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UTILIZAÇÃO DO BAGAÇO DO SISAL (AGAVE SISALANA) PARA PRODUÇÃO

DE LICOR ATRAVÉS DE HIDROLISE ENZIMÁTICA.

D. S. Figueiroa(1), S. S. Oliveira(1), R. P. Veloso, G. F. Franklin(1), L. S. C. Oliveira(1)

Unidade Acadêmica de Engenharia Química

Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) – Campina Grande-PB

(1) E-mail: [email protected]

RESUMO

Nos últimos anos tem-se intensificado as pesquisas com os resíduos

lignocelulósicos, como bagaço de cana de açúcar, na produção de etanol de

segunda geração, pois esses materiais, são fontes abundantes de carboidratos, têm

um grande potencial de bioconversão, baixo valor agregado e são normalmente,

desperdiçados. Neste trabalho pretendeu-se produzir por hidrolise enzimática licor

glicosídico do bagaço do sisal (Agave sisalana) previamente tratado, visando avaliar

seu potencial na conversão de celulose em glicose. Com os resultados obtidos

encontrou-se a melhor condição de conversão 27,7438 g/L de glicose, após 36

horas. Conclui-se assim, que a metodologia proposta obteve resultados significativos

no que diz respeito a solubilização da hemicelulose e na remoção da lignina

seguindo os pré-tratamento ácido e básico, respectivamente, o que influenciou nos

bons resultados de conversão de celulose em glicose, a partir da hidrólise

enzimática.

Palavras-chave: sisal (Agave sisalana), hidrólise enzimática, produção de

glicose.

60º Congresso Brasileiro de Cerâmica15 a 18 de maio de 2016, Águas de Lindóia, SP

1960

INTRODUÇÃO

O melhoramento da qualidade de vida e o crescimento populacional, tem

gerado uma dependência cada vez maior por energia. No entanto tem-se percebido

nos últimos anos uma mudança climática drástica e a diminuição das fontes de

combustíveis fósseis. É nesse contexto que se têm intensificado Pesquisa e

Desenvolvimento de fontes energéticas alternativas, utilizando matérias-primas

renováveis, em particular os abundantes resíduos agrícolas e agro-industriais,

denominados de biomassas residuais(1).

Além das biomassas residuais existem biomassas vegetais que a eles não são

dadas as devidas importâncias por não se extrair ou retirar dos mesmos, materiais

que possam ter uso industrial que gerem alto valor agregado. Nesse contexto no

Brasil, podemos citar como exemplo dessa biomassa, o sisal ou (agave sisalana).

O sisal é uma planta trazida do México que se adaptou no clima semi-árido.

Seu valor comercial está limitado ao beneficiamento da sua fibra, pois esta é

utilizada na fabricação de vassouras, tapetes, bolsas, e outros produtos. Para a

extração dessa fibra a planta passa por uma etapa chamada de desfibramento em

que se remove a parte verde da folha, restando apenas a fibra, onde temos que 4%

são aproveitadas na forma de fibra, 16% são resíduos sólidos e 80% são resíduos

líquidos(2). Este resíduo sólido, o bagaço, é constituído também de materiais

lignocelulósicos que acabam se perdendo no processo de desfibramento e que

muitas vezes são descartados. O bagaço de sisal é constituído por celulose,

hemicelulose e lignina, na proporção aproximada de 30 a 40 % de celulose (fração

mássica em base seca), 25 a 40 % de hemicelulose, 22 a 30 % de lignina e traços

de minerais, cera e outros compostos(3).

O sisal (Agave sisalana) pode ser uma matéria-prima ideal para produção de

etanol de segunda geração, tanto a fibra quanto o bagaço, por serem esses

materiais de custo relativamente baixo, a biomassa vegetal ser disponível no Brasil,

por não ser usado como fonte de alimento e ao mesmo tempo, ser uma fonte de

celulose.

Segundo Santos (2012)(4), a biomassa lignocelulósica contém cerca de 20% a

60% de celulose. A celulose é um polissacarídio constituído de monômeros de

glicose ligados entre si e pode ser totalmente convertida a glicose por um processo

de hidrolise enzimática, após a etapa do pré-tratamento para desorganização da


1961

matriz lignina-carboidrato que protege a celulose. A glicose é a molécula que

participa do processo de conversão da biomassa lignocelulósica em açucares

fermentáveis.

No entanto, ainda se encontra entraves para produção industrial do etanol de

segunda geração o que se faz necessária a realização de inúmeras pesquisas

biotecnológicas, Sticklen (2008)(5); Rubin (2008)(6); Lynd et al. (2008)(7), citado por

Lima (2009)(1), abrangendo os três principais pilares da produção do etanol

celulósico: a produção de biomassa viável, o desenvolvimento de degradadores de

parede celular e a otimização da fermentação dos açúcares formados.

Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi produzir licor do bagaço do sisal

(Agave sisalana) por hidrolise enzimática visando avaliar seu potencial na conversão

de celulose em glicose.

MATERIAIS E MÉTODOS

Matéria-prima: O bagaço do sisal, utilizado no presente trabalho, foi fornecido

pela fazenda Montevidéu da Zona Rural do município de Nova Floresta- PB. Esta

biomassa foi inicialmente lavada e seca à temperatura 65 oC em estufa. A cada 8

horas as amostras foram pesadas até que a massa permanecesse constante, em

seguida foram moídas em moinho de facas.

Caracterização do bagaço do sisal: umidade, cinzas, celulose, hemicelulose e

lignina: A caracterização do bagaço do sisal: umidade, cinzas, celulose,

hemicelulose e lignina, foram realizadas no presente trabalho utilizando a

metodologia usada para análise de matérias lignocelulósicos baseada nas normas

TAPPI citadas no Documento 236 da Embrapa por Morais et al. (2010)(8).

Pré-tratamentos: No presente trabalho foi realizado um pré-tratamento químico

do bagaço do sisal, em um reator MAITEC forno INTI, com controle de pressão e

temperatura.

Pré-tratamento ácido: O pré-tratamento ácido foi realizado em reator

pressurizado: pesou-se uma alíquota de 50g de bagaço de sisal e colocou-se no

reator, e posteriormente adicionou-se 500 mL de uma solução H2SO4 1%, ajustou-

se a temperatura do reator para 120 ºC e manteve-a constante por uma hora para

que ocorresse a reação, em seguida o material foi lavado com água destilada e


1962

filtrado a vácuo para separar o resíduo do licor rico em xilose, depois o material foi

seco em estufa de circulação forçada a 60 °C até atingir massa constante.

Pré-tratamento alcalino: Para o pré-tratamento alcalino 50g do material, tratado

anteriormente em meio ácido, foi transferido para o reator pressurizado em seguida

adicionou-se 500 mL de solução NaOH 4%, a reação ocorreu a temperatura de

120°C mantendo-se o tempo constante de 1hora, em seguida o material foi filtrado e

lavado com água destilada até o pH se igualar a ao da água de lavagem, depois

secou-se o material em estufa de circulação forçada a 60 °C até atingir massa

constante.

Determinação da atividade enzimática: A determinação da atividade enzimática

baseou-se na metodologia proposta por Ghose (1987), que mediu a atividade

celulolítica em termos de unidades de papel de filtro por mililitro da solução

enzimática original.

Hidrólise enzimática: A hidrólise enzimática do bagaço do sisal pré-tratado foi

realizada com o auxílio de um planejamento fatorial 22 verificando-se a influência

das variáveis de entrada: carga enzimática e porcentagem de massa seca de sisal e

volume reacional.

A hidrólise foi realizada em frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo: o

bagaço do sisal seco, extrato enzimático de celobiohidrolases (CBHs), endo-1,4-

beta-glucanases (EGS) de nome comercial Celluclast 1.5L Novozyme, 8,21

FPU/mL) e 0,28g de beta-glicosidase (Powercell) e tampão de citrato de sódio nas

condições do planejamento experimental e três gotas de solução de tetraciclina

(10mg/mL em 70% de etanol) para prevenir o crescimento microbiano durante a

hidrólise. Esta mistura foi mantida em uma incubadora shaker sob agitação de 150

rpm e temperatura de 50°C.

Para cada experimento foram coletadas amostras em tempos pré-definidos

para o estudo da cinética da hidrólise enzimática e assim obteve-se as melhores

condições para a obtenção da máxima concentração de glicose.

As Tabelas 1 e 2 contêm as variáveis de entradas na forma codificada e não

codificada, bem como, a matriz do planejamento experimental.


1963

Tabela 1 - Níveis codificados e reais das variáveis independentes para o planejamento

Variáveis -1 0 +1

Carga enzimática

(FPU/g)

10

17,5

25

% da razão massa seca

do bagaço do sisal/

volume total

2

3

4

Tabela 2 - Matriz de planejamento fatorial 2²

Exp. Carga

enzimática

% da razão

massa seca/

volume de extrato

Massa

de sisal

Volume

de extrato

Volume

total

Volume

do

tampão

Tetraciclina

1 -1 -1 3,00 2,68 150,00 147,32 0,6

2 +1 -1 3,00 6,69 150,00 143,31 0,6

3 -1 +1 3,00 2,68 75,00 72,32 0,3

4 +1 +1 3,00 6,69 75,00 68,31 0,3

5 0 0 3,00 4,68 100,00 95,32 0,4

6 0 0 3,00 4,68 100,00 95,32 0,4

7 0 0 3,00 4,68 100,00 95,32 0,4

Determinação de pentoses e hexoses nos processos de hidrólises

O teor de açúcar e aldeídos (HMF e Furfural) foram determinados através de

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) equipado com uma bomba modelo

ProStar 210 (Varian); Injetor manual com loop de 20 µL; Detector de índice de

refração modelo ProStar 356 (Varian) e UV/visivel 284nm (aldeidos); Coluna

analítica de aço inox Hi-Plex H (300 mm x 7,7 mm; Varian), e as condições das

operações foram as seguintes: Temperatura da coluna de 60 ºC; Fase móvel: água

miliQ com vazão de 0,6 mL/min; Tempo de análise: 60 minutos para teores de

açúcares e aldeídos respectivamente Soluções padrões interno de açucares:

glicose, xilose, arabinose e sacarose (Sigma 99,99% grau HPLC), congêneres 5-

hidroximetilfurfural –HMF (Aldrich 99,98%) e furfural (Vetec 99,9 UV/HPLC) foram

utilizadas na quantificação dos componentes do licor.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Caracterização do material lignocelulósico


1964

Na Tabela 3 encontra-se a composição química para o bagaço do sisal in

natura e pré-tratado.

Tabela 3 – Caracterização físico-química do bagaço in natura e pré-tratado

Parâmetros analisados Bagaço sem pré-tratamento

(%)

*Bagaço pré-tratado (%)

Umidade b.u 14,22 ± 0,48 5,47 ± 0,15

Umidade b.s 16,58 ± 0,05 5,78 ± 0,16

Cinzas 8,79 ± 0,23 7,45 ± 0,61

Extrativos 11,87 ± 0,32 8,62 ± 0,51

Lignina 12,04 ± 0,53 8,20 ± 0,27

Holocelulose 51,02 ± 0,42 71,07 ± 0,22

Alfa Celulose 29,68 ± 0,55 53,47 ± 0,13

Hemicelulose 21,34 ± 0,69 17,76 ± 0,10

*Bagaço de sisal submetida pré-tratamento ácido seguido de básico

Por meio dos dados percebeu-se que houve uma redução nos teores de

umidade, cinzas, extrativos, ligninas e hemicelulose após os pré-tratamentos, no

entanto houve um aumento nos teores de holocelulose e alfa celulose. O aumento

nos parâmetros citados se deve ao fato do bagaço ter passado pela etapa da de

retirada de hemecelulose e lignina, devido aos pré-tratamentos químicos utilizados

no presente trabalho.

Os valores de cinzas encontrados nesse trabalho foram de 8,79 % e 7,45

para o material in natura e para o material pré-tratado respectivamente, no entanto

esses valores são bastantes destoantes dos valores relatado por Banerjee e Pandey

(2012)(9) que trabalhando com bagaço de cana encontraram 2 a 3 %.

Os valores de extrativos foram de 11,87% e 8,62% para o material in natura e

para o material pré-tratado respectivamente, valores esses similares aos

encontrados em outros materiais lignocelulósicos como o bagaço de cana-de-açúcar

9,38 % (CANILHA et al. 2010)(10), cladódios da palma forrageira 7,9 % (PRADO,

2010)(11), palha de trigo 9,8 % (SILVA, 2011)(1).

Para α-celulose, lignina e hemicelulose os valores encontrados neste

trabalho foram de 29,68%, 12,04% e 21,34 %, após o pré-tratamento foi de 53,47%,

8,20% e 17,76 % um aumento de 55,50% para celulose e uma redução de 31,89 %

para lignina e 16,78% para hemicelulose o que difere, principalmente no valor

encontrado para lignina por Wanderley (2012)(12), este trabalhando com bagaço de

cana para produção de etanol de 2ª geração obteve um aumento de 74,98% para


1965

celulose, uma diminuição de 13,4% de hemicelulose, enquanto que a lignina

diminuiu 83,35 % em relação ao bagaço pré-tratado.

Os resultados da caracterização físico-química mostram que o pré-tratamento

com ácido seguido de básico tem a vantagem de remover uma parte da lignina,

solubilizar a hemicelulose e concentrar a celulose. No caso da produção de etanol

deseja-se teores menores para a lignina e hemicelulose, pois estes quanto mais

elevados para estas matérias-primas, mais dificuldades são encontradas na reação

de hidrólise, pois os mesmos dificultam a ação dos agentes hidrolíticos (ácido ou

enzimas).

Hidrólise enzimática

Estequiometricamente para 1g de celulose seca pode-se obter teoricamente

1,11 g de glicose. A Tabela 4 apresenta a quantidade teórica máxima que se pode

obter do bagaço de sisal pré-tratado nas condições de razão massa de bagaço de

sisal/volume de extrato.

Tabela 4 – Concentração teórica de glicose para cada condição trabalhada.

Experimento Concentração de Glicose

Teórica (mg/L)

1 11870,34

2 11870,34

3 23740,68

4 23740,68

5 17805,51

6 17805,51

7 17805,51

A Tabela 5 apresenta os resultados da cinética para os rendimentos do

processo realizado no planejamento fatorial 22.

Tabela 5 – Valores da concentração de glicose (mg.L-1) durante a hidrólise do bagaço de sisal no

hidrolisado

Experimentos

Tempo (h) 1 2 3 4 5 6 7

36 10699,15 8266,82 13706,93 14506,74 12938,78 11817,34 14602,24

48 8593,57 9473,91 19280,15 17138,37 14654,94 13311,49 16713,49

60 7897,86 7758,16 18719,02 18734,96 14463,81 10600,64 15291,75


1966

A Figura 1 mostra o perfil da cinética da concentração de glicose obtidos nos

experimentos para uma melhor visualização dos valores expostos na Tabela 5.

Figura 1 - Cinética da glicose na hidrólise enzimática: Carga=10 FPU/g , Razão=2 % Carga=25

FPU/g , Razão=2 % Carga=10 FPU/g , Razão=4 % Carga=25 FPU/g , Razão=4 % Carga=17,5

FPU/g , Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g , Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g , Razão=3 %.

Do comportamento da cinética da hidrólise mostrado na figura acima, observa-

se que as maiores concentrações de glicose no hidrolisado ocorre, na maioria, no

tempo de 48 horas.

Durante o processo de hidrólise enzimática ocorreu também a formação da

celobiose que é um dímero de glicose, produto da hidrólise incompleta da celulose.

A Figura 2 apresenta a cinética da concentração de celebiose no hidrólisado.

Figura 2 - Cinética da celobiose da hidrólise enzimática: Carga=10 FPU/g , Razão=2 %

Carga=25 FPU/g , Razão=2 % Carga=10 FPU/g , Razão=4 % Carga=25 FPU/g , Razão=4 %

Carga=17,5 FPU/g , Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g , Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g , Razão=3 %


1967

A presença da celobiose pode ser justificada provalvelmente pela quantidade

insuficiente da enzima beta-glicosidase colocada na solução de hidrólise. Essa

enzima tem a função quebrar a ligação da celobiose, ou seja, do dímero de glicose.

Após análises dos resultados, observou-se que na condição de carga 10 FPU/g

e percentual razão massa do bagaço de sisal/volume total igual à 4%, após 48h

obteve-se a maior concentração de glicose 19280mg.L-1. No entanto, observa-se

que haveria uma conversão mais elevada de celulose em glicose se a celobiose

estivesse sido totalmente quebrada pela ação da beta-glicosidase.

O diagrama de Pareto é apresentado na Figura 3. Pode-se afirmar que para a

hidrólise o percentual da razão massa seca do bagaço do sisal/volume total (g/mL),

influencia o processo aumentando a concentração de glicose. Os dados foram

analisados em nível estatístico de 95% de confiança apresentando um coeficiente de

determinação de 90,95 %.

-,368093

-,881866

5,354902

p=,05

Carga

Carga by Percentual

Percentual

Figura 3 - Diagrama de Pareto para a hidrólise enzimática em 48h

Na Tabela 6 está apresentado os valares da ANOVA das variáveis

estudadas na presente pesquisa.

Tabela 6 - Análise de variância (ANOVA) para o licor hidrolisado com 48 horas.

Fonte de

variação SQ GL MQ Teste F

Regressão 86871,277 3 28957,09 1,1


1968

Resíduo 8644874 3 2881,62

Falta de ajuste 2772,844 0

Erro puro 5872030 4

Total 95516151 6

% R2 90,949

Ftabelado = 9,28

Fcalculado

=10,049

GL – grau de liberdade; SQ - soma dos quadrados; MQ. – média quadrática dos desvios ;Teste F -

(Fcalculado / Ftabelado).

A partir da razão entre o Fcalculado e o Ftabelado que foi igual a 1,1; pode-se dizer

que o modelo proposto para a variável dependente é estatisticamente significativo,

ao nível de 95% de confiança. Pois segundo Rodrigues e Iemma (2005) para valores

de F maior que 1,00 o modelo estatístico é considerado significativo.

O modelo estatístico codificado com as variáveis significativa é apresentado na

Equação (A).

Glicose(mg.L-1) = 14166,56 – 315,36.C + 4587,76.P – 755,53 C.P (A)

Sendo o modelo da resposta em estudo estatisticamente significativo, pode-se

construir a superfície de resposta. A Figura 4 apresenta a superfície de resposta

para a variável concentração de glicose do licor obtido da hidrólise enzimática do

bagaço do sisal.

Figura 4 - Superfície de resposta para produção de glicose por hidrólise enzimática no tempo de 48h

Analisando os resultados obtidos percebe-se que para as condições estudadas

a maior concentração de glicose do bagaço do sisal ocorreu para níveis mais altos


1969

da razão massa seca do bagaço de sisal/extrato enzimático e que a concentração

da carga enzimática não influenciou de forma significativa, podendo assim, trabalhar

com menores valores da carga enzimática, o que significa menor gasto com a

enzima.

Vale ressaltar que a condição teórica máxima de conversão de celulose em

glicose não foi atingida porque há a necessidade de aumentar a concentração de

enzima beta-glicosidases no extrato enzimático.

CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos, pode-se verificar que o pré-tratamento ácido

seguido de básico foi eficiente, pois ocorreu uma redução da lignina e hemicelulose,

deixando, assim, a celulose livre, o que favorece o processo de hidrólise por expor

as regiões cristalinas da mesma facilitando a ação enzimas para conversão em

glicose.

Na hidrólise enzimática, operando-se na menor carga enzimática (10) e na

maior relação massa seca de bagaço/extrato (4%) obtive-se o melhor resultados da

concentração de glicose (19280,15 mg.L-¹).

Os valores de conversão de celulose em glicose podem ser melhorados

aumentando-se a concentração da enzima beta-glicosidase na hidrólise enzimática.

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1971

USE OF SISAL BAGASSE (AGAVE SISALANA) FOR LIQUOR

PRODUCTION BY ENZYMATIC HYDROLYSIS

ABSTRACT

In recent years has intensified the research on lignocellulosic waste such as

sugar cane bagasse, used for the prodution of the second-generation ethanol, as

these materials are abundant carbohydrate sources, great potential is developed for

bioconversion, besides that, low added value and they are usually wasted. This work

is intended to produce by enzymatic hydrolysis glycoside liquor sisal bagasse (Agave

sisalana) previously treated, to evaluate its potential in the conversion of cellulose to

glicose. With the results obtained, the best conversion condition is 27.7438 g / L

glucose, after 36 hours. Therefore, is concluded that the proposed method has

achieved significant results as regards the solubilization of the hemicellulose and

lignin removal following the acidic and basic pretreatment, respectively, which

influenced in good conversion of cellulose results in glucose, from enzymatic

hydrolysis.

Keywords: Sisal (Agave sisalana), enzymatic hydrolysis, glucose production.


1972

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