MICROBIOLOGIAOalmanaqueCaractersticasprincipaisdavidacelular1.MetabolismoInteracesentreaclulaeoambiente.2.Reproduo (crescimento) AsSubstncias qumicas do ambienteso transformadas em novasclulas, atravs das clulas jexistentes.3.Diferenciao * Formao deuma estrutura celular quenormalmente faz parte do ciclo davida(ex.:esporo).*DiferenciaoeMovimentonoso propriedades comuns a todososmicrorganismos.4.Comunicao As clulascomunicameinteragematravsdequmicos que so libertados ouapanhados.5.Movimento * Os organismosvivos so capazes de semovimentarematravsdeflagelos.6.Evoluo As clulas tm genes eevoluem de forma a adquiriremnovas propriedades biolgicas. Asrvores filogenticas mostram aevoluoentreasclulas.DesignaodosMicrorganismosEx.PseudomonasputidaIST21EstirpeGneroEspcie(Itlicoousublinhado)Pseudomonassp.vriasespciesObjectivodaMicrobiologiaEntenderomodocomoosmicrorganismosfuncionam,demodoa:Explorarosaspectosbenficossuaactividade;Prevenir/evitarosaspectosnegativos. 2TcnicasBsicasdaMicrobiologiaPreparaodemeiosdeculturaAcomposiodeummeiodeculturadependedaespciequesepretendecultivar.Macronutrientes:Carbono(~50%) 3Oxignio(~20%)Azoto(~14%)Hidrognio(~8%)Fsforo(~3%)Enxofre(~1%)PotssioMagnsioSdioClcioFerroMicronutrientes:CrmioCobaltoCobreElementosessenciaisMangansMolibdnioNiquelSelnioTungstnioVandioZincoFerroVitaminasfactoresdecrescimentoessenciais.Meiosdeculturasintticosoudefinidoscomposioqumicaconhecida.Meiosdeculturacomplexoscomposioexactadesconhecida.TmalgunsingredientescomoPeptonas(fontedecarbono,deenergiaedeazoto),ExtractodeLevedura(fontedevitaminas,carbono,azotoeminerais),ExtractodeCarne,etc.MeioSelectivosuprimeocrescimentodedeterminadosorganismosembenefciodeoutros.MeioDiferencialpermitedistinguirmicrorganismoscombasenacapacidadedemetabolizarcomponentesespecficospresentesnomeiodeculturae/ounamorfologiadasclulas.Permite,porvezes,aidentificaodemicrorganismoscombasenassuascaractersticasbiolgicas.IsolamentodeculturaspurasTcnicadeRiscadoemmeioslido TcnicadeEspalhamentoemmeioslidoColniaCulturapuradeummicrorganismo.CulturapuraCulturadeclulasgenticaemorfologicamenteidnticas.Morfologia de colnias depende do microrganismo, mas tambm pode dependerdas condies ambientai, tais como, quantidade de oxignio, nutrientes disponveis,etc.PostuladosdeKoch(primeirocientistaadefinircultura pura e a isolar colnias de bactrias emmeiosdeculturaslidos):1.O organismo patognico suspeito deviaestarpresenteemtodososanimaisdoenteseausentenosanimaissaudveis;2.O organismo suspeito era cultivado emculturapura;3.Clulas de uma cultura pura do organismosuspeito deviam provocar a doena noanimalsaudvel;4.O organismo voltava a ser isolado emostravasequeeraigualaooriginal. 4IsolamentodecolniaseenumeraodeUnidadesFormadorasdeColnias(UFC)Passo1.Diluiessucessivas.Passo2.Transferir0,1mLdecadaumadasdiluiesparaasplacasdeagar.Passo3.EsterilizaravaretadevidroemLeespalharaamostranasuperfciedoagar.Passo4.Incubar.Passo5.Contarascolniasdasplacasquecontenham20300colnias. 5Cultura de enriquecimento Isolamento de microrganismos pouco abundantes e comrequerimentosnutricionaisespecficos,apartirdepopulaesmistas.103102104Ncolniasx10x(diluio)1UFC/mldesuspenso(A)Ncolniasx103x(diluio)1UFC/100mldesuspensodesolo/10g 6isolamentodecolniasemmeioslido.esentes nos ambientes naturais soultivveisemmeiosdeculturalaboratoriaisconhecidos.icrorganismos nocultivveis nos meios de culturaboratpendentes do cultivo) paraProcuradenovasfrmulasparacultivodemicrorganismos.Tcnicasdeasspsiaedeesterilizao Este iz laboratrio: co eficiente e aplicado apenas a materialCalorh bactrias, poistesaocalor.rfcies)es)filtrao:(highefficiencyparticulateairfilters)Usadosuxolaminardeseguranabiolgica;Salaslimpas.anutenodeclulasviveisnolaboratriono de clulas viveis, noconsdePetricontendomeioslido(diasousemanas); Emarcascongeladoras(70oC);Crescimentoemmeiosdeculturaselectivos1enriquecimentoemmeiolquido;2Limitaesdastcnicasdeisolamentodecolnias Apenas 110% dos microrganismos funcionais prcExplorao das potencialidades dos mla oriaisconhecidos Desenvolvimento de mtodos moleculares (no depesquisaeidentificao(ex.:AnlisedeDNA,RNA,protenas); ril aonoCalor: Calor seco em estufa (pouresistenteaaltastemperaturas); mido(vapordeguasaturado)naautoclave. A esterilizao na autoclave feita a 121C durante pelo menos15minutos para assegurar a destrruio dos endsporos dasestassoasestruturasbiolgicasmaisresistenRadiaoultravioleta(limitadaasupeFiltrao(aplicadaalquidosegasEsterilizaodoarporMscarascirurgicas;Rolhasdealgodonosfrascosparacultivarmicrorganismos;FiltrosHEPAem:CmarasdeflM Metodologias que permitem a manutetaminadaseinalteradasnassuaspropriedades:EmrampasouplacaCongelao(anos)Emazotolquido(196oC);Liofilizaodesidrataodasclulasporsublimaodeguacongelada,sobvcuo(anos,dcadas)MicroscopiaTcnicasMicroscpicasPoderdeResoluodoMicroscpiopticocompostoDistnciamnimaentredoisobjectos.QuantomenosodmaioropoderderesoluoAbertura angularndicederefracodomeioentrealminadevidroealentedaobjectiva=1Ar=1,52vidro;leodeimersoComprimentodeondadaluzqueincidenoobjetoVriosTiposdeMicroscpiopticoComposto:MicroscpiodecampoclaroMicroscpiodecampoescuro 7MicroscpiodecontrastedefaseMicroscpiodecontrastedeinterferncia Maiorcontrastediferencial(DIC)MicroscpiodefluorescnciaCampoClaro Campodecontrastedefase Campoescuro SaccharomycescerevisaeLuzvisvelIdealparaobservarclulascoradasIdealparaobservarclulasvivas,nocoradasBaixocontraste MelhorcontrasteMelhorcontrastequecampoclaroContrastedefaseContrastedeinterfernciadiferencialParameciumImagemtridimensionalcoloridaMelhorresoluoquecontrastedefaseExcelenteparaobservarclulasvivasMicroscpiodeFluorescnciaExpeoobjectoaradiaoultravioleta,violetaouazul;Aplicaes: Visualizao de clulas (coradas com fluorocromosouautofluorescentes); Distinoentreclulasviveis/activasemortas;Giardiasp.Diagnstico rpido de microrganismos especficos emamostrasclnicas,ambientais,alimentares,etc.Exemplo.Imunofluorescncia O anticorpo combinado comfluorocromo; 8O anticorpo combinado adicionado s clulas fixadassobre uma lmina e ligase aosantignios do microrgansimoquesepretendedetectar; 9As clulas s quais o anticorpo se ligou fluorescem depois de serem sujeitas aradiao. Os anticorpos so molculas produzidas por um animal infectado (respostaimunitria) e que tm a capacidade de se ligar aos antigneos que induziram a suaproduo.Microscpioconfocaldelaser:Usaluzemitidaporlaserparailuminarumplanodoobjectodecadavez;Clulassocoradascomfluorocromo;Imagembidimensionaloutridimensional;Aplicaes:Anlisedecamadasdemicrorganismosembiofilmes;Anlisedocontedomicrobianodeamostrasexpessas,emprofundidade;Ecologiamicrobiana.Coloraodepreparaesdeclulas:Aumentaocontrastedasclulasouestruturassubcelulares;Acentuacaractersticasmorfolgicasespecficas;Preservapreparaes;Facilitadiagnsticodemicrorganismosespecficos(ex.:ColoraodeGram); PassosPrincipais:1.FixaoFixaoqumica(preservaestruturasubcelularfina)Fixaoporacodocalor2.TratamentodapreparaocomcorantesColoraosimples Colorao diferencial (mais do que um corante) divide microrganismos em gruposcombasenasuacolorao(ex.:ColoraodeGram);ColoraodeestruturasespecficasMicroscpioelectrnicodetransmisso:usaumfeixedeelectres;permiteresolverestruturasmaispequenasqueomicroscpioptico;imagembidimensional;Aplicao:observaodevirus;observaodaultraestruturainternadeclulasdotipoeucariticoeprocaritico;preparaodaamostracomplexaemorosa. 10Microscpioelectrnicodevarrimento:usaelectresreflectidospelasuperfciedoobjectoparaformaraimagem;imagemtridimensional;observao de caractersticas da superfcie de clulas e virus e estrutura de colnias,directamentenasuperfciedetecidos,etc. ImpactodosMicrorganismosnoambienteenasactividadeshumanasPrincipaisrazessubjacentesdiminuiodaincidnciadedoenasinfecciosas:Melhor compreenso dos agentes microbianos causadores de doena e dos processos detransmissoedesenvolvimento;Melhoramentodasprticassanitrias;Descobertaeusodeagentesantimicrobianos;Descobertaeusodevacinas.ModeloscelularesutilizadosemInvestigaoBsica:ProcessosBiolgicos ModelosDNAcomoasubstnciagenticaMecanismodaexpressogenticaBatriasevrusCdigoGenticoViasmetablicasessenciaisEnzimasderestrioBactriasTranscriptasereversa vrusMecanismosderesistnciaamultiplasdrogas BactriasefungosActividadesbenficasnosAmbientesNaturaisMicroflora natural competem com microrganismos patognicos e produzemalgunsnutrientesparaoorganismohospedeiro; MicrofloranaturalnoserhumanoBarreiradedefesacontramicrorganismospatognicos;Participaonanutrio. Umdesequilbrionafloramicrobiananaturalpodecausarinfecesedoenas. Bactriasdapele:eliminampelemorta; 11impedemainvasoporbactriaspatognicas. Osmicrorganismosdaepidermevariamcom:Modificaodascondiesmeteorolgicas;Exposioluzsolar;Usodecosmticos;Higienepessoal.Decomposiodematriaorgnicamortareciclagemdenutrientesnabiosfera;Reciclagemdenutrientesinorgnicos;Fertilidadedosolo(fixaodeazoto,nitrificao)algumasbactriasfixamoN2atmosfrico e convertemno em NH3 para ser utilizado pelas plantas. OutrastransformamNH3emnitrato;Sobrevivnciadogadoeoutrosruminantesdigestodacelulose;Controlodepestesbiopesticidasmicrobianosnaturais;Basedascadeiasalimentareseciclosdenutrientesaquticoseterrestres;Produodeoxigniomicrorganismosfotossintticosaquticos;Destruiodecompostostxicosbiodegradaodecompostostxicosnaturaiseartificiais;AlimentosProduodebebidasfermentadas;Produodealimentos;Conservaodealimentoscidolctico,cidoactico,bacteriocinas,etc;Aditivos Probiticos Microrganismos ou substncias por eles sintetizadas quepromovemasadeeocrescimento(Lactobacillussp.)Energia/AmbienteProduodemetanol/biocombustvel;Produodeetanol/combustvel,solventeindustrial;Biorremediao despoluio de solos e ambientes aquticos/marinhos,biodegradaodehidrocarbonetosdopetrleo,pesticidas,solventes;Tratamentobiolgicodeesgotoseguasresiduais;Recuperao/lexiviaodeminriosBiotecnologiaProduo de Antibiticos muitos microrganismos sintetizam compostosqumicosqueimpedemocrescimentodeoutrosmicrorganismospatognicos;Produodeoutrosprodutosfarmacuticospormicrorganismosgeneticamentemanipulados;Produodeenzimas,vitaminas,aminocidos,bioinsecticidas,etc.;AlgumasBactriasfamosas(Procariotas)Escherichiacoli(bactrianaturaldointestino);Cianobactria(fotossnteseoxignica);Pseudomonassp.(biodegraodecompostosorgnicospoluentesnoambiente);Bacillusanthracis(ANTRAX);Lactobacillusacidophilus(fermentolcteodoiogurte);Staphylococcusaureus(patogneohumano)Algunsfungosfamosos(Eucariotas)Saccharomycescerevisiae(leveduradopoedacerveja);Cogumelos;Fungofilamentoso(oubolor)Algunsfungosfamosos(Eucariotas)Papel:sopredadoresdebactrias;decompositoresdematriaorgnica;parasitasemanimais;agentes causadores de doenasintestinais.Exemplos:GiardialambliaParameciumsp.AmoebaAlgumasmicroalgasFamosas(Eucariotas)Papel: base da cadeias cadeias alimentaresaquticasemarinhas;oxigenaodoAmbiente; responsveis por eutrofizao(proliferao excessiva de algas o que levaaumaumentodemicrorganismos);sntesetoxinas;produodecarotenides.Exemplos:SpirogyraVolvoxChlorella Diatomceas (indicadores da qualidadedaguapresenadepoluio) 12IntroduoclassificaodemicrorganismosSistemados5Reinos 13Interpretaodarvorefilogenticauniversal Aspectosevolutivosreveladosporestaabordagem:As espcies dos domnios Bacteria, Archaea e Eukarya divergiram de um organismoancestralnoinciodahistriadaTerra;Os microrganismos procariotas evoluiram separadamente formando os domniosBacteriaeArchaea;Espcies do domnio Archaea esto mais prximas filogeneticamente dos eucariotasdoquedeespciesdeBacteria;Clulas eucariticas contm genes dos domnios Eukarya e Bacteria. A sequenciaodo rRNA das mitocndrias e cloroplastos revelou que eles derivam de linhagensespecficasdeclulasdotipoBacteria, queoutrorateroestabelecidoendosimbiosesestveis com outras clulas e evoluido formando clulas do tipo eucaritico (TeoriaEndossimbitica). Seresvivosdivididosportrsdomnios:Eukarya:Microrganismos:protozorios,microalgas,fungos;Organismossuperiores:animais,plantas,algasmulticelulares;Archaea:Maiorpartedasbactriasextremfilas;Bactriasprodutorasdegsmetano.BacteriaTodasasoutrasbactrias. 14MicrorganismosProcariotasFormasetamanhosdasclulasdotipoprocariticoClulasprocaritica Paredecelulardeprocariotasextruturarigidasituadaexternamentemembranaplasmtica.Temcomofunes:Darformaeintegridadeclula;Protegeracluladaliseosmtica;Contribuirparaapatogenicidadedealgumasbactrias;Protegeracluladesubstnciastxicas.AparedecelulareaprotecoosmticaOsmose:movimentodeguaatravsdeumamembranaselectivamentepermevel,desoluesdiludasparamaisconcentradas. 15Asclulasestogeralmenteemsolueshipotnicas:[soluto]foradaclulaquantomaispequena(gua,etanol,gases)e/oulipossolvel(hidrocarbonetos(dopetrleo),compostosaromticos,compostosorganoclorados(pesticidas,solventesorgnicos))foramolcula,maisfacilmenteentra;oAlipossolubilidadedosolutopodeseravaliadacombasenamediaodocoeficientedepartionoctanol/gua(KOWouP):Ovalordestecoeficienteumamedidadabiodisponibilidadedeumcompostoparaosorganismosexpostosaessecomposto:permitepreveracapacidadedebioconcentraoebioacumulaodoscompostosemclulasdetecidosdeanimaisoudeplantas=>determinaograudetoxicidadedocompostoCoeficiente de Hansch = log P = log ([X]fase octanol)/[X]fase aquosa) 302.Transportemediado/catalizadoporprotenastransportadorasoupermeasesou"carriers"2.1.Difusofacilitadaosemelhantedifusopassivanadirecodomovimento(tambmafavordogradientedeconcentrao),navelocidadedetransporte(tambmfunodogradientedeconcentrao)eomovimentodosolutonodependedofornecimentodeenergia;oAsdiferenassoquerecorreaprotenastransportadoras(permeases/"carrier")quesofremmodificaoconformacional;bastahaverumpequenogradientedeconcentraoparaqueasmolculasentrem;oEmmuitosorganismosserveparatransportarglicerol,acares,eaminocidos;oAvelocidadedetransportedeumsolutoaumentamaisrapidamenteabaixasconcentraesdosoluto.EstadifusoatingeumvalormximoquandootransportadoratingeasaturaovelocidademximadetransporteDifusofacilitada(compermeases)Velocidadedetransporteemfunodogradientedeconcentraoparaadifusopassivaedifusofacilitada2.2.TransporteactivooEnvolvepermeases=>humacinticadesaturao;oProcessodependedeenergiaobtidaporhidrlisedeumaoumaismolculasdeATP(sistemasdetransporteactivoprimrio);porgeraodeumgradienteelectroqumicodeies(H+,Na+,K+)(sistemasdetransporteactivosecundrio); 31oMovimentocontraogradientedeconcentrao=>asmolculassoconcentradasnointeriordaclula=>umprocessoacumulativo,permitindoassegurartaxasmetablicaselevadas;oOssistemasdetransporteactivoprimrio,porexemplo,transportadoresdotipoABC,existemembactriasdosdomniosArchaeaeBacteriaeemeucariotas,existindoalgunsquetransportamparaforadaclula(responsveispelaresistnciaacertosantibiticos.EmbactriasGramnegativasenvolveacaptaoinicialdamolculadenutrienteporumaprotenaperiplasmticaoExistemtrstiposdetransporteactivosecundrio:Uniporte,AntiporteeSimporteSegueseumexemplodetransporteactivoembactrias: 321.Osprotessoexpelidosnotransporteelectrnico =>Formaodeumgradienteelectroqumicode protes 2.AntiporteNa+/H+paraformaodegradiente electroqumico de Na+3. O sdio liga-se permease 4. A forma do local de ligao do soluto modifica-se e o soluto (acar, aminocido) 5.Aconformaodapermeasealtera-separaqueo sdio entre na clula, o que seguido da dissociao da molculadesolutodaprotena(mecanismode Simporte) TranslocaoporgrupooAsmolculassomodificadasquimicamenteduranteotransporte;oProcessodependedeenergiaoOsistemaPTS(fosfoenolpiruvatofosfotransferase)embactrias,paratransportedeglucose,envolveatransfernciasequencialdefosfatodofosfoenolpiruvato(PEPmetabolitodagliclise)atravsdeumsistemadeprotenasintermedirias.Altima(EnzimaIIc)transportaefosforilaumamolculadeglucoseparaointeriordaclulaCaractersticasgeraisdossistemasdetransportemediadosporprotenas:oCinticadesaturaotipoMichaelisMenten:velocidademximaeKsconstantedeafinidadedapermeaseparaosoluto; 33oEspecificidade:emgeral,apermeaseespecficaparaumnutrienteougrupodesubstratosquimicamenterelacionados;oInduo:sntesedepermeaseinduzidapelapresenadosubstratonomeioextracelularCinticadotipoMichaelisMentenReparar:Asclulasnecessitamfrequentementedetransportarsolutosaelevadasvelocidadesatravsdamembranademodoacobrirassuasnecessidadesmetablicasdecrescimento.Talobtidoatravsdeumagrandediversidadedesistemasdetransportedesolutos.Transportedeferro:oOiofrrico,Fe3+,tembaixasolubilidadeemmeioaquosoeest,porisso,poucodisponvelparasertransportadoparaointeriordaclula;oOsmicrorganismosproduzemeexcretamsiderforosparacaptaressesiesporcomplexao.Siderforos:oMolculasdebaixopesomolecular;oSintetizadaseexcretadasporbactriasefungosquandoaconcentraodeferronomeiobaixa;oOcomplexoqueformacomoiofrricoposteriormentereconhecidoporprotenasreceptorasespecficasetransportadoparaointeriordaclula;oSoimportantesfactoresdevirulncia. 34 35CategoriasNutricionaisdosmicrorganismosFontedecarbonoCO2AutotrofismoCompostosOrgnicos HeterotrofismoFontedeenergiaSol FototrofismoCompostosorgnicosreduzidosQuimioorganotrofismoCompostosinorgnicosreduzidosQuimiolitotrofismoAdiversidademicrobianaresulta,emgrandeparte,dadiversidademetablicadosmicrorganismos,emparticulardasdiversasestratgiasparasintetizarATP(BIOENERGTICA)queosmicrorganismosapresentam.Noesquecer:Catabolismo=Produodeenergia;Anabolismo=consumodeenergiaRelaodosmicrorganismoscomooxignioGrupo RelaocomO2TipodemetabolismoAerbioobrigatrio Necessrio RespiraoaerbicaAerbiofacultativo Nonecessrio,masprefervel RespiraoaerbicaeanaerbicaefermentaoMicroaeroflico NecessrioemnveismaisbaixoqueosatmosfricosRespiraoaerbicaAnaerbioaerotolerante Nonecessrio,prefervelCO2FermentaoAnaerbioobrigatrio Prejudicaoumata FermentaoourespiraoanaerbicaoOxignioestresseoxidativo:Asespciesreactivasformadasnacadeiadetransporteelectrnico(aniosuperxido,perxidodehidrognioeradicalhidroxilo)soextremamentetxicasparaasclulascausando,porexemplo,aoxidaodemacromolculas(protenas,cidosnucleicos)ealteraesnoslpidosdasmembranascelulares(reduodacapacidadedabicamadalipdicacomobarreiradepermeabilidadeasolutos),etc.oApesardeexistiremenzimasquedestroemasespciestxicas,comoacatalase,peroxidase,superxidodismutaseouaacocombinadadelas,nemtodososorganismosestoprotegidos.MetabolismoQuimioorganotrfico(Protozorios,fungosemaiorpartedasbactriasfotossintticas):Aobtenodeenergiadseapartirdecompostosorgnicose,apartirdestes,podeocorrerrespiraoaerbica,respiraoanaerbicaoufermentao.AproduodeaceitadoresdeelectresconduzsntesedeATPporfosforilao.Umdosprodutosprincipaisodixidodecarbono.Pelofluxodecarbonosintetizamsenovasmolculas:biossntese.Noesquecerqueaconservaodeenergia,narespirao,sednamembranaplasmtica(pelafosforilaooxidativa),enafermentaopelafosforilaooxidativaaonveldosubstrato.EXTRA:RevisodeconceitosdeBioqumicaRespirao:oxidaocompletadecompostosorgnicos,comutilizaodeumaceitadordeelectresexterno(exgeno)paracontrabalanarreacesdeoxidaoreduousadasparagerarATP.AmaiorpartedoATPformadaporfosforilaooxidativacombasenumgradienteprotnico(foraH+motriz)estabelecidoatravsdemembranas(membranaplasmticaemprocariotasoumembranainternada 36 37mitocndriaemeucariotas).Quantonaturezadosaceitadoresfinaisdeelectres,soconhecidos2situaesgenricas:1.RespiraoaerbiaOxigniocomoaceitadorfinaldeelectresnaCadeiadeTransportedeElectresmembranar.AtransfernciadeelectresdeNADHeFADH2paraoO2atravsdoscomponentesdacadeiadetransportedeelectresconduzaoestabelecimentodoGradientetransmembranardeProtes(foraH+motriz).EstegradienteaforamotrizparaasntesedeATPpelaATPase(ouATPsintase).OO2reduzidoaH2O.Esteprocessorendegrandesquantidadesdeenergia.2.RespiraoanaerbiaCompostosinorgnicos,taiscomonitrato,sulfato,dixidodeCarbono(oucarbonato),etc.soaceitadoresfinaisdeelectresnaCadeiadeTransportedeElectresqueestabeleceoGradientetransmembranardeProtes(foraH+motriz)parasntesedeATP.Nessesprocessos,oscompostosinorgnicossoreduzidos.Presenteembactrias.Fermentao:ocorrefrequentementeemcondiesanaerbias(ausnciadeO2).Osubstratoorgnicosofreoxidaoparcial.Norequerumaceitadordeelectresexternooequilbriodereacesdeoxidaoreduoobtidocombaseemmetabolitosintermedirios(endgenos)resultantesdaoxidaodamolculadesubstratoorgnico(porexemplo,nagliclise).ATPsintetizadoporfosforilaoanveldosubstrato.Encontramosdiferentesviasfermentativasemdiferentesmicrorganismos(eucariotasouprocariotas),asquaisrendemdiferentesprodutosfinais.Orendimentoenergticoparaaclulamaisbaixoqueodarespirao.Passosprincipaisdocatabolismoaerbionumorganismoquimiorganoheterotrfico:5. Sntese de ATP, por fosforilao oxidativa. O2 o aceitador final de electres na cadeia respiratria 4. As linhas a tracejado mostram os fluxos de electres (transportados por NADH e FADH2) para a Cadeia de Transporte de Electres 3. Posio central do ciclo TCA 2.Fontesdeenergiadiferentessocanalizadasparavias degradativas comuns 1.HidrlisedasmacromolculasdisponveisnoAmbiente (porbactrias,fungos,protozorios,produtoresdeenzimas hidrolticas) RespiraoAnaerbiaCommolculasquesejammelhoresdadorasdeelectrescomooCH3COO,oCH4eoHS,ocorreacetognese(bactriasacetognicas),metanognese(bactriasmetanognicas)ereduodosulfato(bactriassulfatoredutoras),respectivamente.Todasestasbactriassoanaerbicasobrigatrias.Nota:H2Stxico.Commelhoresaceitadoresdeelectres,comooNO2,N2OouN2ocorredesnitrificao(bactriasdesnitrificantesaerbiasfacultativas).Arespiraoanaerbiausaoutrosaceitadoresdeelectres(semseroO2),permitindoarespiraodebactriasespecficasemambientesondeoO2estausente(elevadaimportnciaecolgica);geralmenteorendimentoenergticomaisbaixo(quenarespiraoaerbia),porqueopotencialredutordoaceitadordeelectresmenospositivodoqueodoO2.Fermentaoousado,frequentemente,opiruvatoouderivado(provenientedagliclise)comoaceitadordeelectresendgeno;oOATPformadoporoxidaoanveldosubstrato;oApenasumapequenapartedocompostoorgnicousadaparabiossntese;oSoproduzidosdiferentesprodutosparadiferentesfermentaes(cidos,lcoois,lactato,etc.) 38 39MetabolismoQuimiolitotrficooObtenodeenergiaapartirdaoxidaodecompostosinorgnicosdadoresdeelectres;oTmelevadaimportnciaecolgica(nosciclosbiogeoqumicosdoselementos);oAmaiorparterealizarespiraoaerbia;mas,algumassoanaerbias(aceitadoresfinaisdeelectrespodemseronitratoouosulfato);oATPsintetizadoporfosforilaooxidativa;oOselectressolibertadosdirectamentedocompostoinorgnicoreduzidoparaoscomponentesdaCadeiadeTransportedeElectreslocalizadanamembranaplasmtica,etransferidosparaaceitadorfinal,quesofrereduo.oOrendimentoenergticobaixo.TipodeQuimiolitotrofismoBactrias Dadordeelectres AceitadordeelectresOxidaodeH2Bactriasdohidrognio H2O2Nitrificao Bactriasnitrificantes NO2,NH4+O2Oxidaodeenxofre(exemplodeummetabolismoquimiolitotrficoanaerbico)Bactriasdoenxofre S0,H2S NO3Oxidaodeferro Bactriasdoferro Fe2+,S0,H2S O2Origemdasfontesdeenergia:oActividadevulcnica(H2S);oAgricultura(Amnia;nitrito)oActividadesmineiras(Fe2+)oQueimadecombustveisfsseiselixo(H2S;NH3)oBiolgicasdecomposiomicrobianadematriaorgnica(porexemplo,H2S;NH3;H2)FluxodeelectresnaCadeiadeTransportedeElectresdeumaBactriaNitrificante1.Oxidasenitritoanitrato,eocorretransportedeelectresnosentidonormal,demodoagerargradienteelectroqumicodeprotestransmembranar(foraH+motriz)paraasntesedeATPporfosforilaooxidativa.2.UmapartedaforaH+motrizestabelecidanaCadeiadetransportedeElectresdirectausadaparaforarofluxodeelectresnosentidoinversocadeiadetransportedeelectresinversa(contraogradientedepotencialdereduo)donitritoparaNAD+,demodoagerarNADH(fontedeelectresparafixaodeCO2ciclodeCalvin). 40 41Importante:Tambmosfototrficospodemusarcomofontedecarbonoodixidodecarbono(fotoautotrficos)oucompostosorgnicos(fotohetrotrficos).Nanatureza,algunsmicrorganismosmudamometabolismo,dependendodosrecursosquetmdisponveis.FotossnteseAfotossntesepodeseranoxignica(opoderredutorformadoapartirdeH2S,SouH2,dependendodaespciebacteriana),embactriasprpuraverde,ouoxignica(aluzcaptadatambmusadanafotlisedagua,gerandoO2epoderredutor,necessrioparaafixaodoCO2),emmicroalgas,cianobactriaseplantas.Emambas,aobtenodeenergiaapartirdaluz,masafotossnteseanoxignicadsenaausnciadeoxignio.IsolamentodemicrorganismosapartirdoambientenaturalFactoresimportantes:1.Inculo(fontedosmicrorganismos);2.Composiomeiodecultura;3.Condiesambientais(oxignio;Temperatura,pH,luminosidade,etc.)Exemplo1.Isolamentodebactriasdesnitrificantes(porexemploPseudomonasrespiraoanaerbia);ImportnciaremoodenitratodeguasresiduaisemETARs)1.Inculo:solo,sedimentosdelagos2.Meiodecultura:cidosorgnicos,comofontesdeCeenergia;NO32comoaceitadordeelectres;3.Ausnciadear(O2). 42Exemplo2Isolamentodebactriasnitrificantes(porexemploNitrobacterquimiolitoautotrficaaerbia);Importnciafertilizaodossoloscomnitrato1.Inculo:solo,lama2.Meiodecultura:ausnciadeCarbonoorgnico(paraseleccionarbactriasautotrficas);NO2comodadordeelectres;3.PresenadeO2/ar(porqueaerbia);ausnciadeluz(paraeliminarfotoautotrficas)Importnciadosmicrorganismosnoecossistema:ProduoprimriadematriaorgnicapormicrorganismosautotrficosConsumodirectoouprimrioporconsumidoresprimriosMineralizao:decomposiodecompostosorgnicoscomplexoscomformaodecompostossimplesOsmicrorganismostmumpapelfundamentalnareciclagemdosvrioselementosqumicosnoambiente(Carbono,azoto,enxofreeferro)Crescimento microbiano: aumento do nmero de clulas do microrganismo ao longo dotempo.Podeserquantificadoemtermosde-Nmerodeclulas- a(DO) Densidadepticadacultur-Massacelular(biomassa)darorigemaduasaofimdeumcertoperododetempotempodegeraoouduplicao.Mtodosparaavaliaraconcentraodeclulasnumapopulaomicrobiana:Grandepartedosmicroganismosmultiplicaseporfissobinria(maioriadasbactrias)ouporgemulao(maioriadasleveduras).Emambososcasos,umaclulaContagemdirectadonmerodeclulas:2. Contadoreselectrnicos. avaliam nmeros totais de clulas. Contudo no distinguem clulasmortasdenoviveis.Contagemdeclulasviveis:1.Cmarasdecontagem Estas duas tcnicas 43 44 Recorrese a tcnicas de contagem em placa em que um volume conhecido de umasuspensodemicrorganismosespalhadonasuperfciedeummeiodeculturasolidificado.Ascolnias que se desenvolvem, aps incubao adequada, so contadas e os resultados vmexpressosemtermosdeunidadesformadorasdecolnias(UFC)Mtodosindirectos:Mtodo espectrofotomtrico permite estimar a concentrao de clulas numasuspensopelapassagemdeumfeixedeluzatravsdela.(maisclulasmaisluzdesviadamenosluztransmitida)Determinao da massa molecular envolve a pesagem de clulas presentes naculturamicrobiana(processomoroso)Fasesdocrescimentomicrobianoemdescontnuo(batch) Fase de latncia, durante a qual o organismo se ajusta ao novo meio (ex. sntese deenzimas)Fase exponencial, nesta fase a populao cresce com taxa especfica de crescimentomxima. consumo de materiais de reserva endgenos (possvelproduodeendsporos) Fasedemorte,perdairreversveldacapacidadededivisocelular intervalos (fase de latncia) que correspondem adaptao das clulas aonovosubstrato.Relativamentefasedecrescimentoexponencial:O EstimativadataxaespecficadecrescimentodapopulaoFaseestacionria,correspondenteaoesgotamentodenutrientese/ouacumulaodemetabolito txico. No entanto, parte das clulas podem permanecer viveis durantealgumas horas custa doCrescimento diuxico: em meios contendo por exemplo duas substncias como fonte decarbonoeenergiaosmicrorganismospodemcontrolarautilizaodestes,demodoaqueumsejaconsumidoprimeiroedepoisooutro.Nestascondiesodeclivedarectanoconstantee surgem breves) ( ln ln0t t N Nt = + 0 45Ta crescimentoxaespecficade 46O Estimativadotempode populao,gduplicaoda= g actoresqueafectamocrescimentomicrobianocentraodonutrientelimitanteiv.Disponibilidadedeguav.Oxignioi.Concentraodonutrientelimitantento pare. O transporte dasmolculas de nutrientes atravs de sistemas de transporte transmembranar mediado pornzimasedevriospassosmetablicoscatalizadosporenzimas.Ataxaespecficade endedaconcentraodenutrientelimitante2 lnFi.Con ii.Temperaturaiii.pHFactoresambientaisNutriente limitante do crescimento S: o seu esgotamento no meio de cultura leva a que apopulao microbiana entre na fase estacionria e o crescimeecrescimento,depS KsSmx+= (EquaodeMONOD)mxmxrepresentaovalorquando[S]seencontra emconcentraosaturante(sistemasde transportetransmembranarparaonutrienteS estosaturadas)eKsumaconstantede semi-saturaoquecorresponde concentraodesubstrato,[S],quepermitea finidadedossistemasde transportetransmenbranarparaamolculado utriente limitante taxa de crescimento igual a metade da mx. Ksreflecteaan 47KsOsvaloresdasconstantesmxeKsdependem:oDascaractersticasintrnsecasdomicrorganismooDosubstratolimitanteusadoparaocrescimentooDascondiesambientais(temperatura,pH,)CulturacontnuademicrorganismonoquimiostatoNa cultura em descontnuo os microrganismos esto sujeitos a uma modificaocontnuadomeio,porqueossubstratossoconsumidoseosprodutosdemetabolismosevoacumulando,nopodendoporissoocrescimentoexponencialsermantidoindefinidamente.Nos sistemas de cultura contnuas a populao microbiana mantida continuamenteem fase de crescimento equilibrado, isto , num estado estacionrio, por remoo de parteda cultura de microrganismos que substituda por meio fresco, sendo o caudal dealimentaoigualaocaudaldesada.Recorrese ao quimiostato, que opera por fornecimento do nutriente essencial quelimitaocrescimentoaumataxaconstantedemodoaqueadensidadecelular(biomassa)eataxadecrescimentodomicrorganismoseajustamaestefornecimento.Taxa de diluio: traduz o volume que entra e sai do fermentador, por unidade detempoeporunidadedevolumeCaudaldealimentaodomeiofresco=caudaldesadadacultura(F)Volumedaculturanoquimiostato=VconstanteVFD = Emestadoestacionrio:ataxaespecficadecrescimentocorrespondeaovalordataxade diluio ( =D) a taxa especfica de crescimento do microrganismo controlada pelataxadediluioaqueoquimiostatoopera(D)WASHOUTQuanto maior for a taxa de diluio maior a taxa de crescimento da populao. Noentanto,paraDDcocrescimentocelularnoconseguecompensaradiluiodaculturaeapopulao e a populao de clulas sai do quimiostato (WASHOUT lavagem doquimiostato).Vantagensdocrescimentomicrobianoemcontnuo:Permite manter populao microbiana na fase exponencial do crescimento duranteperodoslongosPermite obter produto com caractersticas constantes durante perodos de temposlongosPermiteobtermaioresprodutividades possvel obter culturas em crescimento exponencial e com taxas especficas decrescimentodiferenteatravsdaalteraodataxadediluio possvel seleccionar uma populao de clulas dum microrganismo nico, que sejamuito competitivo e metabolize muito eficientemente um composto orgnico face a outrosmicrorganismosmenoscompetitivoseventualmentepresentesnapopulaomistainicialDesvantagens:Contaminaodacultura 48 49Degenerescnciadacultura(devidoamutaesespontneas)ii.TemperaturaA temperatura interfere em fenmenos enzimticos e no metabolismo celular, quedependemdelaparaobomfuncionamento.Paracadamicrorganismopossveldefenir:Temperaturamximaacimadaqualomicrorganismomorre(geralmentepordesnaturaoproteica)Temperatura ptima aquela que proporciona uma maior taxa demultiplicaoTemperatura mnima abaixo da qual o metabolismo domicrorganismocessa Quantotemperaturaptima,asbactriasclassificamseemMesofiloscomTptima~2540CPsicrfiloscomTptima~410CTermfiloscomTptima>45CHipertermfiloscomTptima>80cAdaptaesmolecularespsicrofilia:-insaturados face a cidosgordossaturadosnosfosfolpidosdabicamadalipidicaAdaptaesmolecularestermofilia:bicamada d-Membranas ricas no hidrocarboneto isopropeno; estrutura em monocamadalipdica.anismosclassificamseem:slcalfilo-ProtenaseenzimasquesoestveisatemperaturasbaixasMembranas com maior proporo de cidos gordos-Protenasestveisatemperaturasaltas-Snteseeacumulaodesolutoscompatveisnocitoplasma-Membranas com maior proporo de cidos gordos saturados face a cidosgordosinsaturados,nosfosfolipidosda lipi ica.iii.pHdomeioOsmicrorgAcidfilosNeutrfiloA 50.DisponibilidadedeguaO crescimento microbiano depende da quantidade de gua disponvel no meio extracelulareaixoaw pressoosmticaelevada; altaawpressoosmticabaixa)Deste modo, os microrganismos podem ser halfilosiv(expresso rmosdeactividadedegua,aw). emt(B, halotolerantes, osmfilos ou halfilosextremosdeacordocomascondiesdeactividadedeguaemquevivem.is, aumentando deste modo a awintracelularequilibrandoacomaawextracelular.IstopossveldevidosntesedepolialcooisoutransporteactivodeiesK+paraointeriordaclula.icrorganismosextremfilos Limitao cAdaptaesdecertosmicrorganismosaocrescimentoemmeioscombaixaaw Acumulao intracelular de solutos compatveMEXTREMOZYMESEnzimas que funcionam em condiestermfilosouhipertermfilosAcidfilosoualcalfiloshalfilosCrescimentomicrobianonosambientesnaturais:dorescimentoporfactoresambientais: 51 crescimentodependefrequentementedaconcentraodessenutrienteLeidatolerncia:acertoslimitesambientaisaspopulaesmicrobianaspodemnocrescer,independentementedadisponibilidadedenutrientesRespostadosModificaes morfolgicas (menor tamanho das clulas maior reaCre biofilmes : comunidade estruturada de clulas adetentes a umasuperfcie inerte ou viva embebidas numa matriz de polissacrido de origemVantagensdosbiofilmes:.Proteco relativamente a condies agressoras ou a fagocitose por clulas dosistemaimunitriodisponibilidadedenutrientes.Estabelecimento de relaes que podem ser benficas, como por exemplocomunicao entre clulas envolvendo molculas sensoras ou troca de material=Controlodo anismos=Agentesanti r icos:FiltraoFrioCalorRadiaoCalorLei do mnimo: a biomassa total de um organismo particular limitada pelonutriente presente com mais baixa concentrao; a taxa demicorganismosanveisbaixosdenutrientes:superficialparatransfernciadenutrientesmaiortaxametablicaescimentomaisrpidoFormao dmicrobiana.12.Maior3genticosmicrorgmic obianosfs 52PrincipaisProtenasdesnaturaotrmicainactivaodeenzimasMembranascelularesdesorganizaodabicamadalipidicaempo de reduo decimal, DT: intervalo de tempo para matar 90% de um dadomicrorganismo quando sujeita temperatura T (i.e. fraco de sobreviventes diminui de 100Processosquerecorremaocalorparacontrolarmicrorganismos:+Esterilizao(calorhmido,autoclave,ouseco)+Pasteurizao+Rad-potenteacooxidantequecausamdeDNAeprotenasmortedasclulas-Radiao u a ir a mutaes e morte dos microrganismosdevidoformaodedmerosdetiminanoDNA.alvos: perdadafunodebarreirasemipermevelTpara10%duranteoperododetempoDt)iaoRaiosXegamaproduzelectreseradicaiscomalteraoeroturaltr violeta Pode conduzReparaodedanos:FotoreactivaoReactivaonoescuro intensidades altas podem gerar um agente oxidante potente que leva fotooxidaodeprotenasecidosnucleicosRespostafotooxidao-Luz visvel :Pigmentos como carotenides protegemos microrganismos expostos luz dos danos porfotooxidaa.Mediodaactividadedeagentesantimicrobianos:+MtododasdiluiessucessivasValoresdeMIC 53deser medida com basementeocrescimentodomicrorganismo+Mtododadifusoemagardimetrosdoshalosdeinibio Aactividade antimicrobianadeum compostoqumicopona determinao da concentrao mais baixa desse composto necessria parainibircompletaAplicadoporexemplonadeterminaodasusceptibilidadedeestirpesbacterianasAgentesbacteriostticosouFungistticos:causaminibiodecrescimento molculas com asmesmaspropriedadesmassintetizadasquimicamente(agentessintticos).Umaspectocrticode um ente quimioteraputico a sua toxicidade selectiva, isto , a sua capacidade parainibir ou matar bactrias ou outro microrganismo patognico sem afectar adversamente ohospedeiro. Cada agente ou grupo de agentes quimioteraputicos tem um espectro de acoantimicrobiana.s antibiticos com aco antibacteriana so especialmente teis notratamentodedoenasinfecciosascausadasporbactriaspatognicasa antibiticosGermicidas: mata microrganismos patognicos ou no (no mata necessariamenteendsporos)Certos compostos qumicos com aco antimicrobiana podem ser usados nos seresvivosparaocontrolodedoenasinfecciosasagentesantimicrobianosdeusoteraputico.Osagentes quimioteraputicos podem ser molculas produzidas por microrganismos ou plantascom efeito contra outros microrganismos (antibiticos) ou podem seragControlo dos microrganismos por agentes antimicrobianos Desinfectantes,antispticoseesterilizantes,etc(agentesantimicrobianosqumicos)oExemplosemodosdeaco.Agente Tipodeagente AcoAlcoisDesinfectanteseAntispticosAcobactericidaefungicida,masnoesporicida;InactivamalgunsvirusDesnaturamprotenasedesorganizammembranascelularesCompostosfenlicosDesinfectantesDesnaturaodeprotenaserupturademembranasHalogneos(1)Iodoecompostosiodados(2)Cloroecompostosclorados(1)AntispticodapeleAgenteoxidante(2)Agenteoxidante(1)Oxidaconstituintescelularesereagecomprotenascausandoasuainactivao.Concentraesaltaspodeminactivaresporos(2)OxidaconstituintescelularesDestriclulasvegetativasdebactriasefungos,masnoesporosactuasobrealgunsvirusPodereagircommatriaorgnicaeformarcompostoscarcinognicosCompostosquaternriosdeamnio(1)Detergentes(2)Detergentescatinicos(1)CausamrupturadasmembranascelularesActuamcomoemulsionantes(2)Matammaiorpartedasbactrias,ouendosporosMetaispesados(prata,zinco,cobre)AntispticosoudesinfectantesEstabelecemligaescomgruposespecficosdeprotenas,inactivandoasoulevandosuaprecipitaoAldeidosAgentesalquilantes,Acobactericida,fungicida,virucidaeesporocida;combinamsecomcidosnucleicoseprotenasecausamasuainactivao.GasesesterilizantesEsterilizanteAgentesalquilantesAcomicrobicidaeesporocidaCombinamsecomprotenasinactivandoas 54 55AGENTES ANTIMICROBIANOS PARA USO TERAPUTICO Agentesquimioteraputicoagentesantimicrobianossousadosparacontrolaretratarinvivodoenasinfecciosas,actuamsobreumnmeromaisoumenoslimitadodemicrorganismos.AlvosbiolgicosdeagentesquimioteraputicosANTIBACTERIANOSEstesagentesactuamselectivamentesobreocrescimentoouviabilidadedebactrias. 56AlvosbiolgicosdeagentesquimioteraputicosANTIFUNGICOSToxicidadeselectivamaisdifcildeconseguir;Algumasdrogasspodemserusadastopicamente,devidoaograudetoxicidadeparahospedeiros.Resistncia a drogas antimicrobianas Definio:Capacidadeadquiridadummicrorganismopatognicopararesistiraosefeitosdeumagentequimioteraputicoaoqualerasusceptvel.Causa:usoindiscriminadodedrogasantimicrobianasusoexcessivodeprodutosdelimpezapessoaisoudomsticoscomagentesantibacterianos,etc.ExemplosdebactriaspatognicasHumanasquesetornaramresistentes:Pseudomonasaeruginosa,staphylococcusaureus 57 58Mecanismosderesistnciaadrogasemestirpesmicrobianasresistentes:Reduodapermeabilidadedaparedeemembranaplasmticadroga;Inactivaodadrogadevidoamodificaoqumicaouquebradamolcula(acoenzimtica)DesenvolvimentodeviabioqumicaalternativaExpulsodadrogaparaforadaclulaporsistemadetransporteactivo(efluxo)Aresistnciaresultadaselecoeexpressodegenesespecficos,presentesemplasmdeos(PlasmdeosRdeResistncia)ounogenomabacterianos.PrevenoeSolues:-Higiene;imunizao;prticaclnicaadequada;-Procuradenovasdrogasantimicrobianasatravsdedesigncomputarizado-Aumentodoconhecimentosobremecanismosderesistncia(erapsgenmica)ModificaoetransfernciadainformaogenticaDefiniesbsicas:EstirpeoucloneumapopulaodeclulasgeneticamenteidnticasGeneumfragmentodeDNAemqueasequnciadebases,apstranscrioetraduo,originaumaprotenacomumasequnciadeaminocidosbemdefinidaGenomaconjuntodetodososgenesdeumorganismo.Asbactriassohaplides(1cpiadecadaumdosgenesdogenoma).Gentipoconjuntodegenesespecficoqueumorganismopossui.leu,leuFentipopropriedadeobservvel.Aexpressofenotpicaprofundamenteinfluenciadaporfactoresambientais.Leu+,LeuPrincipaismecanismosquegeramvariabilidadegenticanasbactriasMutaoTransposioTransfernciadegenes(veiculadaporplasmdeos)RecombinaesentreregiesdasmolculasdoDNAMutaoDefinioqualqueralteraopermanentedeumasequnciadebasesdoDNA,mesmoquenotenhaefeitodetectvelnofentipo.Podelevaraoestabelecimentodeumasubpopulao. 59Mutaespodemser:Espontneas;Induzidas;Mutaesespontneas(ausnciadequalqueragentemutagnico,aleatrias,poucofreqentes)TautomerismodebasesamutaoresultadeerrosnareplicaodoDNAdevidoincorporaodenucletidoscontendoformastautomricas(ismerosquesediferenciamnaposiodeumgrupofuncional).MutaoespontneaportransioNestetipodemutaoumapurinasubstitudaporoutrapurinadiferenteouumapirimidinaporoutrapirimidinadiferenteAdioeeliminaodebasespodeocorrerumescorregamentonumadascadeias(cadeiaemformaoouparental)quelevaformaodeumlaoestabilizadoporligaesdeHnasequnciarepetitiva.AcontinuaodareplicaodeDNAlevaadioouremoodenucleotdeo(s),respectivamenteex: 60TransposesAmutaopodeocorrerporinserodasequnciadeinserooudotransposocomplexodentrodasequnciacodificantedeumgeneounasuaregioreguladoraNota:Oqueumtransposo?segmentosdeDNAmveisnopossuemfunesautoreplicativasnonecessitaderegiesdehomologiaentreotransposoeolocaldoDNAondesevaiinserirrequeraenzimatransposaseeextremidadescontendosequnciasderepetioinvertida(IR) Ostransposescomplexospodemtransportargenesdiversosqueconferemresistnciaantibiotica.Algumasconsequnciasdestamutao:interrupoouactivaodatranscriodeumgenetransfernciadegenesparticularesparaplasmdeos,oudeplasmdeosparaogenoma;Osnveisdemutaoespontneasocontroladospelaactividadedepolimerases53eexonucleases35. 61Mutaesinduzidas:(presenadeagentemutagnico) Agentesmutagnicos:(soagentesqueestimulamataxademutao(~1000x))QumicosFscosAgentesmutagnicosqumicos:IncorporaodeanlogosdebasesOcrescimentodeumapopulaodeclulasnapresenadesteanlogooriginaumadescendnciadeclulasondeocorreusubstituiodebases(parATparGC)Ex.5bromouracilo.AgentesalquilantesResponsveispeloemparelhamentoerradodebasestornandomaislbilasligaesentreelas.Exdeagentesalquilantes:Hidroxilamina,Metanossulfonatodeetilo(SEM)DesaminaooxidativadasbasesporacodeHNO2OHNO2promoveasadadogrupoNH2dasbasesazotadasoqueprovocaligaesmaislbeisouligaesentrebasesnocorrespondentes. 62Nesteexemploacitosinadesaminadaauracilo,oqualligaaadeninaemvezdeguaninaAgentesqueseintercalamentreasbasesdacadeiadupladeDNAEstesagentescausammutaesdotipo"frameshift".Ex.Brometodeetdeo,Acridinalaranja,proflavinaAgentesmutagnicosfsicos:Radiao UV Leva formao de dmeros de timina adjacentes por acoderadiaoUV(~260nm)causandodistoresnacadeiadeDNA.EstamutaopodeserreparadaporacofotoquimicaEfeitodasmutaesaonveldasprotenasMutao"missense"Mutaopontualnumcodopodelevarsubstituiodeumaminocidoporoutro,resultandonumaprotenadeficiente.Mutao"nonsense(semsentido)OriginaoaparecimentodeumcodoSTOP,tendocomoconsequnciaaproduodeumaprotenasemactividade.Mutao"frameshif(mutaodesfasada)Aadiooueliminaodeparesdebasesnomltiplosde3,levaalteraodagrelhadeleituraabertadosegmentodeDNAquecodificaparaumaprotena.MutaosilenciosaDevidodegenerescnciadocdigogentico,nemtodasasmutaessoexpressasfenotipicamenteMutaoneutraResultanacodificaodeumaminocidodiferente,masfuncionalmenteequivalente 63Expressodasmutaes(Adetecodemutantesspossvelseasalteraesocorridasnopatrimniogenticodomicrorganismocausarumaalteraodefentipo)"Forwardmutation(mutaodirecta)Aseguiraumaprimeiramutaodirecta,podemseguirsemutaes(mutaoinversaoumutaosupresso)querestabeleceousubstituiporumequivalenterestabelecimentodofentipooriginal:"Reversemutation"(mutaoinversa).Ex: rpresso)"Suppressomutation"(mutaosuSelecodemutantesOobjectivoaproduodemutantesparainvestigaooumelhoramentodeestirpesparafinsbiotecnolgicos.Tiposdemutantes:LetaisCondicionais(asmutaessoexpressassemdeterminadascondiesambientais)Morfolgicos(mutantesqueporexemplopromovemapigmentao)ResistnciaaumcompostoBioqumicos(levamaalteraesmetablicas)oAuxotrficosNecessitamdeumprodutodeumaviametablicacomonutrienteemmeiomnimo,porquenosocapazesdeosintetizaroPrototrficosCrescememmeiomnimosemsuplementos 64 65Selecoindirecta(negativa)usodatecnicaderplicaplatingAselecoindirectapermitedetectarmutantescondicionaisebioqumicosAtcnicaderplicaplating:usadaparaidentificarmutantesqueperderamporexemploacapacidadedesintetizarumnutrienteessencialSelecodirecta(positiva)Aselecodirectapermitedetectarmutantesmorfolgicosederesistnciaeaindamutantesauxotrficosquesetornamprototrficos.TestedeAmesusadoparadespistarapotencialacomutagnicadecompostosqumicos;recorreamutantesauxotficosdebactrias(ex.MutanteHisdeSalmolellasp.);analisadaafrequnciadereversodeauxotrficosaprototrficosporacodocompostoOtestedeAmesusadonadetecodecompostoscarcinognicos 66ProcessosdetransfernciadematerialgenticoOsplasmideospodemserdevriostipos:PlasmdeosBacterianos:Soelementosgenticos(DNAemcadeiadupla),circularesoulinearesTmreplicaoautnomaPodemexistiremcpianicaouhavermltiplascpiasPodemsereliminados(curing)deforma:ExpontneaInduzidaSodispensveisviabilidadecelularAlgunsplasmdeossoepissomas(conseguemintegrarnocromossomahospedeiro)Algunsplasmdeossoconjugativosepodemaderircomareceptorapor:pilusoutubodeconjugaoConjugao(atravsdeumapontecitoplasmtica)PodemconferirvantagemselectivaemdeterminadosambientesPlasmdeosCol(EmEscherichiacoli,Salmonellasp.,Enterobactersp.)Codificamparacolicinas(bacteriocinas)AlgunsdestesplasmdeossoconjugativosAlgunstambmcontmgenesderesistnciap.exresistnciaaantibiticosPlasmdeosdevirulncia 67ContmgenesdevirulnciaetornamabactriamaispatognicaEx.genesqueconferemresistnciaaosmecanismosdedefesadohospedeiro(p.ex.Sntesedecpsula)PlasmdeosmetablicosContmgenesenvolvidosemprocessosmetablicosEx.genesresponsveispelafixaobiolgicadeazotoPlasmideosqueconferemresistnciaaantibiticosFactoresdeResistncia:PlasmdeosRTmgenesquecodificamparaaresistnciaaantibiticos,metaispesados(Hg,Ni,Co),etc.AlgunssoconjugativosGeralmentenoseintegramnocromossomaPlasmdeoF,FactorFdefertilidadeouplasmdioFfundamentalnaconjugaobacteriana. OfactorFpodeexistirnaclulabacterianade2formasdiferentes:livrenocitoplasma;integradonocromossoma(epissoma) 68IntegraodofactorFnaE.Coli.Aintegraomediadaporsequnciasdeinsero(IS)3MecanismosprincipaisnatransfernciadematerialgenticoConjugao(explasmideosconjugados)TransformaoTransduoConjugaoBacterianaTransfernciadeDNAporcontactodirectoentreasclulasContactodirectoentreasclulasfoiprovadopelaexperinciadetuboemU. 69ConjugaoF+xFF+estirpedadorcontemofactorFFestirpereceptorn~\aocontemofactorFOfactorFreplicapelomecanismocrculorolante,duplicaetransferidoAtransfernciagenticaunidirecional(deF+paraF)AestirpereceptoratornaseF+AestirpedadoracontinuaF+PodeocorreremalgumasbactriasGram.positivas(E.coli,Pseudomonassp.,etc.)eemalgumasespciesGrampositivas(p.ex.dosgnerosBacillus,Streptococcus,Staphylococcus,etc) 70ConjugaoHfrxFEstirpeHfr(Highfrequencyofrecombination)AestirpedadoracontmofactorF(epissoma)ODNAdasclulasHfrduplicapelomecanismocirculorolanteecomeaasertransferido Nestecaso,afrequnciadetransfernciadocromossomamuitoaltaemcomparaocomadoFactorFporclulasF+Existetransfernciadegenesquerdoplasmdeo,querdocromossomaathaverquebradaligaoentreasclulas.AclulareceptorapodecontinuarF,separtedoplasmdeoFnotransferida 71ConjugaoFxFOplasmdeoFumepissoma,peloquepodelibertarsedocromossomabacterianoexciso.PlasmdeoFFormaseporexcisoincorrectadocromossomaPodelevarconsigomaisdoque1genedocromossomaondeestavaintegrado ClulaHfrpassaaF AclulaFtransferesseplasmdeoparaumaclulareceptoraF(mecanismovirtualmentesemelhanteaodaconjugaoF+xF)AGenescromossomaisAparterosafactorFintegradonocromossomacircularmaiorNota:Osgenescromossomais(A)nemsempretemqueseintegradosnaclulaparaseexpressaremAsclulasreceptorestornamseFesoparcialmentediploides(possuemdoisconjuntosdogeneA) 72 73OsgenesbacterianospodemserdifundidosatravsdestemecanismoTransfernciadeDNAportransformaoComprovaodasuaexistncia:ExperinciadeGriffith Definio:aentradadeDNAlivreexistentenomeioambientedasclulasesuaincorporaoestvelnumaclulareceptoracompetente.umprocessoaleatrioAsuafrequnciaemclulascompetentesmuitofrequenteEspciesnaturalmentecompetentes:EspciespertencentesAosgnerosHaemophilusStreptococcusBacillusAzotobacterPseudomonas,etcMecansimodetransformaoemclulascompetentesAsclulascompetentespodemfixarfragmentosdeDNAnumaprotenareceptoraespecficadaparedecelular,nodiscriminaotipodeDNAOfragmentodeDNA,emcadeiasimples,vaiseralinhadocomregiohomloga,ocorrendorecombinaoentreascadeias(mediadoporprodutodogeneRecA)Fragmentosquenoencontremregiohomloganocromossomadesaparecero(apsalgumasgeraes) 74 75TransformaoArtificialembactriasPodesetornarasclulastemporariamentecompetentespor:Tratamentodasclulascomcloretodeclcioe/ououtrosies,seguidodechoquetrmico;ElectroporaoouelectrotransformaoTransduoGeneralizadaDefinio:atransfernciadegenesbacterianosentreclulasdiferentesmediadaporvirusqueinfectambactrias(designadosporbacterifagosoufagos)ResultadofactodefragmentosdoDNAdabacteriahospedeiraentrarem,porengano,nacabeadofagoaquandodasuareplicaoematuraopodeocorerduranteoCicloLticodereplicaodevirusembactriasinfectadas.ClassificaoeIdentificaodemicorganismosTaxonomiaCinciaquedistribuiosorganismosporcategoriastaxonmicasoutaxaquetraduzemoseugraudesemelhana. Divideseem:Classificaodefineaformadedistribuiodosorganismosemgrupostaxonmicos;Nomenclaturaatribuinomesaosgrupostaxonmicosdeacordocomregrasprestabelecidas;Identificaooprocessodedeterminaraquegrupotaxonmicopertenceumdeterminadoisolado.Espcieunidadebsicadataxonomiamicrobiana.definidacomo:umconjuntodeestirpesquepartilhammuitascaractersticasestveisediferemsignificativamentedeoutrosgruposdeestirpes;umconjuntodeestirpescujacomposioG+CdogenomaidnticaeemqueasequnciadenucleotdeosdoDNAapresenta70%oumaissemelhana.Gnerogrupobemdefinidodeumaoumaisespcies,claramenteseparadodeoutrosgneros. 76 77Utilizaseumsistemabinomialparaadesignaodeumaespcie,sendoognero(primeironome)porvezesabreviadoinicial. 78Todososorganismosvivosestodistribuidospor3divisesmaiores:osdomniosBacteria,ArchaeaeEukarya.Estirpe:populaodeorganismosquesedistinguedeoutrasdentrodeumtaxondescendedeumnicoorganismoouculturapuravariamentreelasdevariasformas:BiovardiferenasbioqumicasefisiolgicasMorfovardiferenasmorfolgicasSerovardiferenaspropriedadesantignicas Estirpetipo:5.aprimeiraestirpedaespcieaserestudada6.geralmenteamaisbemcaracterizada7.nonecessariamenteomembromaisrepresentativodaespcie 79Caractersticastaxonmicas:7.Clssicas:8.morfologiaforma,tamanho,reacogram,flagelo(setiver)9.fisiologiaemetabolismomecanismodeconservaoenergtica;relaocomoxignio;temperatura,pH,etolerncia/necessidadesalina;capacidadedeusarosvrioscarbonos,nitrognioefontesdeenxofre;factordecrescimento;pigmentos;patogencidade;sensibilidadeantibitica10.ecolgicaciclodevida,relaessimbiticas,capacidadedecausardoenasemhospedeiros,habitatpreferencial,factoresqueinfluenciamocrescimento11.anlisegenticacapacidadedetrocadeinformaogenticaportransformaoeconjugao(geralmenteconfinadosaognero),existenciadeplasmideos(emboraainformaonelescontidapossainduziremerro)12. Moleculares:13. cidosnucleicos14. Proteinas15. Lpidos Ostestescomerciaissaobaseadosprincipalmenteemcaractersticasfisiolgicasebioqumicas,eosperfisdecaracteristicasobservados(deculturaspuras)saocomparadoscombasesdedados.SISTEMASDECLASSIFICAO:Classificaonaturaldispeosorganismosemgruposcujosmembrospartilhammuitascaractersticas,ereflecteanaturezabiolgicadosorganismos.Executadapordoismtodos:Fentico(classificaofentica)agrupaosorganismoscombaseemsemelhanasfenotpicas,caractersticasestascomomesmopeso;omelhormtodoparacompararomaiornmerodepropriedadespossvelFilogentico(classificaofilogentica)agrupaosorganismoscombasenasuaprovvelproximidadeevolutiva(filogentica)baseiaseusualmentenacomparaodirectadematerialgentico(ex.DNA,RNA)ouprodutosdegenes 80TAXONOMIANUMRICA usadaparaestabelecerumsistemadeclassificao,eenvolveosseguintespassos:Todasaspropriedadestestadastmomesmopeso(1=temcaracteristica;2=naotemcaracterstica)DeterminaodoscoeficientesdesemelhanaCoeficientesimplematchingbaseadoemtodasascaractersticas,querestejampresentesouausentesCoeficientedeJaccardqueignoraascaractersticasausentesnosdoisorganismosUsacomputadoresparacompararorganismos(em50oumaiscaractersticas)ConstruodematrizesdesimilaridadeConstruodedendogramas(diagramasemrvores)querelacionamosmicrorganismosentresi.Umgrupodeorganismoscomumgraudesemelhanasuperiora80%umaespciebacteriana.Classificaomolecularfeitaatravsdacomparaodeprotenas,deperfisdelipidos,dacomparaodacomposiodoscidosnucleicos(ex.ContedoG+CdoDNA),dahibridaodecidosnucleicos,dacomparaodesequnciasdebasesdecidosnucleicos.Comparaodeprotenascomparaodamobilidadeelectrofortica,depropriedadesenzimticaseadeterminaodesequnciasdeaminocidos,erespectivoalinhamentodassequncias. HIBRIDAODNA:DNAcomoferramentataxonmicaMedeograudesimilaridade(ouhomologia)noDNAdedoisorganismos(peloemparelhamentodeduasmolculasdeDNAdesnaturadas) 81EcotipopopulaodeclulasquecompetemparaummesmorecursoNovaespciepopulaodeclulasquesedistinguegenticamentedasclulasdoecotipooriginal Filogenia(ouclassificaofilogentica)Traduzahistriaevolutivadeumgrupodeorganismos;Ahierarquiataxonmicarevelarelaesevolutivasoufilogenticas Evoluoalteraesnumalinhagemdedescendnciaaolongodotempo,conduzindoanovasvariedadeseespcies.Relaoesevolutivassaomostradasemrvoresfilogenticas. CLASSIFICAOFILOGENTICA Baseiasenacomparaodirectadassequnciasdematerialgentico(genes)oudosseusprodutos(protenas) cidosnucleicoseprotenasfuncionalmenteidnticospodemserusadosparamediraevoluodosorganismosaolongodotempo Baseiamseemalgunspressupostos Assequnciasalteramsegradualmenteaolongodotempo Essasalteraessorelativamentealeatrias 82 AquantidadedealteraesaumentalinearmentecomotempoOsribossomassomolculasdeRNAribossmico(rRNA)soexcelentesferramentasparadeterminarrelaesevolutivasentreorganismosCRONMETROSEVOLUTIVOS.Istoporque: Souniversais(estopresentesemtodososorganismosvivosecomamesmafuno) Asuafunonosealterouaolongodoprocessoevolutivo ContmvriasregiesemqueasequnciadenucleotdeosconservadaemtodosostiposdeclulasAssequnciasdorRNA16S(emprocariotas)edorRNA18S(oequivalenteemeucariotas)amaisusadaemtaxonomia.AsequnciadebasesnestasmolculasderRNAmuitoconservadaaolongodoprocessoevolutivo. 83PASSOSPRINCIPAISENVOLVIDOSNAOBTENODERVORESFILOGENTICASBASEADASNASEQUNCIADENUCLEOTDEOSDOrRNA:1.ExtracodoDNAdeclulasdecadaumdosmicrorganismosquesepretendecomparar2.ApartirdoDNAobtidoem(a)sofeitasmuitascpiasdogenequecodificao16SrRNAemcadaumdosmicrorganismos,porrecursotcnicadePCR.AtcnicadePCRbaseiasenarealizaoinvitrodoprocessonaturaldereplicaodeDNAqueocorreinvivo.Permiteobtermuitascpiasiguaisdeumgeneespecfico.3.Sequenciaodosgenesquecodificamo16SrRNAdecadamicrorganismo;4.Alinhamentodassequnciasdenucleotdeosdosgenesquecodificamo16SrRNAparapesquisarsemelhanasediferenas,porrecursoaferramentasinformticasespecializadas(p.ex.disponveisnositeRibossomalDatabaseProject;nestabasededadosestdepositadaumacolecodecercade160000sequnciasde16SrRNAsdadodeNov2006).5.Umalgoritmopermitefazercomparaesecalculardistnciasevolutivas,doisadois,econstriumarvorefilogenticaquemostraasdiferenasnassequnciasdorRNAentreosorganismosanalisados:nesteexemplo microrganismos1e3soparentesmaisprximos(provavelmente,pertencemmesmacategoriataxonmica),doque2e3ou1e2.