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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE FSICA DE SO CARLOS
VALRIA SPOLON MARANGONI
ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE NANOCOMPSITOS
CONTENDO NANOPARTCULAS DE OURO CONJUGADAS COM
BIOMOLCULAS: SNTESE E APLICAES EM NANOMEDICINA
So Carlos
2012
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VALRIA SPOLON MARANGONI
ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE NANOCOMPSITOS CONTENDO
NANOPARTCULAS DE OURO CONJUGADAS COM BIOMOLCULAS:
SNTESE E APLICAES EM NANOMEDICINA
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Fsica do Instituto de Fsica de
So Carlos da Universidade de So Paulo, para
obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de concentrao: Fsica Aplicada
Opo: Fsica Biomolecular
Orientador: Prof. Dr. Valtencir Zucolotto
Verso Corrigida
(Verso original disponvel na Unidade que aloja o Programa)
So Carlos
2012
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AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTETRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO PARAFINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalogrfica elaborada pelo Servio de Biblioteca e
Informao do IFSC, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Marangoni, Valria Spolon Estudo e desenvolvimento de
nanocompsitoscontendo nanopartculas de ouro conjugadas
combiomolculas: sntese e aplicaes em nanomedicina /Valria Spolon
Marangoni; orientador ValtencirZucolotto - verso corrigida -- So
Carlos, 2012. 116 p.
Dissertao (Mestrado - Programa de Ps-Graduao emFsica Aplicada
Biomolecular) -- Instituto de Fsicade So Carlos, Universidade de So
Paulo, 2012.
1. Nanobiocompsitos. 2. Nanopartculas de ouro. 3.Jacalina. 4.
BeCen1. I. Zucolotto, Valtencir,orient. II. Ttulo.
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Aos meus pais, Adenir e Mrcia, e ao meu
irmo, Bruno, por estarem sempre ao meu
lado e me apoiarem em todos os momentos.
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Adenir e Mrcia, que so base de toda a minha
formao pessoal e
profissional. Obrigada pela confiana e apoio em todos os
momentos!
Ao meu irmo, Bruno, por tantos anos de convivncia, amizade e
pelas aulas de Mecnica
Quntica.
Ao Pedro, por todo apoio e amizade e a toda sua famlia, pelo
apoio e por compartilharem
comigo as dificuldades e conquistas durante todo este
perodo.
Ao Prof. Valtencir Zucolotto pelo grande aprendizado que me
proporcionou em todos estes
anos de convivncia. Obrigada pela amizade e confiana!
Fapesp pela bolsa de mestrado e todo apoio financeiro necessrio
para a realizao deste
trabalho.
Ao CNPq e Capes pelo apoio financeiro.
Ao Laboratrio de Microscopia Eletrnica (Laboratrio Nacional de
Nanotecnologia -
LNNano) pela oportunidade de treinamento e utilizao do
Microscpio Eletrnico de
Transmisso. Em especial, gostaria de agradecer a Marina Magnani
por todas as sesses de
treinamento, pacincia e grande ajuda com tudo.
pr-reitoria de ps-graduao por ter concedido todos os recursos
financeiros necessrios
para a participao e apresentao do trabalho no evento E-MRS 2011
- SPRING MEETING
IUMRS ICAM 2011 & E-MRS na cidade de Nice, Frana.
diretoria do Instituto de Fsica de So Carlos - IFSC, pela
concesso do prmio Yvonne
Primerano Mascarenhas" pelo melhor trabalho de Mestrado na I
Semana Integrada de
Graduao e Ps-Graduao do IFSC.
Aos docentes e funcionrios do Grupo de Biofsica Molecular Sergio
Marcarenhas, em
especial, a Andressa e Bel, pela grande ajuda com os
experimentos e por proporcionarem um
ambiente de trabalho agradvel e organizado para a realizao dos
experimentos.
Dra. Ana Isabel de Camargo pela colaborao com a protena BeCen1 e
pelo grande
ensinamento na rea biolgica, principalmente na expresso e
purificao de protenas.
Ieda, pela imensa ajuda com os experimentos de cultura celular e
pelo grande ensinamento
nesta rea.
Ester, secretria do Grupo de Biofsica Molecular, e aos
funcionrios da biblioteca e da
ps-graduao do IFSC que sempre nos auxiliam.
Aos amigos do Grupo de Biofsica e do LNN: Paty, Ana Eliza, Ju
Cancino, Lilian, Joci,
Sussu, Thalita, Z, Luis, Dbora, Julio, Ana Isabel, Andressa,
Fernando, Amanda, Jaciara,
Camilo, Wagner, Vernica, Fabrcio, Denise, Fabio, Edson, Crusca,
Thaty, Helton, Ju,
Rodrigo, Leandro, Marilia. No tenho palavras para descrever o
quanto vocs foram
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importantes nestes anos. Obrigada pela amizade e pelos momentos
de descontrao no caf,
Brotas, Churrascos, Cachorro-quente, PQ, congressos, passeios,
discusses cientificas,
conselhos. Enfim, obrigada por estarem presentes e
compartilharem comigo as conquistas e
dificuldades! Vocs so grandes amigos que eu espero que estejam
sempre presentes na
minha vida!
Aos amigos da graduao da turma de 2009, que passaram estes
ltimos anos de mestrado
dizendo que eu entrei no buraco negro da fsica. Obrigada pela
amizade e compreenso,
principalmente: Bruno, Thiago, Lvia, Eder, Naty, Sheyla,
Scheila, Alexandre, Ashino, Jesus,
Herbert, Gi, Fer, Elys...
Aos amigos desde pequeninha que sempre estiveram presentes e me
apoiaram: Raisa,
Larissa, Gustavo, Jssica, Renata, Tata.
Ao Instituto de Fsica de So Carlos pela estrutura, corpo de
docentes e funcionrios que
juntos proporcionaram auxlio na realizao desta obra.
Enfim, muito obrigada a todos que direta ou indiretamente
contriburam para a realizao
deste trabalho.
Agradeo a Deus!
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You have got to find what you love (...)
Your work is going to fill a large part of your life, and
the only way to be truly satisfied is to do what you believe is
great work.
And the only way to do great work is to love what you do.
If you haven't found it yet, keep looking. Don't settle.
Steve Jobs (Stanford, 2005)
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RESUMO
MARANGONI, V.S. Estudo e desenvolvimento de nanocompsitos
contendo
nanopartculas de ouro conjugadas com biomolculas: sntese e
aplicaes em
nanomedicina. 2012. 116p. Dissertao (Mestrado) Instituto de
Fsica de So Carlos,
Universidade de So Paulo, So Carlos, 2012.
A convergncia entre a biotecnologia e a nanotecnologia tem
levado ao desenvolvimento de
novos nanobiocompsitos hbridos com funes sinrgicas que
incorporam as propriedades de
reconhecimento dos biomateriais com as propriedades eletrnicas,
pticas e catalticas nicas
das nanopartculas. Apesar do recente desenvolvimento na sntese
de nanobiocompsitos, a
aplicao biomdica destes materiais ainda apresenta muitos
desafios, j que no apenas uma
conjugao apropriada requerida, mas tambm outros importantes
aspectos relacionados
biocompatibilidade. O presente trabalho tem como objetivo
expandir o campo da sntese e
caracterizao de nanoparticulas funcionalizadas com biomolculas.
Em especial, visamos o
entendimento e caracterizao das interaes entre nanopartculas de
ouro (AuNPs) e
protenas, por meio do estudo de dois sistemas distintos: AuNPs
funcionalizadas com
Jacalina, e AuNPs funcionalizadas com a protena BeCen1. No
primeiro sistema, o interesse
advm da capacidade da lectina Jacalina de reconhecer o
dissacardeo (Gal1-3GalNAc)
associado a tumores. Neste caso, AuNPs formadas na presena do
dendrmero
poli(amidoamina) gerao 4.0 (PAMAM G4) foram conjugadas com a
Jacalina marcada com
o fluroforo Isotiocianato de fluorescena (FITC). A formao do
complexo AuNP-PAMAM
G4/Jacalina foi confirmada por Microscopia Eletrnica de
Transmisso (TEM), Espalhamento
de Luz Dinmico (DLS), Espectroscopia de Absoro no UV-VIS e
vibracional (FTIR). A
interao entre as AuNP-PAMAM G4 e a Jacalina parece ser um
processo dirigido por
entropia com afinidade moderada e formao de complexo, segundo os
resultados de
Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC) e supresso da
fluorescncia. Os resultados de
Dicrosmo Circular (CD) mostraram que a conjugao da Jacalina com
as AuNP-PAMAM
G4 no alterou sua estrutura secundria. Testes realizados em
cultura de clulas revelaram
que o complexo apresenta maior afinidade e citotoxicidade pelas
clulas de carcinoma do colo
de tero humano (HeLa) se comparadas com fibroblastos saudveis de
adipcitos de
camundongo (L929). Estes resultados so relevantes uma vez que
demonstram o potencial do
complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FTIR para aplicaes biomdicas
incluindo
diagnstico e tratamento de cncer. O segundo sistema interessante
devido a habilidade da
protena BeCen1 em formar filamentos nanomtricos em funo da
temperatura. As AuNPs
foram formadas na presena da protena utilizando cido frmico
diludo como agente redutor
e o excesso de protena foi separado por Cromatografia de Excluso
Molecular. Anlises de
CD revelaram uma pequena diminuio no contedo de -hlices,
confirmado por FTIR, o
que pode estar relacionado interao das AuNPs com os grupamentos
amida desta protena.
Medidas de espalhamento de luz revelaram um aumento da turbidez
da suspenso do
complexo AuNP-BeCen1 com o aumento da temperatura e imagens de
TEM, com e sem
aquecimento, confirmaram uma mudana de padro no arranjo das
AuNPs. Estes resultados
revelam a possibilidade de fabricao de nanobiocompsitos
termorresponsivos, o que pode
ser muito importante para aplicaes em nanodispositivos.
Palavras-chave: Nanobiocompsitos. Nanopartculas de ouro.
Jacalina. BeCen1.
-
ABSTRACT
MARANGONI, V.S. Study and development of nanocomposites
containing gold
nanoparticles and biomolecules: synthesis and application in
nanomedicine. 2012. 116p.
Dissertao (Mestrado) Instituto de Fsica de So Carlos,
Universidade de So Paulo, So
Carlos, 2012.
The convergence between biotechnology and nanotechnology has led
to the development of
new hybrid nanocomposites that conjugate the bio-recognization
properties of biomaterials
and the unique electronic, optic and catalytic properties of the
nanoparticles. Despite the
recent advances in the development of nanobiocomposites, the
biomedical applications of
these materials are still limited, among other factors, by the
low efficiency of
functionalization and biocompatibility. The present study was
aimed at developing protein-
conjugated nanoparticles for application in nanomedicine. Our
main focus were the
understanding and characterization of the interactions between
proteins and gold
nanoparticles (AuNPs), which was accomplished using two distinct
systems, viz.: Jacalin-
functionalized AuNPs, and Becen1-functionalized AuNPs. In the
former, the interest is due
the capability of the protein Jacalin of recognize the
disaccharide (Gal1-3GalNAc), largely
expressed in some tumors cells. AuNPs were synthesized in the
presence of the polyamido
amine generation 4.0 (PAMAM G4) and conjugated with a Jacalin
target with the fluorescein
isothiocyanate (FITC). The excess of protein was removed by
centrifugation and the complex
formation was confirmed by Transmission Electron Microscopy
(TEM), Dynamic Light
Scattering (DLS), UV-VIS Absorption and Vibrational Spectroscopy
(FTIR). The interactions
between AuNP-PAMAM G4 and Jacalin seemed to be driven by an
entropic process with
moderate affinity and complex formation, as revealed by
Isothermal Titration Calorimetry
(ITC) and quenching fluorescence measurements. Furthermore,
Circular Dichroism (CD)
analyses revealed that protein maintained its secondary
structure upon conjugation with
the nanoparticles. In vitro tests revealed that the
AuNPs/Jacalin complexes presented higher
affinity and cytotoxicity against human cervical cancer cell
(HeLa) compared to healthy
mouse fibroblasts (L929). These results are relevant, since the
AuNP-PAMAM
G4/Jacalin-FITC complex may be used for biomedical applications
including cancer
treatment and diagnostics. The second nanocomplex, comprising
AuNPs and BeCen1, was
chosen due to the ability of BeCen 1 to polymerize in the form
of nanometric filaments as a
function of temperature. The AuNPs were formed in the presence
of the protein using diluted
formic acid as reducing agent and the excess of protein was
removed by Molecular Exclusion
Chromatography. CD analysis showed a decrease in the -helix
structures confirmed by
FTIR, which may be related to the interaction between the AuNPs
and the amide groups of
the protein. Light scattering measurements revealed an increase
in the turbidity of the
dispersions upon increasing the temperature, indicating a change
in the arrangement of the
AuNPs. Such BeCen-1 induced alignment was confirmed by TEM
images. The latter results
point to the possibility of fabrication of novel
thermoresponsive nanobiocomposites, which
are of great relevance for nanodevices applications.
Keywords: Nanobiocomposites. Gold nanoparticles. Jacalin.
BeCen1.
-
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representao esquemtica da variao de densidades de
estados em
funo do tamanho do material. Adaptado de (21).
...................................
28
Figura 2 - Representao esquemtica da estabilizao de partculas
pelo efeito a)
eletrosttico e b) estreo
............................................................................
29
Figura 3 - Estrutura molecular do dendrmero PAMAM G4 (38)
.............................
33
Figura 4 - Representao esquemtica de uma nanopartcula
teranstica.
Nanopartculas multifuncionais so direcionadas at a membrana
de
clulas cancergenas usando um ligante especfico para um receptor
na
superfcie da clula (51)
............................................................................
36
Figura 5 - Estrutura tetramrica da Jacalina extrada do pdb
(cdigo 1KU8). ............
37
Figura 6 - Imagem de Microscopia Eletrnica de Transmisso da
protena BeCen1
contrastada com acetato de uranila mostrando a formao de
filamentos
aps aquecimento (67).
...............................................................................
39
Figura 7 - Representao esquemtica da sntese de nanopartculas de
ouro na
presena do dendrmero PAMAM G mostrando a estabilizao das
nanopartculas nas cavidades do dendrmero
.............................................
46
Figura 8 - a) TEM da amostra de AuNPs-PAMAM G4 e b) Histograma
de
tamanho de partcula e distribuio Gaussiana ajustada aos
dados
indicando um dimetro mdio de 6,1 0,2 nm.
.........................................
61
Figura 9 - a) Espectro de absoro das AuNPs-PAMAM G4 em
diferentes
concentraes e b) valores de absoro mxima na banda de
ressonncia
plasmonica de superfcie em funo da concentrao e ajuste linear
dos
dados.
..........................................................................................................
63
Figura 10 - Espectros de absoro no UV-VIS para AuNP-PAMAM G4,
Jacalina e
AuNP-PAMAM G4/Jacalina.
.....................................................................
65
Figura 11 - Espectro de absoro para a Jacalina-FITC e
AuNP-PAMAM
G4/Jacalina-FITC.
......................................................................................
66
Figura 12 - Histogramas obtidos a partir de medidas de DLS para
as amostras de a)
Jacalina, b) AuNP-PAMAM G4 e c) AuNP-PAMAM G4/Jacalina.
.........
68
Figura 13 - Espectros de CD da Jacalina livre e do complexo
AuNP-PAMAM
G4/Jacalina.
................................................................................................
70
Figura 14 - Espectro de fluorescncia da Jacalina e do complexo
AuNP-PAMAM
-
G4/Jacalina. O inset do grfico mostra o espectro para o
complexo
AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC. excitao = 280 nm..
...........................
71
Figura 15 - a) Supresso da fluorescncia da Jacalina na presena
de vrias
concentraes de AuNP-PAMAM G4. excitao = 280 nm; b) Grfico da
intensidade da fluorescncia em 325 nm em funo da concentrao
de
AuNP-PAMAM G4; c) Grfico de F0/(F0-F) em funo de 1 / [AuNP-
PAMAM G4], no inset grfico de F0/F contra [AuNP-PAMAM G4] e
d)
Grfico F0-F em funo de [AuNP-PAMAM G4]..
...................................
74
Figura 16 - Espectroscopia no Infravermelho a) AuNP-PAMAM G4; b)
Jacalina e c)
AuNP-PAMAM G4/Jacalina..
...................................................................
77
Figura 17 - Calorimetria de Titulao Isotrmica das AuNP-PAMAM G4
com a
Jacalina. O painel superior mostra os calores produzidos em
cada
titulao das nanopartculas na suspenso da protena. O painel
inferior
mostra a rea integrada de cada pico. Os dados foram ajustados
segundo
o modelo de um stio de ligao (One Sites).
............................................
79
Figura 18 - a) Imagens de Microscopia eletrnica das AuNP-PAMAM
G4 antes
(inset) e aps a conjugao com a Jacalina; b) Representao
esquemtica do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina.
..........................
82
Figura 19 - Imagens obtidas com um aumento de 40 vezes das
clulas HeLa e suas
respectivas imagens de fluorescncia aps 24 horas de incubao
e
lavagem dos poos. a) e b) controle negativo; c) e d)
AuNP-PAMAM
G4/Jacalina-FITC 1,0 mol L-1; e) e f) Jacalina-FITC 1,0 mol L-1.
......
84
Figura 20 - Imagens obtidas com um aumento de 40 vezes das
clulas L929 e suas
respectivas imagens de fluorescncia aps 24 horas de incubao
e
lavagem dos poos. a) e b) controle negativo; c) e d)
AuNP-PAMAM
G4/Jacalina-FITC 1,0 mol L-1; e) e f) Jacalina-FITC 1,0 mol L-1.
......
85
Figura 21 - Viabilidade das clulas a) HeLa e b) L929 aps 24 de
incubao com as
amostras. Os valores correspondem a mdia e o desvio padro
obtidos a
partir de trs experimentos independentes e em triplicata para
cada
concentrao. *diferena significativa com relao ao controle (p
-
Figura 25 - Espectro de emisso para BeCen1 e o complexo
AuNP-BeCen1 ..............
92
Figura 26 - Espectros de CD da protena BeCen1 livre e do
complexo AuNP-
BeCen1.
......................................................................................................
93
Figura 27 - Espectroscopia no Infravermelho a) BeCen1 e b)
AuNP-BeCen1.. ...........
95
Figura 28 - Espalhamento da luz a 350 nm como funo do tempo aps
rpida
transferncia da soluo do gelo para uma dada temperatura em
tampo
Tris pH = 7,0: a) AuNP-BeCen1, b) BeCen1 livre e c)
AuNP-PAMAM
G4.
..............................................................................................................
97
Figura 29 - Espalhamento da luz a 350 nm como funo do tempo do
complexo
AuNP-BeCen1 aps ter sido submetido a elevadas temperaturas
(Figura
27a) e, posteriormente, passar diferentes tempos no gelo
.........................
98
Figura 30 - Imagens de TEM do complexo AuNP-BeCen1 a) antes e b)
aps o
aquecimento
...............................................................................................
99
Figura 31 - Representao esquemtica do processo de agregao
induzida pela
temperatura do complexo AuNP-BeCen1.
.................................................
99
-
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dimetro mdio obtido a partir dos histogramas de
distribuio de
tamanho.
..........................................................................................................
68
Tabela 2 - Porcentagens da estrutura da Jacalina livre e do
complexo AuNP-PAMAM
G4/Jacalina. Estimativa realizada utilizando o programa
CONTINLL
(CD/Pro Package) (97)
....................................................................................
70
Tabela 3 - Potencial zeta obtido para amostras em pH = 7,4
........................................... 75
Tabela 4 - Bandas e atribuies encontradas no espectro de
infravermelho para a
AuNP-PAMAM G4, Jacalina e AuNP-PAMAM G4/Jacalina (30, 83).
........
77
Tabela 5 - Parmetros termodinmicos para a interao das AuNP-PAMAM
G4 com a
Jacalina obtido a partir do ajuste dos dados utilizando o modelo
de um stio
de ligao (One Sites).
....................................................................................
79
Tabela 6 - Porcentagens da estrutura da BeCen1 livre e do
complexo AuNP-BeCen1.
Estimativa realizada utilizando o programa CONTINLL (CD/Pro
Package)
(97)
..................................................................................................................
93
Tabela 7 - Bandas e atribuies encontradas no espectro de
infravermelho para a
BeCen1 livre e conjugada com as AuNPs (82).
..............................................
95
-
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
A Absorbncia
an Coeficiente de Mie
ANOVA Anlise de varincia
Antgeno T Antgeno Thomsen-Friedenreich
AuNPs Nanopartculas de ouro
bn Coeficiente de Mie
BSA Albumina de soro bovino
C Concentrao
CD Dicrosmo Circular
DLS Espalhamento de luz dinmico
DMSO Dimetilsulfxido
EDTA cido etilenodiamino tetra-actico
F Intensidade de fluorescncia da protena na presena do
supressor
F0 Intensidade de fluorescncia da protena na ausncia do
supressor
F Intensidade de fluorescncia da protena saturada com o
supressor
fa Frao de stios de fluorforos acessveis ao ligante
FITC Isoticianato de fluorescena
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com transformada de
Fourier
GFP Protena verde fluorescente
HeLa Clulas epiteliais de carcinoma cervical humano
HSA Albumina de soro humano
IPTG Isopropil--D-tiogalactopiranosdeo
ITC Calorimetria de Titulao Isotrmica
Ka Constante de afinidade
Kq Constante de supresso bimolecular
KSV Constante de Stern-Volmer
KSVa Constante de Stern-Vomer da frao acessvel
Caminho tico
L929 Fibroblastos de adipcitos de camundongo
LB Meio de cultura Luria Bertani
MTOCs Centros Organizadores de Microtbulos
-
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazlico
PAMAM G4 Dendrmero poli(amidoamina) Gerao 4
PDB Banco de Dados de Protenas (Protein Data Bank)
PBS Tampo fosfato salino
Potencial Potencial zeta
QSE Efeitos Qunticos de tamanho
SBF Soro bovino fetal
SDS Dodecil sulfato de sdio
SERS Espalhamento Raman intensificado por superfcie
SPR Ressonncia de Plasmon de Superficie
T Temperatura
TEM Microscopia Eletrnica de Transmisso
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
UV-VIS Espectroscopia no Ultravioleta-Visvel
G Variao da energia molar de Gibbs
H Variao da entalpia molar
S Variao da entropia molar
Coeficiente de absortividade molar
m Funo dieltrica
0 Tempo de vida
-
SUMRIO
1. INTRODUO
...............................................................................................................
25
2. REVISO BIBLIOGRFICA
.......................................................................................
27
2.1 Nanocincia e Nanotecnologia
.......................................................................................
27
2.1.1 Estabilidade de nanomateriais
.................................................................................
29
2.2 Nanoparticulas de ouro
...................................................................................................
30
2.3 Sntese de nanoparticulas de ouro
...................................................................................
32
2.4 Nanobiotecnologia
..........................................................................................................
33
2.5 Nanoparticulas teransticas: materiais multifuncionais para
aplicao em
nanomedicina
........................................................................................................................
35
2.5.1 Jacalina
....................................................................................................................
36
2.6 Utilizao de biomolculas na auto-organizao de nanomateriais
.............................. 38
2.6.1 BeCen1
.....................................................................................................................
39
2.7 Citotoxicidade de nanomateriais
.....................................................................................
40
4. MATERIAIS E MTODOS
...........................................................................................
45
4.1 Materiais
.........................................................................................................................
45
4.2 Estudos do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC
............................................. 45
4.2.1 Sntese de Nanopartculas de ouro estabilizadas em PAMAM-G4
.......................... 45
4.2.2 Obteno e purificao da Jacalina
........................................................................
46
4.2.3 Marcao da Jacalina com FITC
............................................................................
47
4.2.4 Conjugao da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4
.............................................. 48
4.2.5 Estudos qualitativos da interao do complexo AuNP-PAMAM
G4/Jacalina-FITC
com clulas tumorais e saudveis
.....................................................................................
49
4.2.6 Ensaios de citotoxicidade in vitro
............................................................................
50
4.3 Estudos do complexo AuNP-BeCen1
.............................................................................
51
4.3.1 Expresso e purificao da centrina BeCen1
.......................................................... 51
4.3.2 Sntese in situ das nanoparticulas de ouro com BeCen1
......................................... 52
4.3.3 Monitoramento da polimerizao controlada por temperatura
por meio de medidas
de espalhamento de luz
.....................................................................................................
53
4.4 Tcnicas de Caracterizao
.............................................................................................
53
4.4.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM)
...................................................... 53
-
4.4.2 Espectroscopia no Ultravioleta-Visvel (UV-VIS)
................................................... 54
4.4.3 Espectroscopia de Fluorescncia
............................................................................
55
4.4.4 Dicrosmo Circular (CD)
........................................................................................
56
4.4.5. Espectroscopia de Infravermelho (FTIR)
...............................................................
56
4.4.6 Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC)
........................................................... 57
4.4.7 Espalhamento de luz dinmico (DLS)
.....................................................................
59
4.4.8 Potencial Zeta ()
.....................................................................................................
59
5. RESULTADOS E DISCUSSO
....................................................................................
61
5.1 Sntese e caracterizao das AuNP-PAMAM G4
.......................................................... 61
5.2 Sntese e caracterizao do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina
............................. 64
5.2.1 Espalhamento de Luz Dinmico (DLS)
...................................................................
66
5.2.2 Dicrosmo Circular (CD)
........................................................................................
69
5.2.3 Espectroscopia de Fluorescncia
............................................................................
70
5.2.4 Potencial Zeta ()
.....................................................................................................
75
5.2.5 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR)
................................................................
75
5.2.6 Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC)
........................................................... 78
5.2.7 Microscopia Eletrnica de Transmisso
.................................................................
81
5.2.8 Testes qualitativos in vitro
.......................................................................................
83
5.2.9 Ensaios de citoxicidade
...........................................................................................
86
5.3 Sntese e caracterizao do complexo AuNP-BeCen1
................................................... 88
5.3.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM)
..................................................... 90
5.3.2 Espectroscopia de Fluorescncia
............................................................................
91
5.3.3 Dicrosmo Circular (CD)
........................................................................................
92
5.3.4 Espectroscopia vibracional (FTIR)
.........................................................................
93
5.3.5 Anlise da propriedade termorresponsiva do complexo
AuNP-BeCen1 ................ 95
6. CONCLUSES
.............................................................................................................
101
7. PERSPECTIVAS
..........................................................................................................
103
REFERNCIAS
...................................................................................................................
105
-
25
Introduo
1. INTRODUO
O desenvolvimento de nanomateriais hbridos, que incorporam as
propriedades de
reconhecimento e catalticas de biomolculas com as propriedades
eletrnicas, ticas e
magnticas nicas exibidas pelas nanopartculas, tem resultado em
nanobiocompsitos com
elevado impacto em medicina. Suas aplicaes vo desde sistemas de
liberao controlada de
frmacos e marcadores biolgicos, at sistemas para deteco e
diagnstico de doenas (1, 2,
3). O crescente interesse na aplicao destes nanocompsitos em
medicina tem levado ao
surgimento de uma nova rea de pesquisa denominada nanomedicina
(4).
Em particular, nanopartculas de ouro so interessantes devido s
suas propriedades
ticas e eletrnicas diferenciadas (1), fazendo com que sejam teis
para diversas aplicaes
como deteco de analitos (5), biossensores (6), agentes de
contraste em imagens de
Microscopia Eletrnica de Transmisso (7) e raios X (8), veculo
para a entrega de molculas
dentro das clulas (1) e na teraputica do cncer (9). Para esta
ltima, normalmente,
requerido que as partculas se alojem especificamente na regio de
interesse. Esta
especificidade pode ser alcanada por meio da funcionalizao de
sua superfcie com
biomolculas como protenas (10), peptdeos (11), aptmeros (12) e
anticorpos especficos
(13). Assim, o desenvolvimento de nanobiocompsitos baseados em
nanopartculas de ouro
tem tido um importante impacto no diagnstico e tratamento de
doenas.
A interao entre nanopartculas e biomolculas , em muitos casos,
facilitada pela
compatibilidade de tamanhos, e pode ocorrer de maneira sinrgica,
fazendo com que
propriedades melhoradas ou totalmente novas sejam obtidas a
partir da escolha e
processamento adequado dos materiais. Esta conjugao proporciona,
alm do aumento da
estabilidade do sistema, a introduo de funcionalizaes
biocompatveis e interaes
biolgicas adicionais aos nanomateriais. Biomolculas possuem
interaes de reconhecimento
complementares fortes e especficas, que permitem levar
nanoparticulas at clulas de
interesse por meio do seu recobrimento com receptores adequados
(2).
Outra questo importante a organizao de nanopartculas para a
obteno de
estruturas bem definidas que possam ser integradas em
dispositivos para aplicaes
tecnolgicas (14). Para isto, nanoparticulas podem ser conjugadas
com biomolculas que
-
26
Introduo
possuem propriedades responsivas, permitindo a obteno de
materiais com forma, tamanho,
alinhamento e orientao controlados (15, 16).
Apesar do desenvolvimento considervel nesta rea, reativamente
pouco conhecido a
respeito das interaes entre nanoparticulas e biomolculas, o que
representa uma questo
muito importante em reas emergentes como nanomedicina e
nanotoxicologia. Para o
eficiente desenvolvimento destes nanobiocompsitos so necessrios
tanto o entendimento
dos mecanismos de interao que ocorrem entre as biomolculas e os
nanomateriais quanto o
controle dos mtodos de manipulao utilizados para conjugao e
posterior aplicao destes
nanobiocompsitos.
O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da sntese
e caracterizao
de nanoparticulas funcionalizadas com biomolculas. Em especial,
visamos o entendimento e
caracterizao das interaes entre nanoparticulas de ouro e
protenas por meio do estudo de
dois sistemas distintos: nanoparticulas de ouro funcionalizadas
com Jacalina para a fabricao
de nanocompsitos especficos para clulas tumorais, e
nanoparticulas de ouro
funcionalizadas com BeCen1 para a construo de nanobiocompsitos
termorresponsivos e
auto-organizados. Os novos nanobiocompsitos aqui desenvolvidos
podem apresentar
aplicaes relevantes em smart drug delivery e estudos de
nanotoxicidade.
-
27
Reviso Bibliogrfica
2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Nanocincia e Nanotecnologia
Materiais nanoestruturados tm adquirido cada vez mais importncia
em diferentes
reas da cincia e tecnologia, onde projetar e controlar
propriedades de interesse no nvel
atmico e molecular relevante para o desenvolvimento de novos
materiais com propriedades
e aplicaes fundamentalmente novas (3). Nanocincia pode ser
definida como o estudo dos
fenmenos e manipulao dos materiais nas escalas atmica e
molecular, onde as
propriedades diferem significativamente daquelas de uma escala
maior, e nanotecnologia
como o design, caracterizao, produo e aplicao de estruturas,
dispositivos e sistemas por
meio do controle de forma e tamanho na escala nanomtrica
(17).
Os fundamentos da nanocincia e nanotecnologia foram inicialmente
propostos pelo
fsico norte-americano Richard Feynman em uma conferncia
proferida em 1959 com o ttulo
Theres Plenty of Room at the Bottom. Nesta palestra, Feynman
introduziu a discusso do
tema mostrando as possibilidades de miniaturizao e terminou com
uma explorao do que
poderia ser obtido a partir do controle dos materiais, tomo por
tomo (3).
A nanocincia e a nanotecnologia tm como base dois conceitos para
a obteno de
sistemas nanoestruturados: top-down (de cima para baixo) e
bottom-up (de baixo para cima)
(18). A primeira abordagem consiste na miniaturizao dos
materiais e das estruturas da
escala microscpica para a escala nanoscpica. Este tipo de
abordagem exige o domnio de
toda tecnologia da microeletrnica, implicando no aprimoramento
de um vasto arsenal de
recursos. A segunda se baseia na construo de estruturas e
nanomateriais a partir de tomos e
molculas individuais por meio de processos que permitam o
controle tridimensional, gerando
sistemas cada vez mais complexos (18). Para tal finalidade,
podem ser utilizadas estruturas
orgnicas e inorgnicas menores, que serviriam como blocos de
construo para as
nanoestruturas.
As propriedades diferenciadas ou melhoradas dos materiais quando
estruturados na
escala nanomtrica advm de dois fatores principais: efeitos de
superfcie e qunticos de
tamanhos (QSE, do ingls Quantum Size Effects) (19). O aumento da
razo entre a rea
-
28
Reviso Bibliogrfica
superficial e o volume resulta em um correspondente aumento na
reatividade qumica (3),
fazendo com que alguns nanomateriais sejam timos para aplicao em
catalisadores,
aumentando a eficincia em clulas a combustvel e sensores (20),
por exemplo. Em tamanhos
intermedirios entre o molecular e a matria estendida (bulk
matter), chamado de nanoescala,
estados de energia individuais das molculas e bandas continuas
dos slidos estendidos se
tornam discretos, e sua separao de energia mostra uma dependncia
analtica com a
dimenso espacial do material (19). Um esquema mostrado na Figura
1 e representa a
transformao dos estados de densidade eletrnica das bandas de
valncia e conduo, em
metais e semicondutores, do contnuo para o discreto, conforme a
matria passa de um estado
estendido para o atmico (21). Estes efeitos qunticos possuem
consequncias diretas nas
propriedades eletrnicas, ticas e magnticas destes materiais.
Portanto, no a estrutura e a composio do material que so novas,
mas sim sua
forma, tamanho, arranjo ou orientao. Isto o que produz materiais
com novas funes e
novas utilidades. Assim, o desafio no consiste somente em
fabricar materiais com a
composio adequada, mas tambm com tamanho e forma controlados.
Igualmente
importante que estes nanomateriais tenham a superfcie, carga e
funcionalidade requerida,
uma vez que as propriedades de superfcie controlam as interaes
entre estes materiais e o
ambiente, determinando suas propriedades.
Figura 1 - Representao esquemtica da variao de densidade de
estados em funo do tamanho do material
Adaptado de (21).
-
29
Reviso Bibliogrfica
2.1.1 Estabilidade de nanomateriais
Uma fase coloidal termodinamicamente instvel quando comparada
com uma fase
contnua (22). Isto pode ser explicado pela relao entre a variao
da energia livre de Gibbs
(dG) e a variao na rea superficial de uma amostra (d), a
temperatura e presso constantes,
que dada por dG = d, onde a tenso superficial interfacial (22).
G diminui quando h
uma diminuio da rea superficial do sistema, o que indica uma
tendncia natural de
agregao. Desta maneira, agentes estabilizantes devem ser
utilizados de modo a alterarem as
propriedades de superfcie das nanoparticulas, assim como os
parmetros cinticos de
agregao, permitindo a estabilizao destes sistemas em
suspenses.
A estabilidade de nanomateriais em suspenso aquosa pode ser
obtida por dois
mecanismos: eletrosttico e/ou estreo. A estabilizao eletrosttica
de uma disperso de
nanoparticulas bem descrita pela teoria de
Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO),
que prev que tal estabilidade determinada pelo balano entre as
foras atrativas de van der
Waals e repulsivas eletrostticas (1). Como resultado, as
nanopartculas se mantm estveis,
sem agregao, se a intensidade da fora eletrosttica repulsiva for
maior que a intensidade da
fora atrativa de van der Waals (Figura 2a). Em outras palavras,
as nanoparticulas no
apresentam agregao se contem uma densidade de carga suficiente
na superfcie.
Na estabilizao estrea (Figura 2b), camadas de molculas longas,
como polmeros
ou tensoativos no inicos, adsorvidos na superfcie da partcula,
repelem uns aos outros por
repulso estrea, impedindo a agregao das partculas. Um efeito
combinado obtido por
meio da utilizao de polieletrlitos, que estabilizam tanto por um
mecanismo estreo quanto
eletrosttico.
Figura 2 - Representao esquemtica da estabilizao de partculas
pelo efeito a) eletrosttico e b) estreo.
a) b)
-
30
Reviso Bibliogrfica
2.2 Nanoparticulas de ouro
Nanopartculas de ouro (AuNPs) possuem propriedades ticas e
eletrnicas
diferenciadas, fazendo com que sejam interessantes para muitas
aplicaes (1, 23). Apesar de
algumas aplicaes similares poderem ser encontradas em diferentes
materiais, como
quantum dots, AuNPs so consideradas relativamente menos txicas,
devido maior inrcia
do ouro (1).
Quando AuNPs absorvem a luz, seus eltrons so excitados. Excitao
na frequncia
de ressonncia plasmonica causa uma oscilao coletiva dos eltrons
livres (23). Esta
frequncia de ressonncia plasmonica uma importante caracterstica
das AuNPs, e possui
comprimentos de onda entre 510 e 530 nm para nanopartculas com
dimetro entre 4 e 50 nm
(24). A ligao e proximidade de molculas na superfcie das
nanopartculas podem modificar
o comprimento de onda de absoro. Este efeito de acoplamento de
plasmon pode ser
utilizado para a deteco colorimtrica de analitos (5), medidas de
distncias e mudanas
conformacionais das molculas (25, 26).
Aps a absoro da energia proveniente da radiao, os eltrons
relaxam e a energia
transferida para a rede cristalina do cristal, gerando calor. O
aquecimento das AuNPs
dissipado para o meio circundante (23, 27). Clulas, e
principalmente clulas anormais, so
muito sensveis a um pequeno aumento da temperatura. Esta
propriedade pode ser utilizada no
tratamento de cncer em um conceito chamado hipertermia (23). A
ideia que as
nanopartculas se acumulem em clulas tumorais, e com isso, o
aquecimento provocado pela
radiao possa elimin-las (28). No entanto, como os tecidos
absorvem a radiao no visvel,
esta tcnica ainda limitada a tecidos prximos a pele (23). Neste
caso, o aumento da
temperatura em uma regio contendo AuNPs pode ser realizado
utilizando radiofrequncia.
Glazer e colaboradores (29) mostraram a destruio de clulas de
adenocarcinoma pancretico
tratadas com AuNPs por meio do aquecimento induzido por um campo
de radiofrequncia.
O espalhamento Raman (30) pode ser melhorado quando as molculas
esto prximas
de superfcies de ouro com elevada curvatura como, por exemplo,
AuNPs. Este efeito
conhecido como espalhamento Raman intensificado por superfcie
(SERS, do ingls Surface-
Enhanced Raman Scattering) (23). Devido ao significante aumento
do campo, SERS pode ser
usado como uma tcnica analtica extremamente sensvel, excedendo a
sensibilidade das
-
31
Reviso Bibliogrfica
tcnicas luminescentes de deteco. Alm disso, em experimentos de
Ressonncia de Plasmon
de Superfcie (SPR, do ingls Surface Plasmon Resonance), a
sensibilidade pode ser
aumentada cerca de 1000 vezes para a deteco de oligonucleotdeos
complementares
utilizando AuNPs (31).
AuNPs tambm podem ser utilizadas para a transferncia de eltrons
em reaes redox
(1). Neste caso, o objetivo detectar analitos que so substratos
de reaes enzimticas. O
fluxo de eltrons desta reao detectado por alguma medida de
corrente. Para este propsito,
enzimas so imobilizadas em subtratos condutores e conectadas a
um amplificador para a
deteco da corrente. Uma camada de AuNPs aumenta a rugosidade da
superfcie, levando ao
aumento da corrente (6). Assim, devido ao seu tamanho reduzido e
excelentes propriedades
ticas e eltricas, sensores baseados em AuNPs tm tido um
importante impacto em
diagnsticos (26).
Uma das aplicaes mais bem exploradas das AuNPs a sua utilizao
como veculo
para a entrega de molculas dentro das clulas (1, 23). Para estas
aplicaes, as molculas
normalmente so adsorvidas na superfcie das nanopartculas. Por
exemplo, um gene de DNA
pode ser introduzido na clula por adsoro em AuNPs e,
consequentemente, provocar a
expresso de protenas especficas (32). As clulas podem captar
nanopartculas coloidais por
meio de um mecanismo especfico, via receptor-ligante, ou no
especifico. A incorporao
especifica mais eficiente, pois, neste caso, as nanopartculas
modificadas com os receptores
so predominantemente incorporadas pelas clulas de interesse
(23).
AuNPs tambm so agentes de contraste muito atraentes, pois podem
ser visualizadas
com uma grande variedade de tcnicas. As principais tcnicas de
deteco so baseadas na
interao entre as AuNPs e a luz (23). Por exemplo, devido ao seu
elevado peso atmico,
AuNPs proporcionam um excelente contraste em imagens de
Microscopia Eletrnica de
Transmisso (7). AuNPs tambm espalham raios X eficientemente e,
desta maneira,
proporcionam contraste em imagens de raios X (8).
-
32
Reviso Bibliogrfica
2.3 Sntese de nanopartculas de ouro
Muitas estratgias tm sido utilizadas no preparo de
nanoparticulas metlicas, entre
elas AuNPs. Em uma sntese tpica, sais de ouro so reduzidos pela
adio de um agente
redutor que leva a nucleao e, consequente, crescimento das
partculas. No entanto, como
descrito anteriormente, um estabilizante sempre requerido e pode
tanto ser adsorvido ou
quimicamente ligado superfcie das nanopartculas (23). Na rota
mais comum de sntese, as
nanoparticulas so sintetizadas na presena de cido ctrico ou
citrato de sdio, que atua no
s como redutor, mas tambm fornece estabilidade s nanoparticulas
devido a sua carga
negativa (33).
Rotas de sntese similares tambm tm sido realizadas em solventes
orgnicos (34).
Nanoparticulas podem ser sintetizadas utilizando reduo bifsica
(35), onde um sal de metal
nobre dissolvido em gua e extrado por transferncia de fase em um
solvente orgnico
seguido por reduo. A fabricao das nanoparticulas tambm tem sido
realizada por mtodos
de micela reversa, onde o tamanho e disperso de tamanho das
nanoesferas podem ser
controlados por meio da composio da micela (36). Aps a sntese,
as molculas
estabilizantes podem ser substitudas por outras molculas em uma
reao de troca de ligante.
Desta maneira, possvel ajustar as propriedades da superfcie das
partculas escolhendo as
molculas estabilizantes (23).
Para aplicaes biomdicas, as nanoparticulas devem ser estveis em
soluo aquosa.
Dentre os diferentes tipos de molculas que podem ser utilizadas
como estabilizantes,
nanoparticulas funcionalizadas com polmeros tm emergido como
materiais multifuncionais
com grande potencial para aplicao em reas como biossensores,
imageamento, dispositivos
ticos, entre outros (23). Esta funcionalizao permite a obteno de
nanomateriais hbridos
orgnico/inorgnico, cujos parmetros como tamanho, forma, grupos
funcionais na superfcie
podem ser ajustados pela escolha adequada do polmero na
superfcie (37).
Dentre os polmeros, os dendrmeros, que so macromolculas com
baixa
polidispersividade e arquitetura tridimensional regular e
altamente ramificada (38, 39), tem
sido amplamente utilizados para encapsular ou estabilizar
nanoparticulas metlicas (40, 41,
42). Uma vez que possuem composio e estrutura bastante
definidas, a utilizao de
dendrmeros permite a reprodutibilidade na fabricao das
nanopartculas (40, 41). Alm
-
33
Reviso Bibliogrfica
disso, os grupos terminais dos dendrmeros podem ser adaptados
para controlar a solubilidade
do nanocompsito e usado para facilitar a ligao com superfcies ou
outras molculas (43). A
Figura 3 (38) mostra a estrutura do dendrmero poli(amidoamina)
gerao 4 (PAMAM G4),
utilizado no presente trabalho para a sntese das AuNPs. O nmero
da gerao est
diretamente relacionado quantidade de ramificaes e,
consequentemente, de grupos
funcionais na superfcie dos dendrmeros.
Figura 3 - Estrutura molecular do dendrmero PAMAM G4 (38).
2.4 Nanobiotecnologia
A convergncia da biotecnologia e da nanotecnologia tem levado ao
desenvolvimento
de nanomateriais hbridos que incorporam as propriedades de
reconhecimento e catalticas dos
biomateriais, como protenas e enzimas, com as propriedades
eletrnicas e ticas nicas das
nanopartculas (2). A funcionalizao de nanopartculas com
biomolculas resulta na
mudana de suas propriedades e interaes com o meio. A
solubilidade das nanopartculas em
meio aquoso, por exemplo, pode ser melhorada por meio da
funcionalizao de suas
superfcies com biomolculas altamente hidroflicas. Desta maneira,
modificaes da
superfcie de nanoestruturas utilizando biomolculas no s fornecem
interaes biolgicas
adicionais como tambm melhoram sua solubilidade e
biocompatibilidade (10). Estes novos
nanobiocompsitos hbridos com propriedades e funes sinrgicas
constituem uma nova rea
de pesquisa, a nanobiotecnologia (2).
-
34
Reviso Bibliogrfica
Diversas biomolculas tm sido conjugadas com nanoparticulas. Por
exemplo,
nanoparticulas de ouro conjugadas com oligonucleotdeos so de
grande interesse, pois a
complementaridade de pares de base do DNA faz com que esses
complexos sejam altamente
especficos. Esta propriedade pode ser utilizada em biossensores,
na deteco de sequncias
especficas do DNA associadas a anomalias ou doenas (44), bem
como para a organizao de
nanoestruturas supramoleculares (45). Protenas esto envolvidas
em quase todos os
processos biolgicos e so empregadas em uma ampla gama de formas
devido sua
especificidade funcional. Desta maneira, nanoestruturas baseadas
em protenas podem ser a
chave para o desenvolvimento de materiais multifuncionais e
dispositivos para aplicaes
biotecnolgicas (2).
A conjugao de biomolculas e nanomateriais tem sido realizada por
uma variedade
de tcnicas que vo desde adsoro eletrosttica ou ligao covalente
at reduo dos metais
na presena de biomolculas (2). A conjugao qumica de
nanopartculas com protenas
envolve a complexao da protena com nanoparticulas modificadas em
suspenso.
Geralmente, molculas contendo grupamentos amina ou carboxlico so
utilizadas para
acoplar as nanoparticulas s protenas (1). Uma opo para a
biofuncionalizao de AuNPs
por meio da ligao direta da biomolcula na sua superfcie.
Pequenos peptdeos ou protenas
globulares, por exemplo, tm sido conjugados diretamente na
superfcie de AuNPs, utilizando
grupamentos tiis proveniente do resduo de aminocido cistena
(46). DNA modificado com
tiol tambm tem sido diretamente conjugado com AuNPs (32).
possvel observar que a biofuncionalizao dos nanomateriais
normalmente
realizada por meio da ligao superficial aps a fabricao das
nanoparticulas. Normalmente,
vrias etapas adicionais de reaes e lavagens so requeridas, alm
da utilizao de outros
tipos de molculas funcionalizantes (47). A conjugao in situ das
nanoparticulas tem sido
uma tima alternativa para estes casos (47, 48). Nesta
metodologia, o conjugado
nanopartcula-protena sintetizado em uma nica etapa e nenhum
outro estabilizante ou
molcula de entrecruzamento so necessrios. A biomolcula funciona
tambm como
estabilizante, diminuindo a quantidade de interferentes no meio
(48).
Apesar do desenvolvimento de muitas estratgias de bioconjugao, a
aplicao
biomdica de nanobiocompsitos ainda apresenta muitos desafios, j
que no apenas uma
conjugao apropriada requerida, mas tambm outros importantes
aspectos que dizem
respeito a biocompatibilidade e especificidade (1). Estes
aspectos incluem: preveno da
agregao da nanopartcula no meio biolgico, preveno da adsoro no
especifica de
-
35
Reviso Bibliogrfica
biomolculas na superfcie da nanopartcula, especificidade e baixa
toxicidade (1). Portanto, a
aplicao biomdica de nanobiocompsitos depende tanto das
propriedades fsico-qumicas
das nanoparticulas quanto da atividade biolgica da biomolcula.
Entender os processos de
preparao e estabilidade destes nanoconjugados importante para
obter sistemas com a
reatividade desejada.
2.5 Nanoparticulas teransticas: materiais multifuncionais para
aplicao em
nanomedicina
O crescente interesse da aplicao da nanotecnologia em medicina
tem levado ao
surgimento de um novo campo chamado nanomedicina (4). Mais
recentemente, o termo
teranstico (do ingls theranostic, consiste na unio das palavras
therapeutic e
diagnostic) tem sido utilizado para descrever agentes
multifuncionais que combinam
capacidades teraputicas e de diagnstico (49). Esta lgica surgiu
do fato de que algumas
doenas, como cncer, so imensamente heterogneas e os tratamentos
existentes so
limitados e efetivos em apenas alguns estgios da doena. A ideia,
portanto, consiste no
desenvolvimento de complexos versteis a partir do casamento
entre diagnstico e teraputica
(9).
Nanovetores multifuncionais especficos para clulas cancergenas
tm se mostrado
excelentes candidatos para o tratamento e diagnstico de cncer e,
por isso, o termo
teranstico tem sido amplamente aplicado a nanomateriais. No
entanto, a utilizao
eficiente de nanomateriais para o diagnstico e tratamento de
cncer requer que estas
partculas se alojem especificamente na regio de interesse. Esta
especificidade pode ser
alcanada por meio da funcionalizao de sua superfcie com
biomolculas como protenas
(10), peptdeos (11), aptmeros (12) e anticorpos especficos
(13).
Complexos formados por nanoparticulas funcionalizadas com
molculas de
reconhecimento melhoram a biodistribuio e o direcionamento das
nanoparticulas at o
tumor (1, 23, 49). As nanopartculas, alojadas na regio de
interesse, podem, ento, ser
utilizadas para a deteco precoce de cncer por meio de tcnicas de
imageamento, alm de
auxiliarem no tratamento, como por hipertermia (23). Ainda,
nestes nanocomplexos pode ser
adicionado um antitumoral que direcionado especificamente at a
regio cancergena,
-
36
Reviso Bibliogrfica
diminuindo, assim, os efeitos colaterais deste frmaco (50). A
Figura 4 (51) mostra uma
representao esquemtica de uma nanopartcula teranstica atuando no
reconhecimento
especifico, podendo ser utilizada, portanto, no diagnstico, e na
liberao controlada de
frmacos para o tratamento (51).
Figura 4 - Representao esquemtica de uma nanopartcula
teranstica. Nanopartculas multifuncionais so
direcionadas at a membrana de clulas cancergenas usando um
ligante especfico para um receptor
na superfcie da clula (51).
2.5.1 Jacalina
Lectinas correspondem a uma classe de protenas que se ligam
especificamente a
carboidratos (52). Suas principais atividades biolgicas esto
relacionadas ao
reconhecimento celular, interaes patgeno-hospedeiro, sinalizao,
diferenciao celular e
resposta imune por meio da ligao a carboidratos especficos
contidos na superfcie das
clulas (52, 53).
A Jacalina, uma lectina vegetal encontrada na semente da jaca,
um ligante especifico
para a galactose e para que esta interao ocorra no necessria a
presena de ons metlicos
(54). Na sua estrutura existem de 7 a 10% de carboidratos e no
contm resduos de cistena.
A Jacalina possui massa molar de 66000 g mol-1
e ponto Isoeltrico (pI) em uma faixa ampla
de pH, entre 4 e 8,5, sugerindo a presena de isoformas (54).
Possui a forma de um
homotetrmero em pH neutro com cada unidade tendo 16,5 kDa.
Bourne e colaboradores (55)
mostraram que os cristais obtidos a partir da Jacalina pertencem
ao grupo espacial P21 com
dimenses de cela unitria de 5,8 nm, 8,23 nm e 6,29 nm, contendo
um tetrmero de Jacalina
por unidade assimtrica. A Figura 5 ilustra sua estrutura
tetramrica (PDB 1KU8).
-
37
Reviso Bibliogrfica
Figura 5 - Estrutura tetramrica da Jacalina extrada do pdb
(cdigo 1KU8).
Como a Jacalina uma lectina tetramtrica e possui quatro stios de
ligao, estabelece
uma ponte ligante entre as clulas, ligando-se a carboidratos
presentes na superfcie de
diferentes clulas ao mesmo tempo, formando uma rede que se
aglutina (54). Alm disso, a
Jacalina pode ser um estimulante potente e seletivo de funes
distintas das clulas T e
apresenta a habilidade de reconhecer especificamente IgA de soro
humano. Ela tambm
interage com regies especficas do CD4 e inibe a infeco de HIV in
vitro (54).
A Jacalina tambm tem chamado ateno devido sua capacidade de
reconhecer
especificamente os resduos de galactose e acetilgalactosamina
(GalNac) interligados nas
posies 1-3 (Gal1-3GalNAc), dissacardeo associado a tumores de
origem oncofetal e
conhecido como antgeno Thomsen-Friedenreich (antgeno T) (53, 56,
57, 58). Este
dissacardeo expresso em aproximadamente 90% dos tipos de cnceres
humano, incluindo
carcinomas humanos como de mama, bexiga, cavidade bucal,
prstata, ovrio, fgado e
estmago (53, 59). Na maioria destes casos, o aumento da expresso
deste antgeno est
relacionado com a progresso do cncer e processos de metstase
(59).
Desta maneira, o desenvolvimento de um complexo contendo
Jacalina e
nanoparticulas apresenta elevado potencial de aplicao em
biotecnologia e medicina para
atuao no diagnstico precoce e tratamento de cncer, onde
nanopartculas funcionalizadas
com esta lectina podem ser carreadas especificamente at clulas
tumorais.
-
38
Reviso Bibliogrfica
2.6 Utilizao de biomolculas na auto-organizao de
nanomateriais
A natureza, em um processo de engenharia evolutiva lenta, tem
otimizado o
planejamento e a sntese de materiais com estruturas
impressionantes e cada vez mais
versteis e resistentes. Segundo Geoffrey A. Ozin em seu livro
Nanochemistry: a chemical
approach to nanomaterials (19) razovel que pesquisadores
interessados na fabricao de
novos materiais aprendam como a natureza tem resolvido problemas
que so frequentemente
encontrados na cincia e tecnologia. Este sinergismo entre a
natureza e a qumica de materiais
tem inspirado o desenvolvimento de materiais com estruturas e
propriedades
fundamentalmente novas (19).
A fabricao controlada de estruturas em escalas muito reduzidas
que vo alm dos
limites atuais das tcnicas de litografia uma meta tecnolgica de
grande interesse prtico e
fundamental (14). Mtodos para atingir este objetivo so baseados
principalmente na
estabilizao de nanoparticulas por polmeros que respondam a algum
estimulo externo como
pH (60), luz (61) ou temperatura (62). Estes materiais so
chamados de materiais inteligentes
(smart materials) (63) e possuem pelo menos uma de suas
propriedades, como forma ou
solubilidade, drasticamente modificada em resposta a algum
destes estmulos.
Outra estratgia incorpora o uso de biomolculas para organizar
nanomateriais em
padres predefinidos. A combinao destas molculas biolgicas com
nanomateriais
inorgnicos funcionais pode levar a muitas organizaes com forma,
tamanho, alinhamento e
orientao controlados (15, 16). Por exemplo, por meio da conjugao
de fitas simples de
DNA com nanoparticulas de ouro, Sharma e colaboralores (16)
formaram nanoestruturas
tubulares com vrias conformaes e quiralidades, semelhantes s dos
nanotubos de carbono,
o que, segundo os autores, pode representar um avano substancial
para aplicaes de
nanomateriais em dispositivos. O reconhecimento biolgico, como
antgeno-anticorpo,
protena-substrato, entre outros, tambm tem sido utilizado para
induzir a agregao
reversvel de nanoparticulas inorgnicas (64).
-
39
Reviso Bibliogrfica
2.6.1 BeCen1
Centrinas so protenas de aproximadamente 20000 g mol-1
e que possuem quatro
domnios EF-hand de ligao de clcio usualmente encontradas em
Centros Organizadores de
Microtubulos (MTOCs, do ingls Microtubule-organizing centers)
(65). Inicialmente isolada
de razes flageladas na alga verde unicelular Tetraselmis
striata, homlogos de centrinas
foram localizados tambm em organismos eucariotos como fungos,
plantas e animais (65, 66).
As centrinas parecem estar envolvidas em diversos processos que
vo desde reparao por
exciso de nucleotdeos e transduo de sinais em clulas
fotorreceptoras at transporte de
RNAm ncleo-citoplasma (65, 66). No entanto, suas funes mais bem
caracterizadas so a
contrao de fibras dependente de clcio de clulas flageladas e
orientao, localizao e
separao de corpos basais e duplicao de MTOCs, essencial para a
mitose (66).
A centrina utilizada no presente trabalho chamada de BeCen1 e
foi inicialmente
isolada do fungo Blastocladiella emersonii (66). Atualmente
produzida heterologamente por
E.coli. Esta centrina possui a habilidade de formar filamentos
nanomtricos em funo da
temperatura (67), podendo apresentar, portanto, um elevado
potencial biotecnolgico. A
Figura 6 (67) mostra uma imagem de Microscopia Eletrnica de
Transmisso da protena
BeCen1 utilizando acetato de uranila como agente de contraste,
onde possvel identificar a
formao dos filamentos aps o aquecimento da protena. Tourbez e
colaboradores (65)
tambm analisaram este processo reversvel de formao de filamentos
na centrina humana
HsCen2, que possui 70% de identidade com a BeCen1.
Figura 6 Imagem de Microscopia Eletrnica de Transmisso da
protena BeCen1 contrastada com acetato de
uranila mostrando a formao de filamentos aps o aquecimento
(67).
-
40
Reviso Bibliogrfica
Devido a esta interessante propriedade, a conjugao de
nanoparticulas com esta
protena pode ser utilizada como uma estratgia para a produo de
nanomateriais auto-
organizados com potencial para vrias aplicaes tecnolgicas como a
fabricao de
nanodispositivos e processos bioanalticos (60).
2.7 Citotoxicidade de nanomateriais
Nanomateriais possuem elevado potencial para aplicaes mdicas que
vo desde
imageamento e diagnstico at liberao controlada de frmacos e
teraputica (9). Por este
motivo, a toxicidade e biocompatibilidade destes nanomateriais
devem ser cuidadosamente
avaliadas. Uma vez que nanomateriais no so caracterizados apenas
pela sua composio
qumica, mas tambm por suas dimenses fsicas especiais, estudos de
toxicidade devem ser
realizados com nfase no entendimento das propriedades
fsico-qumicas que resultam nas
respostas biolgicas adversas (68, 69). Isto significa que a
toxicidade, a atividade e interao
dos diferentes tipos de nanomateriais necessitam ser
rigorosamente testados. Ensaios de
citotoxicidade in vitro so uma maneira simples para avaliar a
toxicidade bsica de um
material (70).
A citotoxicidade de AuNPs tem sido descrita na literatura como
dependente do
tamanho. Por exemplo, Pan e colaboradores (71) mostraram em
estudos in vitro que
nanoparticulas de ouro com 1,4 nm de dimetro provocam morte
celular por meio da induo
de estresse oxidativo e danos mitocondriais. Outros estudos
apontam que nanoparticulas de
ouro maiores, acima de 3,7 nm, praticamente no apresentam
toxicidade (72, 73). Vale
ressaltar, no entanto, que essa toxicidade tambm fortemente
dependente da dose (72).
A estabilidade e biocompatibilidade das AuNPs podem ser
melhoradas por meio da
funcionalizao de sua superfcie (69, 73). Esta cobertura das
nanoparticulas determina suas
propriedades fsico-qumicas, como tamanho total e carga da
superfcie. Goodman e
colaboradores (74) mostraram que a toxicidade de AuNPs
dependente da carga superficial.
Assim, a carga um fator extremamente importante no s na
determinao da estabilidade
do complexo, mas tambm na extenso das interaes entre a clula e
as nanopartculas (69).
Alm disso, etapas posteriores sntese, como lavagem dos
nanomateriais para retirada de
-
41
Reviso Bibliogrfica
compostos provenientes da sntese, controle da agregao no meio
biolgico, e pH, podem ser
determinantes para a toxicidade destes materiais (69).
Torna-se claro que a toxidade de nanomateriais fortemente
dependente de diversos
fatores como tamanho, forma, concentrao e propriedades de
superfcie. Desta maneira, o
controle destes parmetros e a caracterizao detalhada destes
materiais so de fundamental
importncia para a determinao de suas propriedades no meio
biolgico. Para cada tipo de
nanomaterial, a citotoxicidade deve ser cuidadosamente avaliada
e entendida com base nas
suas caractersticas fsico-qumicas. Este conhecimento importante
no s para entender os
seus efeitos adversos, mas tambm para otimizao dos nanomateriais
para futuras aplicaes
biomdicas.
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42
-
43
Objetivos
3. OBJETIVOS
O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da sntese
e caracterizao
de AuNPs funcionalizadas com protenas. Em especial, visamos o
entendimento e
caracterizao das interaes entre nanoparticulas e biomolculas com
vistas aplicao em
medicina, por meio do estudo de dois sistemas distintos:
AuNPs funcionalizadas com a protena Jacalina para a fabricao de
nanopartculas
teransticas especficas para clulas tumorais. Este sistema ser
caracterizado por tcnicas
microscpicas, espectroscpicas e calorimtricas.
AuNPs funcionalizadas com a protena BeCen1 para a construo de
nanocompsitos
termorresponsivos e auto-organizados.
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44
-
45
Materiais e Mtodos
4. MATERIAIS E MTODOS
4.1 Materiais
Todos os reagentes foram utilizados como adquiridos. Todas as
solues foram
preparadas utilizando gua Milli-Q (resistividade = 18,2 M cm).
cido tetracloaurico
HAuCl4, cido frmico e Isotiocianato de fluorescena (FITC, do
ingls Fluorescein
Isothiocyanate) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Dendrimero
Poli(amidoamina) gerao
4.0 (PAMAM G4) foi adquirido da Dendritech.
Na preparao do tampo PBS (do ingls, Phosphate Buffer Saline) 0,1
mol L-1
, NaCl
0,15 mol L-1
pH = 7,4 foram utilizados os seguintes reagentes: Fosfato de
potssio
monobsico e Fosfato de sdio dibsico 99% adquiridos da
Sigma-Aldrich e Cloreto de sdio
da J.T.Baker. No preparo do tampo fosfato 10 mmol L-1
pH 7,4 tambm foram utilizados os
Fosfato de potssio monobsico e Fosfato de sdio dibsico 99% da
Sigma-Aldrich. No
preparo do tampo Tris (Tris(hidroximetil)aminometano) 20 mmol
L-1
, NaCl 150 mmol L
-1 e
Tris 20 mmol L-1
, NaCl 10 mmol L
-1, ambos em pH = 7,0, utilizou-se TRIZMAR
Base da
Aldrich e Cloreto de sdio da J.T.Baker.
4.2 Estudos do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC
4.2.1 Sntese de Nanopartculas de ouro estabilizadas em
PAMAM-G4
Nanopartculas de ouro foram obtidas na presena do dendrmero
PAMAM-G4
(AuNP-PAMAM G4). A reduo de ons metlicos na presena de
dendrmeros pode levar a
obteno de nanopartculas encapsuladas nas cavidades do dendrmero,
levando a formao
de nanoparticulas muito pequenas (menores que 5 nm) e com
elevado controle de forma e
tamanho (40) como mostra o esquema da Figura 7. Neste caso, as
nanopartculas
normalmente so obtidas por meio da reduo rpida usando NaBH4. Por
outro lado, a
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46
Materiais e Mtodos
utilizao de redutores mais fracos pode levar a obteno de
nanopartculas maiores, que no
so formadas nas cavidades e so estabilizadas por vrias molculas
de dendrmeros (75).
A sntese das nanopartculas consistiu basicamente em se adicionar
volumes iguais de
HAuCl4 1,0 mmol L-1
e PAMAM G4 0,07 mmol L-1
e, em seguida, de uma soluo de cido
frmico 10% v/v (76). A gerao 4 (Figura 4) foi escolhida no
presente trabalho, pois
possibilita a obteno de partculas com tamanhos reduzidos e
altamente estveis em meio
aquoso (77). O sistema foi mantido em agitao a temperatura
ambiente por 2 horas e, em
seguida, permaneceu em repouso e protegido da luz. Quando todo o
ouro foi reduzido, a
colorao passou de amarelo claro a vermelho. Esta reao ocorreu
durante um perodo total
de 4 horas.
Figura 7 - Representao esquemtica da sntese de nanopartculas de
ouro na presena do dendrmero PAMAM
G4 mostrando a estabilizao das nanopartculas nas cavidades do
dendrmero.
Antes de serem utilizadas, as nanoparticulas foram lavadas em
tampo fosfato 10
mmol L-1
pH = 7,4. Este tampo foi escolhido, aps a realizao de vrios
testes de
estabilidade, inclusive na presena da protena Jacalina. Para
isto, as AuNP-PAMAM G4
foram centrifugadas a 13000 rpm e 20C por 15 minutos em uma
Centrifuga Eppendorf 5415
R. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido
no tampo. Este ciclo de
lavagem foi repetido at que as nanopartculas apresentassem um pH
fisiolgico. No entanto,
devido a instabilidade das AuNP-PAMAM G4 em pH = 7,4, estas
lavagens eram realizadas
pouco tempo antes de serem utilizadas.
4.2.2 Obteno e purificao da Jacalina
A lectina Jacalina foi obtida a partir do extrato bruto das
sementes de Artocapus
integriflia em colaborao com tcnicos do Grupo de Biofsica
Molecular IFSC/USP. As
HAuCl4Reduo
-
47
Materiais e Mtodos
sementes foram lavadas com gua destilada, secas a temperatura
ambiente e, ento, trituradas
e ressuspendidas em tampo PBS pH = 7,4. Esta mistura permaneceu
em agitao por 12
horas a 4C e, ento, foi centrifugada a 4000 rpm em uma centrfuga
refrigerada Eppendorf
5804R a 4C. O sobrenadante, ou extrato bruto, foi separado e
purificado por cromatografia
de afinidade utilizando-se uma resina Sepharose contendo
D-Galactose imobilizada (Pierce)
equilibrada com o tampo PBS. Aps a passagem do extrato bruto, as
protenas que no
possuem afinidade por D-Galactose foram eludas com tampo PBS e
coletadas em tubos de
10 mL at que no se observou mais absoro em 280 nm. A Jacalina
foi, ento, eluda com
tampo PBS contendo 0,2 mol L-1
de D-Galactose.
O eluato proveniente da cromatografia de afinidade passou por
uma etapa adicional de
purificao utilizando cromatografia de excluso molecular. Volumes
de 1 mL da protena
foram aplicados em uma coluna Superdex75 3.2/30 (Pharmacia
Biotech Smart System)
acoplada a um sistema kta purifier (GE Healthcare), previamente
equilibrada com tampo
PBS pH 7,4. O fluxo utilizado foi de 0,5 mL min-1
, monitorado pela absorbncia em 220 e
280 nm. A concentrao da protena foi medida por meio da Lei de
Beer-Lambert (Equao
2), utilizando a absorbncia em 280 nm e o coeficiente de
absortividade molar desta protena.
4.2.3 Marcao da Jacalina com FITC
A Jacalina foi marcada com o fluorforo FITC, cujos comprimentos
de onda mximos
de excitao e emisso so aproximadamente 495 e 521 nm,
respectivamente. O FITC se liga
aos grupamentos amino terminal ou aminas primrias das protenas
e, portanto, no deve
interferir na conjugao da protena com as AuNP-PAMAM G4, uma vez
que estas ltimas
so funcionalizadas com grupamentos amina e devem interagir com
outros grupamentos da
protena. Esta marcao permitiu o monitoramento por microscopia de
fluorescncia da
protena e da protena conjugada com as AuNP-PAMAM G4 nos testes
posteriores realizados
em cultura de clulas.
Para a marcao, uma soluo de FITC 0,01 mol.L-1
em tampo PBS pH = 7,4 foi
adicionada a suspenso de Jacalina 1,0 mg mL-1
. O sistema foi mantido em agitao e
protegido da luz a temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida,
o excesso de FITC foi
removido por dilise no mesmo tampo em uma membrana de 25 kDa
(Spectra/Por). A
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48
Materiais e Mtodos
protena marcada Jacalina-FITC foi, ento, retirada do saco de
dilise e conjugada com as
AuNP-PAMAM G4.
4.2.4 Conjugao da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4
Vrias estratgias foram testadas para a conjugao da Jacalina com
nanoparticulas de
ouro. Na reduo in situ, por exemplo, a protena mostrou-se
instvel, precipitando logo aps
o trmino da sntese. A interao com nanoparticulas de ouro
estabilizadas em citrato tambm
no se mostrou eficiente, visto que a quantidade de protena junto
com as nanoparticulas aps
o processo de separao era muito baixa. Assim, a conjugao com as
AuNP-PAMAM G4 foi
a que apresentou os melhores resultados e escolhida para as
caracterizaes posteriores.
Desta maneira, 250 L de AuNP-PAMAM G4 dispersas em tampo fosfato
pH = 7,4
foram adicionados a 1,3 mL de uma soluo contendo 1,0 mg mL-1
de Jacalina tambm em
tampo PBS. O sistema foi mantido sob agitao a 4 C e protegido da
luz por
aproximadamente 12 horas. Tempos maiores de incubao testados no
alteraram os
resultados espectroscpicos e, portanto, este perodo foi adotado
para todos os experimentos.
A separao do excesso de Jacalina, ou seja, que no foi
eficientemente conjugada
com as AuNP-PAMAM G4, foi realizada por centrifugao. A amostra
foi centrifugada a
13000 rpm e 4 C por 15 minutos em uma Centrifuga Eppendorf 5415
R. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 500 L de tampo
fosfato 10 mmol L-1
pH = 7,4.
Este ciclo de lavagem foi repetido por mais duas vezes, para
garantir que todo o excesso de
protena fosse eliminado. A separao do excesso de protena foi
testada tambm por
Cromatografia de Excluso Molecular. No entanto, como as colunas
de excluso molecular
eram compostas por agarose e dextran, a Jacalina interagiu
fortemente com estas resinas,
obtendo-se um baixo rendimento (resultados no mostrados).
-
49
Materiais e Mtodos
4.2.5 Estudos qualitativos da interao do complexo AuNP-PAMAM
G4/Jacalina-FITC
com clulas tumorais e saudveis
Com o intuito de investigar a especificidade do complexo
AuNP-PAMAM
G4/Jacalina-FITC por clulas tumorais, anlises qualitativas
acerca da interao do complexo
AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC com clulas tumorais e saudveis foram
realizados. Todos
os reagentes utilizados na cultura de clulas foram previamente
autoclavados ou filtrados em
membrana para evitar a contaminao da cultura. Todos os
procedimentos foram realizados
em cmara de fluxo laminar com material estril. Duas linhagens
celulares foram testadas:
clulas epiteliais de carcinoma cervical humano (HeLa) e no
tumorais de fibroblastos de
adipcitos de camundongo (L929), ambas aderentes.
As clulas (1x105 clulas mL
-1) foram incubadas em meio de cultura DMEM (do
ingls, Dulbeccos modified Eagles mdium), contendo 2% de
L-glutamina, suplementado
com 15% de soro bovino fetal (SBF), 0,06 g L-1
de penicilina G e 0,10 g L-1
de estreptomicina
em estufa com atmosfera de aproximadamente 5% de CO2 e 37 C. O
crescimento celular foi
acompanhado utilizando-se o microscpio invertido Nikon Eclipse
TS 100.
As clulas foram semeadas em placas de cultura de 24 poos com
volume final de 500
L e, aps 24 horas, foram tratadas em triplicata com as
concentraes de 0,5; 1,0 e
1,5 mol L-1
do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC em tampo fosfato
10 mmol L-1
pH = 7,4 e deixadas em estufa com atmosfera de 5% de CO2 e 37 C
por,
aproximadamente, 24 horas. Com o intuito de realizar uma anlise
comparativa, as mesmas
concentraes e condies foram utilizadas para Jacalina-FITC e
AuNP-PAMAM G4. O
controle negativo foi realizado por meio da adio de quantidades
equivalentes do tampo.
Para todas as amostras e cada uma das concentraes, os
tratamentos foram realizados em
triplicata.
Aps o perodo de incubao, o meio de cultura foi retirado e as
clulas aderidas
foram lavadas trs vezes com tampo PBS pH = 7,4 estril. Em
seguida, as imagens foram
obtidas em um microscpio de fluorescncia Nikon Eclipse TS 100
acoplado a cmera digital
Nikon DS-Ri1 com objetiva de 40x. Para cada regio fotografada
por microscopia tica, sua
respectiva imagem por microscopia de fluorescncia era obtida
utilizando a excitao no azul
correspondente ao comprimento de onda de absoro do FITC.
-
50
Materiais e Mtodos
4.2.6 Ensaios de citotoxicidade in vitro
O conhecimento da toxicidade de novos materiais de fundamental
importncia para
futuras aplicaes. Desta maneira, com intuito de avaliar a
toxicidade do complexo AuNP-
PAMAM G4/Jacalina-FITC, ensaios de citoxicidade in vitro foram
realizados utilizando as
mesmas linhagens celulares, HeLa e L929, e o mesmo procedimento
para o cultivo das
clulas. As clulas foram semeadas em placas de cultura de 96 poos
com volume final de
200 L e, aps 24 horas, foram tratadas em triplicata com as
concentraes de 0,5; 1,0 e
1,5 mol L-1
do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC, da Jacalina-FITC e
AuNP-
PAMAM G4 em tampo fosfato 10 mmol L-1
pH = 7,4 e deixadas em estufa com atmosfera
de 5% de CO2 e 37 C por aproximadamente 24 horas. O controle
negativo foi realizado por
meio da adio de quantidades equivalentes do tampo.
Tanto no experimento qualitativo descrito anteriormente (Tpico
4.2.5) como no teste
de toxicidade, o clculo da concentrao do complexo foi baseado na
concentrao da
protena obtida pela absoro em 280 nm. No controle com a
Jacalina-FITC, as mesmas
concentraes de protena foram utilizadas. J para as AuNP-PAMAM
G4, um procedimento
anlogo ao utilizado para a sntese do complexo foi realizado, mas
apenas em tampo, ou seja,
na ausncia de protena, para garantir que a quantidade de
nanoparticulas fosse a mesma.
Ento, a mesma quantidade adicionada de complexo para cada
concentrao, foi tambm
adicionada de AuNP-PAMAM G4 em tampo fosfato 10 mmol L-1
.
A citotoxicidade foi analisada utilizando o ensaio MTT, um teste
utilizado para avaliar
a viabilidade celular baseado em uma reao colorimtrica. O sal
brometo de 3-(4,5-
dimetilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazlio (MTT, do ingls
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-
diphenyl-2H tetrazolium bromide) entra na mitocndria de uma
clula vivel e clivado pela
enzima succinato desidrogenase, produzindo cristais formazan, de
colorao roxa (78). A
quantidade de cristais formada diretamente proporcional ao nmero
de clulas viveis.
Assim, quanto mais escura a colorao ao final da reao, maior a
viabilidade celular.
Desta maneira, aps o perodo de 24 horas de interao das clulas
com as amostras,
10 L da soluo MTT a 5 mg mL-1
em tampo PBS pH = 7,4 foi adicionado a cada poo. As
placas foram, ento, novamente incubadas na estufa com atmosfera
de 5% de CO2 e 37 C por
3 horas. Em seguida, as placas foram centrifugadas por 5 minutos
a 3000 rpm em uma
-
51
Materiais e Mtodos
centrifuga Eppendorf 5804R utilizando um rotor de placas. O
sobrenadante foi descartado e
100 L de DMSO (Dimetilsulfxido) adicionado em todos os poos para
a solubilizao dos
cristais. Aps 5 minutos de agitao em baixa velocidade, a
absorbncia de cada poo foi
determinada utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M3
(Molecular Devices) a 570
nm.
A porcentagem relativa de clulas sobreviventes foi calculada
dividindo-se a
absorbncia das clulas tratadas por aquela do controle de cada
experimento. Para todas as
amostras e cada uma das concentraes, os tratamentos das clulas
foram realizados em
triplicata e para cada tipo de clula os experimentos foram
repetidos trs vezes, resultando em
nove medidas para cada concentrao. Os resultados foram
analisados de acordo com a mdia
desvio padro resultante destas nove medidas, e foram
estatisticamente comparados
utilizando a anlise de varincia simples (ANOVA) e o teste de
comparaes mltiplas Tukey
no software GraphPad Prisma (p < 0,05).
4.3 Estudos do complexo AuNP-BeCen1
4.3.1 Expresso e purificao da centrina BeCen1
A expresso e purificao da protena BeCen1 foram realizadas em
colaborao com a
Dra. Ana Isabel de Camargo. Brevemente, 5 mL de pr-inculo em
meio LB (Meio de cultura
Luria Bertani), contendo o antibitico canamicina 50 g mL-1
para a construo em vetor
pET28a desta protena, foi incubado a 37C e agitao de 250 rpm
durante 16 horas. Aps
este perodo, foi diludo em 500 mL de meio LB previamente
autoclavado com 50 g mL-1
de
canamicina e permaneceu em agitao constante de 250 rpm por 2
horas a 37 C. A cultura foi
induzida com 0,4 mmol L-1
de IPTG (Isopropil--D-tiogalactopiranosdeo) a 37 C e agitao
de 250 rpm por mais 4 horas.
Em seguida, a cultura foi centrifugada por 15 minutos a 5000 rpm
e o sobrenadante
descartado. As clulas foram ressuspendidas em 10 mL do tampo
Tris 20 mmol L-1
, NaCl
150 mmol L-1
, pH = 7,0 e, ento, sonicadas por 10 minutos com intervalos de
30 segundos. Os
lisados foram centrifugados por 30 minutos a 12000 rpm. O
sobrenadante foi purificado por
cromatografia de afinidade, utilizando uma coluna de Ni-NTA
super flow (Qiagen)
-
52
Materiais e Mtodos
equilibrada com 10 volumes do tampo Tris 20 mmol L-1
, NaCl 150 mmol L-1
, pH = 7,0. O
sobrenadante foi aplicado na coluna, que foi, ento, lavada com
10 volumes do tampo
contendo quantidades crescentes de imidazol de 5 a 100 mmol
L-1
para retirar os
contaminantes ligados a coluna com baixa afinidade. Finalmente,
a BeCen1 foi eluda em 300
mmol L-1
de imidazol. Este ltimo eluato foi novamente purificado por
Cromatografia de
Excluso Molecular em uma coluna Superdex 75 10/300 GL com faixa
de separao entre
3000 e 70000 Da, utilizando um sistema AKTA purifier (Amersham,
Pharmacia). A coluna
foi equilibrada e eluda com tampo Tris 20 mmol L-1
, NaCl 10 mmol L-1
pH= 7,0 contendo 1
mmol L-1
de EDTA (cido etilenodiamino tetra-actico) para retirar o
Ca2+
. A velocidade de
fluxo foi de 0,5 mL min-1
, monitorada pela absorbncia em 220 e 280 nm e o eluato
coletado
em fraes de 1 mL. As fraes contendo a protena foram lavadas em
um concentrador
utilizando o tampo Tris 20 mmol L-1
, NaCl 10 mmol L-1
pH= 7,0 para retirar o EDTA.
4.3.2 Sntese in situ das nanoparticulas de ouro com BeCen1
Na conjugao da protena BeCen1 com AuNPs, a estratgia que
apresentou os
melhores resultados foi a sntese in situ das nanopartculas, ou
seja, a reduo dos ons de
ouro na presena da protena BeCen1. Em 700 L de uma soluo da
protena a 0,8 mg mL-1
em tampo Tris 20 mmol L-1
, NaCl 10 mmol L-1
pH= 7,0, adicionou-se 100 L de uma
soluo de HAuCl4 3,0x10-4
mol L-1
. Este sistema foi mantido em agitao por alguns
minutos e, ento, 30 L de cido frmico 10% v/v foram adicionados.
O cido frmico atua
como redutor e a protena como estabilizante, sendo determinante
na forma e tamanho final
das partculas. Aps a adio do agente redutor, o sistema foi
mantido em agitao a
temperatura ambiente por 15 minutos e, ento, armazenado a 4 C e
protegido da luz por
aproximadamente 24 horas. Aps este perodo, a suspenso apresentou
uma colorao rosa.
O excesso de protena foi removido utilizando-se a tcnica de
Cromatografia de
Excluso Molecular em uma coluna Superdex 75 10/300 GL,
utilizando um sistema AKTA
purifier (Amersham, Pharmacia). Esta tcnica tem sido muito
utilizada no estudo e separao
de nanopartculas conjugadas com biomolculas (79). A coluna foi
equilibrada e eluda com
tampo Tris 20 mmol L-1
, NaCl 10 mmol L-1
pH= 7,0. A velocidade de fluxo foi de 0,5 mL
min-1
, monitorada pela absorbncia em 280 e 520 nm, correspondentes a
protena e as AuNPs,
-
53
Materiais e Mtodos
respectivamente, e o eluato coletado em fraes de 1 mL. Apesar de
o pH inicial da sntese ser
cido, devido a diluio e troca de tampo na passagem pela coluna,
a frao coletada
contendo as AuNPs e a protena apresentaram um pH prximo ao
fisiolgico.
As fraes que apresentaram as bandas em 280 e/ou 520 nm foram
submetidas a
Eletroforese desnaturante em Gel de Poliacrilamida 15% contendo
dodecil sulfato de sdio
(SDS-PAGE), utilizando os seguintes marcadores de massa
molecular: 12 kDa (citocromo C),
20 KDa (inibidor de tripsina de soja), 29 kDa (anidrase carbnica
bovina), 45 kDa
(ovalbumina) e 66 kDa (albumina srica bovina).
4.3.3 Monitoramento da polimerizao controlada por temperatura
por meio de medidas de
espalhamento de luz
A mudana na turbidez induzida pelo rpido aumento da temperatura
das suspenses
contendo Becen1 e o complexo AuNP-BeCen1 foram monitoradas pela
observao do
espalhamento de luz a 90 utilizando o Espectrofluormetro K2 (ISS
Illinois, USA)
pertencente ao Grupo de Biofsica Molecular IFSC/USP acoplado a
um controlador de
temperatura NESLAB RET 111. Para isto, fixou-se o comprimento de
onda de excitao e
emisso em 350 nm e mediu-se o espalhamento por 1200 segundos em
temperaturas fixas de
25, 35, 45 e 55 C.
4.4 Tcnicas de Caracterizao
4.4.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM)
Uma das maneiras mais eficientes e diretas de caracterizar a
morfologia e tamanho de
nanopartculas por meio de imagens obtidas por Microscopia
Eletrnica de Transmisso
(TEM, do ingls Transmission Electron Microscopy). As imagens
foram obtidas em um
microscpio eletrnico JEOL JEM-2100 operando a 200 kV,
pertencente ao Laboratrio de
Microscopia Eletrnica (Laboratrio Nacional de Nanotecnologia) em
Campinas-SP. Em
todos os casos, os sistemas foram preparados depositando uma
gota da suspenso aquosa de
-
54
Materiais e Mtodos
nanopartculas sobre uma grade de cobre recoberta por um filme
fino de carbono 300 mesh
(Ted Pella, Inc.). Aps a deposio da gota sobre o suporte, a gua
foi lentamente evaporada a
temperatura ambiente.
Apenas para o caso em que a inteno era analisar a propriedade de
polimerizao
controlada por temperatura da protena no complexo AuNP-BeCen1,
este sistema foi
aquecido a aproximadamente 45 C durante 15 minutos e, ento, uma
gota foi depositada
sobre a grade de cobre e seca em estufa a 40 C.
O dimetro mdio e o desvio-padro das nanopartculas foram
determinados
estatisticamente pela contagem de 100 a 150 partculas utilizando
o software de domnio
publico ImageJ desenvolvido pelo National Institute of Health,
NIH, Estados Unidos.
4.4.2 Espectroscopia no Ultravioleta-Visvel (UV-VIS)
A espectroscopia no UV-VIS tem sido amplamente utilizada na
caracterizao das
propriedades ticas de nanopartculas metlicas. Segundo a teoria
de Mie (80), a quantidade
de luz que chega ao detector de um espectrofotmetro, aps passar
atravs de uma suspenso
diluda de n
