mg/100 g. É importante salientar que, com o aquecimento no
processo de secagem em estufa, as antocianinas da amostra sofreram degradação,
já que temperaturas superiores a 80 ºC provocam degradação destes compostos
(DIRBY et al., 2001).
89
Verifica-se, portanto, que a redução da umidade resultou no aumento de
capacidade antioxidante e de concentração de compostos fenólicos. Já para as
antocianinas, a exceção ocorreu com a amostra seca em estufa, devido às altas
temperaturas de secagem que podem ter ocasionado a degradação das mesmas.
Com as perdas dos compostos de interesse durante o processo de
secagem do resíduo em estufa, as etapas seguintes (extrações e análises) não foram
executadas para esta amostra.
5.2. Resultados das extrações
5.2.1. Extrações por PLE (Lote 1)
Os rendimentos globais das extrações por PLE e as caracterizações dos
extratos obtidos (fenólicos totais, capacidade antioxidante DPPH e ABTS e
antocianinas) estão apresentados na Tabela 5.3.
90
Tabela 5.3. Rendimento e caracterizações (fenólicos totais, capacidade
antioxidante DPPH e ABTS e antocianinas monoméricas) dos extratos obtidos de
resíduo de mirtilo por PLE a 20 MPa.
Resíduo fresco
Solventes Rendimento
(%)
Fenólicos Totais (mg
GAE/g extrato).
DPPH (µmol TE/g
extrato)
ABTS (µmol TE/g
extrato)
Antocianinas (mg/100g de
extrato)
100% etanol 3,9 ± 0,3d 87,1 ± 0,2b 1625 ± 12bc 73 ± 1b 234 ± 0,2b 50% etanol e 50%
água 4,3 ± 0,1d 90 ± 2b 1746 ± 71ab 66 ± 1bc 250 ± 10ab
100% água acidificada (pH 2,0)
6,8 ± 0,2b 85 ± 1b 1227 ± 31e 31 ± 1e 254 ± 0,6ab
50% água acidificada (pH 2,0)
e 50% etanol 5,8 ± 0,2c 86 ± 1b 1242 ± 3e 73 ± 3bc 119 ± 0,8c
100% acetona 2 ± 0,2e 65 ± 1d 1466 ± 11d 63 ± 5c 101 ± 6d
Resíduo liofilizado
100% etanol 4,2 ± 0,3d 102 ± 1a 1867 ± 5a 103 ± 2 a 257 ± 4ab 50% etanol e 50%
água 5,4 ± 0,3c 99,5 ± 0,8a 1809 ± 62a 43 ± 4d 234 ± 2b
100% água acidificada (pH 2,0)
8,0 ± 0,1a 74,5 ± 0,4c 1510 ± 7cd 24 ± 2e 263,0 ± 0,7a
50% água acidificada (pH 2,0)
e 50% etanol 5.0 ± 0,3c 85 ± 4b 1507 ± 1cd 50 ± 1d 110 ± 10c
Valor da média dos ensaios em duplicata, na mesma coluna letras diferentes representam diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,05). GAE – Equivalente de ácido gálico; TE –Equivalente de Trolox.
A instabilidade da pressão e da vazão da acetona acarretaram na não
realização da PLE com este solvente para a amostra liofilizada. Outro parâmetro
avaliado foi o rendimento de extração, que foi mais baixo utilizando a acetona, também
diferente significativamente dos demais. Isso se deve à baixa afinidade da acetona
com os componentes de interesse a serem extraídos.
Os maiores rendimentos globais foram alcançados com a mesma
composição de solvente (100% água acidificada). Além disso, o rendimento da PLE
do resíduo liofilizado com água acidificada apresentou diferença significativa em
relação a todos os demais.
O teor de fenólicos para os extratos obtidos na PLE, tanto para a amostra
liofilizada quanto para a fresca, aumentou em relação ao dos resíduos fresco e
liofilizado. Os compostos fenólicos se apresentaram em maior quantidade nos
91
experimentos utilizando 100% etanol e 50% etanol e 50% água (amostra liofilizada)
como solventes, e se diferenciaram estatisticamente dos demais. Isso se explica pela
concentração dos nutrientes decorrentes da redução do percentual de água,
resultante dos processos de liofilização.
O teor de fenólicos dos extratos obtidos com acetona se diferenciou
estatisticamente dos demais, com um resultado inferior. Por se tratar de um solvente
orgânico e de alta volatilização, não ocorreu a dissolução dos compostos de interesse.
As atividades antioxidantes dos extratos obtidos por PLE, medidas por
DPPH e ABTS, foram maiores que as da matéria-prima, tanto para o resíduo fresco
quanto para o liofilizado. Comparando as atividades antioxidantes medidas por DPPH,
somente os extratos obtidos com 100% água acidificada e 50% água acidificada e
etanol (fresco) apresentaram-se abaixo dos outros experimentos, com diferença
significativa em relação aos demais. Isto pode ser explicado pela baixa interação do
ácido na capacidade de solubilização de componentes polares, além da possível
degradação destes compostos durante o processo, visto que o rendimento destas
extrações foi maior que o das demais.
Pode-se observar que as amostras, tanto frescas como liofilizadas,
extraídas utilizando água acidificada com ou sem etanol na solução, apresentaram
atividades antioxidantes medidas por DPPH menores que as das amostras onde não
foi utilizada água acidificada. O mesmo ocorreu no método ABTS, quando a amostra
foi submetida à extração somente com água acidificada. Os extratos obtidos com
etanol apresentaram maior capacidade antioxidante e diferenciaram-se
estatisticamente dos demais. Como o resíduo de mirtilo contém compostos polares e
apolares, as extrações realizadas com etanol e água promoveram a remoção de
substâncias apolares, pelo fato do etanol ser capaz de extrair apolares e, tendo em
vista a polaridade da água, a solubilização foi maior. Concomitantemente, as
extrações utilizando água (acidificada ou não) apresentaram menor capacidade
antioxidante.
Analisando os teores de antocianinas monoméricas dos extratos, pode-se
concluir que a PLE é eficiente na recuperação destes compostos, visto que as
quantidades de antocianinas extraídas da amostra fresca nos experimentos com 50%
etanol e 50% água e com 100% agua acidificada, comparadas à da matéria-prima,
92
foram maiores. A combinação de água acidificada e etanol não melhorou o resultado,
e a concentração de antocianinas diminuiu pela metade, diferenciando-se
significativamente dos demais experimentos. O mesmo ocorreu na PLE com acetona,
que apresentou teor de antocianinas abaixo do encontrado na matéria-prima. Já para
a amostra liofilizada, o experimento com 100% de água acidificada foi o que
apresentou maior concentração de antocianinas, média igual ao experimento com o
mesmo solvente, porém com amostra fresca, o que se deve à maior estabilidade das
antocianinas em condições ácidas. Além disso, pode ter ocorrido um processo de
oxidação do material vegetal devido ao baixo pH do solvente, o que pode facilitar
também o processo de extração.
Os experimentos utilizando 50% água acidificada e 50% etanol, para
ambas as matérias-primas, produziram extratos com concentrações de antocianinas
estatisticamente iguais. A extração com acetona não foi efetiva para a obtenção de
antocinaninas.
Para ambos resíduos (liofilizado ou fresco), o solvente de PLE que obteve
maior recuperação de antocianinas foi a água acidificada. A estabilidade da cor das
antocianinas é dependente da estrutura e da concentração dos pigmentos, além de
fatores como o pH, a temperatura e a presença de oxigênio. A sensibilidade ao pH é
o principal fator limitante no processamento e utilização das antocianinas, afetando a
cor e a estabilidade química. Em soluções ácidas, a antocianina é vermelha, mas com
o aumento do pH a intensidade de cor diminui (MAZZA e BROUILLARD, 1987).
Considerando os resultados, as melhores condições de PLE dos
compostos de interesse (compostos fenólicos, capacidade antioxidante e
antocianinas) foram utilizando 50% de etanol e 50% de água para a amostra fresca,
porém com baixo rendimento global, e 100% etanol para a amostra liofilizada, com
bom rendimento de extração.
5.2.2. Extração Soxhlet (Lote 1)
93
A extração pelo método Soxhlet com hexano não foi eficiente, ou seja, não
ocorreu recuperação de extratos para nenhuma das amostras. Já com metanol
ocorreu a extração com ambas as amostras. A explicação para isso está na polaridade
dos solventes, visto que a função dos mesmos é solubilizar os componentes da matriz.
O hexano apresenta polaridade menor que o metanol, resultando em extratos com as
características descritas na Tabela 5.4.
Tabela 5.4. Resultados das análises de fenólicos totais, capacidade antioxidante
DPPH e ABTS e antocianinas monoméricas das amostras extraídas por Soxhlet com
metanol.
Amostra
liofilizada
Amostra seca em estufa
Amostra fresca
Rendimento global (%) 67,8 57 33,66 Fenólicos totais (mg GAE1/g3) 95,0 ± 0,1a 91 ± 1b 30 ± 2c
DPPH (µmol TE2/g3) 1898,0 ±
0,1a 1702 ± 39b 168 ± 8c
ABTS (µmol TE2/g3) 22 ± 1b 27 ± 2a 23,0 ± 0,2ab Antocianinas (mg/100g3) 162 ± 11a 45 ± 2b 143 ± 6a
Valor da média dos ensaios em duplicata; na mesma coluna letras diferentes representam diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,05). 1GAE – Equivalente de ácido gálico 2TE –Equivalente deTrolox. 3g de
extrato.
Com os resultados expostos na Tabela 5.4 pode-se afirmar, comparando
com os resultados do resíduo (Lote 1) (Tabela 5.1), que o processo de extração
degradou alguns compostos, principalmente as antocianinas, que apresentaram
perda considerável em todos os extratos analisados. Estatisticamente, as amostras
liofilizada e fresca não apresentaram diferenças nas médias. Porém, comparando com
a amostra seca em estufa, a diferença foi significativa. Sugere-se que a amostra seca
em estufa já apresentava degradação de antocianinas causada pelo processo anterior
de secagem a elevada temperatura e tempo de exposição ao calor.
Em relação à capacidade antioxidante medida por DPPH, o extrato do
resíduo fresco apresentou perda de aproximadamente 62%, com valor de 168 µmol
TE/g em relação ao resultado encontrado anteriormente, de 446 µmol TE/g da
matéria-prima. Isso pode ser explicado pelo aquecimento e manuseio da amostra
durante a extração.
94
Já para os compostos fenólicos, a extração com sistema Soxhlet foi
eficiente, resultando em maiores teores nos extratos, correspondentes a 43%, 59% e
150% da amostra liofilizada, seca em estufa e fresca, respectivamente, em relação
aos encontrados nas matérias-primas. Os resultados obtidos com diferentes matérias-
primas se diferenciaram estatisticamente (p < 0,05). Mattivi et al. (2002) e Vrhovsek
et al. (2004) extraíram compostos fenólicos de mirtilos frescos e o resultado
encontrado foi satisfatório utilizando acetona como solvente, pois houve extração
máxima da maioria das classes de polifenóis de diferentes frutas.
5.2.3. Extrações por SFE
5.2.3.1. Treinamento e ensaios preliminares (Lote 1)
As pressões utilizadas para as extrações preliminares por SFE foram de
10, 15, 20, 25 e 30 MPa. As extrações a 10 e 30 MPa não apresentaram eficiência,
devido a incontroláveis oscilações na vazão de solvente, ou seja, dificuldade de
manter estável a vazão, gerando resultados não confiáveis durante a extração.
Percebeu-se também que nessas pressões o equipamento trabalhou com muitas
paradas, problemas nas bombas e entupimentos nas válvulas. Por isso, apenas as
pressões de 15, 20 e 25 MPa foram selecionadas para os experimentos
subsequentes.
5.2.3.2. Cinéticas de SFE (Lote 1)
Foram realizadas extrações em duplicata. As melhores curvas obtidas
estão ilustradas na Figura 5.1.
95
Figura 5.1. Curvas globais de SFE de resíduo de mirtilo fresco obtidas a 15 MPa
(a), 20 MPa (b) e 25 MPa (c) e 40 °C.
0,728
0,73
0,732
0,734
0,736
0,738
0,74
0 20 40 60 80 100
X0,
S/F
(C
O2)
Tempo (min)
(a)
0,74
0,75
0,76
0,77
0,78
0,79
0,80
0,81
0 20 40 60 80 100
X0,
S/F
(C
O2)
Tempo (min)
(b)
0,855
0,86
0,865
0,87
0,875
0,88
0,885
0,89
0 20 40 60 80 100 120
X0,
S/F
(C
O2)
Tempo (min)
(c)
96
Nas três condições verifica-se que, após um tempo médio de 30 minutos,
o rendimento se estabilizou. Portanto, estabeleceu-se um tempo de 60 minutos para
todas as extrações subsequentes, para certificar que as extrações obteriam todo o
material solúvel em cada condição. A vazão média de CO2 calculada foi de 1,4 x 10-4
kg/s, durante 60 min de extração, totalizando uma razão S/F de 10 kg CO2/kg resíduo.
Os rendimentos globais das extrações foram de 1,84%, 1,96% e 2,19% para as
pressões de 15, 20 e 25 MPa, respectivamente.
A escolha da melhor condição de pressão e vazão levou em conta o
rendimento global, as condições de operação do equipamento, o comportamento das
curvas de extração e, principalmente, os resultados das análises realizadas nos
extratos obtidos, apresentados na Tabela 5.5.
Tabela 5.5. Fenólicos totais, capacidade antioxidante DPPH e ABTS e
antocianinas monoméricas dos extratos obtidos por SFE do resíduo de mirtilo fresco
Fenólicos totais (mg GAE*/g
extrato)
DPPH (µmol TE**/g
extrato)
ABTS (µmol TE**/g
extrato)
Antocianinas (mg/100g extrato)
15 MPa 36,0 ± 0,2b 590,0 ± 0,4b 13,0 ± 0,5b 209 ± 5b
20 MPa 41 ± 2a 688,0 ± 0,8a 14,0 ± 1,3a 265 ± 8a
25 MPa 28 ± 2c 514,0 ± 0,2c 10,0 ± 0,2c 178 ± 9c
Valor da média dos ensaios em duplicata; na mesma coluna letras diferentes representam diferenças estatisticamente
significativas (p < 0,05). *GAE – Equivalente de ácido gálico **TE – Equivalente de Trolox.
Os resultados apresentados na Tabela 5.5 justificam a escolha da pressão
de 20 MPa e a temperatura de 40 °C para os experimentos seguintes, comprovados
pelas análises dos compostos de interesse. Os rendimentos obtidos nas diferentes
pressões se diferenciaram significativamente para todas as análises realizadas.
Com base nos resultados das análises para os extratos obtidos do resíduo
fresco na melhor condição escolhida (20 MPa), pode-se afirmar que a extração SFE
é mais eficiente que a extração Soxhlet.
97
5.2.3.3. SFE com cossolventes (Lote 1)
No início dos processos de SFE com cossolventes alguns obstáculos foram
encontrados: a vazão de CO2 não se estabilizou, houve oscilações nas vazões de
cossolvente, e com isso as bombas paravam de funcionar frequentemente. Depois de
alguns ajustes nas bombas e nas vazões de CO2 e de cossolvente, as extrações
puderam ser realizadas.
Para definir a quantidade de cossolvente a ser utilizada em cada
experimento, utilizou-se o programa do webbook NIST (2013) para obter a densidade
do CO2 nas condições de pressão e temperatura de cada experimento. Primeiramente
é necessário obter a temperatura e a pressão ambiente com ajuda de um termômetro
e barômetro e adicionar os dados ao programa para a obtenção da densidade do CO2
no início do experimento. Com a densidade do CO2 encontrada e a vazão de solvente
estabelecida em 1,4 x 10-4 kg/s, calculou-se a razão S/F, que em todos os casos se
manteve em 10 kg solvente/kg resíduo. Com esse valor, e de acordo com a
porcentagem de cossolvente estipulada no planejamento e sua respectiva densidade,
calculou-se o tempo final do experimento, assim como a vazão do cossolvente a ser
utilizada em cada condição. Quando houve mistura de cossolventes, calculou-se
também a densidade da mistura. Este procedimento foi realizado em todas as
extrações, incluindo as duplicatas.
Os rendimentos globais das extrações SFE com cossolventes foram
calculados utilizando a Equação 9, apresentada na Seção 4.5.3, e estão apresentados
na Tabela 5.6. Esta tabela também apresenta a caracterização dos extratos em
termos de compostos fenólicos, capacidade antioxidante, taninos e antocianinas
monoméricas.
98
Tabela 5.6. Rendimento global, compostos fenólicos, capacidade antioxidante DPPH e ABTS, taninos e antocianinas
monoméricas dos extratos obtidos por SFE com cossolventes e das extrações com resíduo de mirtilo liofilizado e mirtilo fresco
macerado, todos utilizando o Lote 1.
Solventes X0 (%)
Fenólicos totais (mg GAE**/g extrato)
DPPH (µmol TE*/g extrato)
ABTS (µmol TE*/g extrato)
Taninos (mg taninos/25 g
extrato)
Antocianinas monoméricas
(mg/100 g extrato
Extr
ato
s S
FE
co
m c
ossolv
ente
s –
Resíd
uo
de m
irtilo
fre
sco
10% água 5,3 ± 1cd 65 ± 4d 1422 ± 11abc 129 ± 1cd 191 ± 6ab 420 ± 31 c
50% água 8,4 ± 0,5b 48 ± 4de 1188 ± 116cd 114 ± 11de 229 ± 4 ab 291 ± 27 cde
10% água acidificada (pH=2,0)
2,7 ± 0,1e 46,0 ± 0,4de 808 ± 77ef 87 ± 7ef 140 ± 6 ab 326 ± 12 cd
50% água acidificada (pH=2,0)
16 ± 2a 33 ± 3e 639 ± 49f 74 ± 7f 127 ± 4 ab 291 ± 26 cde
10% etanol 3,3 ± 0,3de 109 ± 9b 1083 ± 103de 89 ± 4ef 119 ± 10b 134 ± 2 e
50% etanol 4,7 ± 0,5cd 119 ± 2ab 1141 ± 111cde 97 ± 6def 161 ± 6 ab 136 ± 2 e
40% água e 10% etanol 6,9 ± 0,6bc 62 ± 0,3d 1292 ± 23bcd 116 ± 11de 119 ± 5 b 214 ± 15 de
5% água e 5% etanol 2,7 ± 0,3e 134 ± 11a 1658 ± 160a 199 ± 20a 410 ± 16 a 1071 ± 64 a
8% água acidificada (pH=2,0) e 2% etanol
3,5 ± 0,1cde 59 ± 5d 1602 ± 42ab 185 ± 9ab 337 ± 13 ab 716 ± 65 b
4% água acidificada (pH=2,0) e 1% etanol
4,6 ± 0,4de 88 ± 4c 1604 ± 111ab 159 ± 7bc 189 ± 12 ab 709 ± 69 b
Resíduo de mirtilo liofilizado
(5% água e 5% etanol) 8 ± 1a 260 ± 4a 2566 ± 19a 94 ± 1b 3725 ± 23a 1209 ± 111a
Mirtilo fresco macerado (5% água e 5% etanol)
3,0 ± 0,2b 71 ± 6b 949 ± 1b 202 ±2a 863 ± 18b 305 ± 20b
Valor da média dos ensaios em duplicata; na mesma coluna letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). **GAE – equivalente ácido gálico *TE –
Equivalente de Trolox.
99
A extração com 50% de água acidificada apresentou diferença significativa
de todos os demais experimentos, com maior rendimento de extração. Os
experimentos com 50% de água e 40% de água e 10% etanol como cossolventes
apresentaram rendimentos estatisticamente iguais. Nota-se que estes experimentos
apresentaram os maiores rendimentos de extração, porém foram os mesmos que
mais obtiveram dificuldades de operação do equipamento, devido ao excesso de
cossolventes utilizados e da maior solubilidade do CO2. Durante o processo o
funcionamento da bomba se manteve instável, assim como a vazão de CO2.
Os rendimentos globais dos experimentos utilizando 10% de água
acidificada e 5% de água e 5% de etanol foram diferentes significativamente de todos
os demais. O rendimento mais baixo foi obtido no experimento com 10% de água
acidificada, seguido dos experimentos usando 5% de água e 5% de etanol, 10% de
etanol e por último, 8% de água acidificada com 2% de etanol.
Quanto maior a quantidade de cossolvente e menor a quantidade de CO2,
pior é a condição de operação do equipamento, porém o rendimento de extração é
maior, pois ocorre maior solubilização de substâncias de interesse. Por este motivo o
experimento com 50% de água acidificada apresentou maior rendimento de extração.
Por outro lado, com maior quantidade de CO2 e menor quantidade de cossolvente, o
rendimento de extração diminui, porém o equipamento funciona com precisão.
É importante observar que a concentração de cossolvente no CO2 pode
afetar o estado da mistura de solventes. Em proporções de até 10%, água e etanol
são solúveis em CO2 no estado supercrítico na pressão e temperatura aplicadas, de
modo que a mistura de solventes pode ser considerada supercrítica, podendo ser
utilizada em SFE (VEGGI et al., 2014; KITZBERGER et al., 2009; KOPCAK et al.,
2005). Contudo, misturas com concentrações maiores desses cossolventes têm duas
fases (líquida e supercrítica), o que pode afetar o rendimento e a recuperação dos
componentes de interesse. A utilização de cossolventes juntamente com CO2 ajudou
a aumentar o rendimento global, o que era esperado, uma vez que a seletividade da
mistura de solventes foi reduzida pela adição de etanol ou água e, portanto, uma
ampla gama de componentes pôde ser solubilizada. Mais uma vez, o uso da água
contribuiu para a recuperação do extrato, que é acentuada em meio ácido (PAES
et.al., 2014). Seabra et al. (2010) estudaram a SFE de bagaço de sabugueiro e
100
encontraram rendimentos diferentes utilizando CO2/etanol/água, entretanto com as
mesmas conclusões. Os autores encontraram menores rendimentos (1,7%) com
proporções de cossolventes de 90% CO2/8% etanol/2% água e maior rendimento
(21,3%) na proporção de 20% CO2/40% etanol/40% água, resultando em uma mistura
bifásica, como no presente trabalho.
O maior teor de compostos fenólicos foi obtido no experimento com 5% de
água e 5% etanol, e o menor com 50% de água acidificada. Isto pode ser explicado
pelo fato de a combinação de CO2, água e etanol ser mais eficiente que somente CO2
e água na solubilização de compostos fenólicos. O etanol possui uma molécula
bipolar, aumentando assim a solubilização de compostos polares e apolares. Vale
ressaltar que os maiores teores de compostos fenólicos foram obtidos nos
experimentos com menores rendimentos de extração, o que pode ser explicado pela
seletividade do processo.
Seabra et al. (2010) encontraram maiores teores de compostos fenólicos,
rendimentos de extração e antocianinas para o bagaço de sabugueiro com
combinações dos solventes CO2, etanol e água. Isso pode ser explicado pela
diferenciação dos componentes dos materiais utilizados e pelas condições de
processo. Vatai et al. (2009) realizaram a extração convencional de sabugueiro
previamente liofilizado utilizando etanol e água como cossolventes e fizeram uma
compararação com extração SFE usando CO2, etanol e água a 30 MPa. Obtiveram,
na SFE, um teor de compostos fenólicos consideravelmente mais elevado que na
primeira condição somente com etanol e água.
A presença de água como cossolvente também foi importante para
promover a extração de antioxidantes, pois aumentando a polaridade do solvente com
a água, se extraem as agliconas, flavonas e flavonóis mais polares. Esta afirmação é
comprovada nos resultados das extrações em que se utiliza água como cossolvente.
Os compostos fenólicos podem contribuir para o aumento da capacidade
antioxidante dos extratos, conforme descrito por Seeram (2008). Explicam-se, com
isso, as maiores atividades antioxidantes encontradas no experimento com 5% água
e 5% etanol, que apresentou as maiores concentrações de compostos fenólicos.
101
Nota-se que os valores de capacidade antioxidante DPPH para o resíduo
fresco, tanto para extração PLE quanto SFE, foram menores que os das demais
extrações, quando utilizados cossolventes nas proporções 50% de água, 50% de
etanol e 5% de água e 5% de etanol, respectivamente, confirmando estas como as
melhores condições utilizadas. Machado et al. (2015) encontrou a maior capacidade
antioxidante nos extratos de resíduos de amora obtidos por PLE com etanol + água
(50% v/v) como solventes a 80 e 100° C. Valores elevados de capacidade antioxidante
também foram encontrados com água acidificada como solvente nas mesmas
temperaturas, sem diferença significativa em relação à primeira condição mencionada.
A discrepância entre os resultados de DPPH frente à diferentes
cossolventes pode ser devida aos seus diferentes mecanismos de reação (interações
distintas), aos componentes fitoquímicos extraídos e às suas concentrações.
A água acidificada como cossolvente não contribuiu com a capacidade
antioxidante dos extratos, e o mesmo ocorreu com relação aos compostos fenólicos.
Como a capacidade antioxidante é intimamente ligada aos compostos fenólicos,
Pinelo et al. (2004) demonstraram que, em solventes polares, as ligações de
hidrogênio podem induzir alterações nas atividades do átomo-H, reduzindo a
capacidade antioxidante dos compostos fenólicos. As moléculas envolvidas e suas
características estruturais determinam o mecanismo de ação da capacidade
antioxidante, assim como, o sistema em que estão presentes, condições de
armazenamento e de processamento, entre outros (SHAHIDI, 2015).
Para a capacidade antioxidante determinada por ABTS, os valores
encontrados são inferiores aos resultados de DPPH. Os baixos valores obtidos por
ABTS mostram que esta técnica é mais específica que a DPPH, que mede a
capacidade antioxidante de compostos de natureza hidrofílica e lipofílica e, com isso,
é mais adequada para um tipo de extrato diferente do estudado. A diferença pode
também ser explicada por interferências ocorridas durante a leitura, sendo as faixas
de comprimento de onda diferentes para os dois métodos (PAES et al., 2014).
Métodos mais detalhados de análise de capacidade antioxidante, como ORAC e
métodos in vivo, precisam ser realizados a fim de avaliar a biodisponibilidade dos
compostos antioxidantes.
102
Pode-se observar que a concentração de taninos também foi maior nos
extratos obtidos com proporção de cossolventes de 5% água e 5% etanol,
diferenciando-se estatisticamente dos demais resultados. E os menores valores foram
encontrados nos extratos obtidos com etanol na composição de cossolvente. Isso
pode ser explicado pela baixa solubilização dos taninos em presença do álcool.
A maior concentração de antocianinas foi encontrada no extrato obtido com
5% de água e 5% de etanol como cossolventes. As menores concentrações de
antocianinas foram encontradas nos extratos obtidos com 10% etanol e 50% etanol,
e as concentrações dos extratos obtidos com 50% água, 50% água acidificada e 40%
água com 10% de etanol foram muito parecidas. O uso de etanol e água como
cossolventes foi importante para promover a extração de antocianinas, que possuem
alta solubilidade em água, de acordo com Metivier et al. (1980).
Pasquel-Reátegui et al. (2014) determinaram o conteúdo de antocianinas
dos extratos do resíduo de amora obtidos por SFE utilizando cossolventes como
etanol e água, e verificaram um aumento do teor de antocianinas com o uso destes
cossolventes. Ainda em relação à extração de amargosa com cossolventes,
Tonthubthimthong et al. (2004) estudaram a mistura de etanol e acetato de etila e
concluíram que o rendimento de antocianinas aumentou com a concentração dos
mesmos. Finalmente, Corrales et al. (2009) estudaram a influência da concentração
de etanol na extração de antocianinas de casca da uva por pressão hidrostática a 600
MPa, e encontraram uma relação positiva entre o solvente (etanol) e a quantidade de
antocianinas recuperada.
Os rendimentos de antocianinas monoméricas reportados na literatura são
bastante diversos, variando não só com os métodos de extração, solventes e
condições operacionais utilizados, mas também com a variedade da matéria-prima,
época da colheita e tipos de pré-tratamento da matéria-prima. Os resultados
reportados neste trabalho são semelhantes aos obtidos por Rufino et al. (2010) e
Santos et al. (2010).
Analisando os resultados obtidos com diferentes proporções de
cossolventes, os teores de compostos fenólicos, capacidade antioxidante e
antocianinas dos extratos foram superiores na SFE utilizando 5% água e 5% etanol.
Por este motivo, estas condições foram escolhidas para as extrações a partir do
103
resíduo liofilizado e do mirtilo fresco triturado. Os resultados destas extrações estão
apresentados na Tabela 5.6.
O rendimento global da extração a partir do mirtilo liofilizado foi 50% maior
que o da extração com mirtilo fresco. Para todas as análises, as médias foram
significativamente diferentes entre o resíduo liofilizado e o mirtilo fresco. O extrato de
mirtilo liofilizado apresentou maiores concentrações de compostos fenólicos,
capacidade antioxidante e antocianinas devido à concentração dos compostos de
interesse ocorrer no processo de liofilização. Nota-se que os rendimentos das
extrações com material fresco (mirtilo e resíduo fresco) foram semelhantes. Isso
ocorre porque as quantidades de material extraível são parecidas e tem pouca
variação da fruta fresca para o resíduo.
Comparando os teores de compostos fenólicos, capacidade antioxidante
(DPPH) e antocianinas, os extratos obtidos do resíduo de mirtilo foram superiores aos
obtidos do mirtilo fresco. Isso se deve ao fato de os compostos de interesse estarem
mais concentrados na casca do que na polpa do fruto. Pertuzatti (2009) também
estudou a capacidade antioxidante no mirtilo e observou que a casca dos frutos
apresenta as maiores atividades antioxidantes em todos os cultivares avaliados. Em
todos os tempos de reação avaliados com o radical livre DPPH, o cultivar com maior
capacidade antioxidante foi a “Powderblue”, resultado também observado por Carlson
(2003) através do método ORAC. Carlson (2003) também observou em seu trabalho
que a polpa apresentou teor de fenóis totais 72% menor que a casca, para o cultivar
“delite” e até 90% menor para “bluebelle”, indicando uma vez mais que a maior
concentração de compostos fenólicos está presente na casca do mirtilo. Diferenças
na concentração de compostos fenólicos são normais em cultivares da mesma fruta,
como relatado por Malacrida e Motta (2005), que constataram que a variedade de uva
utilizada no processamento de suco pode ser uma causa de variação nos teores de
compostos fenólicos.
As atividades antioxidantes apresentadas no presente trabalho foram
superiores às de Elisia et al. (2007), que encontraram valores entre 552,2 - 1046,5
µmol TE/g de extrato nas cultivares “delite”, com exceção da cultivar “clímax”, em que
o resultado foi maior. Estas diferenças podem ser explicadas pela diferença de
variedades e pela técnica de extração.
104
As concentrações de antocianinas do mirtilo fresco encontradas neste
trabalho (305 mg/100 g de extrato) são semelhantes às encontradas por Pertuzatti
(2009) (217,55 mg/100 g para a variedade “clímax”). Esta variedade foi a única a
apresentar diferença significativa em relação aos demais cultivares, como “bluebelle”
e “delite”. Estes teores foram inferiores aos encontrados por Su e Chien (2007) que,
ao avaliarem o mirtilo do grupo Rabbiteye, encontraram teores de antocianinas de 363
mg/100 g. O teor de antocianinas que estes autores encontraram na casca do fruto foi
de 622,3 mg/100 g, metade do valor encontrado neste trabalho. Pertuzatti (2009)
conclui em seu trabalho que a casca do fruto apresentou os maiores teores de
antocianinas em todos os cultivares. O resultado é esperado, pois se percebe que o
mirtilo apresenta a casca com coloração bem acentuada e a polpa clara.
5.3. Identificação e quantificação de antocianinas por UPLC (Lote1)
A Tabela 5.7 apresenta as concentrações de antocianinas monoméricas e
as determinadas por pH diferencial e UPLC dos resíduos de mirtilo fresco e liofilizado,
dos extratos obtidos por PLE e SFE e do mirtilo fresco macerado.
105
Tabela 5.7. Resultados da quantificação de antocianinas por UPLC e pH
diferencial dos resíduos de mirtilo fresco e liofilizado, dos extratos PLE e SFE e do
mirtilo fresco macerado.
Matérias-primas
(mg/100 g de matéria-
prima) Método: pH diferencial
(mg/100 g de matéria-prima) Método: UPLC
Resíduo de mirtilo fresco 175 ± 17 128 ± 0,2
Resíduo de mirtilo liofilizado 301 ± 29 159 ± 0,2
Extratos PLE
Solventes Fresco
(mg/100 g de extrato) Método: pH diferencial
Fresco (mg/100 g de extrato)
Método: UPLC
100% etanol 234 ± 0,2 85 ± 0,2
50% etanol e 50% água 250 ± 10 136 ± 0,1
100% água acificada (pH 2,0) 254 ± 1 248 ± 0,2
50% água acificada (pH 2,0) e 50% etanol
119 ± 1 108 ± 0,2
100% acetona 101 ± 6 71 ± 0,1
Solventes Liofilizado
(mg/100 g de extrato) Método: pH diferencial
Liofilizado (mg/100 g de extrato)
Método: UPLC
100% etanol 257 ± 4 230 ± 0,1
50% etanol e 50% água 234 ± 2 214 ± 0,2
100% água acificada (pH 2,0) 263 ± 1 235 ± 0,1
50% água acificada (pH 2,0) e 50% etanol
110 ± 10 106 ± 0,3
Extratos SFE
Solventes (mg antocianinas/
100 g extrato) Método pH diferencial
(mg antocianinas/ 100 g extrato) Método UPLC
10% água 420 ± 31 343 ± 8,3 50% água 291 ± 27 228 ± 10
10% água acidificada (pH 2,0) 326 ± 12 216 ± 0,3 50% água acidificada (pH 2,0) 291 ± 26 164 ± 0,5
10% etanol 134 ± 2 124 ± 88 50% etanol 136 ± 1,4 123 ± 0,2
40% água e 10% etanol 214 ± 15 205 ± 0,1 5% água e 5% etanol 1071 ± 64 808 ± 0,1
8% água acidificada (pH=2,0) e 2% etanol
716 ± 65 674 ± 0,5
4% água acidificada (pH=2,0) e 1% etanol
709 ± 69 533 ± 0,3
Extrato do resíduo de mirtilo liofilizado
1209 ± 111 305 ± 20
Extrato do mirtilo fresco macerado 1043 ± 1 282 ± 3,3
As antocianinas majoritárias encontradas no resíduo do Lote 1 e nos
extratos obtidos por PLE e SFE foram a Cianidina-3-O-glucosídeo, Peonidina-3-O-
arabinosídeo e Malvidina-3-O-glucosídeo.
106
Observa-se diferença entre os teores de antocianinas obtidos pelos
métodos pH diferencial e UPLC. Gouvêa (2010), ao quantificar antocianinas de açaí
por esses métodos, observou que o método do pH diferencial superestimou a
quantidade de antocianinas, devido à presença de possíveis substâncias que
interferiram apenas nos resultados provenientes da análise de quantificação por pH
diferencial e não nos resultados cromatográficos. Além disso, o açaí apresenta como
antocianina majoritária a cianidina-3-O-rutenosídeo e não a cianidina-3-O-glucosídeo,
causando erros na determinação, visto que dados como massa molar e coeficiente de
absortividade, utilizados para a quantificação das antocianinas totais pelo método do
pH diferencial não provêm da antocianina majoritária do açaí. Gouvêa (2010)
determinou também o teor de antocianinas de extrato de amora, que possui a
cianidina-3-O-glucosídeo como majoritária, como preconiza o método do pH
diferencial. O autor observou que, para essa fruta, os resultados da análise por pH
diferencial e por HPLC têm a mesma ordem de grandeza e valores próximos. A
quantificação de antocianinas realizada pelo método do pH diferencial fornece teores
de antocianinas monoméricas totais, ou seja, tanto as majoritárias quanto as outras
de menor concentração são quantificadas. Já a UPLC fornece a soma dos valores de
concentrações das antocianinas identificadas, constatando que as duas técnicas
avaliadas são eficientes para quantificação de antocianinas do extrato de mirtilo.
A concentração de antocianinas encontrada no extrato SFE do resíduo de
mirtilo liofilizado é maior que a do extrato de resíduo de mirtilo fresco para ambos os
métodos. Isto confirma que, no processo de liofilização, os compostos se concentram
no resíduo. Já o extrato de mirtilo macerado apresentou teor de antocianinas três
vezes menor. Essa diferença pode ser explicada pelo fato de o mirtilo utilizado nesta
avaliação ter sido adquirido no mercado local e sem referência de variedade, safra e
cultivo, podendo sofrer diferenciações das quantidades de antocianinas presentes. A
Figura 5.2 mostra os cromatogramas das antocianinas identificadas nos extratos e
resíduos do Lote 1.
107
Figura 5.2. Cromatogramas dos íons das antocianinas analisadas: 1) Delfinidina-3-O-galactosídeo, 2) Delfinidina-3-O-
glucosídeo, 3) Cianidina-3-O-galactosídeo 4) Delfinidina-3-O-arabinosídeo, 5) Cianidina-3-O-glucosídeo, 6) Petunidina-3-O-
galactosídeo, 7) Cianidina-3-O-arabinosídeo, 8) Petunidina-3-O-glucosídeo, 9) Peonidina-3-O-galactosídeo, 10) Petunidina-3-O-
arabinosídeo, 11) Peonidina-3-O-glucosídeo, 12) Malvidina-3-O-galactosídeo, 13) Peonidina-3-O-arabinosídeo, 14) Malvidina-3-O-
glucosídeo, 15) Malvidina-3-O-arabinosídeo, 16) Malvidina 3-O-xilosídeo.
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 465 0.5000Da
1.36e5
J2 a 1: TOF MS ES+ 435 0.5000Da
6.41e4
J2 a 1: TOF MS ES+ 419 0.5000Da
2.19e5
J2 a 1: TOF MS ES+ 479 0.5000Da
1.50e5
J2 a 1: TOF MS ES+ 449 0.5000Da
3.59e5
J2 a 1: TOF MS ES+ 433 0.5000Da
6.40e4
J2 a 1: TOF MS ES+ 493 0.5000Da
2.21e5
J2 a 1: TOF MS ES+ 463 0.5000Da
2.98e5
1
4
7
6
5
13
14
15 16
2
8
3 10
12
9 11
108
As antocianinas identificadas evidenciam a grande complexidade da
composição do resíduo e extratos e reforça a importância da utilização deste
subproduto em novas formulações. Todas as antocianinas foram simultaneamente
identificadas nos resíduos e extratos de mirtilo obtidos por SFE e PLE do Lote 1.
A Figura 5.3 mostra o cromatograma dos íons para as antocianinas
identificadas no mirtilo fresco e que não foram identificadas nos resíduos.
Figura 5.3. Cromatograma dos íons das antocianinas analisadas no mirtilo
fresco e não identificadas no resíduo: 1) Petunidina-3-O- (6-acetil)-glucosídeo, 2)
Malvidina-3-O-(6-acetil)-glucosídeo, 3) Cianidina-3-O- (6-acetil)-glucosídeo, 4)
Delfinidina-3-O-(6-acetil)-glucosídeo.
Além daquelas apresentadas na Figura 5.3, foram identificadas as mesmas
(todas) antocianinas do resíduo, evidenciando a grande complexidade desta fruta.
Cho et al. (2004) encontraram concentrações de antocianinas entre 140 e
823 mg/100 g nas análises realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência em
uva, amora e mirtilo. Essa variação se deve às diferentes variedades de fruta. Porém,
os valores mais encontrados foram próximos a 140 mg/100 g, da mesma ordem dos
resultados encontrados neste trabalho. Gao e Mazza (1994) encontraram teores mais
antocianionas
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 521 0.5000Da
8.47e4
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 535 0.5000Da
4.61e5
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 491 0.5000Da
1.18e4
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 507 0.5000Da
1.27e4
2
3
4
1
109
baixos de antocianinas em mirtilo frescos (109,0 - 112,0 mg/100 g), que também
podem ser atribuídos à diferenças de condições ambientais, safra e maturação do
fruto. Bunea et al. (2013) encontraram teores de antocianinas variando de 101 a 195
mg/100 g em diferentes variedades de mirtilo por cromatografia. Prior et al. (1998)
relataram uma maior concentração de antocianinas nas variedades de mirtilo
selvagem em relação aos mirtilos cultivados. A variedade selvagem (Vaccinium
myrtillus L.) contém quantidades mais elevadas de antocianinas que o mirtilo (V.
angustifolium L.) e o cultivado (V. corymbosum L.) (LATTI et al., 2008). Nos estudos
de Bunea et al. (2013), os perfis de todas as variedades mostraram que a antocianina
majoritária é a Delfinidina-3-O-glucosídeo, seguida de Malvidina-3-O-glucosídeo e
Petunidina-3-O-glucosídeo. A Tabela 5.8 apresenta as antocianinas identificadas
pelos autores na uva, amora e mirtilo e as tentativamente identificadas nos resíduos
e extratos obtidos por SFE e PLE do Lote 1.
110
Tabela 5.8. Antocianinas encontradas na uva, amora e mirtilo e
antocianinas encontradas no resíduo de mirtilo e extratos obtidos por PLE e SFE do
Lote 1.
Antocianinas encontradas em uva, amora e mirtilo*
Antocianinas encontradas no resíduo, mirtilo fresco e extratos obtidos por PLE
e SFE do Lote 1
Delfinidina-3-O-galactosídeo Delfinidina-3-O-galactosídeo Delfinidina-3-O-glucosídeo Delfinidina-3-O-glucosídeo Cianidina-3-O-galactosídeo Cianidina-3-O-galactosídeo
Delfinidina-3-O-arabinosídeo Delfinidina-3-O-arabinosídeo, Cianidina-3-O-glucosídeo Cianidina-3-O-glucosídeo
Petunidina-3-O-galactosídeo Petunidina-3-O-galactosídeo Cianidina-3-O-arabinosídeo Cianidina-3-O-arabinosídeo Petunidina-3-O-glucosídeo Petunidina-3-O-glucosídeo
Peonidina-3-O-galactosídeo Peonidina-3-O-galactosídeo Petunidina-3-O-arabinosídeo Petunidina-3-O-arabinosídeo Peonidina-3-O-glucosídeo, Peonidina-3-O-glucosídeo, Malvidina-3-O-galactosídeo Malvidina-3-O-galactosídeo Peonidina-3-O-arabinosídeo Peonidina-3-O- arabinosídeo Malvidina-3-O-glucosídeo, Malvidina-3-O-glucosídeo
Malvidina-3-O-arabinosídeo Malvidina-3-O-arabinosídeo Malvidina-3-O-xilosídeo Malvidina-3-O-xilosídeo Petunidina-3-O-xilosídeo
Delfinidina-3-O-(6”-acetil)glucosídeo Delfinidina-3-O-(6-acetil)-glucosídeo Cianidina-3-O-(6”-acetil)glucosídeo, Cianidina-3-O- (6-acetil)-glucosídeo
Malvidina-3-O-(6”-acetil)galactosídeo Petunidina-3-O-(6”-acetil)glucosídeo Petunidina-3-O- (6-acetil)-glucosídeo Malvidina-3-O-(6”-acetil)glucosídeo), Malvidina-3-O-(6-acetil)-glucosídeo
Delfinidina 3-(p-coumaroil)glucosídeo, Cianidina 3-(p-coumaroil)glucosídeo
Petunidina 3-(p-coumaroil)glucosídeo, Malvidina 3-(p-coumaroil)glucosídeo
Cianidina 3-rutinosídeo Cianidina 3-xilosídeo
Cianidina 3-malonilglucosídeo Cianidina 3-dioxalilglucosídeo
* Bunea et al. (2013).
111
5.4. Concentração por membranas
5.4.1. Resultados dos testes preliminares
A identificação e o planejamento dos testes preliminares de concentração
por membranas estão descritos na Tabela 4.5, na seção de Materiais e Métodos.
Foram realizados três testes com o resíduo do Lote 1 (dois testes de ultrafiltrações
seguidas de nanofiltração e um teste somente com nanofiltração) e seis (um teste com
microfiltração, um com ultrafiltração e quatro testes com nanofiltrações) com o resíduo
do Lote 2. Todos os testes preliminares foram realizados para verificar o melhor
comportamento das alimentações frente aos sistemas de filtração e,
consequentemente, para a escolha das melhores condições para os ensaios
subsequentes.
Nos testes realizados com ultrafiltrações (0,45 MPa e 0,3 MPa a 30o C)
seguidas de nanofiltrações (NF 10, 3 MPa a 30o C) com o Lote 1, ocorreram
vazamentos no sistema de filtração. Os testes com o Lote 2, realizados por
microfiltração e ultrafiltração, não apresentaram diferença de coloração entre
alimentação, permeado e retido e, com isso, concluiu-se que não seriam boas opções
para concentrar antocianinas. Consequentemente, as análises de permeado e retido
deste processo não foram efetuadas. Já os testes com a nanofiltração (NF 10 e NF
30 a 1 MPa e 2,5 MPa, a 25o C) apresentaram ineficiência no processo, pois o fluxo
de permeado caiu logo no início e não se estabilizou mais. Por isso, também não
foram analisados, o permeado e retido destes processos.
Para os testes preliminares de nanofiltração realizados com o suco
concentrado, com os Lotes 1 (NF 10) e 2 (resíduo com solução 50% de etanol e 50%
água, NF 10 e 30), as condições de processo se ajustaram bem. Os resultados desses
testes estão detalhados na Tabela 5.9. Todos os resultados estão apresentados em
base úmida.
112
Tabela 5.9. Resultados dos testes preliminares de concentração de extratos de
resíduo de mirtilo em membranas.
Teste preliminar (nanofiltração)
60 g suco concentrado/
400 mL água acidificada
(pH = 2,0)
40 mL resíduo de mirtilo/
40 mL solução
(50% água +50%etanol)
40 mL resíduo
de mirtilo/
40 mL solução
(50% água +50%etanol)
NF30 NF10 NF30
Lote 1 2 2
Antocianinas mg/100 g extrato
Alimentação 8 ± 0,3 2,8 ± 0,1 3,2± 0,2
Retido 14,7 ± 0,6 9 ± 0,7 9,4 ± 0,4
Permeado * 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1
Fenóis totais mg GAE**/g
extrato
Alimentação 7 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1
Retido 9 ± 0,3 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1
Permeado * 0,1 ± 0,1 *
DPPH (mg TE***/g extrato)
Alimentação - 4,2 ± 0,1 2,5 ± 0,1
Retido - 8,7± 0,1 8,6 ± 0,1
Permeado - 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1
ABTS (mg TE/g extrato)
Alimentação - 1,0 ± 0,6 0,9 ± 0,3
Retido - 2,0 ± 0,3 3,6 ± 1,9
Permeado - 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1
(-) não realizado, (*) zerado, **GAE – equivalente ácido gálico, ***TE – Equivalente de Trolox.
Pode-se notar que houve retenção de compostos de interesse em todos os
processos de nanofiltração dos testes preliminares. Percebe-se também a diferença
entre as alimentações dos resíduos de mirtilo dos Lotes 1 e 2. Isso pode ser explicado
pela diferença entre os processos (despolpadeira e arraste de vapor) para obtenção
destes resíduos.
O fluxo de permeado no teste com suco concentrado apresentou queda
com o tempo, passando de 110 kg/m2min para 84 kg/m2min em 17 minutos e
permanecendo constante até o fim do processo. Esse declínio do fluxo de permeado
pode ser considerado um fator limitante para o processo. De acordo com Marshall e
113
Munro (1993), existem três estágios de declínio do fluxo permeado, sendo o primeiro
estágio caracterizado por uma queda brusca do fluxo nos primeiros minutos devido à
ocorrência da polarização por concentração na superfície da membrana. No segundo
estágio inicia-se a precipitação dos solutos acumulados, ocasionando o bloqueio dos
poros da membrana, a formação da camada polarizada e da incrustação. E o terceiro
estágio é definido como a consolidação do processo, na qual ocorre uma queda no
fluxo lenta, mas contínua.
Com base nos resultados encontrados nos testes preliminares, como
concentração de compostos de interesse, temperatura, fluxo de permeado, tipo de
membrana e pressão transmembrana, foi realizado um planejamento para os
processos subsequentes de nanofiltração. Este planejamento está apresentado na
Tabela 4.5, na Seção 4.6.2 de Materiais e Métodos.
A partir dos resultados dos testes preliminares, para todas as nanofiltrações
foi fixada uma temperatura de 40 oC e pressão de 4 MPa. Com estas condições,
diferenças nos processos puderam ser observadas, devido à porosidade das
diferentes membranas.
5.4.2. Resultados das nanofiltrações de resíduo de mirtilo e do extrato SFE
Foram determinados a umidade, teor de compostos fenólicos, capacidade
antioxidante (DPPH e ABTS) e concentração de antocianinas monoméricas de todos
os produtos obtidos das nanofiltrações, assim como das alimentações (resíduo e
extrato SFE), para obter a massa de extrato seco. Foi também calculado o índice de
retenção de cada componente para cada processo de concentração. A Tabela 5.10.
apresenta as umidades, teores de compostos fenólicos, capacidade antioxidante
(DPPH e ABTS) e concentração de antocianinas monoméricas das alimentações,
retidos e permeados das nanofiltrações, além dos índices de retenção de todos os
ensaios de nanofiltração.
114
Tabela 5.10. Umidade, teor de fenólicos totais, capacidade antioxidante, concentração de antocianinas monoméricas e suas
respectivas porcentagens de retenção nas alimentações, retidos e permeados das concentrações por membranas.
% Umidade Fenólicos Totais
(mg GAE/g)* %IR
DPPH (µmol TE/g)
%IR ABTS (µmol
TE/g) %IR
Antocianinas monoméricas
(mg/100g) %IR
Resíduo de mirtilo - Lote 2
Resíduo macerado Alimentação 92 ± 0,4 3,3 ± 0,6 - 110 ± 2 - 81 ± 3 - 339 ± 16 -
NF 10
Retido 91 ± 0,2 2,9 ± 0,3ab
70,4 a
97 ± 2 bcd
13,3 b
79 ± 6 b
27,5 b
311 ± 16 b
17,5 b
Permeado 92 ± 0,1 0,9 ± 0,1b 84 ± 4 bcd 57 ± 4 b 257 ± 12 bc
NF 10**
Retido - 3,3 ± 0,4ab 73,4 a
105 ± 1 bcd
0,7 b
67 ± 1 b
23,5 b
345 ± 2 b
26 b
Permeado - 0,9 ± 0,1b 104 ± 1 bcd 51 ± 2 b 255 ± 16 bc
NF 30
Retido 83 ± 2 2,1 ± 0,1ab
6,23 b
55 ± 2bcd
38,7 ab
39 ± 1 b
51 ab
188 ± 5 bc
27,2 ab
Permeado 98 ± 0,2 1,9 ± 0,2ab 34 ± 2cd 19 ± 1 b 137 ± 10 cd
NF 30**
Retido - 1,6 ± 0,1ab
0,7 b
63 ± 1bcd
40,8 ab
38 ± 3 b
26,4 ab
273 ± 3bc
65,2 ab
Permeado - 1,6 ± 0,1ab 37 ± 2 cd 28 ± 3 b 95 ± 2 cd
NF 90
Retido 89 ± 2 3,2 ± 0,1ab
28,2 ab
83 ± 2 bcd
48,9 ab
59 ± 4 b
41,9 ab
401 ± 5 b
40,1 b
Permeado 100 ± 0,1 2,3 ± 0,1ab 43 ± 2bcd 34 ± 1 b 240 ± 5 bc
NF 90**
Retido - 4,5 ± 0,1ab
56,2 ab
67 ± 2 bcd
33,2 ab
41 ± 3 b
39,2 ab
360 ± 18 b
22,8 b
Permeado - 2 ± 0,1ab 52,5 ± 0,7 bcd 25 ± 3 b 278 ± 6 bc
NF 270
Retido 91 ± 0,3 4,1 ± 0,1ab
86,7 a
102 ± 5 bcd
46,5 ab
64 ± 1 b
83,2 ab
587 ± 1 a
95,2 a
Permeado 95 ± 0,3 0,5 ± 0,1b 55 ± 4 bcd 10,7 ± 0,3 b 29,4 ± 0,8 d
NF 270**
Retido - 4,4 ± 0,2ab
90,3 a
98 ± 3bcd
51,3 ab
59 ± 1 b
63,4 ab
601 ± 8 a
98,2 a
Permeado - 0,4 ± 0,1b 47,6 ± 0,2 bcd 22 ± 1 b 10,7 ± 0,2 d
115
(Continuação) % Umidade Fenólicos Totais
(mg GAE/g)* %IR
DPPH (µmol TE/g)
%IR ABTS (µmol
TE/g) %IR
Antocianinas monoméricas
(mg /100g) %IR
Extrato SFE – Lote 2
Extrato SFE Alimentação 98 ± 0,8 2,7 ± 0,3 - 221 ± 5 - 189 ± 5 - 256 ± 5 -
NF 10
Retido 93 ± 0,3 2 ± 0ab
68,8 ab
203 ± 3a
12,6 b
136 ± 6 b
22,2 b
336 ± 11 b
66,3 ab
Permeado 98 ± 3 0,6 ± 0,2b 177,5 ± 0,1ab 106 ± 2b 113 ± 3 cd
NF 10**
Retido - 1,8 ± 0,2ab
44,1 ab
250 ± 6 a
14,22 ab
62 ± 7 b
6,8 b
287 ± 6 b
54,3 ab
Permeado - 1,0 ± 0,1b 215 ± 4abc 58 ± 8 b 131 ± 1 cd
NF 30
Retido 97 ± 0,4 5,6 ± 0,2ab
34,7 ab
173 ± 2 ab
69,08 a
118 ± 7 b
18,2 ab
300 ± 9 b
63 ab
Permeado 98 ± 0,7 3,8 ± 0,1ab 53 ± 5cd 97 ± 1 b 169 ± 7 cd
NF 30**
Retido - 4,7 ± 0,2ab
41,4 ab
143,8 ± 0,5 ab
61,47 a
89,3 ± 0,8 b
9,5 b
319 ± 2 b
44 ab
Permeado - 2,8 ± 0,1ab 55 ± 5cd 81 ± 2 b 17 ± 1 cd
NF 90
Retido 91 ± 4 6,3 ± 0,4ab
68,6 ab
113 ± 1 abcd
74,79 a
207 ± 0 a
57,7 ab
286 ± 4 b
51,8 ab
Permeado 100 ± 0,2 2 ± 0ab 28,5 ± 3 d 88 ± 2 b 138 ± 2 d
NF 90**
Retido - 2,8 ± 0,2ab
26,2 ab
149,8 ± 0,4 abcd
60,72 a
255 ± 0 a
65,8 ab
324 ± 4b
57 ab
Permeado - 2,0 ± 0,1ab 58,8 ± 0,2 d 87 ± 1 b 141 ± 7 d
NF 270
Retido 91 ± 0,1 3,4 ± 0,2ab
71,2 a
113,5 ± 0,8 abcd
80,82 a
248 ± 1 a
91,8 a
319 ± 1 bc
94,6 a
Permeado 99 ± 0,1 1 ± 0ab 21,8 ± 0,4 cd 20 ± 5 b 17,4 ± 0,2 cd
NF 270**
Retido - 9,6 ± 0,3ab
70,9 a
114,4 ± 0,1 abcd
81,74 a
233 ± 8a
90,4 a
371 ± 4 bc
84,1 a
Permeado - 2,8 ± 0,1ab 20,9 ± 0,1 cd 23 ± 1 b 59 ± 1 cd
*g extrato seco, **duplicata da filtração. Valor da média dos ensaios em duplicata; na mesma coluna letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). **GAE –
equivalente ácido gálico *TE – Equivalente de Trolox.
116
Em todos os processos de nanofiltração a umidade do retido é menor que
a do permeado, evidenciando que houve retenção de material de interesse pela
membrana. Em alguns casos, como a NF 10 do resíduo, a diferença entre a umidade
do retido e do permeado muito pequena, indicando que o processo não apresentou
eficiência na concentração. Já as concentrações realizadas por NF 90 e 270 do
resíduo e do extrato apresentaram umidades com de retido e permeado distantes,
mostrando que a retenção e a concentração dos compostos de interesse foram
efetivas.
O resíduo macerado apresenta uma concentração de fenólicos totais maior
que o extrato SFE. O processo de maceração pode ter intensificado a concentração
destes compostos, e quanto ao extrato SFE, pode ter ocorrido degradação de
fenólicos durante o processo, pelo manuseio constante em temperatura ambiente,
possível incidência de luz e tempo de estocagem.
A separação por membranas nas condições aplicadas não resultou em
diferenças significativas nos teores de fenólicos totais dos retidos. Porém, nos
permeados há diferença nos experimentos das membranas NF 10 do resíduo e do
extrato, assim como no experimento NF 270 do resíduo, que evidencia que a retenção
foi significativa.
Observou-se também que em alguns casos o retido apresentou
concentrações menores que a alimentação, ou seja, os compostos de interesse
podem ter atravessado a membrana por apresentarem distribuição de tamanhos de
molécula diferentes (parte permeou e parte ficou retida). Isso se comprova com as
concentrações encontradas no permeado, que são altas. Isso pode ser observado
com maior intensidade nas membranas NF 10 e 30, nos processos utilizando o resíduo
macerado, comprovando que estas duas membranas não apresentaram altas
retenções.
Verificou-se também que, em alguns casos, a massa de alimentação foi
superior à soma das massas de permeado e retido. Algumas explicações podem ser
atribuídas a este fato: alguns compostos podem ter ficado retidos na parede da
membrana, ou mesmo na camada polarizada formada pelo fluxo, ou pode também ter
ocorrido degradação destes compostos durante o processo.
117
Em outros casos a massa de alimentação é inferior à soma das massas do
permeado e retido. Isso pode ser observado nas análises de antocianinas em todos
os experimentos, com exceção das membranas NF 10 e 30. Há possíveis explicações
para estes resultados: as alimentações são constituídas de material heterogênio e
consequentemente, com tamanhos e formatos de moléculas diferentes, apresentando
interações com as demais moléculas constituíntes do meio; pode existir afinidade com
o material da membrana, com o tamanho do poro e também afinidade com as demais
substâncias presentes na alimentação.
Para definir qual concentração foi melhor para a retenção de compostos
fenólicos, calculou-se o índice de retenção de cada experimento. Verifica-se que a
maior retenção de compostos fenólicos ocorreu na concentração com as membranas
NF 270 do resíduo e extrato e NF 10 do resíduo, que apresentaram as maiores
retenções, que chegaram a 90% e se diferenciaram significativamente dos demais
resultados, independentemente da alimentação ter sido o extrato SFE ou resíduo
macerado. A concentração com a membrana NF 30 do resíduo foi diferente de todas
as outras, pois a retenção de compostos fenólicos foi significativamente menor. As
demais membranas não apresentaram diferença significativa na concentração de
compostos fenólicos.
Mello et al. (2010) estudaram a concentração dos extratos aquoso e
alcoólico de própolis por nanofiltração (em membrana NF 90) e concluíram que,
independentemente dos parâmetros de processo, a concentração dos compostos
fenólicos foi eficiente, com retenção de 84% dos compostos fenólicos. García et al.
(2010) estudaram a concentração de compostos fenólicos na nanofiltração do vinho
tinto e constataram que o índice de fenóis totais evoluiu de forma crescente com o
aumento da concentração das amostras. Visto que a maior parte dos compostos
fenólicos apresenta massa molecular superior à MMC da membrana utilizada, apesar
desta medida não ser linear, registrou-se um forte aumento dos valores deste índice
nos extratos analisados. Tendo em conta que as amostras de permeado
apresentavam coloração rosada, provavelmente a sua quantidade teria sido ainda
maior se as amostras tivessem sido analisadas logo após a sua concentração.
Apesar da grande seletividade das membranas utilizadas, principalmente
as membranas NF 90 e 270, com massa molecular de corte menor (200- 300 Da), há
sempre alguns constituintes além dos pretendidos (água e etanol) que, em
118
quantidades relativamente pequenas, conseguem passar para o permeado. Este fato
está ligado à relação entre a massa molecular dos constituintes e a MMC. Como já
mencionado, a MMC não é uma medida linear e está sujeita a alterações ao longo do
processo. Logo, existem sempre algumas porcentagens de compostos que, apesar
de apresentarem massas moleculares superiores à MMC, passam para o permeado.
É previsível que ocorra uma maior retenção de constituintes como os
compostos fenólicos, que normalmente apresentam uma massa molecular (300 Da)
superior à MMC da membrana de nanofiltração (200-300 Da). Outros constituintes,
como os ácidos, apresentam massas moleculares próximass à MMC e, portanto, é
esperado que parte deles fique retida e parte permeie juntamente com os compostos
fenólicos, que podem se associar a outros compostos. Machado et al. (2015)
estudaram a concentração de compostos fenólicos nos extratos aquosos de pequi e
observaram que, em relação aos polifenóis, as membranas NF 90 e NF 270 também
proporcionaram retenção superior a 90%. A maior retenção de compostos fenólicos
nas membranas de nanofiltração pode ser explicada pelas MMCs nominais destas
membranas, que estão entre 200 e 300 Da. Assim, pode-se prever que compostos
orgânicos com massa molecular entre 164 e 302 Da sejam rejeitados pelas
membranas de nanofiltração utilizadas. Resultados semelhantes foram obtidos por
outros autores. Conidi et al. (2012), que concentraram flavonoides com membranas
de nanofiltração do mesmo fabricante (NF 70 e NF 200), obtiveram entre 88 e 95% de
retenção em relação a esses compostos. Conidi et al. (2011) estudaram a
concentração do suco de bergamota (Citrus Bergamia Risso) e obtiveram uma
retenção de polifenóis de 2 e 84% por ultra e nanofiltração (membranas com MMCs
de 100 kDa e 450 Da), respectivamente.
A mesma explicação para a retenção dos polifenóis se dá ao fenômeno de
formação da camada polarizada aumentada durante a retenção. Além disso, o anel
aromático de polifenóis pode formar agregados com proteínas e se transformar em
moléculas maiores, que ficam retidas na camada filtrante da membrana (Charlton et
al., 2002). Além disso, a ligação de hidrogênio entre os grupos hidroxila do polifenol e
átomos de oxigênio do grupo SO2 da polietersulfona (material da superfície da
membrana) é possível (Susanto et al., 2009), reduzindo a passagem dos polifenóis
através da membrana.
119
Nota-se que a maceração não intensificou a concentração dos
antioxidantes, e o extrato SFE apresentou maior concentração dos mesmos. Pode-se
observar, com estes resultados, que houve retenção eficiente dos compostos de
interesse nas membranas de NF 90 e 270. Em todos os processos de separação
utilizando os resíduos como alimentação, as membranas não apresentaram
diferenças significativas nas atividades antioxidantes de retidos e permeados medidas
por DPPH. Os valores foram próximos e, consequentemente, as retenções foram
menores e com pequena diferença estatística nos resultados, com exceção da NF 10,
que apresentou o menor índice de retenção em todas as concentrações, devido ao
tamanho dos poros ser maior que os demais, resultando em maior permeação dos
compostos de interesse. O mesmo não ocorre nos processos com as membranas de
nanofiltração utilizando o extrato como alimentação. Houve diferença significativa nos
resultados obtidos com as membranas NF 10 e 30, que foram as de menores índices
de retenção de antioxidantes, e as membranas NF 90 e principalmente a 270, com
altos índices de retenção, comprovando que o diâmetro dos poros das membranas é
fator importante para a retenção dos compostos de interesse.
Todos os retidos apresentaram capacidade antioxidante menor que a
alimentação. Em particular, as menores atividades antioxidantes foram encontradas
nos retidos provenientes das membranas NF 10, tanto para o resíduo quanto para o
extrato como alimentações. A menor capacidade antioxidante foi detectada em
permeados da nanofiltração, devido ao menor conteúdo de polifenóis. Pode-se notar
que a retenção de polifenóis e, consequentemente, a capacidade antioxidante, é
aumentada quando a MMC nominal diminui. Os resultados estão de acordo com os
dados experimentais relatados por Conidi et al., (2011), que trabalharam com
concentração de suco de bergamota por ultra e nanofiltração. Os resultados sugerem
que os compostos biologicamente ativos do resíduo do mirtilo foram melhor
recuperados pelo processo na membrana NF 270 a partir do extrato SFE, com
retenção acima de 80%.
Luis et al. (2012) afirmaram que, para a separação de solutos por
nanofiltração, é possível que não haja alta retenção de moléculas com um tamanho
semelhante à MMC da própria membrana, acima ou abaixo do tamanho de poro. Já
para a capacidade antioxidante medida pelo radical ABTS, produtos da nanofiltração
do resíduo macerado não apresentaram diferenças significativas nos resultados
120
encontrados. As membranas NF10, tanto para o resíduo quanto para o extrato,
proporcionaram as menores retenções destes compostos, pois provavelmente estes
atravessam os poros das membranas, resultando em atividades antioxidantes
próximas para retidos e permeados. Nota-se que os resultados para as nanofiltrações
do extrato SFE foram estatisticamente iguais, com exceção da NF 270 do extrato, que
apresentou retenções maiores que 90% dos antioxidantes analisados.
Conidi et al. (2011) e Cassano et al. (2013) também verificaram um
aumento na capacidade antioxidante medida pelo radical ABTS em extratos vegetais
concentrados por nanofiltração. O mesmo comportamento foi observado para os
concentrados obtidos para todas as fases da concentração, semelhantes aos
resultados obtidos por Boaventura (2015) para o extrato aquoso de erva-mate. Por
isso, os resultados foram superiores e diferentes significativamente dos demais.
Existe uma relação entre teor de compostos fenólicos, capacidade
antioxidante e antocianinas, que pode ser observada no trabalho de Orak (2007), que
estudou 16 cultivares de uvas vermelhas. Para as uvas vermelhas avaliadas, o teor
de fenólicos totais teve maior correlação com a capacidade antioxidante quando
comparada à correlação apresentada entre antocianinas e a capacidade antioxidante,
indicando maior contribuição de compostos não flavonoides na capacidade
antioxidante de uvas vermelhas. De acordo com Vinson et al. (1999) e Luo et al.
(2002), a interação entre compostos fenólicos pode causar um aumento da
capacidade antioxidante do suco concentrado de forma independente, sem a
influência das antocianinas, apesar de as mesmas possuírem comprovado potencial
antioxidante. Garcia-Alonso (2004) avaliou as propriedades antioxidantes em 28
frutos, e concluiu que a capacidade antioxidante está associada à ação de outros
compostos presentes nas frutas e a possíveis efeitos de sinergia e antagonismo ainda
desconhecidos.
Para as antocianinas, nota-se que o resíduo macerado apresentou maior
concentração que o extrato SFE, coincidindo com os resultados dos compostos
fenólicos. Isto é, com a maceração do resíduo, ocorreu maior extração das
antocianinas, porém o extrato sofreu degradação durante o processo. Como
consequência, os teores de antocianinas resultantes das nanofiltrações também
seguiram as mesmas proporções das alimentações, ou seja, maiores para as
membranas de nanofiltração do resíduo do que para o extrato SFE.
121
A concentração de antocianinas é geralmente usada como um importante
indicador da qualidade de produtos de mirtilo. No entanto, antocianinas são muito
reativas e podem ser facilmente degradadas, chegando a se tornarem incolores ou
marrons (Kırca et al., 2007). A estabilidade das antocianinas em alimentos é
influenciada por fatores como as condições de processamento e armazenamento
(temperatura, oxigênio, luz), propriedades físicas e químicas de alimentos (atividade
da enzima, pH e conteúdo de açúcar, etc.) e na presença de copigmentos e íons
metálicos (JACKMAN et al., 1987; ROMERO e BAKKER, 2000; KIRCA et al., 2007).
Os permeados da nanofiltração tiveram menores concentrações de
antocianinas que as alimentações, o que já era esperado, uma vez que a nanofiltração
é capaz de realizar separações de moléculas em uma faixa de massa molecular de
0,3 a 1 kDa, podendo ser utilizada na indústria de química fina, na recuperação de
moléculas com alto valor agregado e na separação de íons monovalentes de
multivalentes. Em geral, as massas molares das antocianinas são de
aproximadamente 450 Da. Estas antocianinas foram retidas no processo de
nanofiltração com as membranas NF 90 e 270, tanto para o resíduo quanto para o
extrato. Já nas membranas NF 10 e 30 do resíduo e extrato, com cortes maiores (1000
e 500 Da) as antocianinas permearam, e com isso os teores de antocianinas foram
semelhantes no retido e no permeado.
Apesar de pequenas, as perdas observadas de antocianinas ao longo dos
processos podem ser atribuídas ao fato de os mesmos terem sido conduzidos em
escala laboratorial. Um exemplo disto é o acúmulo de material na superfície da
membrana. Também deve ser considerada a oxigenação por aeração natural que
ocorre no interior do tanque de alimentação, o que resulta na oxidação das
antocianinas e de outros compostos, além da possível existência de materiais
acumulados na tubulação. Outra possível explicação para a perda de antocianinas
pode ser a própria concentração do suco. Segundo Wang e Xu (2007), que estudaram
a estabilidade de antocianinas em suco concentrado de amora e o compararam com
o suco integral, o suco concentrado é mais suscetível à degradação de antocianinas
devido à proximidade entre moléculas reativas (como oxigênio), acelerando a
velocidade das reações de degradação. Este fenômeno também foi relatado por
Garzon e Wrolstad (2002) para antocianinas do morango e por Cemeroglu et al.
(1994), para antocianinas da cereja.
122
Houve diferença significativa nos teores de antocianinas resultantes dos
processos de separação pelas membranas NF 270 do resíduo e extrato. Além disso,
os índices de retenção foram estatisticamente diferentes dos demais processos,
apresentando retenções maiores que 90%. Logo, as concentrações com a membrana
NF 270 foram eficientes.
5.4.3. Identificação e quantificação de antocianinas por UPLC (Lote 2)
Foram identificadas 14 diferentes antocianinas por UPLC nas
alimentações, retidos e permeados obtidos do resíduo do Lote 2. A Figura 5.4
apresenta o cromatograma para identificação das antocianinas.
123
Figura 5.4. Cromatograma das antocianinas identificadas no resíduo de mirtilo
(Lote 2), nos extratos de resíduo de mirtilo e nos produtos obtidos nas separações por
membranas. 1- Delfinidina-3-O-galactosídeo, 2-Cianidina-3-O-galactosídeo, 3-
Cianidina-3-O-glucosídeo, 4-Petunidina-3-O-galactosídeo, 5-Cianidina-3-O-
arabinosídeo, 6-Petunidina-3-O-glucosídeo, 7-Peonidina-3-O-galactosídeo, 8-
Petunidina-3-O-arabinosídeo, 9-Peonidina-3-O-glucosídeo, 10-Malvidina-3-O-
galactosídeo, 11-Peonidina-3-O-arabinosídeo, 12-Malvidina-3-O-glucosídeo, 13-
Malvidina-3-O-arabinosídeo e 14-Malvidina-3-O-xilosídeo.
As Tabelas 5.11 e 5.12 apresentam os resultados da quantificação de
antocianinas por UPLC das amostras do resíduo de mirtilo do Lote 2, do extrato SFE
obtido do resíduo do Lote 2, dos retidos e permeados das separações por membranas.
Minutos
0 1 2 3 4 5 6 7 8
mA
U
0
50
100
150
200
250
300 m
AU
0
50
100
150
200
250
300
1
2
3
4
5
6
7 8 9
10
11
12
13
14
124
Tabela 5.11. Concentrações de antocianinas identificadas por UPLC das
amostras do resíduo de mirtilo, dos retidos e permeados das separações por
membranas.
Antocianinas monoméricas
(mg/100 g*)
pH diferencial
%IR
Antocianinas monoméricas
(mg/100 g*)
UPLC
%IR
Resíduo macerado
Alimentação 338,5 - 262,1 -
Extrato SFE Alimentação 255,5 - 89,9 -
Resíduo
NF 10 Retido 311,3
17,5 279,3
53,9 Permeado 256,9 128,9
NF 10** Retido 345,1
26 98,5
27,2 Permeado 255,4 71,7
NF 30 Retido 188,1
27,2 157,5
79,5 Permeado 137,1 32,5
NF 30** Retido 272,5
65,2 41,5
7,0 Permeado 95 38,6
NF 90 Retido 401,2
40,1 199,1
27,9 Permeado 240, 2 143,7
NF 90** Retido 359, 8
13,1 232,5
9,2 Permeado 278 211,2
NF 270 Retido 587
95,2 547,1
94,8 Permeado 29,4 28,4
NF 270** Retido 601
98,2 413,3
98,3 Permeado 11 7,1
*g de extrato seco **duplicata.
125
Tabela 5.12. Concentrações de antocianinas identificadas por UPLC das
amostras do extrato SFE, dos retidos e permeados das separações por membranas.
Antocianinas monoméricas
(mg/100 g*)
pH diferencial
%IR
Antocianinas monoméricas
(mg/100 g*)
UPLC
%IR
Extrato SFE
NF 10 Retido 335,8
66,3 258
75,9 Permeado 113,3 62,3
NF 10** Retido 286,6
54,3 271,6
73,4 Permeado 130,9 72,3
NF 30 Retido 299,8
62,9 111,4
38,6 Permeado 169,2 68,4
NF 30** Retido 318,6
43,9 120
35,2 Permeado 17,4 77,8
NF 90 Retido 285,6
25,8 282,5
52 Permeado 137,7 10,3
NF 90** Retido 323,7
56,6 2162
60,2 Permeado 140,5 24
NF 270 Retido 318,5
94,6 174
96,4 Permeado 17,4 83,5
NF 270** Retido 370,7
84 239,3
88,9 Permeado 59,2 95,3
*g de extrato seco **duplicata
Verifica-se que, para o resíduo e para o extrato, e em todas as
concentrações, as concentrações de antocianinas obtidas por UPLC foram inferiores
às determinadas pelo método de pH diferencial. Como já comentado, isso pode ser
explicado pela presença de possíveis substâncias que interferem apenas nos
resultados de quantificação por pH diferencial e não nos resultados cromatográficos.
Como o método UPLC é mais seletivo, a detecção foi somente de antocianinas
realmente presentes nos produtos. O método de pH diferencial apresenta como
antocianina majoritária a Cianidina-3-O-glucosídeo, acarretando possíveis erros na
126
determinação, pois a antocianina majoritária do método UPLC encontrada no Lote 2,
e consequentemente nos respectivos produtos obtidos das concentrações por
membranas, foi a Malvidina-3-O-glucosídeo, seguida da Malvidina-3-O-arabinosídeo.
Estes resultados diferem dos encontrados com o resíduo do Lote 1, no qual
antocianinas majoritárias encontradas foram a Cianidina-3-O-glucosídeo, Peonidina-
3-O-arabinosídeo e Malvidina-3-O-glucosídeo.
Scibisz et al. (2012) analisaram o iogurte de mirtilo da variedade highbush
e encontraram a Malvidina-3-O-galactosídeo como a antocianina majoritária, seguida
da Malvidina-3-O-arabinosídeo e Malvidina-3-O-glucosídeo. Nos estudos realizados
por Lohachoompol et al. (2008), que verificaram os picos de antocianinas em
diferentes variedades de mirtilo, incluindo a variedade clímax, uma das analisadas no
presente trabalho, as antocianinas majoritárias foram a Malvidina-3-O-galactosídeo e
a Malvidina-3-O-glucosídeo, juntamente com a Peonidina-3-O-glucosídeo e
Peonidina-3-O-arabinosídeo. Foram também quantificadas as antocianinas presentes
em diferentes variedades de mirtilo de distintas regiões da China. As antocianinas
foram identificadas e quantificadas por HPLC ligado a espectrometria de massas (LC-
DAD-MS) e os perfis cromatográficos das variedades de mirtilo foram similares:
malvidina (41,0%), delfinidina (33,1%) e petunidina (17,3%) foram os principais
contribuintes para o conteúdo total de antocianinas (DONGNAN et al., 2015).
Comparando os resultados encontrados na quantificação de antocianinas
por UPLC com o método pH diferencial, verifica-se que os resultados são coerentes,
ou seja, a maior retenção de antocianinas foi obtida pela membrana NF 270, tanto
para o resíduo quanto para o extrato. Já a menor retenção de antocianinas verificada
pelo método UPLC foi observada na concentração com a membrana NF 10 para o
resíduo, e com a membrana NF 90 para o extrato, resultados também encontrados
pelo método de pH diferencial.
127
5.4.4. Fluxo de permeado
Os processos de nanofiltração resultaram em fatores de concentração
diferentes, levando em consideração os testes preliminares, que serviram para
determinar o desempenho de cada membrana. Os fatores de concentração foram de
4,0 para a membrana NF 10, 2,0 para a membrana NF 30, 1,5 para a membrana NF
90 e 2,0 para a membrana NF 270. Os fatores de concentração com valores diferentes
são justificados pelos diferentes comportamentos dos processos. As curvas de fluxo
permeado durante a nanofiltração do resíduo de mirtilo e do extrato SFE de todos os
experimentos, realizados a 4 MPa, 40 ºC e 40 mL de alimentação, estão apresentadas
na Figura 5.5.
128
Figura 5.5. Curvas de fluxo de permeado em função do tempo de todas as
concentrações (NF 10, 30, 90 e 270 do resíduo e extrato) por nanofiltração (∆P =
4MPa).
010203040506070
0 5 10 15 20
Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 10 resíduo
1o experimento 2o experimento
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20
Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 10 extrato
1o experimento 2o experimento
0
1
2
3
4
0 10 20 30
Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 30 resíduo
1o experimento 2o experimento
0
1
2
3
0 10 20 30 40
Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 30 extrato
1o experimento 2o experimento
0
2
4
6
8
0 100 200Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 90 resíduo
1o experimento
0
5
10
0 50 100 150Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 90 extrato
1o experimento 2o experimento
-1000011111222
0 20 40 60 80 100
Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 270
1o experimento 2o experimento
0
5
10
15
0 20 40 60Flu
xo (
kg.m
-2.h
-1)
Tempo (min)
NF 270 extrato
1o experimento 2o experimento
129
Verifica-se uma queda contínua no fluxo permeado para todas as
membranas. Essa queda ocorre nos primeiros 5 minutos para as membranas NF 10
e 30 do resíduo, e nos primeiros 15 minutos para as membranas NF 90 e 270 do
resíduo, quando a curva começa a decrescer linearmente, chegando a um fluxo médio
final. Liikanen et al. (2002), Warczok et al. (2004), Luis et al. (2012) e Suárez et al.
(2009) atribuem este declínio à camada de polarização, em decorrência do processo
de concentração, e ao fouling, fenômenos normalmente presentes nos processos de
separação por membranas. Um comportamento semelhante foi observado por
Benedetti (2010) na concentração de isoflavonas do extrato aquoso de farinha
desengordurada de soja por nanofiltração, e por Hódur et al. (2009) na concentração
por membranas de produtos similares, a partir de extratos aquosos. Fersi et al. (2005)
utilizaram o processo de nanofiltração no tratamento de efluentes da indústria têxtil e
observaram um declínio do fluxo de permeado no decorrer do processo. Resultados
similares foram obtidos por Diaz-Reinoso et al. (2009), para concentrados de extrato
aquoso de destilado de bagaço de uva fermentada, e por Luo et al. (2009), na remoção
do sal de molho de soja, todos empregando a nanofiltração. Apesar de serem produtos
diferentes, as similaridades entre os processos permitem a comparação entre os
resultados. Nota-se também que o comportamento dos fluxos finais nas
concentrações dos extratos nas membranas NF 90 e 270 do extrato são semelhantes,
com um leve aumento do fluxo, formando uma ondulação na curva.
Esse comportamento pode ser explicado pela mudança de composição da
camada polarizada com o tempo de processo, podendo ser descrita como um
rearranjo da camada gel, que permite a permeação de moléculas menores. Durante o
processo de nanofiltração a deposição dos materiais na parede da membrana pode
sofrer modificações com o tempo. Outra explicação pode ser atribuída à diferenciação
do tamanho das substâncias que atravessam a membrana e, com isso, permeiam a
mesma com maior facilidade. Além disso, a camada polarizada formada pode
apresentar diferentes porosidades com o tempo e consequentemente, facilitar a
passagem e aumento do fluxo de permeado.
Os valores dos fluxos de permeado durante as nanofiltrações do resíduo
de mirtilo e do extrato SFE realizadas a 4 MPa, 40 ºC e com 40 mL de alimentação
estão apresentados na Tabela 5.13.
130
Tabela 5.13. Fluxos de permeados das concentrações com as membranas NF
10, 30, 90 e 270.
Fluxos médios (kg.m-2.h-1)
Inicial 5 min 10 min Tempo de processo (min)
Resíduo
NF 10 53,0 16,35 - 6,96 17
NF 30 3,35 2,52 1,43 1,03 25
NF 90 5,82 1,43 0,92 0,36 150
NF 270 0,99 0,49 0,43 0,37 89
Extrato
NF 10 43,0 13 - 7,45 16
NF 30 2,52 2,20 2,12 1,32 34
NF 90 5,88 2,0 2,91 3,89 105
NF 270 13,02 5,75 5,21 5,71 55
É possível observar que o tempo de processo para atingir o fator de
concentração desejado com a membrana NF 10 foi menor que os demais. Como os
poros desta membrana são maiores (1000 Da), o permeado a atravessa com maior
facilidade, alcançando o fator de concentração com rapidez. Isso é evidenciado pelos
valores de fluxo de permeado. Após 17 minutos de concentração, os fluxos finais
apresentaram uma queda maior que 80%.
Nas concentrações realizadas com membranas NF 30, tanto para o resíduo
quanto para o extrato, observou-se uma queda menor no fluxo de permeado, em torno
de 70% para as nanofiltrações do resíduo e 50% para as nanofiltrações do extrato.
Porém, os fluxos iniciais já eram baixos e o tempo de concentração foi o dobro da NF
10. Além disso, as curvas apresentam uma ligeira tendência a ficarem constantes com
o aumento do fator de concentração. A queda do fluxo ocorre devido ao acúmulo de
substâncias na superfície da membrana que, consequentemente, inicia o aumento da
camada polarizada e a consolidação do fouling com o tempo.
Nas membranas NF 90 e 270, a alimentação ocasionou uma diferenciação
entre as curvas de fluxo. Os processos de nanofiltração com resíduo de mirtilo, para
essas membranas, apresentaram curvas características de fluxo de permeado.
131
Porém, com o extrato SFE os fluxos tiveram uma queda nos primeiros minutos,
seguida de um ligeiro aumento até se estabilizarem no final do processo. Este
comportamento atípico de aumento do fluxo de permeado com o tempo, que difere da
maioria dos processos de separação por membranas, é denominado “fluxo
paradoxal”. Nesta situação a alimentação contém várias substâncias diferentes, e
algumas delas apresentam ampla distribuição de tamanho de partículas. Assim,
inicialmente ocorre a deposição de partículas menores que causam entupimento dos
poros na membrana, e que ao longo do processo são arrastadas pela solução de
permeado, atravessando a membrana e sendo removidas. Posteriormente ocorre a
prevalência de partículas maiores na camada polarizada, que favorecem o fluxo de
permeado. A deposição formada sobre a área da membrana é bem porosa, já que as
partículas são maiores, e consequentemente ocasionam o aumento do fluxo (GREEN
e BELFORT, 1980). Este fenômeno também foi observado por Vaillant et al. (1999),
que estudaram a microfiltração tangencial de suco de maracujá após liquefação
enzimática parcial. Os autores observaram queda no fluxo nos primeiros minutos de
processo, provavelmente devido à formação da camada gel. Porém, em seguida
ocorreu aumento de fluxo de permeado. É importante ressaltar que a teoria do fluxo
paradoxal sinaliza que há mudança na composição e no arranjo da interface
alimentação-membrana. Sendo assim, mudanças na estrutura geram alterações no
fluxo de permeado.
A queda do fluxo de permeado nos primeiros 5 minutos para a membrana
NF 90 foi maior que 70% em todas as concentrações. Esta queda resultou em um
fator de concentração de 1,50 em maior tempo, e nota-se que a curva de fluxo no
processo com resíduo macerado foi linear. Em contrapartida, a curva de fluxo obtida
utilizando o extrato SFE como alimentação não apresentou a mesma característica.
O mesmo ocorreu com todas as membranas. As curvas de fluxo dos extratos SFE
diferem daquelas do resíduo, sugerindo que a natureza da solução de alimentação é
o fator que diferencia os processos. O mesmo comportamento ocorreu na
concentração de extrato de própolis com membrana NF 90 (Mello et al., 2010).
Entretanto, estes autores observaram que apesar do acentuado declínio inicial no
fluxo de permeado, a membrana utilizada alcançou o fator de concentração em menor
tempo e consequentemente, sua curva de fluxo se estabilizou.
132
As curvas de fluxo para os processos utilizando a membrana NF 270
apresentaram as mesmas características das curvas da membrana NF 90, tanto para
o resíduo macerado quanto para o extrato SFE como alimentações. Comparando os
processos com as membranas NF 10 e 30 e NF 90 e 270, notam-se quedas distintas
de fluxos de permeado, que podem ser explicadas pelo material da membrana e pelo
mecanimso de incrustação. As membranas NF 10 e 30 são confeccionadas em
polieterssulfona, e as membranas NF 90 e 270 são fabricadas em polissulfona e
poliamida, respectivamente. Desta forma, o material das membranas NF 90 e 270
proporcionou maior resistência ao fluxo de água e de outros solventes (CHEN et al.,
1996, MICHELON et al., 2014; SUSANTO et al., 2009) e alguns solutos são mais
suscetíveis a deposição de materiais nos poros da superfície da membrana (BLANK
et al, 1998;. METSÄMUURONEN e NYSTRÖM, 2009). O segundo fator que reduz o
fluxo de permeado é o bloqueio dos poros.
É possível, também, que diferentes compostos extraídos do resíduo de
mirtilo com etanol possam ter alterado a viscosidade dos extratos SFE. Estes
compostos, apresentam característica de adesividade, podendo se fixar à membrana
e ocasionar maior fouling e aumento da camada de gel, resultando na redução do
fluxo de permeado nos primeiros 10 minutos de processo. Além disso, com a pressão
exercida, os poros podem ter sofrido um desbloqueio momentâneo e aumentado
sutilmente o fluxo de permeado, como pode ser observado nas curvas
correspondentes a estes processos.
A turbulência junto à superfície filtrante, seja em filtração perpendicular ou
tangencial, controla de maneira importante a formação da zona de polarização e a
espessura da camada de gel. Esse efeito de turbulência é mais pronunciado na
filtração tangencial, na qual a solução escoa em alta velocidade junto à membrana.
Desta forma, a velocidade de circulação da solução durante o processo tem influência
sobre o fluxo de permeado. O aumento da velocidade tangencial gera um aumento na
turbulência da solução junto à membrana, diminuindo os efeitos adversos da zona de
polarização.
As interações do CO2 com diferentes polímeros têm sido estudadas
extensivamente (SHEN et al, 2003; RAVEENDRAN e WALLEN, 2002), e são a
principal razão para as alterações morfológicas e químicas na estrutura dos polímeros
que constituem materiais de membranas, e assim são fator determinante para a
133
eficiência de processos que envolvem o CO2 como solvente. Membranas de poliamida
não têm sido usadas comumente para separações de gases, devido principalmente
ao excesso de ligações intermoleculares de hidrogênio, resultando em alta energia
coesiva e densidade da rede do polímero. (GARCÍA et al, 2010). Por outro lado, as
condições da transformação, tais como a temperatura e pressão, são estudadas para
conhecer o impacto sobre a força das ligações de hidrogênio, o que resulta em
possíveis alterações físico-químicas e morfológicas na estrutura da membrana (HE et
al, 2004). Embora estudos anteriores demonstrem que o sistema acoplado CO2
supercrítico + membranas é promissor, estudos sobre o efeito do CO2 supercrítico
sobre as membranas ainda são escassos.
A integração dos processos de SFE à separação em membranas pode ser
realizada através da filtração da mistura supercrítica (CO2 + extrato). A combinação
do sistema CO2/membrana confere melhoria no potencial de separação da membrana
e seletividade para a extração, possibilitando a produção de frações de extrato com
estreita faixa de massa molar.
A separação de solutos no processo de SFE ocorre normalmente através
de despressurização, na qual o fluido supercrítico passa ao estado gasoso, seguida
da coleta dos extratos. Os custos de recompressão do CO2 gasoso para a fase líquida
ou supercrítica são altos. Neste contexto, a integração do processo de SFE à
separação por membranas pode permitir a recirculação do solvente sem
descompressão, resultando em uma importante economia energética (SPRICIGO
et. al., 2001). A separação por membranas acoplada ao sistema de extração
supercrítica ainda é uma tecnologia relativamente nova, assim como as tentativas de
separar os componentes extraídos pelo CO2, os benefícios do baixo consumo de
energia e equipamentos compactos para este processo. Além disso, a tecnologia de
membranas oferece uma opção adequada para a regeneração contínua de fluidos
supercríticos (REZZADORI, 2015). Desta forma, o estudo da integração dos
processos e do comportamento de diferentes materiais de membranas em CO2
supercrítico é de grande importância para os trabalhos futuros.
134
6. CONCLUSÕES
A recuperação de compostos bioativos a partir de resíduos de mirtilo pela
extração com solventes pressurizados mostrou resultados promisores. A PLE
utilizando água e etanol como solventes foi eficiente na extração de compostos
fenólicos, antioxidantes e antocianinas do resíduo de mirtilo fresco, e o etanol foi
efetivo para o resíduo de mirtilo liofilizado. A SFE apresentou resultados satisfatórios
usando 5% de água e 5% de etanol como cossolventes para o resíduo de mirtilo fresco
em termos de compostos fenólicos (134 mg GAE/g extrato), capacidade antioxidante
DPPH e ABTS (1658 e 199 µmol TE/g extrato, respectivamente) e antocianinas pelos
métodos de pH diferencial e UPLC (1071 e 808 mg/100 g extrato, respectivamente).
Os extratos obtidos com água acidificada apresentaram menor capacidade
antioxidante determinada por ambos métodos, DPPH e ABTS. Assim, com relação
aos métodos de extração, o processo SFE apresentou-se mais vantajoso que a PLE
na obtenção dos compostos de interesse.
O extrato do resíduo liofilizado apresentou baixas concentrações de
compostos fenólicos, antocianinas e capacidade antioxidante, devido a possíveis
degradações durante o congelamento e secagem. Os extratos de resíduos de mirtilo
(Lote 1) apresentaram maiores concentrações dos compostos de interesse, o que
pode ser explicado pelo fato de estes compostos serem mais abundantes na casca
do que na polpa da fruta. A capacidade antioxidante e a concentração de antocianinas
para os materiais avaliados foram semelhantes ou superiores às encontradas na
literatura, o que pode ser explicado pela diferença de variedades. Os resultados de
quantificação de antocianinas por UPLC foram inferiores aos obtidos com o método
de pH diferencial. Foram identificadas dezesseis antocianinas, provando a riqueza
destes compostos no resíduo de mirtilo do Lote 1.
Com a finalidade de concentrar e purificar os compostos interesse, utilizou-
se o resíduo de mirtilo e o extrato SFE do mesmo material e nas mesmas condições
utilizadas com o Lote 1, como alimentações para a nanofiltração. Das membranas
testadas, a NF 270 apresentou as maiores retenções dos compostos de interesse para
as duas alimentações. Diante dos resultados apresentados, abre-se a perspectiva de
135
montar uma unidade de extração supercrítica acoplada à separação por membranas,
a fim de avaliar o processo integrado, desde a matéria-prima até a
purificação/separação de um composto de interesse.
Considerando que os resíduos de mirtilo, bem como outras frutas,
geralmente são descartados ou desvalorizados pelas indústrias de alimentos, os
resultados deste trabalho fornecem perspectivas promissoras para a recuperação de
componentes de alto valor de tais subprodutos, abrindo uma nova possibilidade para
a produção de ingredientes alimentícios com custo reduzido e que possam ser
aplicados nos setores de panificação, confeitos, bebidas e lácteos.
136
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Estudar a recuperação dos compostos de interesse do mirtilo pelas técnicas de
PLE e SFE com CO2 supercrítico;
Construir uma unidade integrada de SFE/PLE e separação por membranas;
Avaliar diferentes materiais de membrana em termos de sua adequação ao
sistema integrado;
Avaliar diferentes membranas de nanofiltração e de osmose inversa nas
condições de operação do sistema integrado;
Avaliar o comportamento das membranas em CO2 supercrítico em diferentes
condições de temperatura, pressão exercida na membrana e vazão de CO2;
Verificar o comportamento de diferentes cossolventes quando permeiam a
membrana juntamente com o CO2 supercrítico;
Estudar a melhor condição de processo e a integração SFE e PLE com
separação por membranas em sistema integrado: fluxo de solvente, retenção de
compostos de interesse e fator de separação.
137
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. APÊNDICES
9.1. Perfis cromatográficos das antocianinas identificadas nos resíduos
do Lote 1, nos extratos de resíduos de mirtilo e nos produtos da nanofiltração.
Figura 9.1. Perfil cromatográfico da Cianidina-3-O-glucosídeo
Figura 9.2. Perfil cromatográfico da Petunidina-3-O-glucosídeo
antocianionas
m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150
%
0
100
J2 a 501 (1.956) 1: TOF MS ES+ 2.99e5449
435409287203126
110 173132158 177 207 265251245!
379376!
303 335!
317!
349!
395419
450
451 !471
452
!489
519!
533!
548!
897551 704582!
630
!593
670667
!683 713
875!
757739!
844 935915!
950964 11841011!
989!
1045!
1073
!1194
antocianionas
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 521 0.5000Da
8.47e4
160
Figura 9.3. Perfil cromatográfico da Peonidina-3-O-glucosídeo
Figura 9.4. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-glucosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J18 a 1: TOF MS ES+ 301 0.5000Da
1.87e5
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J18 a 1: TOF MS ES+ 331 0.5000Da
2.24e5
161
Figura 9.5. Perfil cromatográfico da Delfinidina-3-O-glucosídeo
Figura 9.6. Perfil cromatográfico da Cianidina-3-O-galactosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 465 0.5000Da
1.36e5
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 449 0.5000Da
3.59e5
162
Figura 9.7. Perfil cromatográfico da Petunidina-3-O-arabinosídeo
Figura 9.8. Perfil cromatográfico da Delfinidina-3-O-arabinosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J18 a 1: TOF MS ES+ 317 0.5000Da
1.68e5
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 435 0.5000Da
6.41e4
163
Figura 9.9. Perfil cromatográfico da Petunidina-3-O-galactosídeo
Figura 9.10. Perfil cromatográfico da Cianidina-3-O-arabinosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 479 0.5000Da
1.50e5
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 419 0.5000Da
2.19e5
164
Figura 9.11. Perfil cromatográfico da Peonidina-3-O-galactosídeo
Figura 9.12. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-arabinosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 463 0.5000Da
2.98e5
antocianionas
m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800
%
0
100
J2 a 1255 (4.875) 1: TOF MS ES+ 2.89e5463
126117
111 331251223173142149158
203201177
!217
!245
260265 !
285 301 313449417
!349
!377
!371
393 397!
433
464
465
503466 485 517 569565!
547545533
!599
!579 729
!607
700!
666
!659647
625 679685
!710
!720
!795
!740
!755
!770
!789 800
165
Figura 9.13. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-xilosídeo
Figura 9.14. Perfil cromatográfico da Malvidina-3-O-galactosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J18 a 1: TOF MS ES+ 331 0.5000Da
2.24e5
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 493 0.5000Da
2.21e5
166
Figura 9.15. Perfil cromatográfico da Peonidina-3-O-arabinosídeo
Figura 9.16. Perfil cromatográfico da Delfinidina -3-O- galactosídeo
antocianionas
Time-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40
%
0
100
J2 a 1: TOF MS ES+ 433 0.5000Da
6.40e4
antocianionas
m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800
%
0
100
J2 a 350 (1.369) 1: TOF MS ES+ 1.32e5465
203
126111
200177173142
157 191379
265223203 251
!245 303288281
!319
!365
!343
!325
!351 441380 421
!410
395 435 449
466
467!
505487479
519!
549!
533 582!
564573!
698!
689661623!
597 621!
642
!636 647
!671
!680
!751729
!723!
709 750
!760
!778
!783
!793
801
167
9.2. Perfis cromatográficos das antocianinas identificadas no mirtilo
fresco
Figura 9.17. Perfil cromatográfico da Delfinidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo
Figura 9.18. Perfil cromatográfico da Malvidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo
antocianionas
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 507 0.5000Da
1.27e4
antocianionas
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 535 0.5000Da
4.61e5
168
Figura 9.19. Perfil cromatográfico da Cianidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo
Figura 9.20. Perfil cromatográfico da Delfinidina -3-O-(6-acetil)-glucosídeo
antocianionas
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 491 0.5000Da
1.18e4
antocianionas
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00
%
0
100
Mirtilo pao 1 a 1: TOF MS ES+ 507 0.5000Da
1.27e4
169
9.3. Atividades realizadas no doutorado
Estágio docente (PED)
Ano de 2012: Programa de estágio docente (PED), no grupo C – Atividades
de Apoio à Docência Parcial, no primeiro semestre letivo de 2012, com dedicação de
08 (oito) horas semanais, nas atividades da disciplina TA832 (Formulação e Avaliação
de Projetos), sob supervisão da Professora Doutora Miriam Dupas Hubinger, na
Faculdade de Engenharia de Alimentos – Unicamp.
Supervisão de Iniciação Científica
Ano de 2013: Supervisão de Iniciação Científica da aluna de graduação da
Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade de Campinas, Raquel Dotta,
finalizando o trabalho de pesquisa intitulado: Caracterização do Resíduo de Mirtilo e
Extração de seus Compostos Bioativos usando CO2 Supercrítico. Processo FAPESP
nº 2013/00221-7.
Ano de 2014: Supervisão de Iniciação Científica da aluna de graduação da
Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade de Campinas, Vitória
Rasmussen, finalizando o trabalho de pesquisa intitulado: Extração de componentes
funcionais do resíduo de mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) por CO2 supercrítico seguida
de concentração por membranas.
Trabalhos apresentados em eventos
Ano de 2013: III Iberoamerican Conference on Supercritical Fluids – Prosciba -
Cartagena de Índias- Colômbia.
Apresentação em pôster dos trabalhos intitulados:
1- Extraction of phenolic compounds from blueberry (Vaccinium myrtillus L.)
residues using supercritical CO2 and pressurized water.
170
2- Development and assembly of a home-made pressurized liquid extraction
(PLE) unit.
3- Ultrasound assisted supercritical fluid extraction of oil from baru (Dipteryx
alata vogel).
Ano de 2014: European Meeting on Supercritical Fluids - Marseille, França.
Trabalhos apresentados em pôster:
1 - Extraction of phenolic compounds and anthocyanins from blueberry
(Vaccinium myrtillus L.) residues using supercritical CO2.
Ano de 2014: IUFOST – Montreal – Canadá
Trabalhos apresentados em pôster:
1 - Extraction of functional compounds from blueberry (Vaccinium myrtillus L.)
residues using pressurized liquids.
Ano de 2015: Euromembrane - Aachen – Alemanha
Apresentação em pôster dos trabalhos intitulados:
1 - Concentration of bioactive compounds from blueberry juice, residue and
its extract by nanofiltration.
2 - Sugarcane juice tangential microfiltration: evaluation of temperature and
transmembrane pressure and comparison to conventional clarification
process.
3 - Concentration of lycopene from the pulp of papaya (Carica papaya L.) by
ultrafiltration on a pilot scale.
Ano de 2015: 11o Slaca – Simpósio Latino Americano de Ciências de Alimentos
– Campinas –SP.
171
Trabalhos apresentados em pôster:
1 - Extração de componentes bioativos do resíduo de mirtilo (Vaccinium myrtillus
L.) por CO2 supercrítico seguida de concentração por membranas.
Artigo publicado
Extraction of phenolic compounds and anthocyanins from blueberry
(Vaccinium myrtillus L.) residues using supercritical CO2 and pressurized liquids.
Juliana Paes, Raquel Dotta, Gerardo F. Barbero, Julian Martínez. Journal of
Supercritical Fluids, v. 95, pg. 8–16, 2014.
