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UNIVfílSIDAO NACmNAL A~rnNOMA Ot MtXl'CO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN

TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR APLI­CADAS AL DIAGNOSTICO DE ALGUNAS

HEMOGLOBINOPA1'1AS ( REVISION BIBLIOGRAFJCA)

T E s s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

PRESENTA

RICARDO ANTONIO GARCIA MERLO

DIRECTOR: Q F.I. GILDA FLORES ROSALES

CUAUTITLAN IZCALLI, MEX. --------'! TESIS COR FALLA DE OIU~

1988

UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis

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V

INDICE

Pág.

I. INTRODUCCION OBJETIVO •••••••••••••••••••.••••••••••••••.••• •

II. HEMOGLOBINA: ESTRUCTURA, FUNCIONES Y MUTACIONES. A. ESTRUCTURA DE LA HEMOGLOBINA HUMANA NORMAL.. 4 B. FUNCIONES DE LA HEMOGLOBINA: RELACION ES-

TRUCTURA-FUNCION e C. VARIACIONES NORMALES DE LA HEMOGLOBINA 1 l D. ORGANIZACION Y ESTRUCTURA DE LOS GENES DE

LAS GLOBINAS HUMANAS ••••••••••········••••• 15 E. TALASEMIAS Y HEMOGLOBINOPATIAS . . . • • • • • . . . • • 19

l. Las Talasemias .. .. .. •• .. . • .... ... ••• ••• 20.

2. Las Hemoglobinopatias ........ , • • • • • • • • • 43

Ill. TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR .........•••••• , • 61 A. OBTENCION DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO ••••• 64 B. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION .......•.••••.. 67 C. ELECTROFORESIS DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION

DEL ADN • . • . . • . . . . • . . . • . . . • • . . . . . . . . . • . • • • . . 72 D. IDENTJFJCACION DE SECUENCIAS GENICAS PARTI-

CULARES •.......••••..•.••.....•.••....•••.. l. Transferencia Southern

2. Hibridación con Sondas Genicas Molecula-

78 78

res .. • • .... • • • .... • ... • • • • .. • .... • .. • .. 80

vi

P&g.

IV. DIAGNOSTICO DE HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS MI. DIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR •••••••••• 95 A. DETECCION INDIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECU-

LARES DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS •••.•••.• 96 B. DETECCION DIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECULA-

RES EN LOS GENES DE LAS GLOBINAS ...•.•••.•• 128 l. Mutaciones Puntuales que Afectan Sitios

de Restricci6n Conocidos • • • • • • • • • • • • • • • 128 2. Uso de Sondas Oligomericas Alelo-Especi-

ficas en Hibridaciones Diferenciales • • • ~147

3. Migraci6n Diferencial en Geles de Poli-

acrilamida • • .. . . . . . . . . . . . • . . . . • • . • • • • • . • 166

v. COMENTARIOS Y PERSPECTIVAS 175

VI. CONCLUSIONES

VII. BIBLIOGRAFIA 182

I. INTRO.DUCC.ION

OBJETIVO

L.a .hemoglobina ha feniilo·~ un ··pápet hist6rico en la

química, la biOlogía y ia :medÚina;· Fue la primer proteína

en .sei':'.'cÍ'istaliza_d_a y en· ser· a:~.oci~cda a una funci6n fisiol6-

gica ~spedfica, La morfología: cr.i.staUna de las hemoglobi­

nas de difererites anim~les ap~~t6 la primera evidencia de

la." eSpeciffcidad de especie en estructuras protéicas; estuvo

entre ·_las primeras proteínas cuyo peso molecular se determin6

, cO~.rectamen te, fue la primer proteína eucariota en ser sin te­

tizadá en un .sistema in-vitro libre de células, este experi-

mento demostr6 que el aparato para la síntesis protéica en

~eucariotes es similar al ·de Escherichia coli. El ARN mensaje­

ro _globinico fué el primer mensajero eucariote en ser aislado

y secuenciado (1).

El descubrimiento de Ingram de que la anemia falci­

forme es causada por la sustitución de un solo aminoácido,

de entre un total de 287, a la mitad de la molécula de la

hemoglobina demostr6 por primera vez que una mutación puntual

en un gen estructural puede provocar la sustitución de un

aminoácido en la proteína codificada por ese gene. Este des-

cubrimiento llevó a la fusión de

genética molecular

molecular ( 2).

la extensión

la genética médica con la

de la patología a nivel

La Hemoglobina es un acarreador respiratorio dual,

transporta oxígeno de los pulmones a los tejidos y facilita

el transporte, en sentido inverso, del bi6xido de carbono.

Realiza esta doble funci6n mediante cambios reversibles de

uu estructura. La forma arterial de la Hemoglobina tiene

una gran afinidad por el oxigeno; en la forma venosa esta

afinidad se invierte (1).

Los físicos gustan de probar los nuevos métodos expe­

rimentales o nuevas teorías en el sistema más sencillo posi-

2

ble, el átómo .:·de. hÚrÓgerio •. ·La Hemogl.obina ha sido. llamada

"el átomo ·de .. li'idro.ge~Ó·, .. d.e la. biología" .:puesto que .. ha servido

par~ la apUC:aci6n d~Cnue~os:); sofisticados ~étC)dosde inves­

tigaclÍ>~· (la cinétfca .de nano~~gundo~ y ia res'onÍincia magnética

nlic.1e·ar· 0-: e·n·'· su,.''.mom'8rito· _f./.?'~-~~ ~-~·c1e'fit.·eu;-e-nt.¡{;_~-:--l~s t~~nicas _de

;;;;:;.,,;~;!;:!!i!f };¡\/,:};¿{i\~~~~;~\~~~1:~~f:¡,;¡¡ de . este f en6meno· ha ofrecido ya'' re's~l Údoiíi'en :1,;:, 1:.,rapia de las h~moglobinopatias (3),

Las Hemoglobinas huma·nas· ~~an·~~m~i·~-s~ · s~n~ ai permitir la observacibn de los efectos "de una gran diver~·idad d~- errores ge-nét_ic~s sobre la estructura y -funci6n de uná

p~o~e,tna su relación con laS manifestacione·s clín_~cas.

Desde un punto de vista biolbgico, la acumulaci6n del gen

falciforme en regiones endémicas de malaria es una de las

m-&-s. ··-c-OriVincentes ilustraciones de la evolución por selccci6n

naturál (4);.

Como resultado de ser un modelo biol6gico de los

---más7'-estudiados _es ~_Ógico, como se mencion6 en párrafos ante­

riores, que la vanguardia de la -Señét-ica molecular, la ingen;_~­

ría genética, dirija sus esfuerzos al conocimiento de la He­

moglobina, de sus patologías, el diagn6stico de estas y su

prevención y/o tratamiento.

Aún cuando las hemoglobinopatías no son un proble-ma

de salud camón en México (4), se decidi6 hacer una recopila­

ci6n y revisibn sobre el uso de las técnicas de genética mole­

cular en el diagnóstico de las hemoblobinopatl.as por los si­

guientes motivos (sin establecer una jcrarqula):

I I. HEMOGLOBINA; ESTRUCTURA, - l'UNCIONES Y MUTACIONES

4

- : ;)': - • ~-- - : .. - > • '-.. '. -

A. ESTRUCTURA DE LA HEM§GLO~INA ÍIUMANA)ÓRMAL - .; :::· '.

_L_a~fh~.i.osic>~1n;;';;';J_\k __ e;¡_I_ªÜ_·-_~:_L_P_t::_¡:~~---~--g',~_:_·-~-~: __ -_:_:_·-.·::_h ___ v_--_-:._:_: ___ -__ :_:: los• vertebradosÍ, 0tó~d~ub1i0és_.; brados. y én;1os -. iadi~~les :d~ ,.1S'~na~•cpi;;nt~~ legumi-

-::,::·: :.:.·;< =_--__ '.:_._-~-~---~_>. _::'_;· __ :;_-_( :~: ,,. --~ -

:.i< - ~ -~~'--.-~}.'. > • hé~~gl~~i~a es una - metaloprotélna giobuÍ;,,X:

peso molecular ele 64 5_00 d~ltones, formada por c~a"tio c'..ae:rias.

pólipeptidicas ile globina y cuatr-o moHctilas pirrotiÚs, .\íue c~n;tÚ~y~n "1 Ham;,,do'Grupo llemo ( 6).

~-. La·s· cuatro cadenas polipept!dicas, pueden ser dos

alf_a-"-like (alfa y zeta) y. dos beta-like (epsilon, gama, delta

y ti~_ta)·1 · d0 ta·i ma~era que el tetramero de globina puede ser

repres.intadri por la f6rmula alfa-like2 - beta-like 2 • En el

hombre las relaciones entre las cadenas alfa y beta-likc de­

peri-den del estado de desarrollo del individuo (embrionario,

,fetal o adulto) (3). Los sitios activos de la hemoglobina

·son los· cuatro grupos Hemo, El papel de estos grupos es el

transportar oxigeno, y· es la funcibn de la cadena protéica

que· le rodea el brindarle un ambiente adecuado para hacerlo.

Este ambiente debe ser hidrofÓbico y se logra gracias a que

los aminoacidos que rodean al grupo llcmo son neutros (7).

Como protcina, ln hemoglobina es diferente a otras

muchas debido a que no sufre grandes cambios coníormacionales.

Los cambios que se suceden durante la oxigenación y la desoxi­

genaci6n estan confinados a la relación que mantiene una cadena

con respecto a la otra, quedando las cadenas individuales

intactas, manteniendo as! constantemente el ambiente hidrof6-

bico alrededor del grupo hemo (7).

5

1. El Monómero de Gfobina

El m;c:>"ºln,er~ .. ·. d~· ·globina es una larga secuencia de

amin-oá.cidos, ~~-~·o :.·¡;a18I-es· .·Y ·polares, - de los cuales el 75% se

encue~trá·n<·· en•> una .conf;rmaci6n- ·de alfa helice (figura 1),

L8: .. ca~~-n~: .. --:~~··<~·.bbi·~. ~cÚ>:re :.~¡.·~is~':' d~~do 1ugar a ocho segmentos

helicoidales u~id'o.s mediante esquinas no. helicoidales (7). '->.~~- ·--_::_-. ··:,,·~~ ',• ': - .::

-L~ e~-truc·tura t·erci·a~ia de ia cadena esta determinada

principalme.nté pór la. posici6n en la hélice de los aminolicidos

pa'larés· Y-.·: no'' políires; Así es que debido a la periodicidad

de. la_,tiÜice _ (3,6 aaiinolicidos en cada vuelta completa). la

cera interna dj la hélice es ~o polar (hidrof6bica) y la super-

ficie es polar (hidrofilica). Los aminoácidos internos no

polares son de vii:al importancia para la estructura y funci6n

dP la ·cadena¡ s-us -c-adenas laterales hidrof6bicas se unen,

ya sea un·a con .otra, con arilinoácidos de hélices adyacentes

o Con el grupo hem. Los aminoácidos polares externos permiten

la solubilidad en el agua de las cadenas (8),

2. El· Grupo Hemo

. El g~-·~p·o;:·.-.;heiDO e~_ u.~-~-.-PO~fir_ina. que contiene un átomo

de· hierro; ·La P.orfirin.a o· protóporfirina III comprende ella

misma:_.~ ,4 anillÓS. p~r.ro·¡-, con extremos nitrogenados, unidos

por PUf':!'.Ot·e·s .:mete.no . c.:..:cff-} .·y. oé:ho cadenas laterales; metil,

vinil -- ¿ áci_do p~opi_~."_ic_o~ El átomo .de hierro se sit6a en el :·ce.ni:.ro.:.-de . la· porfirina·,-, Íija'do a los cuatro nitrogenos

de los n6cleos pirrol quedandole dos vaiencias libres (Fe 2+)

(B) (Figura 2).

El grupo hemo se sitúa en un repliegue de la estructu­

ra terciaria de cada monomero ·de globina llamada "bolsa del

hemo 11, y se fija en su sitio, por una parte, por las uniones

Figura 1. Representnc1on d1agramat1ca de la co~ f1guracion tercia.ria de la globina de los mnmif~ roa •• Se muestra la posic1on dal grupo hamo (en. negro)dentro de la bolsa del hemo. (7)

6

_¡¡

Figura 2. La molecula del hemo. AP acido pr,g pionico; M = metil¡ V = vinil. (8)

Cadena de globina

Aproxinl!l cion por ':<~::z=:z:=J::Z:::Wiil~--las cadenas cido J'.lrol'.lionicas del homo

Figura :;.. Las uniones hemo-globina. (8)

7

8

. -·-

que inté.~éambian las cadenas 'laterales del .écido propi6nico

del hem y.·.la globina; por otra, el hierro qu.e dispone de dos

vBlencias./libres fija una de ellas difecfamente sobre un re­

siduo ·histidina llamado ."proximal" y .. la''otra act6a poi: la

cara opuesta a la molécula del hemo fijando una molécula de

ox~gé_no y, gracias a· su acci6n asegura· -·üna_ aproximaci6n suple­

ménúiria sobre otro residuo de hist"i.dina llamado "distal"

d~·la globina (8), (figura 3),

3, El Tetramero

El i:etramero de hemoglobina (Rb A pór ejemplo) puede

ser considerado como un par de cadenas alfa acom~dadas simétri­

camente sobre un par sim~trico de cadenas beta,· pero diagram6ti­

c6mente puede representarse como se muestra en la figura 4.

--Existen dos regiones de contacto entre cftdenas diferentes,

c6no~ldas como region~s de contacto alfa 1-beta1 (o alfa 2-beta2 )

y el contacto alía 1-beta2 (alfa2 -beta1). El contacto alfa1 -

beta 1 es grande y firme (formado por el contacto entre 35

aminoácidos) y estabiliza a las cadenas en dimeros de alfa­

beta (7).

El ot~o contacto,· el-a~fa 1 -beta2 (formado por contac­

to entre 19,. am'inoácid_os)_, .. ,-es _ei contacto funcional¡ es a tra­

vés de el que· se sucede el ·cambio estructural de la molécula

dti~antc· los procesos de oxigenaci6n-desoxigenaci6n (7).

B. FUNÍ:ÍONES DE LA HEMOGLOBINA: RELACION ESTRUCTURA-FUNCION

Siendo la hemoglobina el pigmento respiratorio de

los globulos rojos, asegura varias funciones:

La funci6n principal es el transporte reversible

de oxigeno desde los pulmones hasta los tejidos. Cada molé-

Figura 4. Representacion diagramatica de las rela­ciones entre las cadenas alfa y beta del tetramero de hemoglobina •• El contacto alfa 1-beta1 (alra2 -beta2) es el contacto estabilizante: el contacto alra1- beta2 (alra2-beta1) es el contacto al tra-­ves del cual las cadenas beta se deslizan durante la o:dgenacion y dcsoxigonacion. (?)

9

10

cu la de· hemoglobina fija una molééula de oxígeno. (02 )· sobre

eí" .hi cr.ro .... de cada grupo hemo, Const~ tuy~ndO ia· -'<iXi.h_·~.moglob-in.a. La molécula humana de· henioglobina e~hibe otras tres: pro.pieda~ deS·· q·üe f~vOrecen a su fu'nción pl-inc.ipal: prin!ero ··:~ª- .-~-ñ·terac·­cióñ hcmO-:hemo o efe e to cooperativo, s~g·u-~do·:<t · la:·/Jl.átiiiiiad· para l.igar.· iones H+ (efecto Bohr) y

de'.!iga~ fosfatos orgánicos (2, 3-DPG) (7,

. Ya se mencionó que el agua debe ser manten.ida fuerá

'de -Ya ffÓlsa del hemo para que este pueda funcionar.. La expli­

·éac{óñ -i{·e·s-tO· puede verse al examinar la -reacc.ión hemo-oxígeno.

En ->Sü e_St8do reducido el átomo de hierro tieñe dos cargas

(+)y ~n electr6n desapareado (e-). En la oxigenac16n, el

o:d.g~no_ ~otra a la bolsa del hemo y comparte este electrón.

La ·unión qúímica entre el oxigeno y el átomo de hierro es

un enlace i6nico dHil y se rompe facilmente al disminuir

:la conceritraci6n de oxígeno en los tejidos:

.• Fe+:'°-(2) + o2 ~ Fe+++-(e)-02

(reversible)

.Cuando el oxígeno se libera, el electrón es devuelto

al átomo de h~_~r~~-1 z:egresando este a su estado ferroso

(Fe++:(~)-). Sin embargo, si el agua (H20) ganara acceso al

hemo,, desplazaría al oxígeno, reaccionaría con el Fe++ y acep­

taría al electr6n del átomo ferroso, oxidandolo irreversible­

mente a su estado férrico (metahemoblogina):

2. Interacción Hemo-Hemo

Cuando un grupo hemo adquiere una molécula de oxígeno

11

sufre un cambio en su conformaci6n de tal manera que se alteran

las relaciones entre las cadenas. Este movimiento se reduce

a _un ·désplazamiento de las cadenas beta sobre las uniones

ál~aJ:~beta2,. Durante la oxigenaci6n la molécula se 11 abre11

y :en-.-1a desoxigenaci6n se ~'cierra'~. Este cambio en la confor­

maC.i6n ·~u~enta la capacidad de los otros hemo para ligar oxí­

geno.- El_ P_roceso in.verso se observa cuando la molécula cede

al ~~Íg~~~. Este. fen6men6 se llama interacci6n hemo-hcmo

(!).

3.

c· •• \ .•.• :cLB ·~anfidad de OXÍgeno que la hemoglobioa puede ligar

a Cu~lq~.~er _ _..'"concentraci6n de o2 es conocida como afinidad

por· .el .o.xigeno .(exprezada como P50 - la p0 2 requerida para

saYurar 81 so% la mo°lécula).

·El pH y la presencia de fosfátos orgánicos influen­

cian a esta propiedad (7).

4. Transporte de Bioxido de Carbono

Otra funci6n de la hemoglobina es el transporte del

C02 desde los tejidos a los pulmones. Solamente una parte

del co2 (alrededor del 40%) es transportada en esta forma.

La hemoglobina fija al bioxido de carbono no sobre el átomo

de hierro como hace con el oxigeno, sino sobre los grupos

aminados laterales de la globina, para constituir la carboxi­

hemoglobina (8).

C. VARIACIONES NORMALES DE LA HEMOGLOBINA

edades.

La hemoglobina humana no es la misma a todas las

Las diferentes hemoglobinas que se presentan ·en las

12

"ªriadas etapas del desarrollo del !ndi.viduo se forman por

las -dist:inl:áS comb.i'nacion~s entre cadena·s monomerica~ de glo­

bina. Las. cadenas m0nomeric8s p~eden ser alfa-like (alfa

y ietii)". de 141 aminoácidos .de largo º'' beta-like (epsilon,

gama, delta o beta) con 146" aminoác.ido·s (3).

La configuraci6n - tridim~~sional de las cadenas alfa,

zeta, epsilon'1 ·, ga.ma, delta y. be.ta es la µiisáu~ .. (figura 1).

Las diferencias entre ellos reside en la secuencia y. número -

de aminoácidos :que. las .forman (3).

En lá tabla· ·1 se indican los diferentes tipos de

hemoglobinas ·que se presentan durante el desarrollo del indi­

viduo sano: En los tres primeros meses de la gestaci6n humana,

los islotes sanguineos del saco vitelino sintetizan las llama­

das hemoglobinas embrionarias, que asocian cadenas embriona­

rias (zeta y epsilon), fetales (gama) y del adulto (alfa),

según la edad del embri6n: Gower 1 (zeta 2-epsilon 2 ), Gower

2 (alfa 2-eps!lon 2 ) y, Hb Portland (zeta 2-gamma2); esta última

es hallada en trazas normalmente en el cordon umbilical.

Subsecuentemente el hígado fetal y la médula ósea se activan,

siendo este Último el principal órgano eritropoyetico en la

vida adulta (figura 5 ), La principal hemoglobina durante

la vida fetal es la hemoglobina fetal HbF (alfn2

-gama2), cuya

afinidad por el oxígeno es más fuerte que la de la HbA. Alre­

dedor del nacimiento ocurre el más interesante de los cambios

en el desarrollo del individuo: el cambio de HbF a llbA (alfu,­

beta2). Otro tipo de hemoglobina del adulto es la HbA2

(alfa;­

delta2), la cual aparece al mismo tiempo, pero permanece como

componente minoritario (1-3.5%) durante la vida adulta (tabla

11). Poco se sabe sobre los factores que disparan el cambio

de la llbF a la adulta; se ha observado que la desaparición

de las cadenas zeta y epsilon ocurre paralelamente, sugiriendo

un cambio coordinado de la expresi6n de los genes embrionarios

(zeta y epsilon) a los fetales (alfa y gama), junto con el

Heoes de Gestacion

Saco Vitelino

Higa do

Medula osea

Figura 5. Representacion esquematica de la acti­vidad de los diferentes genes globinicoa (parte superior) y ~e loa diferentes organoa hematopo -yeticos (parte inferior) durante la gestacion, _ niñez tempr~na y vida aC.ulta. (9)

13

14

TABLA I. Las He:noglobinas Humanas (9)

Tipo de hemoglobina Composicion Presente en de

Cadenas

Hb t. «L (!li_ Vida adulta(95''); trazas en la vida fetal

Hb F O(~".% Vida fetal (:pre do-·. minan temen te); en

vida adulta( 1-2'~)

F.b A2 «%, ~z. Vida adulta ( 1 -2"i)

Gower-1 ~ '-.e ~12 semanas

Gower-2 o<i'-& <12 semanas

Portland ·~ "(L <12 semanas

TABLA II. liemoglobinas del Adu1 to Sano (9)

Hemo15lobint1 A (At&t>z) .......................... .. 97-99. %

Hemoglobina A2 (.C1Í¡) .... : .. ·· ............... ~ •.. 1- 3.5%

Hemoglobina F (O(.z ll'¡) .............. ;., ......... .. indicios

1.5

cambio · eriÚopoictico · del·' saco :.vitelino al hfg'!do fetal.

La persistenciá de pequeñas canticl.ad~; d\.. H(PorÚ.iiid •durante

la .vida fetai ;e asemeja a ia>pe.rsistencúi de :~i;Ciu€ñas. canti­

dades de HbF d~~a~te. l..i vida adul·t~· (9>:} ~} .. L . · '¡-'

;La;s •.. d~·fere.nte: h~:ogl~b{~~.:ik~f~~~~~i~P'~~d~k iij~~ifi_. .. :.:.:. ~.e< 7.·~·~~-.~1.·)v:e"~···.ª. ºt.·:.ml~<ldo;~ •.• ;ü,~/~·¿9~:ein~!e~~&~.:_;Jfa~ J¿á~tica

'·; .. :.·· - - -"·:o,-:· ·~.~~{:_ 'o."i;,~;~~~· ~:.~~~-~-- ;·~'.;_,}_·_,~:::- C," :~~:,-,-. !-=-' -.-¿;/ -· - '' ''--,,"!;".:--J ;:•:.''· -·,-;;e'':'- ··:s.':; ·::,:~ -~ -=~-==

-:::::'~;ik~{~;~i"~~k~~Niif~~lI~l~¡;-~l:á;~:F::::: • E1 estudio de la re~istenci; a la de~nat~r~Hza~16~ ·.

alcali[Iª• q~e·.:permite dosificar laHbF, m~·y. resi .. tente a pH

alcalinÓs (7. ·s).

Se puede tambiln estudiar la rcpartici6n de la

HbF en los globulos rojos por medio de una tlcnica inmunoquimi­

ca con la ayuda de anticuerpos antiHbF (9).

D. ORGANIZACION Y ESTRUCTURA DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS

HUMANAS.

l. Organizaci6n

Los - genes de las globinas humanas se presentan en

familias multigénicas; los genes alfa-like se localizan en

el br.azo corto del cromosoma 16, entre 16p12 y 16pter (10),

los genes beta-like ocupan una regi6n, de aproximadamente

70 Kb 1 en el tercio distal del brazo corto del cromosoma 11

(11). Hay dos genes alfa y 2 gama, totalmente funcionales

en cada cromosoma 16, reflejando su duplicación durante la

evolución y la accibn subsecuente de eventos genicos modifi-

+ -- HbA HbF HbS ---- - h'b A2 y Hb C

Figura : .Micracion electroforetica do diferen­

tes hemoglobinas (8)

16

17

¡·.sdores (figura ~). La tan -cercana relación entre los genes

delta y beta habl.a de una duplicaci6n genice, pero mutaciones

posteriores en la regi6n reguladora del gen delta han hecho

a este gen funcionalmente insignificante. Así pues, existen

solo dos genes beta funcionales por célula diploide. Tanto

la familia alfa como la beta incluyen pseudogenes. Estos

son el resultado de la evoluci6n y, representan a genes previa­

mente funcionales que debido a mutaciones secuenciales se

han inactivado, (10, 11).

2. Estructura

Un gen prototipico de globina incluye tres secuencias

codificantes (exones} separadas por dos secuencias interven­

tivas no codifican tes (intrones) (12). Justamente antes de

las ··secuencias codificantes para el ARNm, en las fronteras

exon-intron 1 y al final de las secuencias codi[icantes para

el ARNm, se localizan secuencias conservadas importantes para

el funcionamiento genico. Los promotores pora los genes glo­

binicos incluyen secuencias en el extremo S' que son esenciales

para la fijaci6n de la ARN polimerasa y para una transcripción

confiable y eficiente (13). Las diferencias en el arreglo

de las secuencias conservadas en las regiones promotores entre

los diferentes genes globinicos pueden ser la clave para su

expresi6n selectiva durante el desarrollo (9). Las sencucncias

en los límites exon-intron son cruciales para la remoción

_confiab_le de los intrones en el ARN transcrito y lü suLsccucn­

te re-uni6n de las secuencias codificantes para la formación

de una molbcula funcional de ARNm (14), La transcripción

parece continuar más allá de la posición que, en el ADN 1 corres­

ponde al extremo 3' de la región codificante; secuencias con­

servadas halladas en esta posici6n pueden ester involucradas

en la terminación de la transcripción del ARNm y en la adición

de adenosines para formar la cola de poliA (15). La cola

18

~ '('$y< cl.o<l

..iChúS 0cC like 5' • QQCll!I , 1 -' Cromosoma 16

Genes f.. lrne 5' (. '1~'}- r!> .r ~ 3' Cromosoma 11 • •• e • • 1 1 1 !.o lo !;o 1 o 10 20 60 Kilo bases

Figura 7. Mapa de las familias de las elobinas humanas.

La familia alfa-lI\<e contiene tres eenes funcionales, zeta,

alfa2 , y alfa1 , y do5 seudocenes, psi-alfa y psi-zeta. Talos

seudogenes tienen homologia de secuencia con los genes funci.2 nales pero son defectuosos en algunos componentes esencialos

pera la oxpresion, y por tanto, no pueden expresar a

dueto globinico. La familia beta-like incluye a los

tes genes funcionales opsilon, AgaM, ªeama, delta y

.su pro­

sieuien beta y

un seudogon, psi-beta. Los genes zeta y epsilon son expresa­

dos durante lQs tres primeros meses de la gestacion, origi -­

nando la horr.oglobina Gower 1 (zeta2 -epsilon2 ). Los geneo du­

plicados alfa y eama, son expresados desdo otapas tempranas _

do la gestacion ya que es posibls> hallar H1; Gower 2 (alfa2 -

epsilon2 ), Hb PortlAnd ( zeta2-gama2 ) y Hb F (alraz-gama2 ) on

la sa:igre retal durante el aegunJo tri:.1ostre. El gon beta _

tambien se activa temprano en la gestacion, sin embargo el cambio importante on la sintesis de las globinas, de la cada

na gama a la beta, ocurre en el periodo peri na tal, cuando la

Hb A (alra2-beta2) se convierte en la hemoglobina mayoritaria. (180).

19

de poliA puede ser '0

ilÍlp~;tant~ 'pa~a el ~ransporte del ARNm

del n6cleo al ~\~oplasmi y en l~ ~stabHidad del ARNm en este

6ltiino meilio.;(9) ."/:fa ::· E. T~LA~~MI¡~ . Y k~MOGLO!II~~:P~T~As

", .~-' - · -·'-' ··- ···::_ - ,. ; .: -L-a~·'.:~~-u~-~-~i~;~.e-~-:-~n- 'fas· :·10Cus :de las ·globinas han con-

tribuido ;co~~ide~ableinenl:e a la morbilidad y mortalidad huma­

na. Ademil.s, la· postulada superioridad del heterocigoto porta­

d0r ':~e B_fgunaS- de estas mutaciones en la lucha contra algunas

hemoparas~~osis, ha permitido la persistencia de estos alelos

en algu~as poblaciones. Al nivel protéico, tales mutaciones

han sido detectables por más de 30 años, a través de técnicas

rutinarias de electroforesis de la hemoglobina y del mapeo

polipeptídico. - Un gran número de variantes hemoglobinicas

han sido descritos y catalogadas brindando importantes elemen­

tos de conocimiento sobre el funcionamiento de la hemoglobina

(42).

Las mutaciones en los genes glob!nicos se han clasi­

ficado tradicionalmente en: 1 1 hemoglobinopatias o mutaciones

cualitativas, que se definen como hemoglobinas anormales con

uno o más cambios estructurales, usualmente un cambio Único

en un aminoácido de una de las cadenas globinicas 1 que se sinte­

tiza a un nivel normal o casi· normal. Algunas de estas muta­

_ciones son 11 silenciosas 111 es decil· que no se afecta ni la

funci6n de la proteína alterada ni el fenotipo del portador.

Otras, como la hemoglobina S falciforme, debido a sus importan­

tes alteraciones fisicoquímicas 1 son la causa de serios feno­

tipos patológicos. 2 1 los síndromes talasemicos o mutaciones

cuantitativas, agrupa a mutaciones que no afectan la estruc­

tura de ·la globina sino que resultan en una disminución de

la biosíntcsis de cadenas globinicas específicas. Esta senci­

lla clasificación de las mutaciones en los genes globí.nicos

20

es violada por o~ras mutacionesi que han sido llamadas hemoglo­

binopatias ~alasemicas, que producen tanto una alteraci6n

de la e~tructur~ g~obinica como una disminuci6n en su síntesis

(9).

1. Las TalBsemias

Las talasemias son anemias hipocroJ!licas-microciticas

que:"_, se __ Car~c-terizan_ por un desbalance en la síntesis de una

o mh de las cadenas globl.nicas de la hemoglobina (7, 8).

Las talasemias se clasifican de acuerdo a la cadena cuya sín­

tesis esta disminuida: alfa-, beta-, delta-beta-, delta-,

gama -delta-beta-talasemias. Además, existe un grup"' de

desordenes, no bien definido caracterizado por la pcr~istencia

de hemoglobina fetal en el adulto (persistencia hereditaria

de hemoglobina fetal o PllllF), y que son el resultado de una

forma extremadamente suave de talasemia en la cual la produc­

ci6n defectuosa de cadena beta o delta-beta es compensada

en gran parte por la síntesis persistente de cadenas gama

( 39).

La síntesis desbalanceada de cadenas glob{nicas resul­

ta no solo en una hemoglobinizaci6n defectuosa del hematíe

sino tambi"én el'! h~mÓlisis provocada por la precipitación in-

tracelular de inC.-lllsioil_e_s ___ formadas---por -la_ -cadeñ_a_ -sintetizada_

en relativo exceso. Así pués, la anemia se debe a una éom­

binaci6n de hiposl.ntesis hemoglobl.nica y de· liem6lisis intra­

medular y esplénica (39).

El estudio de familias afect.adao por talasemias ha

indicado que estas mutaciones se heredan como alelos de los

genes globinicos-. O .sea·, qué las mutaciones talasémicas afec­

tan al gen de globina mismo o a una porci6n de ADN muy cercana

(ligada) al mismo, Las talasemias son mutaciones que actúan

en cis. Una mutaci6n en cis afecta solo al gen del cromosOma

en el- cual S!-Jciide- la mu_tación¡ una mutaci6n que actúa en tra·~·s influye ·la ~xpresi6n de ambos genes de un locus cromosoma!.

Esto~- ·h~chos explican el comportamiento recesivo de los sin-:.:

dromes talasémicos mayores, que requieren de "doble dósistt'

de la mutaci6n para conferir un fenotipo patol6gico grave

(9).

El desbalance en la síntesis de las cadenas de globina

a nivel protéico puede ser el resultado de mutaciones a dife­

-rentes __ ni-Veles. Por ejemplo, las mutaciones pueden afectar

la- estructura del gen, la transcripci6n del gen, la maduración

del ARNm ::o la traductibilidad del ARNm maduro. De hecho,

actualmente ~e han descrito mutaciones a casi todos los nive­

les. Los sindromes talasémicos son heterogeneos al nivel

molecular, hecho no sorprendente en vista de la complejidad

estructural y funcional de los genes globÍnicos (180).

Naturaleza de las Alfa-Talasemias

Por muchos años las alfa-talasemias representaron

a un confuso grupo de desordenes caracterizados por mostrar

un vasto rasgo de manifestaciones clf.nicas, así como la exis­

tencia de muchos y variados pedigris familiares. Sin embargo

con el advenimiento de las técnicas de genética molecular

ha sido posible el estudio directo de los genotipos y con ello

la complej:t dad de los fenotipos se tornó en un problema desen­

traña ble.

Antes de describir las diferentes formas de alfa­

talasemias es necesario revisar su nomenclatura (tabla 111):

Un indivi.duo con sus cuatro genes alfa intactos se denota

alfa, alfa/alfa, alfa. Un individuo con un gen alfa inacti­

vado o reducido en sus [unciones se ha designado como alfa-

22

.TABLA III. Las Alfa Talasemias (42)

Designacion

Sano

Tal 2 ó portador cilencioso

Tal 1 o rasgo talase,,,ico alfa

Manifestaciones clinicas

Ninguna

Asintomatico

Asintomatico a anemia muy ligera

Enfermedad de la HbH Anemia

Hidroposia fetal o Muerte e n-utero anasarca fetoplacentaria . del teto

Numero de genes alfa afectados y representacion

2 --.*« o -0(. /-ti(

3 --/--<.

4 - - / - -

23

taláSeD\ia-/2 ·y,· se le denota como -,alfa/alfa, alfa: tal indi~

vi-duo_ preSenta un mínimo de alteraciones hematológic-as Y· se le llama "portador silencioso", su diagn6stico se infiere'·

pÓr. e.studios familiares y por una disminuci6n en la biosínte­

si~ de. la cadena alfa. Por otro lado, la alfa-talasemia .1·

~- ···ur~sgo talasémico" involucra la pérdida funcional de dos

genes alfa y resulta en una anemia suave con alteraciones·

morfológicas de los hematies y una ligera disminución en los

niveles de hemoglobina. Tal individuo puede ser -,alfa/-,alfa,

que es la forma usualmente presente en los negros o. si los

dos genes alfa no funcionales se hallan en el mismo cromosoma,

-,-/alfa,alfa. Si tres de los cuatro genes alfa no son fun­

cionales, la denotación es -.-/-, alfa: tales individuos pade­

cen el mal de la HbH caracterizado por anemia cr6nica, esplcno­

megalia y alteraciones morfo16gicas de las c~lulas rojas origi­

nadas por inclusiones de HbH (tetrameros de globina beta).

La forma más severa de alfa-talasemia es aquella en la que

no existe~ genes alfa funcionales¡ esto origina infantes hi­

drópicos que mueren en utero, o poco después del alumbramiento,

que presentan como único componente hcmoglobinico las

Hb Bart ( tetramero de la cadena gama) Hbl!. Debido a la

alta afinidad por el oxígeno que posee la Hb Bart, esta casi

no libera oxígeno a los tejidos provocando hipoxia, hidropismo

y muerte fetal (42).

Todavía a principios de la década de los 1970's se

pensaba que la deleci6n de los genes alfa era la única causa­

lidad g6nica responsable de las alfa-talasemias (16), Estudios

de cinética de hibridaciones de ADNc de alfa-globina con

ADN de- pacientes alfa talascmicos indicaron que la deleción

de la mayoria (si no es que de todos) de los genes alfa se

presentaba en estos pacientes ( 17, 18). Sin embargo estudios

posteriores (19, 20) demostraron la existencia de genes "tala.­

sémicos", esto es, genes que aún estando presentes en el genomio

. ,

celular .. , no dirigen fa :Sin tesis de· .. lá cadena, alh. · pilra · la. :

cual co'diHcan:·

·"·· ·;·- "':,_ .. ·--,·-: ._,·;." ..

El . ¡~v~nimi~nt~ 'de las técnicas de clonaci6n mole-

c~lar ,_ ,.~~~Úe·~~ .. ¡a~1;6n· d~1·:· .. _ADN y mapeo con enzimas de restric­

ci6n ¡,·:ha --~tev-Sdo 'a una mejor comprensión de las bases molecula­

-re~ ~~~los~r~~~reglos del ADN que desembocan en las alfa-tala­

semias: El análisis de las secuencias de los dos genes al fa­

·-globinicos y el estudio de las secuencias que los flanquean

han mostrado la existencia de segmentos altamente homologas,

- d~ptic6d0-s en tandcm, dentro de la familia olfa-like (familias

de secuencias repetitivas Alu Kpn) (180), La presencia

dé estas regiones altamente homólogas predispone a los genes

de esta familia a eventos rccombinantes. el malapareamiento,

durante la meiosis, entre dos bandas de ADN de un par de cro­

mosomas homblogos puede originar la deleci6n de uno o varios

de los genes cercanos al evento (180).

En la figura 8 se muestran las deleciones descritas

para el locus alfa-like. Existen dos deleciones que resultan

en el haplotipo -,alfa/. La deleci6n -,alfa3 • 7¡, tambi6n

conocida como ''delecibn derecha'', parece haberse

por un entrecruzamiento desbalanceado entre genes

alfa2 malapareados. Esta deleci6n origina en el

-,al[a/ un gen alfa híbrido, siendo su extremo 3'

el S' alfa2 (180).

originado

alfal

cromosoma

alfal y

la otra a-tal-2 se denota como -,alfa4 •2¡ debido

a que se pierde un segmento de 4',2 ,Xb. Es conocida tambi~n

como la "delcci6n izquierda" .c,i8o').

As{ como uno de los_~rod~~to~ d~ estos entrecruzamien-

25

'¡; n: 'I"'- oc?. oci m rnmm m

- alfa-tal 2 - alfa3.7/ - alfa-tal 2 - alfa4.2./ - alfa -tal -Calra)5· 2/

alfa-tal ASU/

alfa-tal Med/

alfa -tal - (alfa) 20/

Figura 8. Delaciones en la Al fa TalaGemia. El locus de la

globina alfa y la seis delaciones conocidas se muestran. A-­

quellas que dejan un ¡:;en alfa funcional originan el feno:t~po

de al fa-talasemia 2, mientras que aquellas que destruyen la funcion de ambos genes alfa originan la alfa-talasemia 1.

Las aroas oscuras representan di do, mientras quo las are"s tidumbre sobre el final de la

porcioes que se sabe so han peL

rayadas rep1·esontan la inceL

delecion en aquellas mutacio -

nes que aun no han sido.secuenciadas. En aquellas dolciones

en que se ha caracterizado la cantidad exacta de AD!I perdido

esto se muestra como un indice en el haplotipo. Por ejemplo --alfa3· 7/ representa un haplotipo en el que un gen alfa perm,!!.

nece funcional y se ha sufrido una delecion de :;. 7 kb. ASU

representa una delecion hallada en el Sureste de Asia, y Med

una descrita en el Hediterraneo. {18d)

26

tos desbalanc~ados· es un cromosoma con sol? un: gen: ,a~fa, ,_e~

de esperarse que se pr·<;;auzca, -·e·n e1 mismo.'" evénto .. ; un cromosoma : . . ·-:.

con 'tres geries alfa! ~st~s C:romosouias ya han ·.sido. _descritos

(21).

La deleci6n i.iquierda· es ·com6~ entre·· i.ndividuos Orien­

tales (22) y se prese~ta 'también. aunque con baja frecuencia.

en Saudi Ar~bia, pero no se le ha hallado ni eri el Mediterraneo

ni en América (23). ·La deleci6n derecha es vista distribuida

mundialment"e e·ntre todos los grupos raciales (Orientales,

Mediterraneos y Negros) (9). El cromosoma con un solo gen

alfa" es más común que el cromosoma con el gen al fa triplicado

(24). Los griegos chipriotas muestran la mayor frecuencia

de alfa-talasemia entre los individuos blancos y de cromosomas

con el gen alfa triplicado (25).

Las deleciones que llevan a la pérdida de ambos genes

alfa en un cromosoma {alfa-tal-1) pueden ser explicados por

mecanismos de ruptura-reunión de los cromosomas y dan lugar

al haplotipo -,-/ (25),

,Las deleciones de un solo gen alfa, que dan lugar

al haplotipo· -,alfa/, son comunes entre los Negros y los Medi­

terraneos (26). Mientras que el cromosoma sin genes de alfa­

globina es típico de individuos Asiáticos (26). El hallazgo

del haplotipo -,-/ en los Orientales explica la ocurrencia

de la íorma·más severa de alfatalasemia, hidropismo fetal o

.anasarca ~~t6-placentario, en este grupo. Este cuadro no

se presenta en los negros ya que su genotipo alfa-talasémico,

alfa,-/alfa,-, hace difícil la ocurrencia del homocigoto

-,-/-,- (27).

27

Reorregl~s en. los genes zeta.

-Debido a la alta homología entre las secuencias de

los .senes ze.ta y·· pseudo-zeta, no es sorprendente que se origi­

nen en~recruzamientos desbalanceados entre ellos, dando por

resultado cromosomas con genes zeta 6nicos o triplicados.

Sin embargo no se ha definido aún si estos rearreglos tienen,

o no, un efecto fisiológico durante la vida embrionaria o

adulta (9).

Hemoglobinopatías alfa-talasémicas.

Las hemoglobinopatias alfa-talasémicas comprenden a un

grupo heterogéneo de mutaciones que originan ausencia o re-

. ducci6n en la- expresi6n de los genes alfa que estructuralmente

estan p_resentes (tabla IV). La herencia de tales mutaciones,

en combinaci6n con mutaciones del tipo alfa,-/ o -,-/, origina

una gran variedad de manifestaciones clínicas (42).

Mutaciones que alteran sitios de corte en el ARNmhn

Se conoce como ARNm heterogeneo nuclear (ARNmhn)

al transcrito de ARN que aún posee intrones y otros caracterís­

ticas del ARNm inmaduro. Se ha descrito una deleci6n de cinco

nucleotidos que elimina completamente el sitio diana de corte

del primer intron del gen alfa2 y activa un sitio oculto de

corte dentro del primer cxon (28). Un aspecto interesante

de estas mutaciones es la apariencia de que existe cierta

"presión" que obliga a completar los cortes en el ARNmhn,

aunque sea incorrectamente, antes que dejarlo sin procesar.

Mutaciones en el codon de terminación.

El codon normal de terminaci6n de la traducci6n,

28

TABLA IV. Hemoglobinopatias Alfa Te.lasemicas (24)

-lecanisr.io t10lecular del Anorcmlidnd estructural

e!'ecto talase:;;ico en la globina

U.J Perdida del terminador (A) Cadena glooinica alargada

nor?:1al (1) Hb Constant Spring

«. ( 142) ter Gln

(2) Hb Icaria

oC. (142) ter Lis

(3) Hb Koya Dora

c(.(142) te~ Ser

(4) ºHb Seal Rock

et (142) ter Glu

(3) Inestabilidad de la (B) (1) Hb Quone; Zse

globina o hemoglobina e(. (125) Leu Pro

(C) ~:ecanis!:o desconocido (C) Supuesta inestabilidad

postraduccional

( 1) Hb Suan-Dok

o<. (109) Leu Arg

(2) Hb Petah Ti kv ah

e( (110) Ala Asp

29

tanto para la globina alfa como para la beta, es UAA; el ARNm

de · 1a globina alfa tiene 109 nucleotidos en su región 3' no

traducida. El reemplazo de un solo nucleotido en el termina­

dor y con ello, el surgimiento de un codon que codifique pare

un aminoácido y no para la terminaci6n de la traducci6n, da

lugar e la síntesis de cadenas alfa. anomala.mente alargadas.

Como se muestra en la tabla IV, se han descrito varias situa­

ciones diferentes en el cod6n de terminación del ARNm-alfa:

las hemoglobinas mutantes resultantes son diferentes solo

por el aminoácido en la posición del codon de terminaci6n.

La primera en ser descrita, que tomaremos como

ejemplo, fue la Hb Constanl Spring (HbCS). El ARNm-HbCS se

traduce hasta que se encuentra otro codon de terminación en

fase, resultando una globina con 31 aminoácidos en m6.s de

su extremo carboxilo

141). El fenotipo

terminal

talasémico

( 172 aminoácidos en lugar

de la HbCS aparentemente

de

se

debe a la inestabiliad del ARNm y no a una transcripción redu­

cida del mismo ( 29).

Mutación en el sitio de poliAdenilaci6n.

La transcripción del ARNm aparentemente continúa

más allá de la posición en el ADN que corresponde al extremo

3' de la molécula de ARNm madura. Por ejemplo, la transcrip­

ci6n primaria del gen de globina del ratón, continúa por 750

nucleotidos más allá de las sencucncias codificnntes del ADN.

La secuencia AAUAAA, presente en el ARNmhn, actúa como señol

de reconocimiento para que a 20 nucleotidos de ella (en dircc­

ci6n 3 1) se realice un corte y se adicione la cola de poliAdc­

nosinas (30).

Se ha descrito una mutaci6n en humanos que ocurre

en la señal de poliadenilaci6n del gen alfa2, alterando la

formo natural AATAAA a AATAAG. Aunque, a pesar de la mutaci6n,

se llegan ~~sini~tizar.·¿ad~na~~~lf~, la ~ip~~Si6n -esta iedu~~da en un sil,; (30):C

__ i'.-."._. ___ ··.: __ ··;

Globinas i~~s~abl;~ • . ::\_-~(. -.\.·

Lá's .:·muta.ciones:" de· las ·hemoglobinas: Quong Sze

(alfa1~5. ~~u--:',; Pro), de la. Hb .Suan-Dok (alfa 109 Leu -1> Arg)

y de la Hb. htah~TikJ~h .'(aÜá ÚO Ala - Asp) origina una gran

in-~Stabilfdad~:: en:--,la ::.moiécula·, 'la -cual no logra mantenerse

c¿•,¡¡c, 'tet ~amercF ·frincionaV.(n).

Hemog lobinopad.a alfa:taia;;~mica •adquirida.

Una forma adicional de alfa-talasemia merece mención,

ya que es la úñica fOrma de talasemia adquirida. Este síndrome

adquirido de la enfermedad de la llbH se ha observado en pacien­

tes con desordenes micloproliferativos (32). Los análisis

moleculares han revelado un fuerte desajuste en la síntesis

de ARNm-alfa. Sin embargo los mismos estudios revelan que

los genes alfa son estructuralmente normales y, aún más, se

encontr6 que los genes alfa se hallan hipometilados (33) (ca­

racterística de los genes altamente expresivos). La inacti­

vación es uniforme sobre los cuatro genes alfa, lo que indica

que la mutaci6n puede ser sobre un factor intranuclear requeri­

do para la expresi6n de los genes alfa (33).

Distribuci6n de las Alfa-Talasemias.

Las alfa-talasemias se distribuyen principalmente

en el Sudeste de Asia, en algunas poblaciones del Mediterráneo

Y entre individuos negros. Presentandose los casos más graves

de hidropesia fetal y HbH entre los Orientales y ocasionai'mente

en la poblaci6n mediterránea (42),

Se calcula que en la poblaci6n negra anieric'ana .·de

31

un 20" á· un"' 30% dé los 'individuos .són •.heterocigoticos para

la ·a1f~';t818Selliia, mierit-ras que ·un -~·os .por ~·ierít~' de·· esta

. població~ af~c~~d.a es homocigo~a (i7); ·

··La .alta prevalencia de alf~-talasemia :en las· pobl8-

·éiones ·m·e·n~i0n8das se ha· tratado d~--·~x-j,11~-~~- ;~~-.. t.r~vés ·:de ia

posi.b1e· moderaci6ri de. los cuadros beta-;-ta-la.~émicos,~····qu_e tam­

,.,biérí son frecuentes en estas poblac-iones: La ·=-~lfa-t818sefnia reduce la severidad de estos males,:_. __ ya Q.ue._ la patofisiologí.a

.-_ d_e 'la - b_eta-tal_asem_ia aguda se debe' a el ~e.la ti va .exceso de

la _cadena Blfa. Cualquier mOdifiCad~-i Qiie re·duZ·ca este · .. exceso

~elatijb ser& henifico (42).

Manifestaciones Cl!nicas y· Diagnbstico de .las .AÚ.a-T.alaseínias

grave.

Este cuadro repres~nta un problema obstétrico muy

Se manifiesta como toxemia del embarazo y hemorragia

postparto. Los infantes afectados mueren en-utero entre les

semanas 28 y 40, aunque, ocasionalmente, fetos con este mal

han vivido por una o dos horas después del alumbramiento.

Los fetos ·afectados muestran un cuadro de anasarca y anemia

con valores de hemoglobina de 60-80 g/1. El froÚs sanguineo

se caracteriza por hipocromia, poiquilocitosis y retículocito-

sis. La electroforesis de sangre umbilical

he~oglobina- se compone en un 80% de Hb Bart

Hb Portland (zeta2

-gama 2)y 10% de HbH (beta4

);

HbF (alfa2

-gama 2 ) o HbA (alfa2-beta

2) (39).

Mal de la ~emoglobina H

revela que la

(gama 4 ), 10% de

no se encuentra

El mal d.e ra HbH lleva a grados variables de anemia

Los pacientes usualmente no requieren de

tran·sl~s'.i,~nef(~·~;~.~~-~-i-ri~··~s .·:·n:i-: .sufren de hemosideros.i's. Tipica­

ment~.::d·e9·~:~-{~i:1·~ri'..~,~~-~~-Íi·S::{s agudas con infecciones que dificul­

ton. su cdi~gnÚticb y manejo (39). :.·.--~ < ,,._ ..

-¡·~:s· ·-\~l ~eles de hemoglobina var!an entre 70-100 g/l

_y ·:·~1 frotis sanguineo muestra hipocromia

Se observo reticulocitosis del 5-10%.

y poiquilocotosis.

Tras la incubaci6n

de los hematies con azul brillante de creso!, se forman cuer­

pos de inclusi6n, debido a la acción redox de los colorantes

que provocan la precipitación de la HbH. En los pacientes

esplenoctomizados algunas, no todas, las células rojas contie­

nen grandes inclusiones preformadas demostrables con violeta

de metilo. El patrón hcmoglobínico demostrable por electro­

foresis es muy variable consistiendo primordialmente de HbA,

H y A2 con cantidades variables de Hb Bart. La proporción

de llbH varia de 5-40%, la HbA 2 esta casi siempre reducida

o un 1. 562%, la HbA forma alrededor de un 70% del total

en la mayoría de los casos la llbBart puede ser evidenciada

a plls de 7.0 o menores. Los estudios de biosíntesis in-vitro

demuestran un gran desbalance en las proporciones de cadenas

alfa/beta; entre 0.25 a 0.5 (39).

Tratamiento de las Alfa-Talasémias.

El mal de la HbH es la única forma de alfa-talasemia

que, en ocasiones, requiere tratamiento (esplenectom{a) aunque

algunos pacientes se mantienen bastante bien sin tratamiento

específico; en otros, la esplencctomía es ocasionalmente nece­

saria .pero no curativa (39).

Naturaleza de las Beta-Talasemias

Las beta-talasemias son un grupo heterogéneo de desor­

denes caracterizados por una deficiencia cuantitativa de cade-

nas beta en relaci6n a las cadenas alfa presentes en las célu­

las eritroides. El exceso re1at.ivo ·de cadenas alfa provoca

su precipitación con el consiguiente daño a la morfofisiologla

celular y a la eritropoies_:is. Los estados homocigotos de la

beta-tálasernia pue.den di~~dir.se ~n :. betaº -talasemias, en las . . +

cuales rio se d~~ecta biosintesis de cadena beta y; beta -tala-

semias, en las cuales· lás cadenas beta si estan presentes

pero en,caritidades:.muy.·inferiores a las normales (7, 8, 42).

Deleciones en J~s 'lci.cus beta y beta-like.

Aun .antes del advenimiento de las t~cnicas del ADN

re·-¿:~~b·.t¡¡:a:~te. se sospechaban deleciones de la familia beta.

En par'i:ic.ular, la observaci6n de que la hemoglobina Lepare

tenia el extremo amino terminal del gen del ta y el carboxilo

term~nal de beta 1 sugería la ocurrencia de un entrecruzamiento

desbalanceado entre estos genes. Un argumento similar se

formul6 para explicar la existencia de la Hb Kenya, que es

una fusión de las globinas A gama y beta. Con la llegada de

la genética molecular se hnn podido corroborar estos supuestos

y describir otras dclecioncs no previstas (180),

En la figura 9 se muestran las deleciones descritas

para la familia beta-likc. Estas varían en tamaño, desde

una delcci6n de 619 pares de bases que causa una forma de

talasemia betaº en hindues, hasta una <lcleci6n gama-delta­

beta-talasémica que elimina a toda la familia beta-like abar­

cando por lo menos 105 Kb de ADN. Aunque vnrias de estas

deleciones son muy grandes, en ninguna de ellas ha sido posible

observar la deleción por técnicas citogcnéticas. También

vale la pena hacer notar que en homocigotos para estas grandes

delecionea no se ha observado manifestaciones clínico-pato16-

gicas aporte de las talasémicas, Esto sugiere que en esta

regi6n 3 1 del brazo corto del cromosoma 11 no se presentan

02.'f6~1a Kb

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>3•t\ E 5' -l~J--.. '"-~~_.. .......... ..__..._~ ..... .__.JLJL-~

• -, . ·~ :.,t.'---~,_ ri ·-·-··

lr.:ml ____ _ .... ____ _ • • . ... ~~

:34

Fenotipo

f.>º tal (Hindu)

Hb Lepore

Hb Kenia

't tal

\l ( J P)0

(Siciliano)

y'i(Jp)1a1 (Hindu)

y ('á~)º tal (Turco)

ú¡'( í'u11>)º tal (España)

~ir Plli!F (USA)

G,(nl" PHHF (Ghana)

(;¡ '( (J r.>)º tal (Chino)

(~ÍJ(!>)° tal (Anglosa jon} a f, (>)ºtal (Dutch)

('íli(!>)0

tal (Mexicano)

(r 6 r>)º ta1 (Esco~es)

Figura 9. Suu;arlo de las delecio118s de l.; fa1.1ilia beta-like. En esta

se sumarizan todas lao grandes delaciones descritas para este compl~

jo. El fenotipo y, en la matoria de los caoos, ol origen etnico del paciente en quien fueron descritas por priir.ora vez. Lo deai¡;nacion

de tal(J~)0 indica que el cromosoma afectado por la mutacion no da ligar a la sintesis do cadenas beta,ni delta; la designacionl{J ~ )0

talaaemica origina la falta de ::·;::' .. c~c;1 do todos los genes de la

familia beta-like. La designacion G~ y A~ en el fenotipo indic~ .\ue

tipo de globina fetal se slntetiza;por ejeraplo en la talaso,.iia "i

35

Figura 9 con t •••

(Sr:> f(Chino) ,se sinterizan cadenas G\í ,pero no cadenas beta,delta

o Agama. La hemoglobina Lepare desarrolla un fenotipo talasemicb

mientras que la hemoglobina Kenia presenta una persistencia her.!! ditaria de la hemoglobina retal (PHHF) (180)

36

otros genes cr.~cial.es_ ·p~~a _e~· de~arr.Oi10 n·Or:mal:· dei- in~viduo (180).

Para· analizar.· el fenotip.ó resultante de las delecio­

nes en ia ~amiiia beta-like deb~'establecerse una distinci6n,

un :tanto artifl~iai", pe~o 6ti1, para su estudio clinico: prime­

ro, -:"aquellO~ ·en que un componente talasémico es evidente (por

ejempla·.· la talasemia del ta--beta) y¡ segundo, los que se carac­

terizan por la persistencia en la expresi6n de los genes de

la HbF durante la vida adulta (slndrome de persistencia here­

ditaria de la hemoglobina fetal o PHHF). Se dice que esta

distin_cib~ ~s un tanto cuanto artificial ya que los síndromes

de PHHF incluyen un cierto razgo talasémico y, las talasemias

del ta-beta cuentan con un aumento en la producci6n de HbF

(39).

Síndrome de PHHF

t.a PHHF es una condici6n benigna caracterizada por

siOtesis aumentada de HbF en el adulto; usualmente acompañada

por una sint.esis dismind.da o ausente de la globina beta del

mismo cromosoma. El alto nivel de expresi6n de ambos genes

gama, en el cromosoma afectado, es suficiente para igualar

la producci6n de la cadena alfa, de tal manera que no se obser­

van efectos fisiopatol6gicos (42).

Delta-Beta-talasemias.

Por otro lado, en las delta-beta-talasemias, existe

una síntesis disminuida o ausente de las cadenas delta y beta

del cromosoma afectado y, el aumento en la síntesis de hemo­

globinas fetales no es suficiente para prevenir la aparici6n

del fenotipo talasémico.

37

i'Por '·· cfu~i).:~.:~-t-~~,~· ai~ün&~ · d·e·iecioileS- de·· la f amil i B. b~ ta·l-Ík~( 1 o~ g~nes ga~~Ós~~Cxpr'es..:n_' de'. manera. elevada; (PH~F)? - .·

- "'-'-;:~::,~-.. -' -- ·-_- ·-'-0:

lPor q~¿;',~n~{o¿·~s deleciones se repiime ·su -¡,,ipréú.I~' ¡~~que intactos (delta-,bétatcai:/ 'fl~L~p'Óre, ·

:v;.:: -.~)!,:t /~. -· :~:~~ -

... •;t h:n: iro~uesto dos ·expÚca~f~n~s ··p~ia 'el comporta­

~ient~ v~riaÚ~ de los. genes gama ~rite· dff~~~n;t-es Úpos de

dele_cioné~ ·-~~-- l~ familia beta-like:

Flavell· (34) ·propone que. las deleciones alteran la

conforma-ci6.n · dE! la croma tiria ejerciendo influencia sobre la

:~xpre-;:i.(;n cié l~S gep_es de las globinas gama. Según este mode­

lo. las diferentes deleciones causarían diferentes efectos

dependiendo de su posici6n y extensión. Por otro lado, según

Tuan y cols. (35). las regiones que son 11 traidas 11 al complejo

beta, por efecto de la deleci6n, son críticas y pueden actuar

como amplificadores de la expresi6n de los genes gamo.

Otro caso interesante dentro de las dcleciones es

el de la deleci6n Dutch. El cromosoma afectado presenta una

deleci6n cpsilon-gama-delta que termina 2.5 Kb antes del inicio

del gen beta. A pesar de estar presente, el gen beta no se

expresa. Esto implica que las secuencias que son 11 traidas 11

a la vecinidad del gen beta reprimen su expresibn (36).

Hemoglobinopat!as beta-talasémicas

Las diferentes que --2.r_igina~--

Se defin.e como pró.motO_( ' . ,•

secuen-

.38

TABLA V. Hemoglobinopatias Beta Talasemicas (36)

Clase Cambio en Grupo

secuencia Tipo etnico

~:.:'.SCRIPCIO:?

Elementos distales

-87 ACACC'é·ACACQC ~+ Mediterraneo

-88 ACACCC-ACA_TCC (!>O Negro

Caja TATA

-28 1:t,T/IA.~t.-CA':!AI;.AA (.!>+ Kurdo

-28 CATAAAA-CATAQAA ~· Negro

-29 CAT/Jill.-CATQAAA (:>+ Chino

A!l"{~ :m EJ1l!CXO'lALES

Mutaciones sin se::tido

Codon 15 G-A C:>o Hindu

Codon 17 A-T ~o Chino

Codon 39 C-T (.\o Hediterraneo

Corrimiento de fase

Codon 6 -1 (A) ('o He di terraneo

Codon 8 -2 (AA) ~o Turco

Codones 8-9 +1 (G) ~o fü.ndu

Codon 16 -1 (C) ('o Hindu

Codones 41-42 -4 (TCTT) ('o llindu

Codon 44 -1 (C) ('o Taiwan Kurdo

Codones 71-72 +1 (A) ~o Chi~10

39

cont ••• TABLA.V. l!emoglobiilopatia.s Beta Talasemices (36) ' .. - -",·$"'-' ,; -

E!·IPAL.'!E DEL AR:l

Uniones de empalme

Sitio donaC:or: IVS-1 h· 1 IVS-1 n. i

I'/S-2 n. 1

IVS-1 n.5

IVS-1 n.6

Sitio aceptar: IVS.1

IVS-2

01'-AT GT-TT

GT-AT.

G-C

T-C

a 25 pb del ext 3' AG-GG

::,,~vo sitio de empalme :'1uevo aceptar:

IVS-1 n,110 G-A :luevo donador:

IVS-2 n,705 T-G IlfS-2 n. 745 C-G

Ac:.1·1acio~·1 ae sitios ocultos

Codo:> 24 T-A (silenciosa) Codon 26 G-A (Glu Í.is) Codon 27 G-T (Ale Se::)

Tipo

~o (!lo ~o P+

{\ +

Po ('o

(1 +

p +?

(' +

~+ PE (h

Grupo etnico

Medite::-raneo

Hindu Me di terraneo

Hindu Chino Me di terranoo

Hindu

Negro

Me di terraneo

Me di terraneo Me di terraneo

Neg:-o

Asidico

Me di terraneo

cias. de ADN· (¡ú~ sori ~~enci~{e~ par~ la i~iCiac~6n, eficiente

y.: ·co-riii.Xb"!~-'~··: _d-~-;~:~1&·5. tf.:~-~~d;i.'p¿·t:6n-~f;·_ ~~-~ --~,·~·ecuenc_i/~s promotoras

se Í.ociiÚi.iri' 'c~'rca'~~ .. 'al sitiéi de i~icio de la transcripci6n

y._.--fu'n_cio~~n. ;~_n_·::'.·~-:~~- >s~l~:<o~i~--r{t~-~¡·frn COn respecto a las secuen­

ctas' c~dÜi.éant:~s:.

·:Una sé.Cuencia ri-cB en timiná.s y adeninas (TA), cono­

cida :.co~o· c~ja TATA, comi0

e~za de 28 a 31 pares de bases antes

del·.· sitio .:.c;,rrespondiente al. CAP del ARNm (se conoce como

CAP al ·primer nucleotido del extremo 5' del ARNm y que es

modificado por metilaci6n). De 46 a 58 nucle6tidos antes del

sitio CAP se encuentra otra secuencia promotora que incluye

al pentanucle6tido, CCAAT, y que se conoce como la caja CAT.

El promotor para el gen de la globina beta incluye ademhs

secuencias duplicadas en tandem

de bases del sitio CAP (36).

localizadas a 86 y 100 pares

Se han descrito cinco genes beta-talas6micos con mu-

tac.iones en

(36). Dos,

una sola base dentro de secuencias promotoras

en las posiciones -87 -88 (la posición cero

se asigna al primer nucle6tido de ADN transcrito y que corres­

ponde al CAP en el ARNm). Cada una de ellas afecta a la se­

cuencia PuCPuCCC (Pu = purina) que forma parte de las secuen­

cias duplicadas en tandem. Ambas mutaciones son rclntivamente

benignas en cuanto a sus consecuencias funcionales, por ejem­

plo, la expresi6n de los genes beta se reduce a un 20 o 30%

de lo normal. Por lo menos en el caso de la mutación -88

vista en negros y, probablemente en la -87, 1,•ista raramente

en mcditerraneos, los pacientes no se ven severamente afecta­

dos. Por ello estas son auténticas lesiones beta+ -talasémi-

cas.

Se han observado sustituciones nucleótidicas dentro

de la caja TATA de tres genes aislados de individuos de origen

41

disimbolos. Cambios en las bases- de las. poSiciones_"~28 y

-29 se- han descrtto en pacientes kurdos; chi.nos_-y negrós (36).

F:stos genes expresan al gen· de le ·:&lob.in_a_.. be-ta a uO niVel -

de 20 a 30% de lo normal y, por tanto, inuésti:an 'un fenotipo

beta•-talasémico en la homo~igosi~.

ARNm no fu-ndonales.

:varios : gen~s bet~~tal~~6~icos contienen mutaciones

sin s~rlti:éÍci .:'o" d~·;.c~-rrim'ien·-~;o ·-~,~ fase _que dan como resultado

la t'erminaci'60.·'·prem8tUra_ de la cadena polipeptídica durante

la Ú~duúió-n _(tabla. V). E_n estos casos no se producen cade­

nas :b~ta·1·_ .pc;>r -.¡:Q'· ~~;- e~t."cis geBes son del tipo betaº. Hist6-

-f.ic-a~-e·nt-e-~'-=-. fe. mutaci6n sin sentido en el codon 17 hallada

en u·n pnC:iente chino, es importante ya que fue el primer gen

~alasémico en el que la sust.ituci6n de un s6lo nuclebtido

demostró ser responsable del fenotipo talasémico (37).

La mutación sin sentido del codón 39 es importante

por su alta prevalencia entre lo_s mediterraneos {30% de los

genes betaº en esta área son de este tipo y contribuye al

100% de la beta0 -talasemiavista'- en Cerdeña) (36).

Las mu_taciones por corrimiento de fase son debidas

a la delec'i?n -¿, inscrci6n ·de uno, dos o cuatro pares de bases.

La riueVa s~cu_encia generada puede dejar en fase a un codbn

de ter.ñi'inacib~ p~ematuro 1 originando así, el fenotipo betaº

(36).

ARN mtitante pa~a el empalme.

El ARNm heterogéneo 1111clear (hn) debe de someterse

a.un proceso de empalme (splicing) como parte de su maduracibn.

Durante eSte proceso las secuencias no codificantes {intrones=

IVS) los. 'exones · son re-unidos para formar

ai::ARNm. f~ncicinal. · Se···.ha. desé~bierto que en los sitios de

e~pnl~~ Cu.~~~'.,~-~s:_::~:~-~~!~n~-~~~~:~-j- ··ex1~ten senc-uencias conservada·s

quC- s_f~v:~~>·~-~~J~.~-_ña~:-:~_p:·a~,a-"' ia·:;realiZ~ci6n corree.ta de los cor­tes y···. ~mp~lm~.C· d.él. ARN·. •.: Los dinucleótidos GT en el extremo

5' (d~~ad:~r) >}i•,\'c e~· ~i 3' (aceptor) del intron, son esencia­

les ·en :est~s ·;;ecu.~ncias de reconocimiento (38).

s'ec~Cnci'irn con cierta similitud a las señales de

empelm.·e p·-~e~~~- 's'.er encontradas en otros sitios que no sean

los l:!mites intron-exon. Por ejemplo, en el gen de la globina

ti''eta, -el dfnucle6tido GT se presenta 44 veces dentro de se­

cuenci&s· ·similares en un 60% a los sitios de empalme, y el

dinucle6tido AG, 49 veces. Estos sitios de empalme 11 ocultos"

son· raramente (si es qu-e alguna vez) usados durante el proce­

samiento normal del ARN pero 1 pueden activarse por mutaciones

que los asemejen aún más a un sitio de empalme activo o como

resultado de la inactivaci6n de un sitio de empalme original

(36).

Se han descrito tres diferentes mutaciones en el

sitio donador (de GT a AT o TT) tanto del IVS-1 como del IVS-

2, y dos en el sitio aceptar del IVS-2, que originan una su­

presi6n total del empalme en las uniones alteradas (tabla

V). Como consecuencia no hay formaci6n de ARNm maduro y el

fenotipo resultante es de betaº.

Otras dos mutaciones descritas para los nucleótidos

5 y 6 del sitio donador del IVS-1 (tabla V), originan una

reducción del empalme normal, originando una disminuci6n de

entre 25 a 50% del ARNm normal maduro. Estas mutaciones dan

lugar a fenotipos beta+.

Se han descrito ciertas mutaciones que generan nuevos

43

sitios. d~~·· e'm~-~;~me-·;._: t'ant~;-,.\1~-~~~o·;/de·_ -exo~·es ::·como de .i~trones Ctablá v). ·. í::stos•'nuevas :sfrtos i:om~iten crin iós_or1g1na1es

en la r~a1Í:zaCi6ri,,del e'~~alm~ del .ARN.' Álgu~os .ÁRN llegan a-. s~:r ~~-~~~~ad~~s.- -ri~~~:~·1m~~-~-te·?~: Ei':o f~-~:~t-Í.'pO ::-'~~su:it~Ote_ e'·s ··por

tant~ beta+ .. (36);.

Dist;ibUci6ii de' las

·-,· Lo_~~-B~J1~S se concentran primordial-

_·'mente_ 8)r·e4~dOi:_:_ ·~e-· la·- cuenca, del mediterraneo, en la India,

:~~----~'~'-~i-~i:~~-e-~~---~-u·~- ·y_ occidental y en pob~aciones negras. La -- deit-a.::6e°ta~'º~ta-lasém:la se halla limitad.a a Grecia, pudiendosele

encontrar r.Bramente en la India. En la raza negra la beta­

tBl-kSem~a e·s en general mejor tolerada y menos sintomática.

Existe la misma distribuci6n geográfica de los genes talaslmi­

cos ,: el gen falciforme, el gen para la deficiencia de la enzima

G6PD (glucosa 6 fosfato deshidrogenasa) y la malaria, asumien­

d~se el .que estos genes confieren al portador cierta resisten­

cia ante la infecci6n (4),

Manifestaciones Clínicas y Diagn6stico de las Beta-Talasemias

~Homocigosis beta0 /beta 0

Las· manifestaciones clínicas generalmente aparecen

tras' lós·· pii,~ercis cuatro o seis meses de vida 1 cuando ocurre

--eT-c.-ambü.l ___ e_n_ l"a -biosíntesís de ·cadenas gama a beta. Adamás

de una anemia profunda, los rasgos clínicos sobresalientes

de la ta_lasemia mayor o enfermedad de Cooley, son las deforma­

ciones 6~eas (resultantes de la hiperplasia medular) la

hemocromatosis (provocada por las constantes transfusiones

san guineas y la hiperabsorci6n de hierro dietario). La hiper­

plasia medular da lugar a una facies característica de aspecto

mongoloide, con 11 craneo en torre" y mala oclusi6n man di bular.

Los iñfan-tes presentan retardo del desarrollo y del creci­

miento. En los' adolescentes la aparici6n de los caracteres

sexuales secundarios se ve retrasada. Los pacientes muestran

un color de piel particular debido a la combinaci6n de icteri­

cia y exceso de melanina. La anemia severa lleva al surgi­

miento de fallas cardiacas congestivas a menos que se hagan

transfusiones. La sobrecarga de hierro (hemosiderosis) pro­

vocada por las transfusiones, desarrolla cardiomiopatías,

desordenes inmunol6gicos, hipogonadismo, diabetes mellitus,

disfunci6n pancreatica exocrina con malabsorción y, cirrosis

hepática. La mayorla de los pacientes desarrolla la cardiomio­

patía en la adolescencia y mueren uno o dos años después de

la aparici6n de los síntomas cardiacos (39).

El diagn6stico de talasemia mayor debe considerar­

se en pacientes con anemia hemolítica severa y hemuties hipo­

dr6micos microcíticos. La hemoglobina en la talasemia

mayor se halla en valores de 40 a 70 g/l. El frotis sanguíneo

muestra anisocitosis poiquilocitosis, células en diana,

bandeo bas6filo, normoblastémia, palicromasia células en

forma de lágrima. La electroforesis de la hemoglobina muestra

cantidades elevadas de l!bF, la llbA2

se eleva al doble y no

se detecta RbA (39).

Homocigosis beta+/beta+ (variedad negroide).

Esta condicibn usualmente produce uno anemia na grave

con valores de hemoglobina de 70 a 110 g/l. Los cambios peri­

f6ricos en la sangre son típicos de los homocigosis para betaº

el patrón hemoglobÍnico se compone de un 30 a un 60% de

~bF con un nivel normal o elevado de 1lbA2 y presencia de HbA.

Los trastornos 6seas son mínimos, la absorci6n gastrointesti­

nal de hierro dietario por lo general no se eleva. La cali-

45.

dad de vida y e1.pro.n6stico en general son ·buenos (39),

Beta-talasemia intermedia.

Talasemia intermedia es un 'térmi~o clínico. usado

para des~ribir a un tipo de homocigosis de beia-tala~emia

menos grave, en la que el paciente puede· sobrevivir_ sin tran-s­

fusiones. No es una condici6n uniforme sino .que incluye desde

individuos con desordenes mínimos hasta paci'entes que- sufren

de patologia severa y variada. Por mucho, el origen de la

mayoría de las beta-talasemias intermedias es la coincidencia

de __ un_o o más genes alfa-talasémicos con genes beta-ta.lasemia

en homocigosis; esto reduce el desbalance de J.as cadenas alfa

y beta, aminorando as! el mal (42).

Tratamiento de- las Beta-Talasemias.

El tratamiento de la b~ta-·t~lasemili' esta· indicado

para los homocigotos. Los. po-rtador.es "del rasgo · beta-talasémico

(heterocigotos) no req~ieren t~ot~miento (39, 42).

Terapia convenciO_"nal

Transfusiones.

Con· transfuciones continuas de sangre se busca mante­

ner0 -los ni~_eles d12 hemoglobina en valores tales que, al mismo

tiein'pa _qué----_effmlnen la anemia, eviten la hiperplasia 6sca1

la hepatoesplenomegalia y la hiperabsorción de hierro dietario.

En ocasiones, y para disminuir en cierta medida la hem6lisis

la esplenectomía es parte de la terapia de transfusiones (40).

Se han descrito recientemente dos metodologías que

·permiten 18. óbtenci6n de hematies jovenes, "neocitos 11 , que

al ser transfundidos permiten espaciar más, en el tiempo,

las sesiones·.de' transfÚsi6n '(40, 4i).

Terapia de quelaci.61'1.

.. Para eliminar la hemosiderosis,

~onstantes tran~fusiones, los pacientes

Desferrioxiamino (Desferal). Esta droga

46

subproducto de las

deben tratarse con

induce la excresi6n

de hierro y es relativamente at6xica: desafortunadamente para

que sea efectiva debe suministrarse continuamente por 8 a

12 horas por vía intravenosa. Además aún no hay pruebas con­

cluyentes de que esta droga prevenga las cardiomiopatías origi­

nadas por lo hemosiderosis (9).

Actualmente se trabaja con la droga dietilentriamino~

pentaacetato (DTPA) que parece ser una promesa para la terapia

oral de la hemosiderosis (9).

Esperanzas para la terapia del futuro.

Transplante de ~~dula 6sea.

El transplante exitoso de médula 6sea a un paciente

talasémico puede significar su curaci6n total. Se han trans­

plantado m6dulas, tratadas con anticuerpos monoclonales que

eliminan a las células responsables del rechazo injerto vs

receptor, a individuos j6vencs mínimamente transfundidos

tratados con drogas supresoras de la respuesta inmune. De

los cinco sujetos transplantados, dos murieron de complica­

ciones del transplantc los otros se encontraban bien al

momento de la publicaci6n de la comunicaci6n (9, 42) (2 años

después del injerto). Ya que es posible brindar al niño tala­

sémico varios a~os de buena vida con un tratamiento de manteni­

miento, parece poco probable la instauración de programas

a gran escala de transplante medular. Aunque los transplantes

47

},.'· ... . ·' .·> de médula 'se. hiciéran.: c'on el· tiemp_o s_eguros y confiables'

su alto costo i~~ ,ha~e eli~i.tÍsi:a~ • . _:.:..;

Terapia' ~én~ca ~úéct~~ ''

E~ist¡n -dos ·acercamientos teorices para la terapia

génica de la beta tBlasemia. La primera seria la introducci6n

de nueva y correcta informaci6n génica a las células eritro­

poieticas. Resultados éxitosos alrededor de ésta idea se

han obtenido al microinyectar en zigotos de ratones ya sea,

un plasmido rccombinante que lleva al gen de la globina beta

humano (43) o sencillamente fragmentos de restricción con te-

niendo los genes gama beta humanos (44). Los ratones

transgénicos resultantes no sólo expresan los genes de las

globinas humanas sino que lo hacen de formo diferenciada,

expresando al gen gama en su vida embrionaria y al beta en

la adulta (43,44). En una aplicación de estos logros a la

terapia humana se podria considerar la introducci6n de los

genes correctivos clurnntc la vida fetal o embrionaria (terapia

de linea germinal) s6lo células somáticas específicas

(terapia somática) (45),

El otro acercamiento a la terapia g~nica pvr intro­

ducci6n de nuevo material genético seria la correcci6n funcio­

nal de mutaciones de terminación prematura mediante la intro­

ducción de un gen codificante para un ARNt supresor. Tales

ARN ºleen 11 los codones de terminación pueden modificarse

para que inserten al aminoácido apropiado en la cadena globini­

ca (9). El riesgo que se corre con estos ARNt supresores

es el de que supriman a los terminadores normales alargando

anomalamente al polipeptido.

El segundo acercamiento a la terapia génica de las

beta-talasemias es la reactivación de los genes gama. Al

-~.--:~> ' :--· /\:>-.º-; re·activar~se· de :1os·:- genes·· _.8~~8~ · :es'tos formaran

HbF con él exc~so 'de ¿~d~nas alf~ y; p~r t~nto eliminan la

causa de la i:i·sdpatologia Celular.

·-La mÚilac:l6n de las Citosinas en el gen gama origina

su -r.epresi6n. durante el desarrollo. La droga 5-Azacitidina

es un_~n~logo de la citidina que, al incorporarse al ADN duran­

te la 'división celular, no puede ser metiledo y además inactiva

e las metiltransferasas responsables de la emtilaci6n de otras

cif:idinas. Así pues, el ADN de celulas expuestas a la droga

5-Azacitidina se vuelve hipométilado tras de unas pocas divi-

siones. La administración regular de esta droga a pacientes

beta"-homocigotos ha aumentado, de 5 a 7 veces, la expresión

de sus genes goma con la consiguiente atenuaci6n de las altera­

ciones patol6gicas. El hecho de que de entre todo el ADN

hipometilado por la azacitidina, sólo los genes gamo se reac­

tiven, hace pensar que el aumento en la HbF no se 'deba a ·el

efecto hipometilante de la droga sino. a otro mecanismo, mas

especifico, aun no conocido (9),

2. Las Hemoglobinopatias

Se han descrito más de 300 variantes hemoglobinicas

con sustituci6n de un s6lo aminoácido y se les refiere usual­

mente como hemoglobinopatias de ''mutantes cualitativos'' ya

que dan lugar a la biosintesis de globinas anormales. Las

hemoglobinapatias pueden dividirse en: a. variantes resultantes

de la sustitución de aminoácidos externos o síndromes falcifor­

mes, que son aquellos en los que el defecto ocurre en la peri­

feria de la molécula produce una alteración en la carga

neta total de la molécula, detectuble mediante la electrofore­

sis y¡ b~ variantes resultantes de la sustitución de aminoaci­

dos internos, en estos casos la sustitución de un aminoácido

interno, no polar, resulta en una severa anormalidad en la

49

estructura o for~i de la molécula (7,8).

Sindromei falcifo~m~s

- Hemoglobin~ s·falcif~ime

La hemoglóbina S (HbS) resulta de la sustitución

del ácido glutilmico por valina en la sexta posici6n de la

cadena beta (alfa2beta

2Glu __...Val). Esta sustituci6n cambia

la carga de la molécula y le permite la formación de uniones

hidrof6bicas anamalas con otras cadenas, desatando así, una

reacci6n de polimerizaci6n que conduce a la formaci6n de fila-

mentos helicoidales polihemoglobinicos (46). La polimeriza-

ci6n de la HbS se favorece por tensiones reducidas de oxígeno,

acidosis e hipertermia. Bajo estas condiciones los filamentos

helicoidales de hemoglobina forman un gel que deforma al

eritrocito, pasando este de ser un disco biconcavo a una célulo

en íorma de hoz (falciforme)~ La repetici6n de este proceso

reversible in-vivo finalmente origina daños y pérdidas a la

membrana eritrocitariaty a una célula irreversiblemente falci­

forme, la cual, por su falta de deformabilidad, origina daño

tisular vaso-oclusivo (46).

La frecuencia del gen falciforme es extremadamente

c,levada en el Africa Central Occidental, situandose entre

un 5 y un 20%. También se le encuentra en algunos sitios

aislados como Chipre• Grecia, el oeste medio y algunas regio­

nes de la India. Por otra parte, ln HbS es ln hemoglobinopatia

más común en los Estados Unidos de Norteameríca, encontrnndose­

le predominantemente en la población negra (8% de la poblaci6n

negra norteamericana presenta heterocigosis para este gen)

( 42).

50

Man~fest~ciog~s ¿linicas

La anemia falciforme es el·· cuadro provocado por la

homoci'go.sis beta 5 /beta 5 y presenta una gran variedad de proble­

mas clínicos gruesamente ilustrados en la tabla VI.

La enfermedad no es aparente hasta los seis meses

de vida, cuando el efecto protector de la llbF disminuye (se

ha observado que la presencia de otro tipo de hemoglobina

dentro del eritrocito aumenta la solubilidad de la HbS, de

ah! el efecto protector de la HbF). Inicialmente se presenta

anemia, palidez, ictericia y, esplenomegalia. La asplenia

funcional, secundaria al infarto esplenico, se presenta usual­

mente a los dos afias de edad. A travé?s de toda la \•ida, pero

especialmente en la infancia, las infecciones, particularmente

las causadas por neumococos, !J.. influenzae, estafilococos

y. selmonela, son el mayor riesgo para la vida y el bienestar ..

Las razones de cstn supcrsensibilidad n lus infecciones no

cstan claros. Lo que si se sabe es quf.? el bazo, que es el

principal 6rguno eliminador de microorganismos en la sangre.

juega un papel importante en la susceptibilidad a infecciones,

junto con el dafio tisular originado por ln deformaci6n eritro­

citaria. Además, hay evidencias de que en estos pacientes

la opsonizaci6n, por complemento, de los microorganismos es

deficiente (39).

Ocurren en estos pacientes varios tipos de crisis

qu~, junto con las infecciones, son responsables, en casi

to-dOS -loS --casos, de la morbilidad de la enfermedad. El tipo

más com6n de crisis es la vaso-oclusiva o dolorosa. Las crisis

ocurren periodicamente y se caracterizan por dolor en abdomen,

espalda y miembros. Virtualmente cualquier 6rgano o tejido

puede estar involucrado. La estasis capilar focal es seguida,

secuencialmente, por hipoxia, generación aumenta~a de drepono-

51

TABLA VI. Manifestaciones Clinicas de la Anemia Falciforme (39)

Constitucionales

A Retardo. en el desarrollo y el crecimiento

B Susceptibilidad aumentada a las infecciones~

II Vasooclusivas ~ A Microinfartos ~

Dolorosas B Nacroinfartos --..------------'

~Deño ~ orea nos

III Anecia

A Hemolisis Severa

52

cit.os .. Y, finnlmente, trombosis e infarto. Las crisis vaso-

oclusiva·s por lo general duran vlirios días requiriendo· hosp:I-

tafización. Frec~entemente se ·~r~~ipi~~n p~r i~fe¿i~ones, hip.otermia o deshidrataci6n. Algunas de .es.tas· crisis pueden

hacer peligrar la vida.

El segundo tipo de .crisis es la apl&sica. Estos

raros ep_i~odios se presentan cuando uri proceso- infeccioso

disminuye la eritrop·a'iesis ·agraVaridÓ, .·aún -má·a·, · 1a anemia;

pudiendOse llegar a _valores de hemoglobina incompatibles con

·la ;·v-ida. -una vez diagnosticada esta ·crisis es facilmente

~01_1~-jii~~a ~~-~:di~~te t'ransfusiones.

LB Criáfs de secuestramiento esplénico son raras

:rai:·ales; ·La obstrucci6n de las venas esplénicas produce

un -.s.út:>"itO·-;·-y -m_asiv_o almacenamiento de sangre en el bazo_. El

dÓ.lór. abdominal ·y v6mito se ven seguidos por shock hipovolémi­

co y 1 · frÍ!-cuentemente 1 la muerte sobreviene en pocos horas

(39).

'L:os,.~eferoc.igotos AS, o portadores del rnzgo falcifor­

me~ pr.e-5:e,nta_n·-. pr_oblemas clínicos m:lnimos. Estos individuos

deSa_r~()llan c_~iSi!! falciformes s6lo si se ven sujetos a hipo-

xia severa. Por .ello los individuos AS no deben incluirse

entre 'los grupos de alto riesgo (39).

·Hallazgos:en el laboratorio.

En la anemia falciforme se presenta anemia hemolíti­

ca, con concentraciones de hemoglobina de 70 a 80 g/1 y reti­

culocitosis del 10 al 20'%. El frotis sanguineo muestra aniso-

citosi"s

típicos.

ocurrido

poiquilocitosis

Se pueden hallar

infarto esplénico.

con policromasia drepanocitos

cuerpos de Howcll-Jolly si ha

La velocidad de scdimentaci6n

53

. . . '

celúlar .se ve 'di~miÓuída,. ~i conte'o pl~qJ~taffo ~e h~Ua ele­v "ádo ."·y rr·~c·u~ñ'te~·en t'e:)se·/\p~·e-se"ii ta t~~c·d~-i t·o~ i~ "<c_«:J·n_;:~- pred~~-~nan-cia di(g~a~lii~ci.~~~;·(/, 8).: ..• ;' > .). . ·.

;-:~s~~~~-... : "·-~·- ... y_<:~ . ,: .··_.,_--

• ·~~ ~},ü~V'a d;i· .·iDet~bÍ~uifito ¡le sodio es útil para

: ~ t adbii;suril6farttº~r .~h¡se/m;o.f:c.:i:gáo~ltoeozs'.~:s~.s1neaja ! ~:: t: :is s a nsger e m :rn: ~:: s:: ~ ¡.~~ c~i~i~_;\'.{~ .. .. .. . .. · ..... ···. se deforman por completo en u_n-á~=:~:do-~.-:\~~or~a:s.·r.r,~1~~c~~'ra-i( :_ q ~e· -l_a·s_ ··de-- he te roe igotos r eq uer iran

:·ia~~-~~ª212~~j2;o;5:>Ht¡ .~}::tr;:;;e:~sH~: 2 ~a ~:morgelsotb0in:8 m~:;~ No se 'cietecta ·ÍlbA. (7; 8) •

Tratamiento. __ .

Desafortunadamente a la fecha no existe una terapia

específica para la anemia falciforme. Existen una serie de

agentes que se piensa pueden ser efectivos en la prevcnsi6n

de la formación de drepanocitosis pero ninguno hn comprobado

su inocuidad y eficacia. Por tanto, el manejo de estos pacien­

tes se limita a la prevcnci6n de graves complicaciones. Se

les inmuniza contra probables agentes infecciosos, se les

suplementa la dicta con ácido fólico para prevenir la aplasia

megaloblástica 1 se les hidrata oralmente para evitar crisis

vaso-oclusivas y las crlsis aplásicos se trdtan con transfu­

siones sanguineas acompañadas de terapia de quelactón (39).

Hemoglobina C.

La hemoglobina C es el resultado de la sustituci6n

del ácido glutamico por lisina de la sexta posici6n en la

cadena beta (alfo 2-beta2 6 Glus-<> Lis), Esta variante hemoglo­

b:!nica produce cristales que al precipitarse reducen la de­

formidad de la membrana eritrocitaria. El gen de la hemoglo-

54

bina ,·C ,e~_· muy· comun en :el:'_A(rica_-o'cc.ideri·taf. Eil lo·s :·_negrOs

~-ort~'ame~;¡-ca·~·a·s--: ;e >e·n~~~n-~r·a, ai,-_:g·~~-: e~ ,un· 2% dC fo·s individuos

y. e~ rarame~t~ ~is ta en hlarÍcos (42).

Él ·estado homocigoto ·ce~ aunque raro•· pr~_duce una

anemia -de le:ve ·a moderada con esplenomegalia leVe, _icterici·a

y·, extraordfnariamente, fen6menos vaso-oclusivos .. En el frotis

sanguineo la presencia de HbC origina c6lulas e.n diana. En

la electroforesis la l!bC comigra con la HbA2 (39).

El. mayor riesgo de la HbC es su · inteiacCió·a· ·~·on ¡',; HbS para producir la anemia CS falciforme. Esta condición

~~esenta manifestaciones similares a las de la ·anemia S falci~

forme.· La anemia CS falciforme tiende a ser menos grov':;

pero puede producir todas las complicaciones vistas_ en los

estados SS.

Al encontrar a individuos con electroforesis sugesti­

vá de HbSC pero con sintomatolog{a más severa, debe de sospe­

charse de una heterocigosis para HbS y HbO Arab (beta

2 !21 Glu ~Lis) ( 7 ).

- Hemoglobina D

La HbD comigra con la HbS en la electroforesis

.. •s __ e1.,·z:.esu.!tad.o_. de_ la _.sustituci6n del· ácido ·glutámico jior gl u­

tamina en la posición 121 de la cadena beta (alfa2~beta/21 Glu-Gln) (39).

La HbD es encontrada, con baja frecuencia, en varias

partes del mundo. En el Punjab (India) la frecuencia del

gen es de 2% y los estados homocigotos no son raros. En la

población negra norteamericana la frecuencia del gen es de

0.5% (42).

55

La HbD comigra con la HbS electroforlticamente.

Sin embargo, la HbD no produce drepanocitos a bajas tensiones

de·· oxigeno_- y no da resultado positivo en la prueba de solu­

bilidad para la HbS. El estado de homocigosis DD produce

·una· anemia leve asintomática. Como la HbC, la HbD cobra impor­

tancia por su interacci6n con la libS. La anemia DS falciforme

-~s menos severa que lo anemia SS, y el infaLto esplénico no

se presenta. Debido a la comigraci6n electroforética de las

Hemoglobinas S y D, la anemia DS puede ser erroneamente diag-

nosticada como anemia SS. Por tonto, casos leves de anemia

falciforme deben ser sospechados como heterocigocis DS. Las

hemoglobinas S D pueden ser separadas por electroforesis

en agar a ph 6.2 (7, 8),

Talasemias falciformes

La combinaci6n de la HbS y beta-talasemia heterocig6-

tica produce un síndrome similar en severidad a la anemia

SS. Al igual que las anemias CS y DS, la talasemia falciforme

es generalmente menos severa que lo homocigosis SS (39).

-VBiiaRtes resultantes de sustituci6n de aminoácidos internos.

La sustituci6n de amino6cidos internos no polares

resulta en severos anormalidades en la estructura y/o funci6n

de la hemoglobina. Las variantes pueden ser divididas en

tres grupos: i. Hemoglobinas H¡ ii. las hemoglobinas con

afinidad alterada y; iii. las hemoglobinas inestables. Estas

variantes s6lo se han descrito en el estado hetcrocigoto y

es probable que la severidad de la anormalidad molecular,

en homocigosis, sea incompatible con la vida (8).

Hemoglobinas M.

Estas variantes hemoglobínicas resultan-: en .una forma

de 111etahemoglobinemia conglonita. En las cinco variantes des­

critas (tabla VII ) la anormalidad uiolecuí-a'r es la misma:

La cadena lateral del nuevo aminoácido es 10 suficientemente

larga para alcanzar .. al· átomo ~erroso del;, gruP.~ h~mo y aceptar

- al electrón· no aparead~, Ox~d-~nd~~ ~-~·~s-~:e! 'a)." estado ~érrico (7).

. Estas he-m<iglobinas -producen--'1evea -anormalidades cll.­

nicas, como policitemia cian~~is~·- La anemia hemolítica

no es evidente pero, la vida ~edÍ:8- -~.f~-'-·:1~~--: h-é'~Oties se encuen­

tra disminuida.

El diagnóstico puede hacerse por- las propiedades

de absorción de las metahemoglobines. La detección de estas

metahemoglobinas congénitas puede lograrse por electroforesis

si el lisado es previamente convertido a metahemoglobina y

corrido a pH 7.1 (7).

llemoglobinas con afinidad por el Oxígeno Alterado.

La sustitucibn de aminoácidos importantes para los

procesos de unión y liberación del oxígeno, producen hemoglo­

binas con afinidad aumentada por el oxigeno (tabla VIII).

Las siete hemoglobinas con afinidad aumentada resultan en

policitemia, debido a la hipoxia tisular, y rasgos clínicos

como dolores de cabeza y laxitud. Las variantes con afinidad

disminuida producen cianosis y anemia. Sin embargo en general

los pacientes son asintomáticos (7).

57

TABLA VII. Las Hemoglobinas M (7)

/vriante Susti tucion Afinidad por el oxigego

¡Jos ton "" ( 56) P.is-.Tir Disrninui da

Saskatoon (S (63) His-Tir Aumentada

Iwate .( (87) His-1':1.r Disminuida

Hyde Park (!. (92) His-4"Tir Aumentada

·!ilwauki::e (S (67) Val-o.Glu Disminuida

TABLA VIII. Hemoglobinas con afinidad por el oxigeno alterada (7)

Variante Sustitucion Afinidad por el oxigeno

Cheaapeake «.. i92) Arg-Leu Aumentada

Cape Town .eJC. (92) Arg-Gln Aucentada

Ye.ki::!a (?I (99) Asp-+-His Aumentada

Kempsey ~(99) Asp-Asn Aumentada

Ranier ~ ( 145)Tir -c1s Aumentada

Hiroshima ~ (146)His -...Asp Aumentada

Ypsilanti ~ (99) Asp -.Tir Aur.ientada

Hemobloginás inestables.

. . . ' '

.:La )1ere:ncia de.· estas hemoglobin:as. ~.normBle.s resulta

en i'a ~ondi¿i6n conocida como anemia congénita. d~ Cuerpos

de Heinz.

Todas las sustituciones aminoacídicas encontradas

en. estas hemoglobinas resultan en una hemoglobina inestable,

debido a cambios en su tamaño o carga (tabla IX). Esto pro­

voca una uni6n deficiente del hemo a las globinas o una inter­

ferencia en la estructura terciaria de la hemoglobina. Esto

desencadena la disociación del hemo y lns globinast seguido

del desdoblamiento de las cadenas y de su precipitaci6n forman­

do cuerpos de inclusi6n de Heinz (7).

tic a

Todos los pacientes afectados sufren de

congénita no esferocítica de severidad

anemia hemolí­

var iable. No

existen manifestaciones clínicas específicas excepto la dipi­

rroluria (excreci6n de orina oscura) y ocasionalmente cianosis.

La dipirroluria es debida al catabolismo anormal de los cuer­

pos de inclu~i6n de Heinz o de grupos hemo libres (39).

El frotis sanguíneo muestra hipocromía bandeado

bas6filo. Los esferocitos no se observan excepto durante

la crisis hemolítica precipitadas por drogas o infecciones.

Los cuerpos de Hcinz se observan s6lo después de

la esplenectomía o pueden ser inducidos mediante ln incuba­

ci6n de la sangre con colorantes redox como el azul de mcti­

leno (B).

La prueba de precipitaci6n en caliente se realiza

calentando una diluci6n 1:25 de hemoglobina en un buffer de

fosfatos pH 7.4 a SOºC por 60 minutos. Bajo estas condiciones

.59

TABLA IX. Algunas Hemoglobinas Inestables (7)

Variante

!!ammersr.iith

Ko1.n

Bristol

Gu:i -:C:!.11

Sustituc:.on

~(1¡2) Fer.-ser

~ (~8) Val- Met

(' (67) Val-Asp

~ Delecion de una porcion no de te!: r.iinada de FG

Anor::alidad

La fe~ilalanina es un contacto invariable con el grupo hemo 1 l~ cad2 na lateral de serina es muy corto para alcn~zar al grupo he:no

La cadena lateral volu­rr.1nosa de rnet1on1na di& torsiona nl segmento FG, rompiendo varios contoc­tos ;,,,_:o-¡;lobina

La valina r.o polar es ree~plazada por el ncido ~S~?rtico polar¡ para neutralizar la car&e del ospartico se requiere de '.1.nc gran distorsion Cel

La delecion resulta en la perdida de ~uchos conta~ tos he!:!o-glo';:)ina

Go

•,., '

la mayada de las v~ri°¿nt.;; ~riestables 'cono;cidas precipitan _.;:·/:· .. :>' ._;· -_.)'. :.·) .. . ··· ·.··;:

-· · \.·· · ~~:.:.. , :·,. ;'~{·.:'S.: .. :.· . ·~::.f:.

aunque .l~Noe~epxli~s~teect:r~~::mH~~:fit:litd~}f·º~ri~•:ifü::.to:.:::.ien~:: pacientes deben ser. ad.v.ei: .. Údtis . del ·•riésgo: de tomar drogas oxidantes (8). -::••,

111. TECNlCAS DE GENETICA MOLECULAR

61

_.-;~He ;.~~;t~. --f-~"~z~-~o-,·-a·> prtú~e~t~.r~e .-_como bi6logo molecular .• ·. · (. ,:. ). •: porque estaba·. cansado/•. de ·. e'xplicar· :•'.que e'ra .a·.:_ ·la .vez', :un'. crl'st-a16gr_afo, un··: bio.qu!mico, u.n ·:·biof!sico y. un·. "geneti,sta".. · ·

Fra'nds Cri~k (47)·

La genética•'de hoy y la genética del mañana proceden

en línea 'directa 'de la genética de ayer de la que, como se

sabe, H.endel .f~e el ge.nial iniciador (48). Nadie ha pretendido

nunca. que. tod.a .la genética haya nacido en 1865, fecha de la

expoSic.i6n' de los trabajos de Hende!, pero si es innegable

que- fu'e é.1 qUien primero descubri6 lo esencial: la naturale­

za diScreta, es decir discontinua, de los determinantes here­

ditarios, su independencia de unos con respecto a otros,

todo_ ello en una época en la que reinaba la concepci6n de

que la herencia era el resultado de la mezcla de sangres.

Se suele decir que fue a principios de este siglo

cuando tuvo lugar el verdadero arranque de la genética. Nume­

rosos trabajos fueron dedicados entonces al análisis de la

transmisi6n de los genes mediante la reproducci6n sexual.

Por aquella época ya se conocía el mecanismo de la meiosis 1

desde 1902 W,J. Sutton T. Boveri (49), demuestran que

existe un paralelismo entre el modo de transmisi6n de los

determinantes hereditarios, denominados genes por Johansen

algunos afies mas tarde, y el comportamiento de los cromosomas.

Estudios posteriores por parte de W. Bateson y R.C.

Punet (49) originan resultados que parecen estar en desacuer­

do con un comportamiento totalmente independiente de los genes

entre s.í. Estas aparentes excepciones a las leyes de Mendel

encontraron su explicaci6n cuando Thomas H. Margan (SO) funda

la teoría cromos6mica de la herencia.

62

También fue ,a· principios .del siglo vdnte cuando·

se formuf~ron·: otras ··~as· ·nac_iones fundBm.e'ntales. Una, 18 _l_e·y

de Har.dy-Wei.nbérg, •relativa·'.a la distribuci6n .de los alelos

en uná poblaci6n, enc:.lacual se basa la genética de p~bla'cio-: nes. (59)

La:,:otra nocibn .se debe al médico inglh<A.B'. GarrÓ.d

(51), qui~n fue .. el primero en proponer que uri, defecto en •. un

~:ó'ío -f:~-~~·e~<·P·~~d~~ -·----~·-ri.Si~a r una p-rot~'Ína def ei: t·u~sa re.sPOnsB:bl,e

de .una e,l1ferineda·d, estableciendo es! ~-1 c~ncepto'_.·de' errores

innatos ,del metabolismo.

Descubrimientos posteriores (1944-1961) establecie­

ron conceptos pilares para la genética moderna: i) El estable­

cimiento de la relaci6n "un gen-una enzima 11; ii) La descrip­

ci6n de que la unidad de mutaci6n es la base nuclcica; la

unidad de recombinaci6n es también la base nucleica, ya que

las recombinaciones pueden efectuarse entre dos bases adyacen­

tes; y que la unidad funcional es el gen que está formado

por unBs mil bases; iii) Los experimentos de Avery y Mcl..eod

por un lado y los de Hershey y Chase por otro que establecie­

ron sin lugar e dudas que los ácidos nucleicos son el mate­

rial portador de la herencia; iv) La elucidación por parte

de J. Watson y F. Crick de lo estructura en doble hélice del

ADN; v) El concepto del Operan, de J. Monod y F. Jacob, como

sistema regulador de la actividad génica y; vi) Como punto

culminante el desciframiento por W. Niremberg, J.H. Hatthae

y S. Ochoa, del c6digo genético que permite el flujo de infor­

maci6n de los ácidos nucleicos a las proteínas explicandose

as{ la relaci6n funcional: genotipo-fenotipo (49,50).

Cuando se pretende formular una dcfinici6n se co­

rre el riesgo de caer en la sobresimplificnción y/o en el

rcduccionismo. Es por ello que cuando se estudia a la Vida

63

_en vez de _tratar de definirla sé prefiere enunciar sus cuali­

dades y pro-piedades. De la misma manera, antes que dar una

def inid6n de lo que es la Genética Molecular es preferible

enumerar- sus carocter{sticas, objetivos, métodos y campo de

acci6n: La Genética Molecular aisla segmentos de ADN, locali­

za aquellos que corresponden al gen que quiere estudiarse

y determina la secuencia de sus bases. El gen así aislado

puede ser obtenido flanqueado por sus regiones adyacentes,

de las que también pueden determinarse las secuencias. Se

accede de este modo a las bases nucleicos que, situadas con

frecuencia en el exterior de los genes sobre el mismo segmento

de ADN, pueden cumplir la función de lugares de reconocimiento

para los proteínas de regulaci6n. Conociendo, efectivamente,

la secuencia de las bases de un segmento de ADN cuya funci6n

es desconocida, es posible deducir la secuencia de los amino­

ácidos de la proteina cuyo sintesis rige, Este tipo de gen{,ti­

ca permite tambi6n actuando directamente por v!a química sobre

una o varias bases de un segmento de ADN, inducir mutaciones,

que, en este caso, son mutaciones dirigidas. De donde, o6n,

la posibilidad por una parte de hncer síntesis de proteínas

modificadas en sus propiedades y que podrían ser de interés

agron6mico, industrial o ml!dico, y por otra parte, de conocer

mejor los procesos que operan en el funcionamiento de los

seres vivos (49).

La v~nguardia de la genética molecular es la inge­

niería genétiCa, la cual, al permitir el análisis fino del

S_o_p_or-i::e--o-riat·i?r'tal ___ de--1n herencia -hace posible su modificaci6n;

su aplicaci6n a las ciencias de la salud reside en los

originales métodos de producci6n de sustancias biolbgicas

de interés ml.dico y en el diagn6stico de enfermedades heredi­

tarias.

La genética, una ciencia relativamente joven, tiene

: ,_,_ ,'

ya un brillante- .,p8s640 •... Su f~~-~r~, "n~·, {~:::.~S~ .. :_·m,~n'Ol~ ._·P~_estO_ que los ml!todos que. empl~D son de: Una frnur.i•. yc'de Un~ 'precisi6n

in.com'p·arablés~ __ Y_. son· a~gunas ·d~ -.é-~t~:¿·-"·m~-·~od'ti·ios_!~~-:,._:._c¡U_~: h-~-~ servido para, el diagnóstico de :dÍ.vkrso.s U pos .·de hemoglobirio­

patl.as, l'as que se describen a c~ntinua2i6n~

A. OBTENCION.DE.ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO HUMANO

Muchos de los estudios de la gen6tics molecular

se inician con la obtenci6n de ADN de et.lulas humanas en un

É!stado i"o suficientemente puro que permita un análisis confia­

ble' del mismo. El paso crucial en su purificnci6n, la remo­

ci6n de proteínas, puede lograrse extrayendo la solución acuo­

sa de ácidos nucleicos con fenal y/o cloroformo. Sin embargo,

medidas adicionales son requeridas cuando los ácidos nucleicos

se purifican a partir de una mezcla compleja de moléculas

como un lisado celular. En estos casos, se destruye a la

mayoría de las proteínas digiriendolas con enzimas proteolí­

ticas antes de realizar las extracciones con solventes org&ni­

co (84).

l. Fuentes de ADN Humano

El leucocito es un tipo celular conveniente para

la extracci6n de ADN; suficiente ADN (aproximadamente 200 ug) pueden obtenerse de 10 a 20 ml de sangre (7,8).

_' __ -__ ;~_..:'. ~!~~:~~_,:,~nc_i_6n_ de células fetales, cuyo ADN servirá

para el diagn6!ú:icoc'preiiatal, pueden obtenerse por diferentes

métodos:

., Amniocentesis; su aparici6n en 1960 la hace la

técnica mas antigua para la detecci6n en útero de alteraciones

fetales. En la decimoséptima semana de gestación puede obtc-

ncrse liquido amni6tico con numerosas' ~éiuiBs descamadas del

feto. La punci6n se efect6a' ii t'ravés de la> pared. abfominal

con la ayuda de una aguja. 'La ecografía que visualiza la

maniobra permite, con gran se.guridad, controlar con precisión

el lugar y la profundidad de la punci6n. La técnica es extre­

madamente fiable si es realizada por técnicos diestros. En

19 años de práctica, el riesgo para el feto está bien evalua­

do: varia de 0.5 a 1.0% seg6n la experiencia de los equipos

(52). Los amni6citos colectados mediante la centrifugaci6n

de 5-20 ml de Hquido amni6tico proveen suficiente ADN para

los an6lisis pertinentes.

técnica es lo tardio del

Sin embargo una limitaci6n de esta

examen: decimoséptima semana de

gestaci6n ¡ este retraso significa que en caso de descubrir

una anomalía grave en el feto, la madre sufriría un aborto

de Segundo trimestre, que, en este momento y desde cualquier

punto de vista, es particularmente penoso.

Obtenci6n de sangre fetal; los mhodos de obtenci6n

de .sangre fetal aparecen en 1973; los principales son la fe­

toscopia la punci6n directa bajo control ecográfico. La

feto~copia es en principio un m6todo de visualizaci6n del

feto: un tubo rígido que contiene fibras 6pticas y una aguja

que permite puncionar los vasos de la base del cord6n umbili­

cal. Esta técnica que impone la hospitalizaci6n de la mujer,

comporta un riesgo fetal elevado, entre un 1 y un 4%. Uno

vez más, la ecografía ha permitido progre.5ar fttcilitando la

técnica y reduciendo el riesgo: la obtención de sangre puede

ser realizada ahora por punci6n directa de la vena umbilical

con la ayuda de una aguja que atravieza la pared abdominal.

Esta técnica presenta para el feto un riesgo inferior al 1%.

Estos dos métodos se practican entre las semanas decimosépti­

mas Y vigésima presentando, por tanto, el mismo inconvenien­

te de diagnóstico tardío que la amniocentesis (52).

66

Biopsia ·de las vellosidades del cori6n: esta tilc­

nica, _,de~8:rr'ollad~ a finales de. )os años 60 1 s pero puesta

•en prácd.ca cHnica· a iÍliGios de 1980, permite la obtenci6n

de· células i~tales en un estadio precoz ·del embarazo (53).

Al .~principio de la embriogénesis, alrededor del embri6n apa­

re·c~ · progresivamente una en vol tura externa, el cori 6n. En

una parte del cori6n situada en contacto con el tejido ( trofo­

blas.to} que se convertirá en placenta, se desarrollan prolon­

gaciones celulares (vellosidades) de origen fetal, La idea

bhica de esta técnica es la de obtener por la via vaginal

-e1-· cori6n tiene un acceso relativamente directo- estas vello­

sidades (aunque recientemente se ha reportado un caso de mues­

treo transabdominal (54)). La obtenci6n puede llevarse a cabo

de forma precoz, entre la novena y undécima semana de gesta­

ci6n y no necesita anestesia. Con respecto al riesgo que

acarrea al feto esta biopsia, los Últimos resultados conocidos,

publicados en 1984 y que provienen de 42 centros europeos

y americanos, arrojan un riesgo de 4% de pérdida fetal (en

aquellos. centros que han superado las 100 biopsias el riesgo

fetal ob~-erva_do es de 2.3% (52).

~Bs indicaciones de este nuevo método para el mues-

__ treq. pre~etBl están en estudio. A este respecto hay dudas

sobre'_ .·la· calidad del proceso de obtenci6n; la contaminaci6n

~~-r :céiul~s mat.ernas puede ser una grave fuente de error (55,

56); ._Las primeras aplicaciones de este método se han llevado

a_ c.abo0

. para .ia·.detecci6n de la anemia falciforme (57).

2. Puriffcaci6n del ADN

El ADN de las células en estudio; leucocitos, amnio­

citos o trofoblastos, es obtenido de la siguiente manera (58):

a. Laa células son Usadas mediante tratamiento

una vez -C.~D ·-f-enoi, seguido de otra extracci6n' con una mezcla

1 d d~ friñol y cloroformo, y por 61timo con cloroformo. Este

p~ocedimiento aprovecha el hecho de que la desproteiniznción

eS-- más efectiva cuando se usan dos solventes orgánicos en

vez de uno solo. Aún más, la Última extracci6n con cloroformo

elimina restos de fenal presentes en la prcpnraci6n de ácidos

nucleicos que podrían inhibir a las enzimas modificadoras

del ADN utilizados en pasos posteriores.

e. El ADN en la fose acuosa es concentrado por

prccipitaci6n al adicionar etanol fria. El precipitado de

ADN, que se forma a bajas temperaturas (-20 C) y en presencia

de concentraciones moderadas de cationes monovalentes, es

recuperado por ccntrifugaci6n y redisuclto en un buffer adecua­

do.

El ADN as! obtenido es de aproximadamente 40-100

kilobases de largo y suficientemente puro para ser sustrato

de enzimas modificadoras del ADN (58),

B. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

El ADN obtenido y purificado del sujeto en estudio

debe de ser analizado para determinar el tipo de alelo presen-

68

te en el locus de interh. Esto significa que se requiere

localizar caracterizar a un fragmento de aproximadamente

1000 pares de bases, o 1 kilobase, de entre un total de -

6 000 000 kilobases que conforman el genomio completo de un

ser humano. En términos prácticos esto significa que un re­

quisito para el a·nUisis directo de un gen es la habilidad

para identificar a un fragmento de ADN del tamaño de un gen

de entre 6 millones de fragmentos de tamaño similar. Para

~ograr. esto se requiere de una estrategia metodológica que se

inic-ia - con la fragmentaci6n del ADN por medio de las enzimas

de restricci6n.

Una definici6n que se ha dado en forma general para

lo que es una enzima de restricci6n es: Endonucleasa que degra­

da ADN duplex modificado impropiamente (59). Estas enzimas,

especificas de cepa, son parte de los sistemas de defensa

bacterianos

rápidamente al

excisiones en

sobre el ADN.

permiten a la bacteria reconocer destruir

ADN extraño, como ol de los vjrus, al causar

la doble cadena en un número limitado de sitios

Para tener una actividad de restricci6n, cada

una de estas cepas bacterianas posee una metilasa ADN-cspecí­

ficn que transfiere grupos metilo S-adenosil metionina (Ado­

Met) a Adenina específica o o residuos de citosina en el ADN.

De esta manero, ~l ADN de las células es protegido contra

su propio actividad restrictivo (60).

Por muchos años se ha sabido que los virus bacteria­

nos tienen un rango limitado de hospederos. Desde 1952, va­

rios grupos de investigoci6n describieron el fen6meno de modi­

ficaci6n del cromosoma viral inducida por el hospedero; fenó­

meno por el cual el espectro de bacterias hospedadoras para

ciertos virus depende de lo cepa bacteriana en que este se

hubiera propagado originalmente (61). A principios de los

años 1960's, Arber (61) demostr6 que la replicaci6n viral

69

exitosa se acompañaba de la permanencia del ADN vírico en

su forma macromolecular intacta, mientras que el fracaso en

la infecci6n se caracterizaba por la destrucci6n del genomio

viral. Arber predijo la existencia de enzimas que hidroliza­

rian el ADN extraño mientras que el ADN propio seria modifica­

do para evitar ser reconocido por tales enzimas. A principios

de los años 1970's, Smith y llilcox (62) describieron a las

endonucleasas de restricci6n que destruían al ADN extraño,

mas no al ADN de la bacteria hospedadora. Smith y otros han

purificado y descrito mas de 200 de tales enzimas, la mayoría

de las cuales tiene una especificidad de secuencia absoluta

(63).

Originalmente las endonucleasas de restricci6n fueron

clasificadas en dos grupos en base a su complejidad estructu­

ral y a sus requerimientos de cofactores. Conforme el conoci­

miento ha avanzado se han establecido criterios adicionales

para,_ dif.erenciar entre varios sistemas de restricci6n y modi­

fic·aci6n. Como resultado actualmente se reconocen tres tipos

diferentes de enzimas de restricción: Las enzimas del tipo

I y- III portan las actividades de modificaci6n (mctilaci6n)

y de restricci6n dependiente de ATP (excisi6n) en la misma

prote!na~ Ambos tipos de enzima reconocen secuencias no mcti­

l_ádas eri· 'el ·-ADN sustrato, pero las del tipo I realizan cortes

~_zarpsos, ___ m;entras que las del tipo III cortan el ADN en sitios

específicos,

Las enzimas del sistema de restricci6n/modificaci6n

tipo II consisten de una endonucleasa de restricción y de

una metilasa de modificaci6n separadas una de otra. Un gran

número de enzimas de rcstrícci6n tipo II han sido aisladas

(63), muchas de las cuales son indispensables en las metodolo­

gías de genética molecular (véase Tabla X donde aparecen

nu~vc populares). Estas enzimas cortan al ADN dentro o cercn

?O

TABLA X. Endonucleasaa de restriccion rle uso comun y sus especificidades de corte~ c59> Enzima Secuencia blanco

Bam HI GIG A T e e e e T A GIG

Bgl I G e e N~N G G e CGGN NCCG

Eco RI GfA A T T C e T T A AIG

Hae III a ªle e e e G a

Hind III AIA a e T T T Te a AIA

Msp I C~G G C

Pst I e T Ge A!G GJA e G T e

Taq I Tt.g-g,A A T

Xba I TLC TA G A A G A T CIT

+ Las secuencias reconocidas y restringidas por una enzima de restriccion es tipicamente un palin--dromo: esto quiero decir que se lee igual de 1z quierda a derecha, QUe cuando se invierte de d,!J, recha a izquierda. N= cualquier base nucleica.

71

de sus-. ~·~-e~.~~.¿~~ª-- pár~~cu~~re~: de reCon~~im~.~-nt~-~·-~ ~u~ ti_~ic~- -ment.e s<in de 4·:··.·a 6 .nucleotidos de largo. co.n' un doÚe 'eje de

simetría: La i.'nzima Úó RI, por ejeinplo, (llamada asi porque

es ·~·•. RY .· .. 13) ,' reconoce

la s~cue~cfíi ·. hei~nulleotÚic.a :e

/ .• 51 G4.·A: i .:·.:• . ,. ·.· ... ··: >. <'A~T,T,;c <3 1S!Tiº,A·.·.;·.·· .. -.• ~ ... ~ .. _-.:,G 5:1

.·.•• '"' ·.· <~-- ·_-.:~:~ji.'J .:+=~~, :-{~L Al igual ~¡¡~. ~~~llJ~ cifi~-~:Í:énÚma's': ci;< re"~~r~~ci6n 1: Eco _ RI no

cor t ª"' ~-~~¿ t'~-~~-~-t·e ·;~~~~:·~ 1;:~'.í.~:~.'ij:~~1~~·~-:~~~i~·~,t~;¡-9--~~;- '._~in~~-~,~~ ':.'·J.o sic iones

· sep~radaLp<ifc¿¡¡;.t;i'o'' ¡¡¡f¿f'~'ó'ifil'i>1i-:e1i~l~~- éii;'~ ~ili!ii';¡¡s· ü•ADN: ".-)i>~:··_,:?;'>- <.;-:.·_ t;_/'·-··-.> '<'.,"'-- -~·~':·;.~'-:'-='. ~,-_ ..

'51''31• - cs!xh· : -0·31,\

-.:;.:fr_~.iT;:r~~ ~S;. 1_._':.:\. - _ ]§i ¡g 5 / . - ~o:,;-·

·. ;<_;_-.-. ~_::'·' :~·-_:/:~---.---;_·:' _ ... -._-,_ ·:·_. ·_ '·-··--'_ .. _.': '--" /

EstéiS Co'ites~-"desfesíidos orfgi~a~ frag'mentos de ADN con extremos

5 ! .. · c_~h~~'.~ .. ~.~~~:'_~ · .. _--,.~~~--~q ~_ie~~'.~- 'd,~_ :.-'e·at~s·. -e~t remos puede aparear se con.:~~tr_o:--e~frerD_O.·'·Orfgfná.d_O·:-p·o~ la actividad de la misma enzima

de restricci6n. ·As! pues, cualquier molEcula de ADN que

posea. erit·aS··.-e?Cfr~m-~:s c·oheáivos -complementarios puede ser un1da

.a º~-~oB ':_f~~-8-~entos .-.pa-ra for~ar nuevas moléculas recombinantes

(84).

Muchas enzimas de rcstricci6n, como Eco RI, generan

-'-~-~~~~e-~~~-ª ~e- ADN con extremos 5' cohesivos; otras (por ejemplo Pst I) generan fragmentos con extremos 3' cohesivos, mientras

otras (por ejemplo Bal I) cortan en el eje de simetría produ­

ciendo extremos rasurados (64).

~lgunns enzimas de restricci6n se emplean en el labo­

ratorio para cortar al ADN humano en fragmentos definidos

para su posterios manipulaci6n y análisis. Un gran número

72

d-e e'nzi~~s de~ res.tric'ci6n, ·de dif~fentes bacterias, son comer­

~--1.aim:ent·~:. acCeS:Ú~·les~ /La ·~m-~y~i{~ >~o~··\estables por meses si

se almacerian a -20 C, y cÓÍ:ta~·'ie1 ÁDN a 37 ºe en buffers sim­

p~~~---·qu1{:·:~ontengan a.al~·~. --~--~_g·~:~-~·i:~: y' un agente que prevenga

su oxidaéi6n como. el ditfotr~itol.

El genomio ·humano-- diploide puede ser cortado por

una enzima de restricci6n en cerca de l 000 000 de fragmentos

discretos con tamaños que van de los 100 a los 100 000 pares

de, bases de largo. Solo uno de tales fragmentos (o dos o

- _tres- ·s·f_ el gen de interéB tie·ne·· sitios de corte internos para

la enzima empleada) contendrá al gen en estudio, Estos frag­

mentos portadores del gen en estudio pu~den ser separados

d~l- re_~to,_ en base a su tamaño, mediante la técnica de electro­

foresis (84).

C. ELECTROFORESIS DE FRAG~ENTOS DE RESTRICCION DEL ADN

Se define como electroforesis a la migraci6n de por-

·-t{ciJlas, cargadas eléctricamente, en una soluci6n bajo el

influj.o de un campo eléctrico. Los métodos electroforéticos

-se--div_iden -en -dos categorías, que dependen de si la separaci6n

se efe~túa en ausencia o en presencia de un medio de sosten

o estabilizador. La electroforesis de soluci6n libre, que

fue la· primera en desarrollarse, presenta muchas dificu1 tndes

que _se-evitan si la separaci6n se efectGa en un medio de sopor­

te como un papel, una capa de s6lido finamente dividido como

celulosa, geles de almid6n o de poliecrilamida, polvos de

vidrio, geles de agar, etc. (84).

En la electroforesis convencional, la corriente eléc­

trica es conducida por medio del buffer a través de un medio

de soporte tal como el gel o la poliacrilamida. La separaci6n

tfene lugar a :un pll y· fuerza i6nica constantes. Los iones

73

de la muestra_ se desplazan dependiendo de su carga neta hacia

el ánodo-· o cátodo, en el caso de los ácidos nucléicos estos

migran hacia el ánodo debido a su carga neta negativa (84).

La electroforesis a través de geles de agarosa es

el método estandar para separar, identificar y purificar frag­

mentos de ADN (fig, 10), La técnica es simple, rápida y capaz

de resolver (resolver = separar a los fragmentos de ADN en

virtud de sus tamañas moleculares) mezclas de fragmentos de

ADN que no pueden ser separados adecuadamente por otros proce­

dimientos, como la centrifugaci6n en gradientes de densidad.

Aún más, la localizaci6n del ADN dentro del gel puede determi­

narse directamente: Las bandas de ADN en el gel son teñidas

con bajos concentraciones del colorante, intercalante, bromu­

ro de ctidio; tan poco como 1 ng de ADN puede ser detectada

mediante observaci6n directa con luz ultravioleta (65).

La migraci6n electroforética del ADN a través de

los geles de agarosa depende de cuatro factores principalmen­

te:

a. El tamaño molecular del ADN. Las moléculas linea­

les de ADN duplex migran a través de la matriz del gel a velo­

cidades inversamente proporcionales a el log10

de sus pesos

moleculares (66) (Véase fig. 11)

b. La concentraci6n de agarosa. Un fragmento de

ADN con un tamaño determinado migra a diferentes velocidades

a través geles con diferentes concentraciones de ogarosa.

Existe una relaci6n lineal entre la movilidad elcctrofor6tica

del ADN y la concentraci6n del gel.

Así pues, al usar geles con diferentes concentracio­

nes, es posible resolver una amplia gama de tamaños de molécu-

Fieura 10. Preparacion

de geles de agarosa;

1 - 3 1 preparacion del molde

con báse de vidrio o acri

lico '· en que se formara

el gel;4, colocacion del

"peine" que originara

los p'.l;us en los que se

colocaran lns .~ues".;rfls;

liquiUa¡G y 7, al onrrl~~

:; solidificar la agarosr.

co.1 cuiJ,,Jo p~ra 110 ares

t.~r la integr:t..10.U de los

pozos; 3, se retiran los

1iordt:G clel r.tolde y; 9,

el gel es colocado on la

camara de electroforesis

a

~ ~ 'º

previamente aforada con la solucion buffer de electroforesis; 10,

la enmara de electroforesis se conecta a u11n fuente de poder, con

la cual se establece la fuerza del campo electrico bajo el cual

se llevara a cabo la corrida electroforetica (34).

5

.. o

"' Ti .., o

4 "' ... o g

"' 'O .. Q)

" "' "' .. o

3 ... Q) 'O CJ,':'.

o o,á"" o ...

2 2 3 4 5 e 7

distancig recorrida (cm)

FiGUra 11. Comportamiento electroforetico del ADll en

galos de agarosa en funcion de su tamaño~molocular •

(adaptado de la referencia 84)

75

las de .ADN _ (84),

Cantidad d~:agarosa en

eL.geL·. (%) - -

0~'3 '0;6c

'• 0;'7--'--co .. --~-C'-------1 :2

LS 2;0

e• Conformaci6n del ADN.

76

Rango efic~ente de sepa­

ra¿i6n de mol6culas de -

ADN (Kb)

60 -

20 -

io - o.a 7 - 0.5

6 - 0.4

4 - 0.2

3 - 0.1

Fragmentos de ADN del

mismo tamaño pero con diferente conformación {cerrado circu­

lar (tipo !) , circular con excisión en una de las cadenas

(tipo II), y lineal (tipo III)), migran con diferentes velo­

cidades a trav~s de geles de agarosa (67, 68), Las movilidades

relativas de las tres formas depende primordialmente de lo

concentraci6n de agarosa en el gel pero están también influi­

das por la inter1sidad de la corriente aplicada, lo fuerza

i6nica del buffer de electroforesis, y de la cantidad de tor­

ciones supcrhelicoidales presentes en la forma I del ADN (69).

En algunas condiciones la forma I migra más r.c'!pido que lo

III; en otras, el orden se invierte. Una forma de identificar

lns diferentes especies conformacionales del ADN es el llevar

a cabo electroforesis en presencia de cantidades crecientes

de bromuro de etidio. Conforme L1 concentrución del coloran­

te aumenta, m6s de este compuesto se une al ADN. Las torciones

negativas presentes en la forma I de las moléculas se eliminan

progresivamente, y su velocidad de migrnci6n va decreciendo.

Cuando todas las lorciones negativas han desaparecido, la

velocidad de migraci6n de la forma I alcanza su valor mínimo.

77

Si·- se añade mas bromuro de etidio, Se generan torciones super- -

helicoidales positivas, y la movilidad· de la forma I aumenta

rápidamente.

d. La corriente aplicada. A voltajes bajos'· la

velocidad de migrad6n del .ADN lineal es proporcional al vol­

taje aplicado. Sin embargo, conforme la intensidad del campo

eléctrico se incrementa, la movilidad de los grandes fragmen­

tos de ADN aumenta diferencialmente. Así es que, la efectivi~

.dad ~~ ia~~epa~aci6n de fragmentos de ADN en geles de agarosa

disminuy-e conforme el voltaje es elevado. Para obtener la

máxima resoluci6n de los fragmentos de ADN, los geles deben

correrse a· no mas de 5 volts/cm. (84).

e. Composición nucleotidica y Temperatura. El com-

port.amiento electroforl.tico del ADN en geles de agarosa no

es afectado significativamente ni por la composición nucleotí­

dica dC las muestras (70}, ni por la temperatura a la que

se corre el gel. Así es que en geles de agnrosa la movilidad

electroforética de los fragmentos de ADN de diferentes tamaños

no varía entre 4 y 30 °C. En general, los geles de agnrosa

se corren a temperatura ambiente. Sin embargo, los geles

con menos de 0.5% de agarosa son muy delicados y se recomienda

corr:erlos a 4°C, temperatura a la cual adquieren mayor rigi­

dez,

El m~todo mas conveniente para visualizar al ADN

en geles de agarosa es mediante el uso del colorante fluores-

cente, bromuro de etidio (65). Estn sustancia contiene un

grupo planar que se intercala entre las bases del ADN. La

posici6n fija de este grupo y su proximidad a las bases provo­

ca que el colorante unido al ADN fluorezca mas que el que

está libre en soluci6n. La radiaci6n ultravioleta absorbida

a 260 nm por las bases nucleicas, transmitida al colorante

78

o a 300 y 360 nm por el colorante

mismo-, se· .. emite a 590 nm en· la regi6n rojo-naranja del espec­

tro v"isible. ·cuando la eleé:trofo-resis se ha completado, el

gel es inmer~o en una soluci6n _de bromuro de etidio (Q;S ug/ml)

por 45 mini.itas,, y ·se procede a observar lBs bandas· de ADN

por i~ansilbminaci6n con luz,ultraviolet~ (65).

n. IDENTIFICAáON DE SECUENCIAS GENICAS PARTICULARES

La localizaci6n de una secuencia de ADN en particular

,_(p~; ~~-j. el: gen en estudio) de entre los fragmentos de restric­

ci6n-- d~l·-·-ADN- que han sido separados por tamaños gracias o

u_n·li:-~- el~cctror·o-resis- en gel de agarosa se logra por medio del

uso de· dos t~cnicas muy comunes en genética molecular: la

transferencia Southern (71) y la hibridaci6n con sondas génicas

moleculares radiomnrcados: Los fragmentos ya resueltos en

el gel de agarosa son desnaturalizados, transferidos a un

filtro· de nitrocelulosa, e inmovilizados en el. Las posiciones

relativas de los fragmentos de ADN en el gel se conservan

durante la transferencia a el filtro. El ADN unido al filtro

es hibridado a ADN o a ARN radiomarcado con 32r, y la autorra­

diografía es empleada para localizar la posici6n de la(s)

banda(s) complementaria(s) a la sonda radioactiva (84).

l. Transferencia Southern (71, 84)

Los fragmentos de ADN ye ref!~e}_tos en el gel de aga­

rosa- son desnatilralizandos, volviéndolos de cadena sencilla,

mediante inmersiones repetidas del gel en una soluci6n 0.5

M de NaOH. Enseguida el gel se coloca encima de un papel

filtro cuyas orillas estén inmersas en un recipiente que con­

tenga una solución salina concentrada (fig. 12). Encima del

gel se colocd una hoja de papel filtro de nitrocelulosa previa­

mente humectado y encima de esta se colocan varios papeles

Fif;ura 12. Metoclo para transferir AD'.l ele geles de agarosa

a filtros de nitrocelulosa (transferencia Southern). El

buffer establece un flujo capila1• desde el deposito hacia

los papeles absorbentes arrastrando consigo a loa rragmen

tos do /Jlll que se adsorben a la nitrocelulol>a (34).

79

ESTA TESfS SAUI D(· LA

H6 Dm BISUITECA

80

' -absorbentes· con un- objeto pe,;~-do rematando el .conjunto (fig.

12). · La. soluci6n: saHna >estable.ce un flujo capilar: del r~d::­pie.~te que -ia -~on~iene. hacia los papeles absorbentes, a .. ~ra­vés_ del" gel - y del filtro de nitrocelulosa, y en _el p_rocesci

acarrea al ADN de una sola hebra del gel hacia el: fÚtro; de

nitrocelulosa. Después, de 12-24 .horas de t·~ansfer~nci:a·,,· .los

fragmentos de -ADN. se encuentran ya ·adsorbidos_·· al: ·filtro-.; de·

'nitrocelulosa. Un h.orneado posterior de los ,fili:~os/ ·a· ·ao•" C durante 2 'horas, estabiliza la uni6n filtro"."ADN.

- - -·· ·.·

El ADN "de· cadena sencilla unido a. -la· nitro~elul~sa" aún··· pu~de c--_ªP~rJa~-~~··- a·- ··s~~úe~-c-1á~ comp-1e~e-n-fa·r-i1is ~-~~-e--~-.ADN; -uñ. -­

proceso llamado hibí-idáCi6n.

2. 'i1i~~i~a:~6'.ri; con -Sondas ·Génicas Moleculares

Una vez que se cuenta con una réplica en nitrocelulo­

sa de los ff"agmentos resueltos, de la restricci6n del ADN,

se requiere localizar e identificar al gen particular que

deseamos estudiar. Para lograrlo se requiere contar con un

fragmento de ADN que sea complementario a la secuencia, o

a parte de ella, del gen en estudio. A este fragmento de

ADN se le llama sonda g6bica molecular (en adelante referida

solo como sonda) y debe de estar radiomarcada para poder ser

visualizada. De esta manera, cuando se pone a la réplica

en nitrocelulosa del ADN en uno solución de la sonda, esta

Última se apareara por complementnriedad (hibridara) con el

gen de interés, y a6lo con el, y la posici6n del hibrido puede

determinarse mediante la autorradiografia.

Sondas Genéticas Moleculares

·Una· so~da :sénica molecular 'puede ser definida 'como

un ác_idó.nucléico: radioactivo de_ ca_dena sencilla que 'es empleado

_---·::;\:_:__._ - .. ·- s-oi.t~~·-~:·c-o-nO_c_e------1a·· s-ecüencia aminoac idica, total o par­

ci,8!'• :de 18,:,"pr'o'úÍn~ codificada por el gen de interés, la

.cd-~·~-'es};·ci'ódie~t-~>.s-ec.~encia del ADN puede ser inferida gracias

· ·-~a.1:~-~~~ .. o~-~{.1:~¡-~~-~~: .. dé.--que triple te codifica para cada aminoácido

·.-:--(1·2·;--.:_:--·~;-:EO'=-·:·;e·s~~~cio, se estudia lo secuencia de la proteína : -:· ~ - ..

en.\_bu~.é-~ ·d·e -áreas ricas en aminoácidos codificados por sólo

un·:,~,od6'~ (po',, ej. metionina, AUG; trp, UGG) o a lo más por

doS.:'· (p-·. eJ., ·fenilalanina, UUU, UUC; tirosina. UAU 1 UAC; his­

ti_dina·, CAU, ·cAC). Conociendo la frecuencia con la cuol se

--·_emp.lean diferentes codones degenerados (p. ej. glutamina es

us_µ~lm~~te codificado por CAG) y aprovechando los aparcamien­

tos G:T, a menudo es posible reducir la lista de oligonucleb­

tidos Posibles a una cifra manejable. Estos oligonuclc6tidos

son entonces sintetizados in vitre, mediante una serie de

reacciones químicas en cadena que van añadiendo un nucle6ti-

·- ·d·~- en--cada ciclo, ya sea por el método del fosfodiester (73)

o ·el mas eficiente del fosfotriester (74). (Para una discu-

si6n completa de estos métodos v~ase la referencia (75).

Una vez que se ha sintetizado químicamente a aquellos

oligonucleonútidos que representan todas las posibles combina-

e.iones codificantes para una

aminoacldica de la proteína

pequeña porci6n de la secuencia

de interés, se requiere saber

82

cual ___ de e·11o·s fOrma un -dúplex perfectamente ap_areado con la

secuencia del ADN gen6mico. Ya que los .oligonucleótidos

que no sean 100% complementarios al ADN gen6mico sufrirán

de errores de apareámiento, si las cciñdiciOries de hibridaci6n

se h~~en severas, s6lo los duplex perf~ctamente complementarios

serán estables y de esta manera podremos eiegir al oligonuclho­

tido .que nos servir& como sonda.

Sintesis de ADN copia

La conversión enzimáiica j~l ARNm poliA en ADN copia

de doble cadena es una herramienta fundimental de la biología

molecular de los eucariotes. El procedimiento más com6n para

sintetizar copias de ADN de doble cadena a partir de ARNm

conste de los siguientes pasos: síntesis de la primera cadena

de ADN copia gracias a la transcriptasa inversa (ADN polimera­

sa dependiente de ARN), remoci6n del templado de ARN por degra­

daci6n alcalina 1 sin tesis de la segunda cadena de ADN con

la ADN polimerasa I de g. sill (usando como cebador para ini­

ciar la síntesis un pasador formado en el extremo 3' de la

primera cadena de ADN copÍa), finalmente, la digestión,

con la nucleasa Sl (especifica de cadena sencilla), de la

conexión covalente que liga a la primera con la segunda cadena

de ADN copia (90).

Una c6lula tlpica de mamífero contiene alrededor

de 10-5 microgramos de ARN, del cual 80-85% es ribosomal

(285, lBS SS), 10-15% esta constituido por una variedad

de especies de bajo peso molecular (ARN de transferencia,

ARN nuclear, etc.). Todos estos ARN5

son de tamaño y secuen­

cia definida pueden ser aislados mediante electroforesis,

centrifigUaci6n en gradientes de densidad, o por cromatogra­

fía de intercambio i6nico. En contraste, el ARNm' que consti­

tuye entre un 1 y un 5% del ARN celular total, es heterogéneo

83

tant·ó en tS'maño comO :en. SéC:ueíl¿i~-/ Sf~:':~mbargo·J----vii:tue~ment~ tod-~s los ARN · df? mamíf,~ros- · poS·~en··::_·e~\-~u ~,~-"xt~e'~o: 3' un .residuo

poliadenil ico m que.• per~ite alslarl.~ •• media~te. cromatografía

de afinidad 'en una 'colu'm~a; con ~e_lüló:~:a 'llgada a deoXioligoti-

midinas (90);

Una forma'·. 'pr·á.cticá de ·iniciar el aislamiento del

ARNm, dé .{~fe~é( ~s ''¡jaftie~do de polirribosomas (grupo de ribo­

~~omas. ·~n~~d.~-~;- p~r una· ··larga molécula de ARNm) provenientes

de -·Ú·n·a-·:_ ;c'é"ful~- e~p-ec·ializada , que transcriba activamente el

~};~;~ddee:~}~~~elil1~~. po~~sej:::::· pa:: :~·:~:::::e:ta:a so:151~8sr s;~ ·guiente·s:

Las- células son lisadas en un buffer que contenga

i~hibido.ies·· de las ARNasas, los núcleos se colee tan por

centrifugaci6n.

b. Los polirribosomas se precipitan del sobrenadan­

te por adici6n de grandes concentraciones de iones magnesio.

Estos polisomas contienen ARNm y ribosomas.

c. El ARNm es ai.slado por cromatograf!a de columna,

gracias a la adsorci6n selectiva de las colas poliadenllicas

de los ARNm a los restos politimid{licos ligados al medio

de soporte.

d. Finalmente, el ARNm es cluído de la columna usan­

do soluciones con bajas concentraciones de sales.

Para identificar a los ARNm aislados se puede hacer

uso de un sistema de traducci6n in vitro. Este es un extracto

libre de dlulas (obtenido de reticulocitos de conejo) que

presenta un alto nivel de síntesis proteica. Cuando el ARNm

84

purificado es agregado, la sin tesis proteica se inicia. Si

se agregan anticuerpos dirigidos a la proteína codificada

por el ARNm de i~terés, estos reconocerán a la cadena polipep­

tídica naciente y sé le uniran provocando que -precipiten aque­

llos complejos ribosoma-ARNm que contengan el mensaje de inte­

rés. De estos precipitados, el ARNm de interés puede ser

aislado por una segunda cromatografía de afinidad en columnas

de polidT-celulosa (90).

Una vez que se cuenta con el ARNm de interés, en

una forma pura, se le puede usar para hacer una copia de él,

pero en forma de ADN (ADN copia o ADNc) con la ayuda de la

ADN polimerosa dependiente de ARN (transcriptasa reversa halla­

da en algunos virus-ARN) y de un oligodT que se agrega para

que sirva de cebador en el inicio de la duplicaci6n. El dia­

grama de flujo del proceso se muestra en lél figura 13 •

Una vez que la transcriptaso reversa ho copiado al ARNm en

una cadena complementaria de ADN, el ARNm es removido por

hidr6lisis alcalina selectiva una segundo cadena de ADN

es sintetizada sobre lo primer cadena de ADN usando un frag­

mento de la ADN-polimcrnsa I de ~· E.Q...1.i (el fragmento Klenow)

que carece de la actividad de cxonuclca5a (82).

La síntesis de la segundo cadena se autoceba por

un rizo que se forma en el extremo 3' de la prjmer cadena

del ADNc La doble cadena resultante es cortnda en su unibn

covalente con la nucleasa Sl (82).

Clonación de Sondas

Para que el ADN copia tenga utilidad práctica como

sonde seº requiere contar con una gran cantidad de copias del

mismo, Eato se logra mediante la clonación del ADN copia:

AR1lra

hibrido entre ol AR:lm ·y el cebador

sé rorma un rizo autocebador

85

--------AAAAn

1.---- Oligo dT

' • cebador

--------~~~An

como

f_ transcriptasa reversa ~ .. mas deoxinucleotidos

~~~~~~.t;.AAA -------~TT f_ tratamiento con i elih1ina el AR:lm

':.-..--·- •- • _TTT

Fragmento Klenow de la AD;/ polimarasa

ADHc de doble cadena t': =--=-:: .-: - -

ADlic con extra mos rasurados-

--- ------ -.............. nucleasn Sl que rompe la union covalonte en el AD~rc

Figura 13. Diagrama de flujo para la sintesis de ADil COJ!l

plementario o copia (ADllc) a partir de ARll mensajero

(ARNm) (90).

86

Lá existencia de sexualidad o transferencia de infor­

maci6n 8ené):ic8_ entre cepas bacterianas se ha conocido y es­

tudiado por mas de 30 años (76). En la década de los 1960's

el ·rápido ~tirgimiento de cepas bacterianas resistentes a mól­

tiples: antibi6ticos condujo al descubrimiento de los factores

de ~esistencia (factor R), o plasmidos de replicaci6n aut6noma

que forman parte de la herencia genética extracromos6mica

de·-algunas bacterias y que en ciertas condiciones puede indu­

cirse su. réplicaci6n acelerada (77). Es a esta clase de plás-

~i~os a la que se ha explotado como vectores para la

ci6n.·:·de··fi-agmentos específicos de ADN dentro de las

bacterianas (clonaci6n) (fig. 14).

propaga­

dlu las

Hay varios métodos para insertar al ADN copia de

doble cadena en el vector: uno es el de añadir, por síntesis

química, sitios artificiales de Eco RI en los extremos y des­

pués ligarlo a los sitios Eco RI del plasmido; el otro m~to­

do es el añadir una cola de 10 e 20 deoxicitidinas al ADN

copia y un nlímero similar de deoxiguanidinas a los extremos

del vector. Cuando las dos moléculas son puestas en contacto

los extremos complementarios se aparearan por acci6n de

una ligasa del ADN (enzima que cataliza el enlace entre el

grupo fosfato del extremo 5 1 y el grupo hidroxilo 3') la uni6n

covalente entre las dos moléculas se formalizará (fig. 15)

(90).

El plasmido recombinante resultante debe ser introdu­

cido en una cepa bacteriana adecuada para su propagaci6n.

posteriormente se le recuperará en grandes cantidades para

su uso como sonda:

lle 1944, cuando Avery (SI) demostrará que el ADN

extraído de neumococos era capaz de inducir la transformaci6n

de otros neumococos genéticamente distintos y de ser replicado

87

plasmaido vector sitio <le

corte sitio~<le i'i , corte 5 ~ ~ ue ~ cor~e

~/A;:;;¡ a \ clonar

~ ..... ndonucleasa

Je restriccion

Endonuclaat de

restriccion

recombinacion y--G~

~~

¡ue;asc.

o plasmido recombinante

Fisura 14. Creacion <le un plasmido recombinante. El area

rayada representa al gen para resistencia :; tetr::iciclina,

y el areá obscura i·epresenta al gen para resistencia <• ªl!l

picilina. Despues de la restriccion con Eco RI el ;,n;¡ a

clonar es insertado dentro del sen para resistencia a a~

picilina (85)

-----­........ AD:r copia con extremos rastirados

¡.-- transferasa terminal + dCTP

•·--~·-CCCC cccc ...... . zen de resistencia

88

e a empicilina

gen de resistencia digestion a tetraciclina coa P~t I i

ADH copia insertado

ACGTC _.....,;;._._..;,CTGCA

I_ h'ansferasa ..---- + dG1'P

G ____ CTGACGGGG GGGGGATC G

gen de resistencia a tetraciclina

Figura 15. Diagrama de flujo para la clonacion

de ADll copia (90).

terirlnal

39

e.n·.· citos~·~.: a·~~-,:1a fec~a, ~e han estable;cido condiciones .. exp_eri­

me'nt~'les,:·:''~-~~:·:)~ff-_in.iten hacer de la transformaci6n un ·método

~~nfl~bl~ y ~~p~odu;ible .. para introducir a los plásmidos recom-,

bfoarites~·en 'las bacterias que les propagaran. El cultivo

bact·~~,ianá. a···. ~ransformar debe de estar en competencia (esto

es 'e"O .. :.:;un~ f~_se logarítmica de crecimiento) y debe ser someti­

do a. un tratamiento con cloruro de calcio, factores ambos,

que i~crementan la tasa de transformaci6n (78).

tas ·Células transformadas por el plasmido recombinante

son ·aeleccioñ-adas en medios con antibi6ticos gracias a las

propiedades de resistencia portada por el plásmido (gen de

·resisteñcia _a· tetraciclina en la figura 14) y a la no resis­

tencia a otro antibi6tico debido a la inserci6n del ADNc (gen

de resistencia a ampicilina inactivado en la figura 14). Los transformantes ya seleccionados son crecidos en medio

liquido. Cuando el cultivo alcan¿o la fase logarítmica del

crecimiento se agrega una alta concentreci6n del antibi6tico

cloramfenicol. El grupo nitrobenccno presente en la molécula

del cloramfcnicol (figura 16) se intercala en el ADN cromos6-

mico bacteriano e impide su dupl icnción, ejerciendo así un

efecto bacteriostático sobre el cultivo (figura 17). Sin

embargo el ADN Plasmídico no sufre alteración alguna por el

antibi6tico y su duplicnci6n prosigue normalmente originando

que cada célula bacteriana transformantc acumule una gran

cantidad de plasmidos recombinantes (amplificaci6n del plasmi-

do) (79). El ADN de los plasmidos recombinantes se obtiene

mediante lisis alcalina de las células y posterior centrifuga­

ci6n diferencial en gradientes de densidad (BO).

Para liberar al inserto de ADNc del resto del ADN

plasm!dico, se trata al plasmido recombinante con la misma

endonucleasa de restricci6n que se us6 para introducir ini­

cialmente al inserto en el plásmido nativo. La mezcla resul-

::'~ .. ,,

Figura )6. Estructura molecular del antimierobiano

Cloranreniclo (91 ).

A. Turbidez

cloranfenicol

tiempo ( l1oras)

,., z ..... ., .,, bl o

B. Supervivencia

..... i--....1.~..1-~L........L~-'---A tio:,;po (horas)

Figura 17. Curso de la accion aotiurl.crobiafla del "1edi-

camento clornnfenicol. El medicaljlento rue añadido en el

momento tle crecimiento expouencial, co::10 señaln.n lns

flechas (91).

90

91

tante de la restricci6n, ADNc y plasmido linearizado, es sujeta

• electroforesls en un gel de agarosa de bajo punto de fusi6n.

Con bromuro de etidio ~ luz ultravioleta se visualiza l~-~~pa­

raci6n del inse-rto y del plasmido linearizado y se corya la

por¿i6n ~el" gel en que se encuentra el inserto. E•t~ fr~gmen~ to :,dél gel es sUjeto a extracciones con fénol -"y Ci~r¿-f_¿-r~;nd, quedá.ndo_ en lo fase ?CUOSB e.l ADNC puro qu~ e~ c'·a'nc~ó'tr~'do por precipitaci6n con etano_l (81)._

-Pára que el ADNc sirva como sonda en la identifica­

_:ci6n ;-.-de·- un· .. gen en~ pa"rticular de entre los varios presentes

"e.~ -:·~_a, r_~pÚ.-ca de nitrocelulosa, se requiere que esté marcado

i-adioactivamente para su visualizaci6n. El marcaje radioacti­

vo ·de la sondo se realiza por el m6todo de traslaci6n de la

- ruptura (nick translati6n): La ADN polimerasa I de Jl_. coli

añade residuos nucleotldicos al extremo hidr6xi lo 3' que se

crea cuando una cadena de una molécula bicatcnario de ADN

sufre una ruptura.

exonucleolitica 5 1

5' de la ruptura.

Además, la enzima, gracias a su actividad

3', puede remover nucle6tidos del extremo

La eliminaci6n de nucle6tidos del extremo

S' Y la adici6n secuencial de nucle6tidos al extremo 3' resul­

to en el desplazamiento de la rcuptura (traslaci6n de la

ruptura o nick translation) a lo largo del ADN (82). Si se

reemplaza a los nuclcótidos preexistentes por nucle6tidos

radioactivos, es posible preparar ADN marcado con 32 P (83)

(figura 18).

Hibridaci6n

Así pues, cuando se cuenta con una réplica en nitro­

celulosa de los fragmentos de restricci6n del ADN, resueltos

por tamaño molecular, y una sonda radi.omarcada para identifi-

11 11 1111111

! ruptura en una cadena por la AD:iasa I

5' + 3' 3' '] 1 1 1 1 1 11 11 1 1 1 5'

I

ADN duplex escindido +

ADN polircerasa +

4 d NTPs (uno Je ellos marcado con 32p)

i ""'"" '";'."'" 1 1 11 1 1 1 5'

92

5'

3'

... ,.,.J.,,., ,, 1 11 1 1 u 1. 11 l 1 [ 5'

ADi! eacindi do, radioma.J: cado

Figura 18. Diagrama que ilustra la translacion de la

ruptura en el ADH. J..a ADN polimerasa I produce una

incision o ruptira en una cadena del ADN, a part"lr

ele este punto la 01dena puede ser clagrarlada, y re-­

puesta por sintesis con nuevos nucleotidos (90).

93

car· al gen de interés, se procede a realizar la hibridaci6n.

Esta se realiza en un medio liquido salino y durante un perio­

do de tiempo que depende del tamaño de los f ragmcntos de res­

tricci6n, la actividad radioactiva específica de la sonda

(cpm/ug), y de la cantidad de sonda adicionada. Si la secuen­

cia complementaria a la sonda se halla en la réplica de nitro­

celulosa estas hibridarán. Y si sobre la r~plica de nitrocelu­

losa, ya hibridada y lavada (para que s6lo la sonda que haya

hibiidado permanezca en ella), se coloca una placa radiográfi­

ca,, en esta se imprimirán la o las bandas correspondientes

al gen.de interés (autorradiografia) (64).

Por Último, un resumen del proceso seguido pera iden­

. tificar- ~-~\:_·p.~~~e,ncia de una secuencia g~nica especifica de

entre el.-~otal.de un genomio eucarionte se muestra en la figu­

ra

Para :mayor. informaci6n sobre las t~cnicas de genética

molCcUlar' t<Su .~ ·,"8plicaci6n clínica / consultar las referencias

64-90.

LeucocÚos ,nlsnlados de

ann~e O PlasmiUo recombinante conteniendo al gen on ostud

0

io

ADll oxtraldo ~ ~igorido -e·c1n áriziinns de restriccion

! Liborncion dol e;on del plns~ido para au

uoo como noncl:l

Origen

ADH cli¡¡erido y

separado p0r electroforesis en e;olos do agnr : 11 t T '. ll I T._____.: T.__,..._._,:

t Trnnororoncia Ilit•ridHcion ílovolndo de lns l Southern con nonda bnnd.1s hibrltlndna

Mnrcat1oros do rndiomo.rc3dn por· nutorrn.dio-peso 1ooleculor

Figura 19. Diaer,111\a qua respresenla loo ditürenteo procoooo oocuidos para ln identificncion de un gen ospecirico de entro •l genomio com­

pleto de un eucorionto ($5).

grafin Loa benJ.1s <lo la

aurorrmlioern fin c.Q.

rrooponden n los rrn,&

mentoo que contienon al t;on do. !nteres

IV. DIAGNOSTICO DE HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS MEDIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR

95

LaS técnicas de genética molecular, expuestas en

páginas anteriores, han desempeñado un papel muy- importante

en el campo de la genética clínica en los 6ltimos años,

estas nuevas metodologías han permitido el

los -mecanismos moleculares que subyacen en

algunas hemoglobinopatías, la detecci6n de

discernimiento de

la etiología de

portadores de las

mismas y el diagnóstico prenatal de fetos en riesgo de padecer­

las (92).

El empleo de las técnicas de genética molecular por

divei-sos grU.pos científicos de trabajo, en diferentes sitios

y ~omentos, ha dado lugar al surgimiento de varios enfoques

experimentales dirigidos hacia el mismo objetivo (el análisis

molecular de las hemoglobinopatíos), en donde, obviamente

los enfoques mas recientes se enriquecen con el contenido

y experiencias de los anteriores. Los protocolos experimenta­

les de estas metodologías comparten elementos comunes: todos

dependen de la digesti6n (fragmentaci6n o restricci6n) de

las muestras de A .D.N. con cndonucleasas de restricción, la

separaci6n de los fragmentos generados mediante electroforesis

(resoluci6n) y del uso de A.D.N. 's marcados radioactivamente

para estudiar los patrones obtenidos de las digestiones ya

resueltas (análisis de los fragmentos de restricci6n). Sin

embargo, debido a que cudn metodología posee una base te6rica

propia existen diferencias en los detalles de la realizaci6n

de cada protocolo. Estas incluyen diferencias en las estrate­

gias de restricción enzimática del A.D.N., en el tamaño de

los A.D.N.s empleados como sondas --largos A.D.N.c u oligomeros

nuclcotidicos cortos para el análisis de los fragmentos

de restricci6n, asi como en las características de los geles

empleados para la resoluci6n. de los mismos.

La suma de estas variaciones determina el que cierta

metodología resuelva el problema de la identificaci6n del

defecto genito molecular directa o indirectamente. Y para

facilitar el análisis o integración de los resultados, que ..

estas metodologías han aportado al conocimiento de las hemoglo~

binopatías, en este trabajo se los han organizado en dos grupos

y sus respectivos subg~ripos:.

A. DETECCION INDIRECTA.· DE LOS. DE.FECTOS MOLECULARES EN. LOS GENES CODIFICANTES

hibridaciones.diferenciales.

A. DETECCION INDIRECTA DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS

Polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricci6n.

La primera de las metodologías es, como se señala

en el encabezado del capítulo, indirecta y depende de la aso­

ciaci6n de cierta mutaci6n puntual con un polimorfismo del

A.D.N. Por ejemplo, si una enzima de restricci6n corta al

A.D.N. a ambos lados y en el medio de una secuencia que es

reconocida por una sonda específica para esa secuencia, en

una autorradiografía se observarían dos bandas. Si el sitio

de restricci6n intermedio se perdio a causa de una mutaci6n

97

·en uno_ ·.de_, __ los c~-omosoMas >del par·, 18 perso~a_ portadora de

e_s_o_s '.~·ro~~so~_aS m~straria - un patr6n ~e los · fragm~ntos de res-

- tricci6n difer~nte del normal (fig< 20). Uno de los cromosomas

ge'nerar_i8 :solo una banda que hibridaria con su sonda especifica

y· ·el~ otro -cromosoma produciría los dos fragmentos típicos.

A le_~< va~ieciónes presentes en el A.D.N. que son detectables

por ~l análisis de los fragmentos de restricci6n se les llama

polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricci6n

(92). Da.tos de secuenciaci6n del A. D.N, humano sugieren que

en, aPro~imadamente 1 cada 100 o 200 nucleotidos de les regiones

del _A.D.N., no involucradas con la codificaci6n de proteínas,

e~iste un sitio. polimorfico que no causa ningun defecto aparente

en-los individuos (93, 94). Este elevado nivel de variaci6n

en las secuencias que flanquean al A.D.N. codificante puede

producir que cada cromosoma de un par origine un patr6n distin­

tivo ·en el análisis de los fragmentos de restricci6n, Esto

e- su vez permite el que se pueda determinar cual cromosoma

de un par se heredo a la descendencia.

Para ser Útil en la asignación de un cierto gen a

determinado cromosoma, el sitio polimorfico debe de estar

suficientemente cerca del gen en estudio de tal manera que

ambos se hereden de manera ligada. Pero debido a que la fre­

cuencia de ligamiento entre un gen y cierto polimorfismo nunca

es del 100% esta metodología requiere un estudio familiar

para determinar el patr6n de segregaci6n génica de los fragmen­

tos de restricci6n polimorficos entre los miembros de una familia.

- Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricci6n

originandos con Hpal.

Relaci6n con el gen .de la. g_i:~bi~a beta _s

En 1978¡ K¿n t•~az~,(9S);••1•me.Íi'ante el mapéo con enzi-

98

(A)

z y

~ J. J. ~Electroforesis

Kb

' X

i que~ncela

~ mutacion un sitio de restriccion

(B)

Figura 20. Si el cambio de un nuclootido en uno de los cro­

mosomas produce la ral ta del sitio de reconocimiento de la

enzima de restriccion, los fragmentos (A) mostraran un pa­

tron electrororetico diferen'·e del nor1nal (B). X,Y Y· Z su-­

puestos tamaños de los fragmentos de restriccion en kiloba-

ses (Kb)(92).

X

z

y

mas_ de traron

de la

99

restricci6i ~e los genes de las-globinas huma~as, _enc~n­.·u~a"· ·.Vat-.f8ci6ñ genética en .un sitio de r~conoc~miento -

endoiíucleasa de restricci6n HpaI, que corta el A.D.N.

en.~e secuencie.GTTAAC, hallado e 5000 nucleotidos del extremo

3 1 del ien-esti~cturel de la globine beta.

Cuando el A.D.N. normal es digerido con _le enzima

Hpal, el gen estructural de la globina beta se Cf!CUentl-a en

un· fragmento de 7.6 Kb (Fig, 21, cerril 1). Cua~d-o'.-~e estudio

el A.D.N. de individuos negros de origen efrié:ano,··con···1e

,enzinia._ Hpal, se encontraron variaciones en ~l: taul8ño ·del:- f~ag-

mento de A.D.N. que contenie el gen de-lailobinecbi~a;· Algu~­

nos-·muestres de A.D.N. de individuos_ negro.a, :'or.lgina-ba~ un

fragmento de 7 .o Kb y otros uno d~ iJ:·¡; Kb-. ''i.a·a' Variantes

se heredaban en forma mendeliana de. los padres a 'los hijos.

Las variantes del patr6n 7 .6/i.6 halladas fueron: 7. 6/7 .O,

• 7.0/13.0, J.6/13.0 y 13,0/13.0 (Fig, 21)

El mecanismo que produjo la alteroci6n genica, del

sitio Hpal, y que dio como resultado las variantes de 7.6,

7.0 y 13.0 Kb, no es conocido, Pudo originarse por mutaciones

qUC'. cr"Caran o _·de~truyeran secuencias de reconocimiento para

Hpal, por deleci6n o inserci6n de secuencias adicionales (Fig.

22).

Inicialmente el patr6n 13.0/13.0 fue observado en

un individuo negro con anemia falciforme. Para estudiar la

relaci6n-del fragmento de 13,0 Kb con el genotipo de la hemo­

&lobina S, se analiz6 el A.D.N. de individuos negros con o

sin hemoglobinopntias (Tablo XI). El fragmento normal de

7 .6 Kb Y el variante de 7 .O l<b son los patrones comunes en

los individuos con el genotipo de hcmoglobinn A. S6lo uno

entre 15 de toles individuos sanos presento el palr6n 7.6/13.0.

Por el contrario, la variante de 13.0 Kb se hallo frecuentemen­

te ligada con el genotipo de la hemoglobina S. De 15 pacientes

2 3 4 5

EJEJ CJEJ~

100

Kb

13.0

7.6

7.0

Figura 21. ADl> restrin¡;;ido con lipa I e hihridado con unn

sonda para el gen de la @:>bina beta, Los individuos mue.!!

treados fueron negros americanos con diferentes fenotipos

llemoglobinicos. Carril 1, hemoglobina AA ; 2,3,y 5, he11,t

globina AS; 4, hemoglobina SS. Los cinco pa.tTones obser­

vados son: 7.6/7.6, 7.G/7.0, 7.6/13.0, 13.0/13.0 y ?.O/

13.0 respecMvamente (95)

~ 7.0 Kb

~ 7.6 Kb

7lD' 1}.0 Kb

t t

Figura 22. Diagraraa do los tres tipos de

fragmentos Hpa I. Las flechas indican los

sitios de reconocimiento Hpa I. A y S, ~

nea de globinns beta normal y CalciformJ

respectivamente (95).

101

102

ABLA -xr.J. Relacion entre los fragmentos Hpal y los ~

no ti os de la he~o lobina

Genotipo Patron de los fraz. Frecuencia he?:Of'lo:.. m~r. ... os E12al Total de1 fragi:¡en

binico 7.b 7¡._. 7JJ ?.'. 13.0 to do 13 Kb .o 1 o 1• .. o 1~0

i;egros AA :: o 15 0.03 AS .7 1 cp g 16 0.31 SS : e o 4 11 15 0.37

Cauca&i cos

t./.. 12 o 12 o.oo

Asiatj,

cos

AA 15 o o.oo

1C3

con anemia .falciforme¡ se· halló el pai:r6n '13•0/13,0. en 11 de ellos y el patr6n 7.6/13 ;o en: 4. Así pues la ::·frecuencia

de asociaci6n del frag~ent~. de lJ,O. Kb ~on el gen de. la hemo­

globina A es de 0.03 éri negr~s a~erica~os, .y de 0 •. 89 con el

gen de .la hemoglobina:.· s en . pacientes c~n áne~ia . falciforme.

En 16 inÚviduo'.s · Íuiterozigoto-s (AS), 9 ·preseritaron el patr6n

7.6/13.0, uno e-1 de 7.0/13.0 y séis el de 7.6/7.6 o 7.6/7.0.

En contraste, . en la poblaci6n Caucasica o Asiática, solo se

·observaron .los pat~one~ 7.6/7.6 (Tabla XI),

Kan y Dozy (96) y Phillips y colaboradores (97) demos­

trar-on .la utilidad practica de la al ta frecuencia de ligamiento

(0,87) hallada entre el fragmento Hpal de 13.0 Kb y el gen

de la hemoglobina S al diagnosticar exitosamente los genotipos

hemoglobinicos de fetos en riesgo de padecer anemia falciforme:

En ambos casos parejas negras con hijos, portadores del gen

de la hemoglobina S e hijos que podecian de anemia falciforme,

solicitaron diagn6stico prenatal para un nuevo embarazo.

Se preparo A.D.N. a partir de células bluncas de los padres

y de los hijos afectados y A.D.N. fetal a partir de amniocitos

obtenidos de líquido amni6tico del nuevo producto.

Los padres, portadores del gen de la hemoglobina

S, presentaron dos bandos, 7.6/13.0, que contenian a los genes

de las globinas beta (patr6n 7.6/13.0). Se confirmo el hecho

de que el fragmento de 13.0 Kb portaba al gen de la globina

S cuando el patr6n de los hijos afectados mostro ser 13.0/13.0.

En el A.D.N. de las c&lulas amni6ticas se observo el patr6n

7 .6/13.0, indicando que el feto poseia los genes para las

globinas A S, obteniéndose asi el diagn6stico de portador

del gen de la globina S (Fig. 23),

104

3 4 Kb

13.0

7,6

Figura 23. ADN digerido con Hpa I e hibridado con

la sonda espec1C1ca para el gen de la globina be­

ta. Carriles 1 y 2, padree con hemoglobina AS;

3, hijo afectado con hemoglobina SS; l¡, cel.ulas de

liquido amniotico (96).

105

- Relaci6n con el gen de lá glÓbina beta C.

En ·e.St.Udios de'· negros americanos. con hemoglobinas

CC, AC y'···sc •se ,o.bserv6 que el fragmento HpaI de 13.0 Kb esta

ta~bi·e~ f0

re.cU~n·t:é·~en'~e·,,~·9oci~do. con el gen'· de :1a globina .beta

e ·este·· hiého·:;lia ···servido tanto como para el diagn6stico prenatal

(98) .· 'com'ó: ·¡;ara · e'stúdios antropologicos evolutivos ( 4).

~~ .• 2¿·: ~· -Uso ~n .ei: estud.io. de la .e.voluci6n de

binas:·sy··c enla: póbl8d6n mundial.

los genes de las hemoglo-

Lás . mutaciones beta S y beta C afectan al codon GAG

(G, guanina; A, .adenina) que codifica para el ácido glutamico

como sexto aminoacido de la cadena de la globina beta (99).

La mutaci6n beta S esta dada por GUG (U, uracilo) (codon para

Valina), y la mutaci6n beta C por AAG (lisina). Los genes

de beta s y de beta e seguramente surgieron independientemente

a partir del gen beta A ya que la tronsici6n de A a S o A

a C involucra el cambio de un solo nucleotido, mientras que

una mutaci6n S C necesitaría el cambio de 2 nucleotidos por

triplcte lo cual es altamente improbable. Ya que tanto el

gen S como el C estan ligados a el fragmento Hpnl de 13.0

Kb, Kan y Dozy concluyen que la mutación que produjo la varian­

te Hpal de 13.0 Kb surge antes que los mutaciones para las

hemoglobinas S y C, las cuales surgieron despucs, por separado

en cromosomas que contenian la variante Hpal de 13.0 Kb ( 11).

La anemia falciforme puede encontrarse en Africa,

la regi6n mediterránea y Asia. Para determinar si en todas

ellas existía el ligamiento entre el fragmento Hpal <le 13.0

Kb Y el gen, S, Kan y Dozy extendieron sus estudios o Sicilia,

Chipre, Gnbon, Kenia, Snudia Arabia e India ( 4)(Tabln XlI).

En Sicilia le asociaci6n si se presenta y en proporción eleva­

da. En cambio en Gabon (Africa Occidental), Kenia (Africa

Orientál)¡ s.~údiaArabia e I.ndia el gen S e~ta daso'ciad~ al f;agmento ·HpaI'. de. 7 ,6·Kb (Tabla . XII y l'fg,;.24)i .-

¿~s ~atoa. anteriores sobre la •Jli~tri~~din ~e~g¡¿~ica de lo,; áagmeátos HpaI asociados a' los 'gen.es s.·y e· pe;~úier6n elabot~r un arbol evolutivo de los Sitios HpaLy Ú su re1Bci6n

c0

on los genes de las globinas A, S y C_ .. (Fig,''25)( 4); En

la· mayor parte de la poblaci6n mundial, el gen de lá globina

beta. esta normalmente asociado al fragmento HpaI de 7 •. 6 Kb.

En Africa Occidental, una mutaci6n que afecto el sitio de

reconocimiento HpaI hallado al extremo 3' del gen de la glóbina

beta produjo un fragmento HpaI de 13.0 Kb (A-13.0 Kb). Las

mutuaciones S y C surgieron independientemente, cada una en

un cromosoma que con tenia la variante de 13.0 Kb (S-13.0 y

C-13.0). Una mayor proporci6n de fragmentos S-13.0 y C-13.0

que de A-13.0 se propago debido a que los genes S y C protegen

contra la malaria y asl aumentaron su frecuencia sobre A-13.0,

que no ofrecía ninguna ventaja selectiva. Parece ser que

despues el gen S ligado al fragmento HpaI de 13.0 Kb se propago

hacia Africa del norte y el mediterraneo. La asociaci6n entre

el gen S y el fragmento Hpal de 7,6 Kb en la poblaci6n Asiatica

favorece la conclusi6n de que la mutaci6n Asiática surgía

independientemente de la Africana ( 4).

Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricci6n

obtenidos con BamHI.

Cuando el A.D.N. humano es digerido con la enzima

de restricci6n BamHI, que corta en la secuencia GGTACC (T,timi­

na), hibridado con una sonda radioactiva complementaria

al gen de la globina beta, se observan dos fragmentos (ya

que contiene un sitio de corte BamHI intragenico) uno de 1.8

Kb que contiene el extremo S' del gen de la globina beta y

otro de 9.3 Kb que contiene el extremo 3', un intron de aproxi­

madamente 850 nucleotidos de largo y las secuencias no codifi-

Frecuencia de los ganes S falciforliles

1111> 10% a 1.5-1 l:S:i! 5 - 7. ~ i'.5 -5% '-' 0-2.5%

Figura 24. Distribucion geografica de los rragme~

tos Hpa I que con!:ienen al een do la globina beta

y su relacion con las hemoglobinas S y e (4)

107

103

Tf.BLA :a1. !"r•gc;ento¡; V.pal .;.1 ~•n r.!e globina beta en 1i ¡:'crentes blacion~s C"): l-e~o lobinas s e

'Ii.po tle ::o. F? tror. lipd Jo ¡;,

r.~:::o¡:lobinF r: ol·ir• 'bt"i.:-!' A~~c-t:;1g~"JO 7.0 7../ 7.S/ 7.,/ 1~ globinas s-~-¡ .... ::o l~O 13.0 13.1> y e con el

rr~gme::to de l'. Kb

:.:.s.h.. Presente

AA o AS 1 SS 30 ce 5 AC 1 S6 9

SiciliE . Presente AA o AS o S T~: s; <'

c;;ipn P:'.'e.,,nte /.A o AS G

G8.bon Ausrnte AS o

Kenil' Ausente /./. i SS o s~udiArsbia Ausente

t.t.. 2 2 o o o o SS 4 4 o o o o

India Ausente AA 17 1(. 1 e o o AS 34 29 1 o o o SS ~

.., e o o o

A 7.6

A 7.6 .._ __ A 7.0

--....... 1o:---s 7. 6

7.6

7.6 13.0

----e 13.0

A 13.0

Figura 25, Evolucion del sitio Hpa I y de los

genes de las globinas beta. Las l~tras A, S y

C representan los genotipos de globinas beta

y los numeros indican el tamaño del fragmento

Hpa I que contiene al gen de la globina beta.

No se ha empleado escala en el tiempo para el

diagrama. La divergencia del gen S antes que

el C indicada en el diaerama os arbitraria. Los

circulos señalan sitios en d~ndo el modo de

evolucion no es conocido; - normal; -- , va--

riantos; y - recombinantes (~).

109

cantes-3'- al gen estructural de la g-lob-ina b-eta (100).

,

·~ <V

Cuando Kan y colaboradores en 1980 (101) estudiaron

el A.D.N. de un grupo de Sardos (habitantes de Cerdeña, isla

del mediterraneo) con la enzima BamHI, encontraron variaciones

en el tamaño del fragmento que contenia al extremo 3' del

gen de la globina beta, Ademas del fragmento usual de 9.3

Kb, observaron, un fragmento de 22.0 K~. Estas dos variantes

del fragmento BamHI se heredan de una manera mendeliana, y

los siguientes patrones pueden ser reconocidos: 9,3/9.3,

9.3/22.0~-y 22.0/22•0 Kb _como __ se muestra en las figuras 26

y- 27, Ef p-olimorfismo no_ altera al sitio BamHI del extremo

5' del ge~ de la ___ glohlnil b-ei:a;-ya que el tamaño de este frag-

mento, no se Sltera.

De ·entre 71 Sardos sin beta-talasemia se observaron

33 con un patrbn de 9.3/9,3, 29 con uno de 9.3/22.0 y 9 con

22.0/22.0 Kh. De estas proporciones se cnlculo la frecuencia

del fragmento de 9.3 Kb en esta poblaci6n en 0.669 y la del

fragmento de 22.0 Kb como de 0.331. En contraste impresionante

todos los 42 Sardos homocigotos para betaº -talasemia mostraron

el patrbn de 9,3/9,3, indicando que el fragmento Bamlll de

9.3 Kb esta asociado con la lcsi6n de bcta0

-tulasem{a en todos

los B4 cromosomas betaº -talascmicos estudiados (tabla XIII).

Para probar la utilidad de este hallazgo en el diagn6stico

prenatal se estudio el A.D.N. de amniocitos provenientes de

15 fetos cuyo fenolipo ya h'1bia si do establecido previamente

por análisis sanguineos (tabla XIV). El fragmento Bamlll de

22.0 Kb fue visto solamente en el A.D.N. de fetos normales

Y en el de portadores del gen de betaº -talasemia. El patr6n

de 22.0/22.0 Kb no se hallo en fetos portadores, y ninguno

de los fetos homozigotos para beta 0 -talasemia presento el

fragmento BamHI de 22. O Kb. Estos resultados son consistentes

con la observaci6n de que a1\ esta poblaci6n el gen de la betaº

111

2 3 Kb

22.0

9.3

U3

Figura 26. AD?l digerido con Bam HI e hibridndo con una

sonda especifica para el gen do la globina beta. Carr1

les: 1, patron 9.3/9.3; 2, patron 9.3/22.0; 3, patron

22.0/22.0 Kb (101).

"-1. 8 Kb ?.3 Kb

-rp----r 1.8 Kb 22.0 Kb

t

Figut·a 27. Diagrama de los tres tipos de frag1ne.n

tos Bam HI. Las flechas indican los sitios de r~

conocimiento de la en<lonucleasa de restriccion

Balí,HI (101 ).

112

TABLA XIII,• Distr1buc1on del rra¡;ciento Ba:i;:t que contiene al oxh ~rcr.o ; !el ¡;e:: :!e la globina beta en el AD:: de Sardos (lOÍ )''

Grupo N-:i. ?~~!"-').: ;,¡i!';.;;;: Frecuencia

da los fr .. D}!.

9.3/9.:;-· 9.3/22.0 22.0/22.0 t::9ntos(%). 9.3 22.0

:;ormales 71 33 29 9 E:G,9 33.1

l!ococi&¡ 42 42 o o 100.0 o tos bct.!!. tslese:ni cos

TABLA XIV ,•Distribuc!-':: -~o los '~· s::iontcs Ba:iHI polimor!icos en el AD:-i aislado de ccl~l·• • :;:.·:otio•s cult~v.~as. (101)

po •.ron BamHI ~ia[.i10stico :·~ . . •. zu~~tos ) .. ;/9.3 9.3/22.o ·22¡0/22.0

i:f)r:JE.l 8 4 2 2 Port~·:ar

!; 3 de bt ';~ o tel~sc~:ifl

lio:::ocigotos beta ~--lE"- 3 scr.,icos

o

114

-talasemia esta. sieoipré ligado al fragmento BamHI de 9.3 Kb.

Asi pues en esta poblaci6n Sarda el hallazgo del fragmento

BamHI de. 22.0 Kb, en el A.D.N. de un feto en riesgo de betaº

-talasemia, elimina la posibilidad de homocigosis para la

enfermedad (101).

La explicaci6n mas plausible para la invariable aso­

ciaci6n del fragmento BomHI de 9.3 Kb con el gen de lo betaº

-talasemia es la de que la mutaci6n que dio lugar al gen de

beta 0 -talnsemia en la poblaci6n Sarda ocurrio en un cromosoma

que poseia el fragmento BamHI de 9.3 Kb (fig 28)(101).

Desafortunadamente en familias en las que tanto el

gen normal como el anormal estan asociado5 con el mismo frag­

mento de restricci6n, esta metodología no es Útil para estudiar

a la descendencia a menos de que exista un segundo polin1orfismo

en los tamaños de los fragmentos de restricci6n. Tal fue

el caso que reportan Phillips y colaboradores (102), cuando

al intentar el diagn6stico prenatal del producto de una pareja

de negros americanos mediante el estudio del polimorfismo

de el sitio Hpal (95,96) se encontraron con que no era posible:

De la pareja de padres portadores uno presentaba un patr6n

llpal de 13 .0/7 .6 Kb mientras que el otro tenia un potr6n de

7.6/7.6 Kb. Lo pareja tenia un hijo previo afectado de anemia

falciforme cuyo patr6n Hpal era 13.0/7.6 indicando que el

fragmento Hpal de 13.0 Kb contenia el gen de beta globina

s (fig. 29).

Como se observa en la figura 29, el feto en estudio

habia recibido de su padre el fragmento Hpal de 13.0 Kb ligado

al gen S, Y un cromosoma 7.6 de su madre, pero lera el cromoso­

ma beta S· o el beta A? en este caso el polimorfismo lipa! no

era· informativo.

115

'13º talasemia/ 9.3

A 9.3

A 22.0

Figura 28. Arbol evolutivo de los genotipos de globinas

beta y los rragmontoe ~e restriccion de la enzima llam HI

en la poblacion Sarda (101).

AS AS ¿ AS o SS

11G

SS

Figura 29. Allll restringido con Rpa I e hibridado con una sonda para el gen de la globina beta. Carriles: M, madre; P, padre; A, amniocitos; H, hijo primogenito afectado con anemia falciforme. El fenotipo hemoglobinico ae indica~ bajo de cada carril (95).

M P A H

·BBBB AS AS ¿ AS

o SS ?

SS

Kb

?.8

?. ,

Figura 30. ADN restringido con Hind III e hibridado con una sonda para el gen de la globina gama. Carriles: M,

madre; P, padre; A, amniocitos; H, primogenito afectado.

El fenotipo hemoglobinico se indica abajo de cada carril

( 102).

.- .=é. < -:--. -.-<~---~-Afo~túnadamen"te ·,'rúan (103)

descrito p·~e~·i:~:m~~·~:~ .: ... ,~'~ ·-~:p_ol_:i:nior_fismo, enzimíi .de.· r~·s~rt"~Ci6n. IÍÍmdIII en el

Jef f reys (93)

en el A.D.N.,

gen estructural

habian para la

de la

:::b7¡: .·.::~tiit:0

i~cutLt su c;::does :: :::::em::t:. ~~~:dohu:.:~ con Ú ~nh~~·;·Hiiiºc!tri y se hibrida con una sonda radioactiva

p~~a·.-:-re\:·._i~~?'dc!·:-,la ... 'glÓbina gamma, puede encontrarse al gen

de J.~-, gl.obirfa gamma en un fragmento de 7 ,8 Kb o en uno de

7. l. Kb ií.egun ,·el sitio de restricci6n para llind III este ausente

. . .PhilHps y colaboradores (102) procedieron a digerí r

el A;D.N. de los miembros de la familia en estudio con la

e~zi'!la "Hindlll encontrando lo siguiente: La madre presentaba

el patr6n 7,8/7.1 el padre el patr6n 7.l/7.1, el hijo afectado

7,8/7,l y el feto 7,1/7.l (Fig. 30),

El hijo afectado dcbio recibir el cromosoma con el

fragmento llindIII de 7 ,8 Kb por parte materna puesto que su

padre tiene el patr6n 7.1/7.1; ya que el niño es homocigoto

SS entonces en su madre el gen beta S se encuentra ligado

al cromosoma con el fragmento llindlll de 7 ,8 Kb. El hecho

de que el feto presente el patr6n 7. l/7 .1 nos indica que por

parte materna rccibio el gen beta A y por lo tanto el diagn6s­

tico definitivo es el de portador del gen beta S (102). Usando

este mismo enfoque ha sido posible diagnosticar exitosamente

el genotipo de fetos en riesgo en casos en los que un solo

polimorfismo no es informativo (104, 105, 106).

Polimorfismos Originados con Ava II

Para el diagn6stico de la beta-talasemia, por med1.o

113

de polimOrfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción

en iridividuos del mediterraneo (Chipriotas, Griegos, Italia­

nos. y ·Malte~es) se cuenta con un nuevo polimorfismo evidencia­

ble con la endonucleasa de restricci6n AvaII ( 107). Cuando

el A.D.N. de estos individuos es restringido con la enzima

AvaII e hibridado con una sonda específica para el gen de

la globina psi-betta (pseudogen situado cerca (en términos

de· ligamiento) al gen de la globine betta), se observan varios

patrones en los fragmentos de restricci6n (Fig. 31). Estudios

familiares mostraron que hay tres tipos de individuos, de

a~uerdo a la herencia Mendeliana¡ homocigotos para los fragmen­

tos menores de 1.1 2.8 Kb (genotipo +/+, carril 3, fig.

31)¡ homocigotos para el fragmento mayor de 3.9 Kb (-/-, carril

2, fig. 31); y hetcrocigotos que presentan los fragmentos

de 3.9, 2.8 y 1.1. Kb (+/-, carril 1 y 4, fig. 31). Estos

resultados muestran que la prcencia del sitio polimorfico

AvaII resulta en la escici6n del fragmento de 3.9 Kb en dos

fragmentos menores de 1.1 y 2,8 Kb respectivamente (107).

En estudios epidcmio16gicos se demostro que la ausencia del

sitio AvaII-psi-betta en el A.D.N. de individuos del mediterrá­

neo, lo que origina el fragmento de 3.9 Kb, es raro en los

cromosomas normales (3.9%) y es mas frecuente en los cromosomas beta-talasemicos (22.3% en Italianos 71% en Chipriotas)

(108), lo que ha permitido exitosos diagn6sticos prenatales

de fetos para los cuales otros polimorfismos (101) no son

informativos (107).

Polimorfismos originados por delcciones o adiciones

Existen, también, casos en los cuales hay variaciones

en los tamaños de los fragmentos de restricción, pero no debido

a la presencia dimorfica de un sitio de restricci6n ligado

al gen de interés sino por raz6n de haberse sufrido una. dele­

ci6n o una inserci6n en el locus en estudio.

2 3

+!- -1- +/+

119

Kb

3.9

2.8

1.1

Figura 31. Autorradiogrnfir, mostrando ejemplnres de

AD:I ( 1-4) digerido con Ava II e hibridado con una sou

da especifica para el pseudogen psi-beta. El genotipo

de cada muestra de AD~ se indica abajo de caJa carril

(107).

120

. .. . . -

cu'ando·. el .A.D;N •. de individuos sanos; nó talasemicos,

es .restringido· éon', la .enzima .de restriccion PstI e hibridado

con· ·una. so_nda .especifi.ca para el gen de la globina betta se

observa una han.da de 4.4 Kb que contiene el gen de la globina

, beta (109) Un tipo de gen talasemico betaº común entre los

hindúes es aquel que presenta una delecion de 700 pares de

- bases¡ e que incluye una porci6n del intron mayor del gen asi

como el extremo 3 1 codificante (110) (Fig. 32), Cuando se

digie_re el A.D.N. de individuos portadores u homocigotos para

este ~en de heta0 - talasemia y se hibrida con la sonda espe­

-dfica «para globina beta, se evidencia un fragmento de 3. 7

Kb, en lugar del fragmento normal de 4.4 Kb, conteniendo al

gen de la globina beta (Fig. 33)

- Delecion de Génes'Completos

Los genes de la globina alfa estan, normalmente dupli­

cados esto es que hay dos genes de globina alfa en cada cro­

mosoma 16 (111). El A.D.N. genomico, de individuos normales,

al ser digerido con la enzima BamllT e hibridado con una sonda

especifica para el gen de la globina alfa, revela un frag­

mento de 14 Kb (112). Este fragmento de A.D.N. contiene ambos

genes de la globina alfa. Asi pues, sujetos no talasemicos,

tienen tal fragmento en ambos cromosomas y mostraran un patron

de 14.0/14.0 Kb (fig. 34).

EN la poblaci6n negra americana se ha calculado que

hasta un 20 o 30% de los individuos poseen un cromosoma con

un solo gen de la globina alfa (113). Cuando el A.D.N. de

un individuo heterocigoto para un cromosoma 16 normal {alfa,

alfa) y un cromosoma 16 con un solo gen de globina alfa (alfa­

se digiere con BamHI e hibrida con la sonda específica para

! ,, J, 5' cu/ 3

1~00.;.--..

¡ / ' I

l ff I/ i 5' ar

Figura 32. Defecto molecutax .te un tipo 1le gen beb."

-talasemico presente en los hindues. Las flechas in dicen los sitios de reatriccion de la endonucleaaa

i1at I ('10).

121

2 3 Kb

4.4

3.7

Fi¡;ura 33. AD:; restringido con Pst I e hibridado con

la sonda para el gen de globina beta. Carrlles: 1,

homocigoto betaA/betaA; 2, heterocigoto betaA/be­

ta0; 3, homocigoto beta0/beta°C110).

122

123

'({

ll' 1 ~

5'~3' t 14 Kb t

...t --t 1 ~ .........

~ 11 ll' 1

~ \' 't

5•-:-@--::--- 3' t 10 Kb t

.-

5

5t.-................ .,_ 3'

Figura 34. Diferentes cromooomaa 16 que tienen cero,un~ 1 das,

o tres genes de la globina alfa. Las nech;:;s indican sitios

de restriccion Bnm HI. Las bandas se obtienen al restringir

el ADN con Bam HI e hibridarlo con una sonda para el gen de

la globina alfa (103).

Kb

:s.o

14.0

10.0

el gen de la ·g1obina alfa, se observan tanto el fragmento

normal de 14.0 Kb como un fragmento de 10 Kb, que es el resul­

tado de la delecion de uno de los genes de la globina alfa

(113) (Fig, 34), De forma similar se han reportado casos

en los cuales han encontrado cromosomas 16 sin un solo gen

para globina alfa (113,114) dando como resultado el sindrome

de la hemoglobina 11 (heterocigotos para un cromosoma 16 con

un solo gen de globina alfa y un cromosoma 16 sin genes de

globina alfa (alfa,-/-,-), en estos casos existe un solo gen

funcional para globina alfa por celula diploidc y solo se

observa el fragmento de lOKb en el análisis de los fragmentos

de restricci6n con Bam!II. Este fragmento de 10 Kb representa

al único gen de globina alfa (Fig. 34).

- Adicion de Genes Completos

Un cromosoma 16 con tres genes de globina alfa ha

sido reportado también (115), El fragmento de A.D.N. que

contiene tres genes de globina alfa es de 18 Kb, en vez de

ser de 14 Kb, al ser digerido con Bam!II (Fig. 34),

Este nuevo cromosoma se encuentra en la poblaci6n

negra americana con una frecuencia de 0.0036 ;entre los grie­

gos con una frecuencia de O.OS y no se le hallo entre los

Sardos. Los heterocigotos para el triple locus del gene de

la globina alfa con cinco genes de globina alfa por celula

diploide (alfa, ulfa, alfa/alfa, alfa) no muestran manifesta­

ciones clínicas anormales (115),

El origen tanto de los cromosomas con un solo gen

para la globina alfa., como para los cromosomas con tres de

ellos puede explicarse por un entrecruzamiento no balanceado

(116) (Fig. 35), Este proceso debe de producir igual número

de cromosomas con un solo gen de la globina alfa como de cromo-

125

sOmas con el locus triplicado. Sin embargo, como se observa

en la tabla XV en las poblaciones negras y Sardas, la frecuen­

cia del cromosoma (alfa,alfa,alfa) es muchisimo menor que

la del cromosoma (alfa,-), Esta di fercncia sugiere que el

cromosoma (alfa,-) es ventajoso evolutivamente, La prevalencia

de la alfa-talesemia en las áreas donde la malaria es endémica

sugiere que, por algún mecánismo, aún no definido, la alfa­

talasemia protege contra la malaria (115).

12G

B

5'~3'

t 14.0 Kb T

Figura 35. Entrecruzamiento no balanceado: Es un mecanismo comun

de delecion o adicion de moterial genetico. A, entrecruzamiento

no balanceado intercromosomal entre los genes de globina alfa

explica tanto al cromosoma con un solo gen de e;lobina alfa como

al que lo tiene triplicado. B, entrecruzamiento intracrJbmosomal

en la region de los genes de globina alfa explica solo al cromOSQ

ma con un unico gen de globina alfa(115)

127

TAll;..A_XV. L~ frecuoncin de el cro~ooJ~~ con t:e3 genes de slob1na al!a(a,a,a) y del ·'l'lC tieC'O UIÍ SOlO gen (a,-) se muestran en di-ftrO!lhS poblacio;1c=. ( 115)

Poblacion Frecuencia Re foroncias a a a a -

:\t;tros /.mcr1canos :.o::::;6 0.16 (115, 117)

Surdo o ~.004 o. 13 (115)

Griccos 0.05 0.07 (115.11R)

128

B. DETECCION DIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECULARES EN LOS .GENES

CODIFICANTES PARA LAS GLOBINAS.

l. Mutaciones Puntuales que Afectan ~itios de Restricci6n

Conocidos.

Esta mctodologia depende directamente de la mutuaci6n

puntual que convierte al gen funcional en inactivo. Si la

mutaci6n crea o destruye un sitio de restricción, el ADN gen6-

mico puede ser estudiado directamente con la enzima de restric­

ción especifica para ese sitio. Para visualizar los patrones

de los fragmentos de restricción esta metodologia como la

primera, emplea ADN marcado radioactivamente como sonda.

El ADN sonda detecta el (los) fracmento(s) gencrado(s) y aso­

ciado(s) al gen normal asi como el (los) nuevo(s) fragmento(•)

gencrado(s) y asociodo(s) con el gen mutado. Este acercamiento

es más simple y directo que el de los polimorfismos en los

fragmentos de restricci6n ya que no necesita estudios familia­

res. Sin embargo, esta más limitado en su uso, ya que no

todas las mutaciones afectan a un sitio de rcstricci6n conocido

A continuaci6n describiremos los resultados que se

han obtenido al aplicar esta metodologla al estudio diagnóstico

de varias hemoglobinopatias como:

Anemia Falciforme

En 1978 Niehuis sugirio que la mutoci6n responsable

de la Anemia Falciforme (CCTGAGG que cambia a CCTGTGG en el

ADN y que· origina que el aminoácido Valina en la posición

seis de la cadena de la globina beta sea sustituido por el

Acido Glutamico) podria ser detectada directamente con la

129

--· - .. •"'

. . ·- - -

-: . . - "·. ,,

-. 'o - ·'" _,• -~~

endonuClea~.a·· de·'·~~~t~·icc~b~ -Mrii ·:r, la cual reconoce la secuen­

cia GAGG.,i.<11.9) •.. ··Esta secuencia esta presente diez veces en

ei· .. g1ú\·. de< la '.globina beta de individuos normales sanos y solo

n~~v~ vec~s·~~ el~gen de la globina beta falciforme, originando

asl. ·un patron de restriccibn diferente que permite distinguir

entre ·individuos sanos, portadores y enfermos (119). Desafor­

tunadamente los fragmentos que se originan al digerir con

Mnl I son muy pequeños (de 60 a BO pares de bases ) y por

lo mismo no son adecuados para ser evidenciados confiablcmente

mediante la técnica de Southern. Con el descubrimiento de

la endonucleasa de restricción ílde (120), que restringe

la secuencia CCTNAG (donde N es igual a cualquier nucleosido),

el grupo de Gcevcr y cols, demostró poder diferenciar entre

el gen normal de la globina beta (betaA) y el gen falciforme

(betas) (121) (tabla XVI),

Al restringir el ADN de individuos sanos, no anémicos,

con la enzima Ddc I e hibridar con una sonda especifica para

el extremo 5' del gen de globina beta, se obtienen dos frag­

mentos de 201 y 175 pares de bases respectivamente ( fig. 36).

Si se considera que la mutacibn de la anémia falciforme elimina

el sitio de restricción para Dde I beta5 +6 (fig. 36) entonces

en homocigotos para el gen HbS solo se debera de ver una banda

de 375 pares de bases complementaria a la sonda S' del gen

de globina beta y en hetorocigotos (betaA/beta 5 ) se espera

observar las tres bandas de 175,201 y 375 pares de bases res­

pectivamente. efectivamente eso fué lo que encontraron

Geever y cols. al estudiar el ADN de diferentes individuos

(121) (fig. 37).

~an y Chang (122) y Wilson y cols. (123) demostraron

el poder diagnbstico de esta técnica al aplicarla exitosamente

a un par de embarazos con riesgo de padecer anémia falciforme.

Ambos tenian un genotipo AS, un hijo previo era SS.

130

TABLA XVI. Comparacion del sitio de mutacion de la Anemia

Falciforme en HbA y en HbS (121)

Tipo de Secuencia de am~noacidos (codones 5,6 y ?) Hb y secuencia nucleotidica correspondiente

A Pro-Glu-Glu QQ!::Q!Q-GAG

s Pro-Vol-Glu CCT-GTG-GAG

El sitio de reconocimiento de DdeI esta subrayado.

5+6 D p D _:. l 175 pbl

---h\\\\\\) 201 pb

l~St

sonda 5'

Figura 36. Mapa de la porcion 5' del gen de la globina beta.

Los sitios Dde I (D),incluyendo el que se arecta por la mu­

t•cion !alcirorme (beta 5+6) 1 y los tamaños de los fragmen­

tos Dde I en pares de bases. El tafüafio y especificidad de la

sonde empleada para detectar el extremo 5' del gen de la gl.Q

bina beta tarnbien se muestra (121). I'/S: intrones

131

132

3 Kb

376

201

175

Figura 37, Diagrama de la autorradio.:~·afia de los fragmen­

tos Dde I que hibridaron con la sonda especifica para el

e;rtremo 5' del gen de lr.. globin:; beta. Carriles: 1, indivi

duo control (AA); 2, individuo homocigoto para la anemia

falciforme (SS); 3, individuo portador del gen de la anemia

falciforme (AS) (121).

133

El análisis 'con Dde I del ADN de . ambos padres revelo, como

s.e esperaba, los fragmentos de 175,201 y 376 pares de bases,

. el ADN del hijo afectado solo origino el fragmento de 376

·pares de· bases, conforme a lo esperado. En el ADN de los

amniocitos cultivados se hollaron los fragmentos de 175

201 pares de bases, lo que es indicativo de un genotipo AA,

lo cúal fue confirmado con estudios sanguineos del neonato.

Ya que existe evidencie de que la mutación falciforme

se origino mas de una vez en la poblaci6n mundial (4), Kan

y Chang se preguntaron si el ensayo con Ode I seria útil para

detectar al gen falciforme en diferentes poblaciones: Estudia­

ron el ADN de negros americanos, de individuos del Mediterraneo

(Sicilia, Grecia), el este medio (Jordania, SnudiArabio),

Africa (Nigeria, Kenya) y Asia (India). En todos los casos,

el gen A produjo los fragmentos de 201 y 175 pares de bases

mientras que el gen S origino solo el fragmento de 376 pares

de bases (122).

Aunque este nuevo acercamiento a la detecci6n del

gen falciforme es mas sencillo, directo, no requiere de grandes

estudios familiares y sirve para diferentes poblaciones mundia­

les, tiene dos limitaciones importantes: Primero, el análisis

con Dde I no detecta al gen betaC' ya que esto mutaci6n (betaA

CCTGAG-.. beta e CCTAAG) produce una secuencia que si es restrin­

gible por Dde I, y por lo tanto no puede ser distinguida de

el genotipo bctaA. Entonces para la detecci6n de bctnC el

polimorfismo Hpo I es mas Útil ya que el 95% de los genes

betaC eston asociados con el fragmento Hpa I de 13 Kb (4,

123). Otro inconveniente de la técnica, es que se requieren

de 10 a 20 ug de ADN para el anil.lisis ya que los pequeños

fragmentos de ADN generados por Dde I producen débiles señales

de hibridaci6n. Esta cantidad de ADN solo puede obt·enerse

mediante el cultivo de amniocitos lo que aumenta el costo

alarga ·la,, . . ·de la prueba. Afortunadamente, poco

después, ,Charig 'y ,Kan, (124) y 'Orkin y cols. (125) introdujeron

una' mo'difi'~aci6n a la 'técnica hadendo uso de 'ta endonucleasa

de restri,cÚ6~, Hst II.

,La enzima MSt III reconoce la misma secuencia nuclco­

tidica, que Dde, I (CNTAG) pero tiene ademas una especificidad

adici,onal, de ,dos bases mas (CCTNAGG), Asi pues la restricci6n

de'! ADN 'c.;n Mst í:I genera fragmentos mayores que los que origi­

na Dde I ( fig. 38) 1 ya que los fragmentos grandes de ADN

favoie~eri ·la "hibridaci6n- y por_ lo mismo producen scfialcs fucr­

t"cs •. el ·ensayo con Hst· II no requiere cultivo de amniocitos

):a. qu-~-=con tan poco co"mo -1 ug de ADN se puede realizar la

p~ueba (124).

-~¡ ·:~esti'ing.ir-·ADN normal de personas sanas, no ancmi­

caS; -Con_- ·Mst>.-.- 11> e· '.hibridarlo con una sonda específica para

el extre~o S,~:,, del gen de la globina beta (fig. 38) se revela

un frágmeiíto~de,'. l', 15 Kb. Ya que la mutaci6n falciforme elimina

el sitfo Hs't' II beta5 • 6 • 7 (fig. 38) el ADN de homocigotos

para::¡,¡ gen ,:bet'aS al ser restringido con Hst II e hibridado

c~·n ·la sonda d.el extremo 5 1 del gen de globina beta revela

un 'fragmento de 1.35 Kb (fig, 39).

Este nuevo enfoque demostro ser Útil tambien para

el diagn6stico de fetos en riesgo de padecer anemia falciforme

(123, 125) ser Útil en diferenles poblaciones mundiales

(Negros americanos, Kcnianos, Hindues y de Snudi-Arabia (124),

con la ventaja de ser mas rápido y barato por no requerir

cultivo

ensayo.

al gen

tambien

de amniocitos para obtener el ADN requerido para el

Sine embargo este ensayo tampoco sirve para identificar

beta , pues lu enzima Hst 11, al igual que la Dde I,

reconoce al sitio mutante bctaC (124 1 125).

Region Adyacente

1 Gen de la Globina lleta

{}5,G,7

~.2Kb~ 5' + 1.15 Kb

sonda especifica para el extremo 5' del gen

Je globina beta \

/,. 1.15 Kb

s 1.35 Kb

r11su\

Figura 38. Diagrama de la region adyacente y del extremo

51 del gen estructural de la globina beta. Las flechas

indican los sitios Mst II, incluyendo el correspondie.n

te a la posicion de los aminoacidos 5,6,7. El fragmento

de 1. 15 Kb es visto en el ADN normal, y el de 1. 35 Kb en

el AD;! portador del alelo S del gen de la ¡;lobina beta.

IVS= intronee (12!¡).

135

2 3

~ § [] Kb

1.35

1. 15

Figura 39. ADN restringido con !4st II e hibridado con la

sonda especifica para el extremo 5' del gen de la globi­

na beta. Carril 1, homocigoto AA;2, heterocigoto AS;3,

homocigoto SS (125).

Figura 40. Deteccion por analisis con la en<lonucleasa Eco RI

del defecto molecular en el gen de la globina beta-Arab. La

mutacion elimina un sitio de restriccion Eco RI. Las flechas

indican sitios de corte para Eco RI (127)

1.37

La glob·:Í..~a ·'.bet~O Arabiga, beta 1 21 GLu-Lis, in teractua

can la glabina ·fi!lcifarme y causa la enfermedad hemoglobinica

soArab, ia cual es cllnicamente tan severa como la anemia

f~lcifarme (126). La sustituci6n nucleotidica que do origen

a esta variante puede ser detectada en el ADN genomico usando

lá endonucleasa de reatricci6n Eco Rl (fig. 40). El sitio

de reconocimiento de Eco RI es un grupo de seis nuclcotidos

(5' G4AATTC 3') que codifica para los aminoacidos 121 y 122

(127) de la cadena normal de la globina beta. La sustituci6n

nucleotidica sencilla en el gen betaOArab(G-A) elimina el

sitio normal de corte de Eco Rl al cambiar la secuencia del

ADN a 5' AAATTC 3' (128). Cunndo el ADN genomico normal es

digerido con Eco Rl o hibridado con una sonda para el gen

de globina beta , se revelan dos bandas de 5.2 y 3.2 Kb de

largo. En el caso de un homocigoto para ilbOArab solo un frag­

mento de restricci6n, de 8.4 Kb, es detectado debido a la

ausencia del sitio de reconocimiento para Eco Rl en los codoncs

121-122 (fig. 40) (97). Esta técnica se ha usado en combina­

ci6n con el polimorfismo Hpa I paro diagnosticar prenatalmcnte

a fetos con riesgo de SOArab y tambien para detectar al gene

beta de la variante hemoglobinica DPunjab (beta 121 Glu-Gln)

(4).

Hemoglobina JBrouasais

Los genes humanos de la globina alfa contienen la

secuencia AAGCTT en el sitio que codifica para los aminoacidos

90 y 91 (129). Eeta secuencia codifica para lia-leu y es

tambien el sitio de corte para la endonucleasa de restricci6n

llind 111. La variante hemoglobinica HbJBroussais (126) tiene

en la posici6n 90-91 de la cadena alfa, lis-asn, siendo la

secuencia nucle6tidica que codifica para ellos AAGAAT. Este

cambio vuelve al ADN resistente al corte de Hind III en este

13S

Sitio.

Cuando se restringe el ADN de una pers.ona homocig~ta

p~ra· ·la HbjBroussais y se hi.brida con una s.onda P~.ra ::e,1 · gen

de _lo globina alfa, se revela un fragmento de 7 .5 -Kb. Este

fragmento esta formado por la fusi6n de l_as fragmentos_ de

4. 6-- y 3. 7 Kb observadas en las individuos sanos (130 )( Úg.

41).

Talasemia Beta0 (gene betaivs ·2 G-A)

Una mutaCÍ.6n puiltual en el _sitia de empalme (sitia·

de _uni6n °entre un - intran y- un exon) del segundo intra-n del - - - - o gen de _la glablna beta es una etiología de la talasemia beta •

La mutación (G-+A) elimina un sitia de reconocimiento para

la enzima·Hph -I (GATGA _en lugar de GGTGA) (131) (fig. 42).

Se sabe- que la endonuclessa de restricción Hph

tiene uno de sus Sitios de corte en el extremo S' del intron

II del gen de glabina beta (132) (fig. 42). Cuando el ADN

humano nor~al se digiere con Hph I y se hibrida con una sonda

específica para el intron II del gen de ln globino beta se

obtiene un fragmenta de 0,9 Kb de largo (fig. 42). llaird y

cols. (131) hallaron en tres pacientes homocigotos para talase­

mia beta, uno Italiano y dos Iranies, un nuevo fragmento de

1.0 Kb de largo, en lugar del de 0.9 Kb, debida a la pérdida

del sitio de restricci6n para Hph 1 en el extremo 5' del intron

11 del gen de globina beta, y consiguiente alargamiento del

fragmento Hph I hasta el siguiente sitio de restricci6n hallado

100 pares de bases mas hacia el extremo 5' (fig, 42).

Avances en la Detecci6n de las Mutaciones Puntuales

En fechas mas recientes se han elaborado protocolos

Figura 41. Deteccion por analisis con Hind !II del defacto molecul.'.lr en el gen Je la hemoe;lobina J-Brou

ssais. La mutacion elimina ur1 sitio llind III. Las

flechas indican sitios Hind III (130).

139

Kb

7,5 4,6

3,7

1.0

0.9

Figura 1¡2. Analista c<on la ondonucle~sa Rph I del defecto molecular en un tipo de bet.l'-talasemia con una mutacion en

el extremo 5' del sitio de empalme Jel segundo intron. La

mutacion elitnlna un sitio de restriccion Hpit I. L-Os sitios Hph I se indican con flechas ( 131).

140

c..... .; .. -

novedoá.os; que :.·i~t·~'~d·~·~e~'., ~odi fi~,fi~i~¡ries :~··i~:~'· .'.~-~,:~-~i~~-¡·6~-:/d·i·~"e.cta :: 6:u;·:~:~:~~;¡;~t:·~:.sdt~ti6~NJLe1m~r~~::;i~:~.j~f de ····~es~ric-

·: :·.¡:.' . -r··- --;,)~ ··:., >,,: ~ -- Usod~Mi.nis~i~s'.~ la R~~";1~~i6~··d~;Fri~me~if~~ de Restricc'i6n

uso

'-~

é~~¿,;~·se•ih~ expuesto ~n los párrafos

de;. erl~-o-nti·cÍ~eB:sas de re-stricci6ri para la

anteriores,

detecci6n,

el

en

~~·f~~~'·: __ ~:-_~r~~%_t_~_:.·< d~ __ uña mutaci6n puntual que haya creado o des­tl-U'id-ó .. jin-.-_:_sit:t'O de l-estricci6n dentro de un gen de interés,

permÚ~·;·:el~~análisis de ADN genomico desde 1 (124) hasta 20

_ug-·_(4), Pa_ra obtener en aproximadamente dos semanas un diagn6s­

_ti~_o· confiable del genotipo hemoglobinico de los sujetos en

estudio (121, 122, 124, 117). Law y cols. han desarrollado

un protocolo, para la preparaci6n y análisis del ADN genomico

de amniocitos, que es mas sensible, pcrmltiendo un diagn6stico

prenatal con tampoco ADN como 50 ng y en un lapso de cinco

días o menos (133). Este protocolo se hn aplicado satisfacto­

riamente al diang6stico prenatal de: anemia falciforme con

Mst II, mapeo de los alelos betaA y beta3 con Dde I, mapeo

del alelo betaD Punjab con Eco RI, mapeo del alelo betaEcon

llph l y al estudio de muestras de ADN mediante polimorfismos

de los fragmentos de restricci6n ( 133). Los puntos novedosos

de este protocolo son:

a. Extracci6n del ADN. En los protocolos de lisis

celular convencionales, al rcsuspcnder a los amniocitos en

el buffer de lisis con S.D.S., se forman agregados celulares

que requieren prolongados periodos de incubaci6n para disper­

sarse y lisarse. En el protocolo modificada por Law , las

células amnioticas (provenientes de 5 a 20 ml de líquido amnió­

tico) se .suspenden homogcneamente antes de agregar el S.D.S,

dando como resultado que ln lisis se obtenga en dos horas.

El pequeño volumen de lisis usado (0.4 ml) permite rapidez

141

en las extracciones fenolicas, de tal manera que el ADN puede

se~ obtenido y cuantificado en unas dos horas.

b. Resoluci6n de los fragmentos de ADN. Una vez

que el ADN ha sido digerido con la-endonucleasa de restricci6n

requerida para el estudio en proceso. se procede a separar

los fragmentos de restricci6n obtenidos, mediante electrofore­

sis horizOntal en minigeles de agarosa al 1.4% con dimensiones

de 6 x 10 x 0.5 cm, durante dos a tres horas.

c. Detecci6n del fragmento de interés mediante hibri­

daciones con sondas radióactivas.

Los procesos de transferencia del ADN a papel de

nitrocelulosa y la posterior hibridaci6n con la sonda radioac­

tiva precisa, son iguales que en los protocolos convencionales,

solo que aqui la sensibilidad con este nuevo ensayo se ve

aumentada. Mientras que con los geles de tamaño convencional

se requieren de 1 a 2 ug de ADN total para poder delectar

a un gen presente en una sola copia, por juego haploide cromo­

somico, el uso de minigeles permite la detecci6n de estos

genes usando 200 ng de ADN totul y una cxposici6n autorradio­

gráfica durante toda la noche. Aumentando el tiempo de cxposi­

ci6n de la autorradiografía ( ';>' 2 días) la sensibilidad aumenta

hasta requerirse solo 50 ng de ADN total.

La mayor sensibilidad alcanzada con el ensayo con

minigelcs no implica perdida de la resoluci6n. Bajo las con-­

diciones de Law y cols., la rcsoluci6n se mantiene comparable

a la obtenida con los geles convencionales.

- Amplificación Enzimática del Gen de Interés

Aunque esta metodología, desarrollada por Saiki

11¡2

cola, (134_), fue' ori.g-¡~;,lmente aplicada a la 'detecci6n de

los alelos_ de la ane~i~ 'falciform~; puedé'seic utiHzada para

cualquier- muta'ci6n pu'ntual que afecte a·_:un-_·sitio de .re;,tricci6n

conocido'.

Inicialmente, un

del gen de globina beta,

Dde I, es amplificado, A

fragmento de 110 pares de bases

que contiene al sitio diagn6stico

20 ng de ADN total desnaturalizado,

se le agregan cebadores para la replicaci6n (oligomeros sinté­

ticos de 20 pares de bases) que se alinean a bandas opuestas

del ADN genomico que flanquea a la secuencia gcnica de interés

Estos cebadores quedan colocados de tal manera que en presencia

de la polimcrasa I de h coli y nucleotidos trifosforilados,

el producto de extensi6n de un cebador puede servir como bantla

molde para la sintesis replicativa del otro. Con esta estrate­

gia de ciclos repetitivos de desnaturalizaci6n, alineuci6n

y extensi6n de los cebadores, se obtie11e unn acumulaci611 expo­

nencial de 1 fragmento de 110 pares de bases componente del

gen de ln globina beta. Por ejemplo, 20 ciclos de amplifica­

ci6n producen un aumento de 220,000 en la cantidad original

del fragmento genico de interés.

El ADN amplificado es hibridado con una oligosonda

de 40 nucleotidos de largo, complementaria a la región del

gen de globina beta que rodea a la mutación falciforme. En

el alelo betaA, la secuencia nucleotidica de esta regi6n contiQ.

ne un sitio de rcstricci.6n Dele I, que ha sido perdido en el

alelo beta 5 • Lo estrategia pnra gencrur productos de restric­

ci6n especificas para cada alelo (mutante o normal), n partir

de las sondos radioactivas se muestra en la figura 43. Se

basa en la presencia invariable de un sitio de restricción

para llinf· III inmediatamente adyacente al sitio diagnóstico

de restricción para Ode I. La resolución en geles de pol ia­

crilamida de los productos de restricción, generados a partir

143

A B

--;.-------GACTCCTGAG---:.-~---;.

__ ,.;-, __ "'.i-:c~aAaGAcTc--;.---------.--------GACTCCTGTG-'--------

---------'-CTGAGGACAC---------

desriaturalizacion y alineacion

•. ~-~~ACTCCTGAG---- con la sonda f---GACTCcrolG----

º --:-,,--'-'-::,..CTGAGGACTC---------- ----------CTGAGGAC A C---------

sri~-''."''.GACTCC • e _:,;;;.,.;_~CTGAGGACT

t. . ----GACTCC

digestion con Dde' I

TGAG----·. ~---GACTCCTGAG----c.;.c..------- -'---------CTGAGGACAC--------­

digestion con Hinr III

TGAG----

-------CTGAGGACT C---------

3n~-G -----CTGA

ACTCCTGAG-­

TGAGGAC A C-----

Figura lt3. Diagrame esquematico de la restriccion ele olie;omeros

mediante digestion secuencial para obtener productos de reotri,!;.

cion especificas para betaA y betas. Se muestran las secuencias,

del ADll genomico del e;en de ln globina \Je te y do la sonde, que

contienen ol sitio invariable Hinr I (GANTC, donde ll represen

ta a cualquier nucleotido) y al s1 tio polirnor rico Dde I ( CT<lAG). El simbo lo t. indica la posicion ele la marca radioac ti vn en la

sonda. (A) ProceJi,niento y resul tndos es¡1orr.dos cuando la ,;onda

hibrida con el gen normal de la e;lo\Jlna beta (bobA). Desruos do

la desna turalizacion del AD:: gonomico y de su liibridncion con la

sonda, la dieestion con Dele I libera un producto de restriccion

(8n). Debido a las condiciones estrictas durante la digestion

con Dde I, ol producto 8n se disocia del All:I genomico y la subs~

cuente cligostion con llinr I no tiene erecto. (B) Descripcion de

digestion ~on Dele I y liinf I posterior n la hibri<lncion de la

soncln con ol alelo betas. Como consecuencia de la mutncion falc!

forme, el <luplo;i contl.ene un error de eparearJiento A-f, dentro

del sitio ~de I y no es restringido por Dde I.

!'igur.~. 43~ con t • .. con Dtle I, ·el producto 8n se dlaocia del AD'.l ¡;onomico y la su~

secuente digestion con Hinf I no tiene efecto. (B) Descripcion

Lle la di¡¡estlon con Dde I y f:inf I posterior a la h:lbridocion

de lu sonda con el alelo betas. Como consecuencia de la muta­

ción ralc-tfor::ie, el uuple:< contiene un error de apareaioionto A­

l.. dentro del sitio Dde I y no es restrineido por la entlonucle!!_

sa Dde I. Sin embargo, el sitio Hinf I permanece intacto y la

digestion con esta enzima e.euera un pro<luc to de <ligesU.on 3n:

Asi pues la presencia del alelo betaA se revela por ln libera­

cion <le un :ragmento en, mientras que la presencia del alelo

batos se revela por un fra:;;inento 3n (lJI¡).

145

. . . . .

de las oli~osondas radioactiy~s groc¡as a la digesti6~ secuen~ cial con Dde. I y Hinf· III, permite distinguii- entre los dos

alelos.· En un Índivtduo homocigoto para el alelo A de la

globina beta, la· -d1gesti6n con Dde I produce un octamero ra­

dioactivo (8 nt) a partir de la oligosonda. Debido a su peque­

ño tarnaño, el producto de restricci6n de 8 nt se disocia de

su ADN complementario la subsecuente digcsti6n con Hinf

111 no tiene ningun efecto. En el caso de homocigotos SS,

la digesti6n con Dde I no tiene efecto debido a la mutaci6n

falciforme, El sitio invariable Hinf III podra entonces ser

restringido, liberando un trimero radioactivo (3 nt). En

un heterocigoto AS, tanto el trimero como el octamero se pre­

sentan (fig. 44).

Haciendo uso de estas técnicas se puede determinar

el genotipo beta hemoglobinico de un individuo en menos de

10 horas usando 1 ug de ADN. Una exposici6n autorradiográfica

de 4 horas es suficiente para generar una señal fuerte 1

una exposici6n más prolongada (de aprox. 12 horas) da señales

detectables cuando la cantidad inicial de ADN es de 20 ng.

Ya que este mhodo incluye hibridaci6n liquida y la adici6n

secuencial de reactivos a un sólo tubo, es más sencillo de

realizar. que una transferencia Southcrn normal y su correspon­

diente hibridaci6n sobre nitrocelulosa. Todas las reacciones

previas e la electroforesis pueden ser automatizadas, lo cual

simplificarla aun mas la metodología.

En resumen, las modificaciones introducidas en los

dos protocolos descritos anteriormente ofrecen ventajas como:

(l) Detecci6n prenatal en una etapa gestacional mas temprana

y/o con menos liquido amniotico; (2) posibilidad de llevar

a cabo varios ensayos con la misma muestra de ADN¡ (3) no

requiere cultivo de amniocitos; (4) ahorro en reactivos

y tiempo de trabajo,

146

i..S SS

i:ucleotidoa

8

3

Figura 41¡, Deter1liinacion del genotlpo beta-globinico

en el AD:; huw1no n;ediante la tecnica de amplific.1cion

hibridacion en solucl.on,rtlstrlccion secuencial, y

resolucion en geles de poli&crila11tida. El genotipo de

los individ.uoe asta ; arriba de cada cnrril (134).

147

2.

,~'egun~,; ', metodoi'ogía para , la , detecci6n directa

de ·1as .. ,mu .. t-~ci·¿-ne~ en 109. ·ge·n·e·s .de·: l:a_s globinas supera muchas

·:de la·a ~:~i·m-ita·éione·a· que las metodOiogías· a1l"teriormentc ex pues-

~· .. ta$, ~~_nÚ>-· indirectas como directas·, padecen. A diferencia

-de ·-ott:ós tlícnica

[nétodos que emplean largos cDNA 1 s como sondas esta

hace uso de oligodcoxirribonucleotidos sintéticos

para este fin. Para asegurar que las oligosondas son de sufi­

ciente complejidad como para ser específicas de alelo, un

largo de mínimo de 19 nucleotidos es empleado para estas son­

das. Para cada sitio mutante un juego de sondas nonadecanu­

cleotidica~ es sintetizado, e incluye por lo menos un oligomcro

complementario a la secuencio g~nica normal y otro complemen­

tario a la secuencia mutada. Asf pués el AD~ de individuos

homocigotos para el gen normal hibridara sólo con la sonda

complementaria al gen normal y no lo har~ con la sonda especí­

fica para el alelo mutante; pa,ro un indivjduo homocigoto para

el alelo mutante ocurrirá exactamente lo contrario y sólo

el ADN de individuos heterocigotos,

y el normal, hibridará con ambas sondas.

daci6n se muestra en la tabla XVII.

para el alelo mutante

Este patr6n de hibri-

A continuaci6n se exponen los resultados obtenidos

,de la, aplicaci6n de estas técnicas al estudio de varias hemo~

globinopatías como:

Anemia Falciforme

La diferenciaci6n entre los genes de la globina beta

normal {beta A) , y la falcifo,rme (beta 5 ) fue el primer éxito

del us~.d~ lo~ oligonucleotidos sintlíticos como sondas diagnos­

ticas, (135, ,.136)~

TABLA l<V!I •• PBtron de hibridacion entre las oligoeondae

ee'Dflcificae ll8ra Bleloa normales o mutantes y el ADN ~

nomico. La noaitividad o negatividad de la hibridacion 11onda-ADN !le indica por loo aimboloe + y - reeneotiva-mente- ( 135)

GENOTIPO SONDA NOR/:10R unoNrrm '"""' Amm

Nonnal + + + - - -l!utante - - - + + +

149

... , -·-··- _._:_ -··- ·- --· --_· -Se ·sintet'izaron 'd'os non-~de~~~u~ie~-tido~··,- - u~·o d.e elios

pt?l- f ~c·t?m~-~-·te · · c~'mpl émeñ tario 'aÍ. :gen· ·de 18. _glob~-~a ~·et~> no~mal (beta~) y elotrocco~pleinentario al· alelo> falciforme {betas)

en.·la .regi6n qué ~odea a Ú mutacf6n falciforme (tabla XVIII)

L~ posici6n y tamafio de la secuencia oligon~cleotidica fu~ establecido en base a una serie de consideraciones:l) Se d~

cidio que el oligonucleotido tuviera 19 nucleotidos de largo

para que asi tuviera una alta probabilidad de reconcer solo

una secuencia dentro del ADN genomico (137); 2) la mutación

falciforme se situo en el centro de !a oligosonda para exacer­

bar· la inestabilidad termica de la hibridaci6n no complementa­

ria; 3) las secuencias sintetizadas no son complementarias

a las regiones correspondientes en los genes de las globinas A O¡ ,,.

E,'{, lf• o d (tabla XIX).

Se obtuvo ADN de individuos sanos

de heterocigotos portadores del gen de la globinu falciforme

(beta A /betas); y de homocigotos para el gen falciforme (betas/

betas). Se restringio el ADN (10 ug) con la endonucleasa

Bam 11!, con lo cual el extremo 5 1 del gen de la globina bela

(que porta la secuencia complementaria a las oligosondas)

queda en un fragmento de 1.8 Kb. Se encentro que las condicio­

nes adecuadas para que solo se produjeran hibridaciones cuando

la complementariedad entre la sonda y el gen fuera de 100%

eran: Hibridaci6n en Sauthern a 45°C en 0.9 M de iones Nn+

Y lavado del Southern a ssºc. Bajo estas condiciones estrictas

solo los duplex de ADN perfectamente complementarios son esta­

bles (135, 136) (fig. 45),

De esta mBnera la técnica de las oligosondas demostra­

ba ser igualmente Útil que el. ensayo con la cndonucleaso Mst

II ya que ambas técnicas requieren de una pequeña cantidad

de ADN, que .. pu~de ser··abtenida sin recurrir al cultivo celular,

150

Kb

(A) --(B) -- 1.8

Figura 45. Hibridncion do las sondas nonarlecanucleotidicas

(beta A y S) al ·AD:! genoinico humano. AD:; de individuos AA,

AS y SS fue di¡;erido con Bain HI y sometido a eloct1·oforruis,

transferido a papel de nitrocelulosa y: (A), hibridado a

la sonda beta A; (B), hibridado a la sonda beta S (135, 136)

TABLA XVIII. Secuencia nuo1eotidica de le.e son ae oligome­

rioae nara el gen norona1 de la globina beta (beta A) y del 11:en f'al,.tform" (h .. t~ S l (' :;G)

G a

beta A beta A 5'CT GAG GAG AAG TCT GC3•

beta A' 3•GA GGA CTC CTC TTC AGA CG5•

beta. S beta s 5•CT CCT Ja GAG A.AG TCT GC3•

beta. S' 3•GA GGA CAC CTC TTC AGA CG5•

A_..,.T

e ~t Ar (

'fA

TABLA XIX. Secuencia de lllllinoaoido11 7 del ADN d~ 1011 gene11

humano11 de la familia de la11 globinas beta-like, en la r~

~ion nue hibrida con las oli~oeondas, \135)

Brrore11 de apareamiento

152

betaA betas

5' Phe Thr Ala Glu Glu Lia Ala Ala Val 3' 2 3 T'I''I' AaT Ge! GAG GAG AAG OCT GCC G'I'C

l'he 'I'hr Glu Gli A11p Lis Ala Thr Ile 7 p T'I'C ACA GAG GAG GAC AAG GCT AC'I' ATC

Leu Thr Pro Glu Glu Lia Thr Ala Val l 2 CTG ACT CC'r GAG GAG AAG ACT GCT GTC

Leu Thr Pro Glu Glu Li11 Ser Ala Val o l CTG ACT CCT GAG "GAG AAG TCT GCC GU

'P" Leu Thr Pro Val Glu Li11 Ser Ala Val l o CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT cae GT'I'

161

-,tos col~ctados a partir de 20 ml de líquido amniótico de tres embar8"os en riesgo de padecer beta O

39 talasemia. El ADN

de los._ individuos adultos se digirió con Bam HI, se hibridÓ

con l~s oligosondas betaA y betaº 39 y los resultados obtenidos

fueron que lo sonda betaA hibridó sOlo con el fragmento de

1.8 Kb del ADN normal (AA), la sonda betaO 39

hibridÓ scilo

con el ADN de individuos betaO 39 -talasémicos (betaO 39 /beta0

39 ).Ambae sondes hibridaron con el ADN de individuos heteroci­

go~cis para beta O 39 talasemia (beta A/beta O 39 ). Al probarse

el ADN de los amniocitos se observo que en un caso ambas sondas

hibridaron con el fragmento de 1.8 Kb (fig. 49 carriles 1

y :1 1) indicando un genotipo de heterocigosis para betaº

39

talesemia; en los otros dos embarazos solo la sonda betaA

hibi-idÓ c·an el ADN, indicando que los fetos eran normales

(AA) (fig. '49 carriles 2,2', 3 y 3'). Estos resultados fueron

-~--~or~obor:-ados-, ·al nacer los productos, mediante estudios hemo­

glob{nfco~ (141).

Esto misma técnica se ha empleado despué's para estu­

dios masivos de parejas sardas que desean diegn6stico prenatal,

siendo de inter~s hacer notar que en estos estudios se usaron

oligosondas que eran ya un producto comercial registrado y

como tal fueron compradas al laboratorio fabricante (142).

De las 103 parejas comprendidas en estos estudios en 91.3%

de ellas ambos progenitores portaban la mutaci6n beta.O 39 ,

confirmando as! reportes previos sobre la incidencia de este

alelo en la ppblaci6n Sarda (143) y sugiriendo la posibilidad

de que el diagn6stico prenatal de beta talasemia en esta pobla­

ción puede ser logrado, en la mayoría de los cosos, rápida

Y facilmcnte con el uso de un solo par de oligosondas alelo

específicas.

La mutaci.6n betaivs-l llO es producida por el cambio

de un solo nucleÓtido (G-A) en la posici6n 110 del primer

2 3 ,. 2' :;•

Kb

--- 1.8

(A) ('.})

Figura 49. ADN de tres retos con riesgo de padecer beta 39

talasemia, restringido con Bam HI e hibridado con : (A) , sonda especifica para el gen normal de la globin.> beta ¡ (B), sonda especifica para el gen mutante beta-39 talasemico. Las muestras de ADll de cada reto astan por duplicado : 1 , 1'

2,2• / 3,3' (141 ).

CTGCCTATTGGTCTATTTT sonda normal (A)

162

betaIVS I-110 A sonda mutante (tal)

Figura 50. Sondas sinteticas preparadas para hibridaciones m_g leculares. El gen de globina beta esta ilustrado en la parte superior. Abajo, la secuencia de AD!: normal y la sustitucion 1oononucleotidica en el gen beta IVS I-110 comun entre los ha­bitan tes del ;.:edi torra neo, se muestra dentro del rectangulo (, 47).

intron (ivs .. l)':dei gen de lo globina beta (144). Esta sustitu­

ci~~ gener~-u~~ nueva. sefial de empalme que origina la forma­

ci6~ d·e·· u~', AR'Nm anormalmente procesado que es inestable "in

vivo"· (145)·; · Ya que algunos pocos ARNm normales son producidos .. +

este gen . prodüce un fenotipo de talasemia beta ( 144). El

grupo de Orkfo y cols. (146) ha estimado que alrededor de

dos·-. tercer·as partes de los genes beta+ talascmicos griegos

y un' tercia· de los italianos son de este tipo, y es por ello

que ellos mismos decidieron hacer uso de oligosondas alelo­

espedficas para el diagn6stico de esta enfermedad en indivi­

duos de estas iomtinidades (147);

Fueron sintetizados dos oligosondas nonadecanucleoti­

dicas una complementaria al gen normal de la globino beta

humana y la otra complementaria a la mutaci6n betaivs-l l lO

del mismo gen (fig. 50).

Se obtuvo ADN de individuos normales y de individuos

portadores del gen betaivs-l llO ya fuera en forma heterocigota

u homocigoto, se digirio con Bam HI e h!brido en condiciones

estrictas con los oligosondas sintetizadas. El ADN de indivi­

duos betaA/bctaA solo hl'brido con la sonda betaA; el ADN de

individuos bctoivs-l llO/betaivs-l llO solo hibrido con la

sonda betaivs-l 110 ; y el ADN de los heterocigotos hibrido

con ambas sondas demostrandose asi, la especificidad de cada

una de las sondas por la secuencia de ADN que le es 100% com­

plementaria, y con ello su valor diagnostico (fig. 51).

En los párrafos anteriores se ha expuesto que el

alelo beta talasemico mas comun en Cerdeña es el betaº 39

Y en Grecia e Italia lo es el alelo betaivs-l l IO, pero es

un hecho 4ue entre las diferentes poblaciones del área Medite­

rranea ha habido intermigraciones que han originado un 11 pool"

genico con características compartidas pero, que al mismo

(A) (B)

I~ A í•I l"I' p-ª¡·' f ~ F'~ ?:-' e>'f.J l·'

CEB Kb -- 1.3

Figura 51, AD:: de individuos con diferentes een.Q_

tipos para el ,;e1• ele la _;lolilM beta, dieerido

con !lam HI e hibriclado posterior.llonte con: (A),

sonda especifica para el gen normal de la globJ.

na ueta (beta A)¡ (B), sonda especifica para el

e;en de talasomin IVS I - 110 ( 147).

tiempo originan mayor variedad en los alelos-- presentes en

una -·comunidad determinada. Es por ello que surge 18·, i~terro­gante 'd_e_ con.-cua~ta's oligosondas .se requi~.re Canta~ para _esta­

·~·~~~t u~ p~og~~ma de diagn6stico __ prenata~ de~los hemoglobino­

palfa-~ ··e_n uria poblaci6rt en particular. PBra contestar a esta

frite~fóg-ilntC, en lo referente- al· área Mediterranea, Thein

y cols. (148) realizaron un estudi6 mediante oligosondas alelo­

espedfii:as- en el que hallaron que en la poblaci6n Chipriota

u,n áo% de los· genes beta-talasemicos eran del tipo betaivs-l -

l.lOJ"~Ya·- -mutaci6n beta O 39 no se hallo en ningun caso. En

los Italianos la mutaci6n betaivs-l llO se encentro en 22%

de los cromosomas beta-talascmicos la mutaci6n heteo 39

en 66% de ellos. Con base en estos resultados se han logrado

diagn6sticos completos (se refieren como diagn6sticos completos

cuando en ambos padres la mutaci6n puede ser identificada

medinnte las oligosondas) en 65% de familias Chipriotas usando la oligosonda para la mutaci6n betaivs-l llO y en 75% de fami­

lias Italianas usando las oligosondas para las mutaciones betaivs-l llO y betaº 39 (148, 149).

Beta Talisemias en Asia

Impulsados por una inquietud similar a la Thein

cols (148) descrita en el párrafo anterior, el grupo de

Kazasian y cols decidieron determinar el espectro de mutaciones

responsables de la betaº talasemia en China y el sureste de

Asia para hacer posible un programa de detecci6n directa de

los genes mutantes de globina beta en esta rcgi6n del mun­

do (150).

Mediante análisis de restricci6n del ADN y de hibrida­

ci6n con oligosondas alelo-específicas encontraron siete dife­

rentes mutaciones puntuales. De estos siete alelos beta-tala­

semicos, dos constituyen el 62% del total y otros dos constitu­

yen un 29%. Ya que solo cuatro alelos forman el 91% de los

genes beta .. níut~rii:e~, y eritre los· s:lete;,álelos. llegan ... al 96%

del .total ;de• genes betá,,-globinfr.of;, mut~ntes en ;~hipa el

. sureste: de Ásiií (talil~ XXII) eLdi~gno~Úco;'pre~~i:~l ;;; éstas

poblaciOnes sérh poslble 'mediant~ ·t&'c:niás. de de'tecci6n direc-

ta de l~ mu~aci6n p~n~'ual. .

El. grupo. de Saiki y cols ha publicado un protocolo

experimental ClSi) que hace uso de la amplificaci6n de regiones

esp~·c:t:ficas del ADN genomico total (ref. 134) y de oligosonda­

sal~~o.:.e_specíficas ·para la detecci6n de mutaciones puntuales.

Aunque el reporte original (151) esta aplicado a la detecci.6n

de.los alelos betas y betaC falciformes esta metodología puede

ser útil para la detccci6n de cualquier mutaci6n puntual para

la cual se pueda contar con oligosondas alelo-específicas.

Inicialmente, siguiendo la estrategia de ciclos

repetitivos de desnaturalizaci6n, alincaci6n cxtensi6n de

cebadores (expuesta en las pags, 142 y 1 41 de este escrito},

se amp! i fica un fragmento de 110 pares de bases del gen de

globina beta (partiendo hasta de 1 ng de ADN total), El ADN

amplificado, obtenido de individuos con cualquier

combin8ci6n de los alelos beta A, beta 5 y beta C, se

posible

dividio

en tres porciones que se aplicaron a cada uno de tres filtros

para hibridaci6n en punto (dot blot hybridization). Cada

uno de los filtros fueron hibridados con una de tres oligoson-

das alelo-específicas radioactivas (fig. 52). La autorradio-

grafía (fig. 53) muestra claramente que cada oligosonda hibrido

solo con aquellas muestras de ADN que contienen por lo menos

una copia de algun alelo de globina beta que le sea 100% com­

plementario.

3. Migraci6n Diferencial en Geles de Poliacrilamida

La desnaturalizaci6n diferencial del ADN, al migrar

electroforeticamente al travez de un gel desnaturalizante 1

TABLA XXII • Alsloe beta-tnl,.semico11 presentes en la po­

blacion de China y del aureete de Asia y frecuencia de lns mismos. (150)

MUrACION PORCENTAJE EN EL TOTAL

167

DE GENES BETA-TALASEMICOS

Ineercion 41-42

26"} .... '

62" 36" ivsII-654

Sin sentido 17 13" 91"

Codnn 2~ 16" ~ 9P"

Codon 29 4" iveI-5 1.5" Delecion 71-72 1.5"

beta - globina

5' 3' 5•----3• cebador (+) 19A

195 19C

CEBADORES Cebador (-) ACACAACTGTGTTCACTAGC Cebador (+) CAACTTCATCCACGTTCACC

SONDAS 19C CTCCTAAGGAGAAGTCTGC 19A CTCCTGAGGAGAAGTCTGC 195 CTCCTGTGGAGAAGTCTGC

3' cebador (-)

Figura 52. Secuencia de los cebadores y de las sondas y de

su relacion co11 el gen de la globina beta. Los dos cebado­

res, (+) y (-), son de 20 pares de bases de largo y son CO.!!!

plementarios a las hebr11s positiva y negativa del ADll res­

pectiva1nente. Las tres sondas, 19A, 195 y 19C, son de 19

pares de bases de largo y cubren del codon 4 al 17 del gen

e 151 >.

168

• AA

• • /J3

• SS

• • se

• ce

• • AC

19C 19s 19A

Figura 53. ADll someticlo a· ciclos de amplificacion

fue aplicado a filtros de nitrocelulosa para ser

expuestos despues a hibridacion con oligosonclas -

especificas de alelo (151).

169

170

es otro recurso ";para lá "detección de sustituciones de una

sola" base:"en el ADN (152). EN e"sta metodología, las moleculas

'de -:AON.:·.mu~·a·~t:~s-- y,. normales so~ s·epata-das mediante electrofore­

sis en geles de:" poliacrila,m"ida que tienen un gradiente de

""formamida "y, urea" (desn,aturalizantes del ADN). Los fragmentos

,de" ADN dú~lex "migran al i:raves de estos geles a una velocidad

pr~·POI'.'C_~a·ri~~ 8-. sii:_-:pes() mo_lecular hasta que alcanzan una regi6n

·d-e1 -g-el c .. Oil 'Uria ·con·centraci6n tal de desnaturalizantes que

ha~en :"q~e,"'~1 :duplé"x se desnaturalice. Cuando el ADN se des na-

. _ t~-~~l·~--~a .:~·:~;~u,. '.mayilid_ad e lec trof o ret i ca decrece a bruptamcn te.

"D~"tal,,for~a-~~e, la posici6n final del fragmento de ADN depen­

fei ~:d·é~'-~=: 5-b\~~tempE!ratu ra de des natural i zac i6n. La diferencia

er,_ -.-la te-iDPer~tura de desnaturalizaci6n entre dos fragmentos

qúe:' di-Íiel--~n ~-en un -solo nucleotido es suficiente para permitir

s·ú."Lse·p~ra~~.'.f6n -_e~ . el gel. Una mayor separaci6n es lograda

•" c"~ll" duplex"~ de ADff, que porten un error de apareamiento y en

ello se basaron Hyers y cols. (153) para elaborar un protocolo

ei~~riment~l destinado al "diegn6stico molecular de las hemoglo­

binopa tías.

El trabajo de Hyers y cols. (153) fue sobre cuatro

mu~acioncs b~ta-talasemicas, que ocurren en las posiciones

l,5,6""y !lo ílel primer intron (ivs-1) del gen de la globina

beta .humana. El esquema general del protocolo experimental

e~el siguiente (fig. 54).

---- -·_·,-,--- ---L8 --muestra de ADN geno mico total (se trabajo con

ci·n-co muestras de ADN: la primera de un individuo sano y de

la·s otras cuatro cada una tenia en forma heterocigotu una

de las cuatro mutaciones mencionadas en el párrafo anterior)

se restringe con las enzimas Bam HI y Neo I (que cortan fuera

de la secuencia mutante de interés), se desnaturaliza por

calentamiento a ebullici6n y se mezcla con un exceso de 6,400

veces de sonda para el gen de beta globina humana normal.

171

3. 5' _____ ,.. Exon I

t Neo I l Ba! HI

restricclon con Neo I y Bam HI

".:'""'"Lll~ ~

1 Deenaturalizacion oor calenta­

~ miento a ebullicion

1~y ADN de una sola hebra

l)Adicion de sonda especifica del gen normal, en exceso de 6,400 veces 2)Hibridacion en medio liauido 3)Digeetion de sonda no hibridJi da y de ADN de una sola hebra con nucleasa Sl 4)Restriccion con Hae III

-A------ ADN genomico sonda radioaotiva -v

lfeteroduclex con un malaparenmiento

l l)Bleotroforeeie en p:P.l de col.! acrilamida con gradiente dHn.1-tural i!:ante. 2)Autorradiografia

~igracion diferencial entre

el homoduolex y el hetero~

duclex.

Pig •. 54 Diagrama eequematioo de la eat~ategia de Myere y oole. cara distinguir genes mutantes de silvestres, P~ ra explicacion leer el texto.(152)

172

,_. ..

Se permite ·1'a h.ibrÍdacicSn en medio·,líquido y. se agrega nu.cleasa

Sl. para··,remov.e~:: p·~~'. hÚrolisis ii. la ... sonda que :no .híbrido y

a todo et ADN :de .una cade.na. El ADN duplex se· restringe con

Hoe IiI, q~·e s'~.;er~ ~n tragmen to de ADN duplex de 272 pares

de bases 'que :.~ontfene ,al primer intron del gen de globina

betá. E.st~, fragmeñ'to de ADN es sometido a electroforesis

en u~.gel de·polia~iialmida con un gradiente de desnoturalizan­

tes_··Y-- m~d~ante-. autorradiografía se evidencian los resultados.

Com'o se muestra en la figura 55 1 cada uno de los

hete.rod_up.lex_· (duplex de ADN que contienen un error de aparea­

miento) ... ' claramente se separa del homoduplex de ADN (duplex

de ADN 100% complementario) cuando se someten a la electrofore­

sis en el gel desnaturalizant.e (carriles 1-5 de la fig, 55),

En e~tos casos la separaci6n entr~· los homoduplex y los hetero­

duplcx vario dé uno a cuatro centímetros 1 dependiendo de el

tipo de mutaci6n. Estos resultados indican la posibilidad

de determinar sin ambigÜedades el genotipo hemoglobinico de

un sujeto haciendo uso de una sola sonda (la específica para

el gen normal) y no de varias como lo requiere la hi bridaci6n

con oligosondas alelo-específicas. Desafortunadamente en

el mismo reporte se hace notar que en algunas otras mutaciones

estudiadas no se observo diferencia en la migración entre

los hamo y heteroduplex. Este comportamiento puede ser debido

a que algunas mutaciones se localizan en sitios que no alcanzan

e desnaturalizarse bajo las condiciones empleadas.

Parte de la solución a la limitación de esta metodolo­

gía podría ser la técnica recientemente reportada por Novack

Y cols. para detectar malapnreamientos únicos en el ADN ( 154)

Y que hace uso de la rcacci6n, descrita por

(155, 156.), entre bases malapareadas el

clohcxil-3- (2-(4-(4-metil) morfolin) etil)

aquí en adelante referida como carboiimida):

Lebowitz y cols. reactivo -ci­

car bo iimi da (de

173

LB-: c1frb.oii-M{da ·reaccJona ,--: formaódo estructuras cova­

lentes 1 e~~ _r~~~~du_~-~ de gu~ni11dat_os Y timidilatos no aparcados

en el 'ADN··superh.eÚcoidal sin .afectar a los bases de Watson

Crick intac'tas·· (fig. 51\). Novack y cola. (154) encontraron

que·· s1.'·\1 ,u~ _h~-ter~dupl·ex, de ·hasta 1,500 pares de bases, con

un sOlo- malapa'reamiento en que interviniera timina o guanina,

se ie hace-_-reaccfonar con la carboiimida yse le somete a elec­

troforesis a través de un gel de poliacrilamida al 15%, su

corrimiento es claramente menor (aproximadamente 10%) que

el que muestra el homoduplex, el cual por ser 100% complementa­

rio no reacciona con la carboiimida. Esta técnica promete

se~-6til para la asignaci6n de genotipos hemoglohÍnicos necesa­

rios para el diagn6stico prenatal diferencial.

lfonnal ivsI,l ivsI,6 ivsL,110 ivsI,5

.JL

e D

A

Fig, 55 AutorraCliografia de la electroforesis, en ~el~e de noliacrilamida con gradiente deenaturalizan­te, de muestras de ADN; mutante (carriles 2-4) y nor­mal (carril 1), hibridado con una sonda esoecifica pa­ra el nrimer intron (iveI) del gen de globina beta, A, migracion del homodunlex entre el ADN normal y la sonda; B,C,D, y E, migracion diferencial de loe heterci. dunlex entre cada uno de loe alelos beta talaeemioos y la Bonda, ( 152)

Formula estructural de la ciclohexil-3(2-(4-

(4-metill morfolin) etil) carbodiimida y de su nroduo_

to de reaccion con uracilo, Una reaccion similar, en

el sitio imino, ocurre con la timina y la guaniná!155,156)

V. COMENTARIOS Y PERSPECTIVAS

1.75

La tecnologfa del .-ADN. nos ha proporci.onado un cuadro

bestailtC 'comj>let~ ·de. las .. ml":t.a¿iOnes· que dan lugar a las hemo­

globinopatías y Síndrom~s Talasémicos, asimismo han permitido

el diseño de métodos para el an&lisis directo del ADN y con

ello \.in · d·iagn.ósi:ico y consejo prenatal cada vez más seguro

y confiable; Ademtls estos estudios han arrojado luz sobre

la CV01uci6Íl''.1de -los -genes normales y mutantes y, en un futuro

esper . .snzador_a·men te cercano• tal vez permitan la corrccci6n

defiiitiva de los defectos génicos,-

La ürupcibn de la genética molecular en apoyo de

la ge.rihica cllnica, médica y de poblaciones no se ha dado

8610· .. ·en er estudio de los genes glob:lnicos, su evolución,

naturaleza 1 diagnóstico y tratamiento de sus mutaciones 1 sino

que .ha _encontrado aplicaciones sobre otras varias entidades

(véase tabla XXIII), De ésta manera, los métodos y técnicas

de 18_ genética molecular dejan de ser exquiciteces de la biotec-

_nologia para, eventualmente, convertirse en técnicas rutina­

rias de anblisis y diagn6stico cllnico.

Uno de los principales impedimentos para emplear

como diagn6stico rutinario a las técnicas descritas en el

segundo capítulo de esta tesis, es el uso que hacen de isoto­

pos radioactivos. El manejo de los radioisotopos conlleva

una serie de requerimientos y limitantes que impiden, de ini­

cio, su uso rutinario masivo: Elevado riesgo biológico

para el personal, necesidad de instalaciones y/o equipo espe­

cial para su manipulaci6n, alto costo ccon6mico y una corta

vida Útil (lo que implica que las sondas marcadas no pueden

almacenarse para su uso posterior sino que deben prepararse

cada vez que se necesiten).

En un intento para desarrollar métodos para el mar­

caje de sondas, que no presentase.las desventajas del radiomar-

ABLA :;xr:r. EnferMdadea CU)'O diagnostico H posibilita 7/0 faci

Enfermedad

Halaria (.f, felCipN'llll)

P'.lbroeie c¡uiatica

Ciertos tW10rea

renilcetonuria

Policiatoeis renil

Distrofia auHula de Duchenne

Distrofia muscular de Becker

SindroM de Don

Lipopatiae

Tranetornos aentalee

HHofilia

Diabetea

Citrullnolda

Kal de Huntington

Referencia

(157)

( 158)

(159,160,1G1)

(162)

(163)

(164, 1G5)

(166)

(167)

(168)

(lG9, 170)

( 171)

( 172., 73)

(174)

(175)

177

ceje pero que al mismo tiempo fuera de alta sensibilidad y

gn!n e"specificidad, Langer y col s. (176) han sintetizado nu­

c1"6tidos biotinilados (unidos a vitamina 11 = Biotina) que

siiye~ para marcar sondas ya que han demostrado ser sustratos

"adecuados para las ARN y ADN polimerasas, además de que los

pol;t.ni.tcle6tidos biotinilados resultantes muestran una cinéti­

:ca __ de -_reasociaci6n similar a la de los polímeros sin biotina

y de esta manera representan sondas génicas funcionales (176).

El mbtodo para la detecci6n de los duplex de hibrida­

ci6n de estas sondas biotinilados se basa en la gran afinidad

que, por la biotina, tiene la glucoproteína Avidina. La Avi­

"dina, proteína de la clara del huevo y con un P.M. de 68 000

d, posee una elevada constante de uni6n a la biotina

(Kdis 11:1 l0- 15 ). De esta manera, si a la Avidino se le acoplan

las moléculas indicadoras apropiadas (fluorocromos, proteínas

electrondensas 1 enzimas o anticuerpos) es posible detectar

cantidades diminutas de las sondas biotiniladas, como lo de­

muestra la técnica reportada por Lcary cols. (177), que

emplea polímeros de fosfatasa alcalina unidos a Avidina

que es de 20 a 50 veces mas sensible que las técnicas repor­

tadas previamente para este sistema, siendo posible el detec­

tar secuencias génicas presentes en una sola copia por gcno­

mio. El marcaje de sondas oligonucleotídicas con biotina

y su uso en el diagn6stico de enfermedades genéticas ya ha

demostrado su factibilidad (178).

De este modo volvemos a comprobar que los escollos

se van allanando y que cada vez esta mas cerca el momento

de que las técnicas de la genética molecular sean un aliado

práctico en el laboratorio de diagn6stico y consejo genético.

Ahora bien lSon todas bondades en el desorrol lo del

diagn6stico genético? Tc6ricamcnte 1 lo detecci6n de "genes

malos" dentro de .. la pob~aci6n humana y, con ello, la posibili­

dad.de .. su···elillltn~ci6n 'del. bagage genético humano estada evi­

tan~o ··~1:-q·ue i'as ··gener~CiOnes futuras heredasen estas mutacio­

~es··: y '·á los p·adeé.illlientos a que dan lugar. Sin embargo esta

·.n.e~~ug·é~Oe~·J~ h.~: P_!'ovoC~do ·profundos cucstionamientos del"!tro

de.los;;álllbitos cieritificos, jurídico, laboral y civil (175,

in'idalmenté, .el ~xamencleÍ ge~oini~ de los individuos

·~esta- dirigido -a: - 1): La dete~~i6n: tenipr~-na.de anomalías enzi­

·m.&.·t."i·~~S: ~u~--p~rmita poner .~n. m··arC.h-0: un tra.tamiento que garanti­

c:e-_.el desrirrollo normal.de_! niño (P• ej. 1 en la fenilcetonuria,

_ leuCini:lsis, galactosemia, homocistenuria, histidinemia, etc.)¡

2). La detécci6n precoz en útero de anomalías graves del feto

que permita considerar la posibilidad de un o borto terapéuti­

co lo mas temprano posible (p. ej., homocigosis para talase­

mias y/o hemoglobinopatías, graves trastornos ncurofisiol6gi­

cos, etc.); 3) La dctecci6n de los individuos mas suscepti­

bles a sustancias dañinas, que sería la forma mas elevada

de la toxicología preventiva (p. cj., se ha sugerido que los

individuos con deficiencia de la antitripsina-alfa-1, que

predispone a transtornos pulmonares, deben ser excluidos de

trabajos que los expongan a polvos de asbesto o algod6n).

Sin embargo, la pregunta que surge ahora es lHasta d6nde llega­

rá la "selccci6n" de los genes? Si bien es cierto que exis­

ten, y se conocen, genes susceptibles de causar condiciones

adversas graves bien caracterizadas, también es cierto que

existen corrientes de pensadores, con muchos seguidores,

que estnn convencidos de que la herencia cromos6mica es el

factor más importante en el Coeficiente de Inteligencia (CI)

de los individuos. Conceptos como el anterior sugieren que

la caza de 11 genes deletereos 11 podría alcanzar proporciones

desmesuradas y llegar a ser absolutamente despiadada.

179

Por 'otro lado, los efecfos. sociÚes· del diagn6stico

genético no son despreciables •.. El· caso. del dfagn6stico precoz

de la ariemia falciforme es Útil ,para ilustrar el fen6meno

de la•dis¿rimina~i6n genéti2a. Eri l~s,Estados Unidos de Nor­

teamérica'¡ donde uno de cada l} indivlduoa negros es portador

d.el gene. falciforme (42); se de'stinarori en 1972, 115 millones

de•· d6lares a la lucha coritra dicha ·:enfermedad. Como era 16gi­

co, se hizo hincapié en el papel de ·la prevenci6n y en la

ne~·es:i:dad'~.'d~· .'Una bu~na ·.infoi-maci6n. Una vez advertidos, los " : : :. : -.ce _ -;~ -·--,-:-- ; O··-:.. _:: -

-p00,.r_ta·4~_re°'s_ :;d_el "mal" gen podrían actuar con mas cautela (pues-

--'--·o"to -,q_u~~::·da~'.-:P8:dre-s ··heterocigotos, pOr supuesto, corren el riesgo

~-:de·.~erier Un hijo homocigoto y, por tonto, enfermo).

--~~~r puras que fueran las intenciones iniciales, resul­

pronto que no todas eran ventajas para los negros.

SC· produjo en primer lugar una "culpabilizaci6n". En efecto,

!Ocluso los sujetos sanos se sint icron "anorinal esu al saber­

se portadores del gen defectuoso y sobre todo. fueron percibi­

dos como tales en su vida social; pues era fácil confundir

un individuo "enfermo'' con otro ''portador de un gen pat6geno''.

El resultado concreto fue que hubo negros con buena salud

que tuvieron que pagar p6lizas de seguros mas caras. Seis

compañías de aviaci6n decidieron no transportar esta categoría

de negros (179). Fueron apareciendo poco a poco formas de

segregaci6n no previstas por los promotores del diagn6stico

genético. Uno de los efectos mas espectaculares se manifest6

en el campo del empleo. Con el transcurrir de los meses y

los años el problema de la adaptaci6n a las condiciones de

trabajo se plante6 en unas formas cada vez más precisas.

Aunque totalmente aptos, los heterocigotos están un poco an6mi­

cos; parecia pues "racionnl 11 desde el punto de vista médico

el no admitirlos en trabajos que implicaran un contacto con

compuestos nitrogenados y aminados. Se desencaden6 asi un

proceso de selecci6n genética con consecuencias directas sobre

130

los empleos· de los negros. Aunque es imposible prever todas

las repercusiones del asunto es evidente que suscita problemas

tanto morales como juridicos. Asl. en 1980, un joven negro

peleb contra una reglamentacibn de la U.S. Air Force que le

prohibla emprender la carrera de piloto por ser portador del

gen de la anemia falciforme. Algunos meses mas tarde, lo

Air Force suprimi6 dicho reglamento, 'que habia estado vigen­

te durante diez años (179).

De la misma , manera, surge la posi,bilidad de ,que, a

inÚviduos con genes que 'les predispon'en a la opad«ún 'de

transtornos e edades maduras (p. e/. 1 -.Corea 4e .Huntington,

canccr·, Alzheimer) se

educacibn ,del estado,

les nieguen beneficios- -~so~ial:eS··· ~~mo .

becas, etc. ~i~~ .. ~-.-~~-t~-éna~-1'¿-~J~·.'-:~·iabo-r:~l--es pee ializado por considerar

la inversi6n en su formaci6n.

que ·su

Con forme el diagnbstico genético 'deja el, can¡po,' de

lo hipotctico para pasar al de la ré'fllidad cotidiana. es C.1a~ó que las cuestiones planteadas anteriormente, y otras ·que _-8:.Cin'

no se han contemplado', deberán ser encarada$, y pronto.

VI. CONCLUSIONES

1. L_a~ tAcn.:1:.ca.s '.>.~-~~~ ::~·Se~-~··.~.i~-~-·, .. m_O~e~-~-~ar_: se_ revelan, hasta la fechá;· como.'1a '.m~todcilogía< m6s c~nfiable, segura

y precoz para el .iÍ:á~~6~ÚÚ de\85- he~ÓgloliiilopatÍas y .talase-

mias.- --i-·:: ·\;r:. -,.;:;" .·_·_-.'~:~_~, :;::,_._;_~~.~· ·:·-,,;.,·. ~

. ," :" /.:/ -:·;:;:_c.:.:·/·;:_.·.;,~--;_··.·. ·.:•;·'.~­

La_• !'plicád6n ~ut.inaria y~inasiva de estas técnicas

._se -~~ _ ~.re~~-d-~}(~~~-~d~:~r-al ·\·reqÜérimicnto de ·material, equipo

y. re'8ctivos·::-co·stos0:S:·y-:··sofisticados, ~orno_ te_mbié'n de personal

al ta~en d~··. ~~-~·e'éi~11·z:~d~--.

,-3·~~Los~recientes avances en la estandarizaci6n comer­

cial de estas técnicas así como el diseño y realizaci6n de

sondas génicas no radioactivas, adelantan la fecha en que

estas pruebas pasen a formar parte de la rutina en· laboratorios

clínicos de las zonas con al ta incidencia de hemoglobinopa­

tías y talasemias.

4. Estas técnicas pueden facilitar el desarrollo

de modelos experimentales para el estudio, diagn6stico, prevcn­

ci6n y tratamiento de patologías, con bases moleculares genéti­

cas, comunes en nuestro país.

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