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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS VALÉRIA SPOLON MARANGONI ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE NANOCOMPÓSITOS CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE OURO CONJUGADAS COM BIOMOLÉCULAS: SÍNTESE E APLICAÇÕES EM NANOMEDICINA São Carlos 2012

Estudo e desenvolvimento de nanocompósitos contendo

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  • UNIVERSIDADE DE SO PAULO

    INSTITUTO DE FSICA DE SO CARLOS

    VALRIA SPOLON MARANGONI

    ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE NANOCOMPSITOS

    CONTENDO NANOPARTCULAS DE OURO CONJUGADAS COM

    BIOMOLCULAS: SNTESE E APLICAES EM NANOMEDICINA

    So Carlos

    2012

  • VALRIA SPOLON MARANGONI

    ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE NANOCOMPSITOS CONTENDO

    NANOPARTCULAS DE OURO CONJUGADAS COM BIOMOLCULAS:

    SNTESE E APLICAES EM NANOMEDICINA

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

    Graduao em Fsica do Instituto de Fsica de

    So Carlos da Universidade de So Paulo, para

    obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

    rea de concentrao: Fsica Aplicada

    Opo: Fsica Biomolecular

    Orientador: Prof. Dr. Valtencir Zucolotto

    Verso Corrigida

    (Verso original disponvel na Unidade que aloja o Programa)

    So Carlos

    2012

  • AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTETRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO PARAFINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

    Ficha catalogrfica elaborada pelo Servio de Biblioteca e Informao do IFSC, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

    Marangoni, Valria Spolon Estudo e desenvolvimento de nanocompsitoscontendo nanopartculas de ouro conjugadas combiomolculas: sntese e aplicaes em nanomedicina /Valria Spolon Marangoni; orientador ValtencirZucolotto - verso corrigida -- So Carlos, 2012. 116 p.

    Dissertao (Mestrado - Programa de Ps-Graduao emFsica Aplicada Biomolecular) -- Instituto de Fsicade So Carlos, Universidade de So Paulo, 2012.

    1. Nanobiocompsitos. 2. Nanopartculas de ouro. 3.Jacalina. 4. BeCen1. I. Zucolotto, Valtencir,orient. II. Ttulo.

  • Aos meus pais, Adenir e Mrcia, e ao meu

    irmo, Bruno, por estarem sempre ao meu

    lado e me apoiarem em todos os momentos.

  • AGRADECIMENTOS

    Aos meus pais, Adenir e Mrcia, que so base de toda a minha formao pessoal e

    profissional. Obrigada pela confiana e apoio em todos os momentos!

    Ao meu irmo, Bruno, por tantos anos de convivncia, amizade e pelas aulas de Mecnica

    Quntica.

    Ao Pedro, por todo apoio e amizade e a toda sua famlia, pelo apoio e por compartilharem

    comigo as dificuldades e conquistas durante todo este perodo.

    Ao Prof. Valtencir Zucolotto pelo grande aprendizado que me proporcionou em todos estes

    anos de convivncia. Obrigada pela amizade e confiana!

    Fapesp pela bolsa de mestrado e todo apoio financeiro necessrio para a realizao deste

    trabalho.

    Ao CNPq e Capes pelo apoio financeiro.

    Ao Laboratrio de Microscopia Eletrnica (Laboratrio Nacional de Nanotecnologia -

    LNNano) pela oportunidade de treinamento e utilizao do Microscpio Eletrnico de

    Transmisso. Em especial, gostaria de agradecer a Marina Magnani por todas as sesses de

    treinamento, pacincia e grande ajuda com tudo.

    pr-reitoria de ps-graduao por ter concedido todos os recursos financeiros necessrios

    para a participao e apresentao do trabalho no evento E-MRS 2011 - SPRING MEETING

    IUMRS ICAM 2011 & E-MRS na cidade de Nice, Frana.

    diretoria do Instituto de Fsica de So Carlos - IFSC, pela concesso do prmio Yvonne

    Primerano Mascarenhas" pelo melhor trabalho de Mestrado na I Semana Integrada de

    Graduao e Ps-Graduao do IFSC.

    Aos docentes e funcionrios do Grupo de Biofsica Molecular Sergio Marcarenhas, em

    especial, a Andressa e Bel, pela grande ajuda com os experimentos e por proporcionarem um

    ambiente de trabalho agradvel e organizado para a realizao dos experimentos.

    Dra. Ana Isabel de Camargo pela colaborao com a protena BeCen1 e pelo grande

    ensinamento na rea biolgica, principalmente na expresso e purificao de protenas.

    Ieda, pela imensa ajuda com os experimentos de cultura celular e pelo grande ensinamento

    nesta rea.

    Ester, secretria do Grupo de Biofsica Molecular, e aos funcionrios da biblioteca e da

    ps-graduao do IFSC que sempre nos auxiliam.

    Aos amigos do Grupo de Biofsica e do LNN: Paty, Ana Eliza, Ju Cancino, Lilian, Joci,

    Sussu, Thalita, Z, Luis, Dbora, Julio, Ana Isabel, Andressa, Fernando, Amanda, Jaciara,

    Camilo, Wagner, Vernica, Fabrcio, Denise, Fabio, Edson, Crusca, Thaty, Helton, Ju,

    Rodrigo, Leandro, Marilia. No tenho palavras para descrever o quanto vocs foram

  • importantes nestes anos. Obrigada pela amizade e pelos momentos de descontrao no caf,

    Brotas, Churrascos, Cachorro-quente, PQ, congressos, passeios, discusses cientificas,

    conselhos. Enfim, obrigada por estarem presentes e compartilharem comigo as conquistas e

    dificuldades! Vocs so grandes amigos que eu espero que estejam sempre presentes na

    minha vida!

    Aos amigos da graduao da turma de 2009, que passaram estes ltimos anos de mestrado

    dizendo que eu entrei no buraco negro da fsica. Obrigada pela amizade e compreenso,

    principalmente: Bruno, Thiago, Lvia, Eder, Naty, Sheyla, Scheila, Alexandre, Ashino, Jesus,

    Herbert, Gi, Fer, Elys...

    Aos amigos desde pequeninha que sempre estiveram presentes e me apoiaram: Raisa,

    Larissa, Gustavo, Jssica, Renata, Tata.

    Ao Instituto de Fsica de So Carlos pela estrutura, corpo de docentes e funcionrios que

    juntos proporcionaram auxlio na realizao desta obra.

    Enfim, muito obrigada a todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao

    deste trabalho.

    Agradeo a Deus!

  • You have got to find what you love (...)

    Your work is going to fill a large part of your life, and

    the only way to be truly satisfied is to do what you believe is great work.

    And the only way to do great work is to love what you do.

    If you haven't found it yet, keep looking. Don't settle.

    Steve Jobs (Stanford, 2005)

  • RESUMO

    MARANGONI, V.S. Estudo e desenvolvimento de nanocompsitos contendo

    nanopartculas de ouro conjugadas com biomolculas: sntese e aplicaes em

    nanomedicina. 2012. 116p. Dissertao (Mestrado) Instituto de Fsica de So Carlos,

    Universidade de So Paulo, So Carlos, 2012.

    A convergncia entre a biotecnologia e a nanotecnologia tem levado ao desenvolvimento de

    novos nanobiocompsitos hbridos com funes sinrgicas que incorporam as propriedades de

    reconhecimento dos biomateriais com as propriedades eletrnicas, pticas e catalticas nicas

    das nanopartculas. Apesar do recente desenvolvimento na sntese de nanobiocompsitos, a

    aplicao biomdica destes materiais ainda apresenta muitos desafios, j que no apenas uma

    conjugao apropriada requerida, mas tambm outros importantes aspectos relacionados

    biocompatibilidade. O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da sntese e

    caracterizao de nanoparticulas funcionalizadas com biomolculas. Em especial, visamos o

    entendimento e caracterizao das interaes entre nanopartculas de ouro (AuNPs) e

    protenas, por meio do estudo de dois sistemas distintos: AuNPs funcionalizadas com

    Jacalina, e AuNPs funcionalizadas com a protena BeCen1. No primeiro sistema, o interesse

    advm da capacidade da lectina Jacalina de reconhecer o dissacardeo (Gal1-3GalNAc)

    associado a tumores. Neste caso, AuNPs formadas na presena do dendrmero

    poli(amidoamina) gerao 4.0 (PAMAM G4) foram conjugadas com a Jacalina marcada com

    o fluroforo Isotiocianato de fluorescena (FITC). A formao do complexo AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina foi confirmada por Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM), Espalhamento

    de Luz Dinmico (DLS), Espectroscopia de Absoro no UV-VIS e vibracional (FTIR). A

    interao entre as AuNP-PAMAM G4 e a Jacalina parece ser um processo dirigido por

    entropia com afinidade moderada e formao de complexo, segundo os resultados de

    Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC) e supresso da fluorescncia. Os resultados de

    Dicrosmo Circular (CD) mostraram que a conjugao da Jacalina com as AuNP-PAMAM

    G4 no alterou sua estrutura secundria. Testes realizados em cultura de clulas revelaram

    que o complexo apresenta maior afinidade e citotoxicidade pelas clulas de carcinoma do colo

    de tero humano (HeLa) se comparadas com fibroblastos saudveis de adipcitos de

    camundongo (L929). Estes resultados so relevantes uma vez que demonstram o potencial do

    complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FTIR para aplicaes biomdicas incluindo

    diagnstico e tratamento de cncer. O segundo sistema interessante devido a habilidade da

    protena BeCen1 em formar filamentos nanomtricos em funo da temperatura. As AuNPs

    foram formadas na presena da protena utilizando cido frmico diludo como agente redutor

    e o excesso de protena foi separado por Cromatografia de Excluso Molecular. Anlises de

    CD revelaram uma pequena diminuio no contedo de -hlices, confirmado por FTIR, o

    que pode estar relacionado interao das AuNPs com os grupamentos amida desta protena.

    Medidas de espalhamento de luz revelaram um aumento da turbidez da suspenso do

    complexo AuNP-BeCen1 com o aumento da temperatura e imagens de TEM, com e sem

    aquecimento, confirmaram uma mudana de padro no arranjo das AuNPs. Estes resultados

    revelam a possibilidade de fabricao de nanobiocompsitos termorresponsivos, o que pode

    ser muito importante para aplicaes em nanodispositivos.

    Palavras-chave: Nanobiocompsitos. Nanopartculas de ouro. Jacalina. BeCen1.

  • ABSTRACT

    MARANGONI, V.S. Study and development of nanocomposites containing gold

    nanoparticles and biomolecules: synthesis and application in nanomedicine. 2012. 116p.

    Dissertao (Mestrado) Instituto de Fsica de So Carlos, Universidade de So Paulo, So

    Carlos, 2012.

    The convergence between biotechnology and nanotechnology has led to the development of

    new hybrid nanocomposites that conjugate the bio-recognization properties of biomaterials

    and the unique electronic, optic and catalytic properties of the nanoparticles. Despite the

    recent advances in the development of nanobiocomposites, the biomedical applications of

    these materials are still limited, among other factors, by the low efficiency of

    functionalization and biocompatibility. The present study was aimed at developing protein-

    conjugated nanoparticles for application in nanomedicine. Our main focus were the

    understanding and characterization of the interactions between proteins and gold

    nanoparticles (AuNPs), which was accomplished using two distinct systems, viz.: Jacalin-

    functionalized AuNPs, and Becen1-functionalized AuNPs. In the former, the interest is due

    the capability of the protein Jacalin of recognize the disaccharide (Gal1-3GalNAc), largely

    expressed in some tumors cells. AuNPs were synthesized in the presence of the polyamido

    amine generation 4.0 (PAMAM G4) and conjugated with a Jacalin target with the fluorescein

    isothiocyanate (FITC). The excess of protein was removed by centrifugation and the complex

    formation was confirmed by Transmission Electron Microscopy (TEM), Dynamic Light

    Scattering (DLS), UV-VIS Absorption and Vibrational Spectroscopy (FTIR). The interactions

    between AuNP-PAMAM G4 and Jacalin seemed to be driven by an entropic process with

    moderate affinity and complex formation, as revealed by Isothermal Titration Calorimetry

    (ITC) and quenching fluorescence measurements. Furthermore, Circular Dichroism (CD)

    analyses revealed that protein maintained its secondary structure upon conjugation with

    the nanoparticles. In vitro tests revealed that the AuNPs/Jacalin complexes presented higher

    affinity and cytotoxicity against human cervical cancer cell (HeLa) compared to healthy

    mouse fibroblasts (L929). These results are relevant, since the AuNP-PAMAM

    G4/Jacalin-FITC complex may be used for biomedical applications including cancer

    treatment and diagnostics. The second nanocomplex, comprising AuNPs and BeCen1, was

    chosen due to the ability of BeCen 1 to polymerize in the form of nanometric filaments as a

    function of temperature. The AuNPs were formed in the presence of the protein using diluted

    formic acid as reducing agent and the excess of protein was removed by Molecular Exclusion

    Chromatography. CD analysis showed a decrease in the -helix structures confirmed by

    FTIR, which may be related to the interaction between the AuNPs and the amide groups of

    the protein. Light scattering measurements revealed an increase in the turbidity of the

    dispersions upon increasing the temperature, indicating a change in the arrangement of the

    AuNPs. Such BeCen-1 induced alignment was confirmed by TEM images. The latter results

    point to the possibility of fabrication of novel thermoresponsive nanobiocomposites, which

    are of great relevance for nanodevices applications.

    Keywords: Nanobiocomposites. Gold nanoparticles. Jacalin. BeCen1.

  • LISTA DE FIGURAS

    Figura 1 - Representao esquemtica da variao de densidades de estados em

    funo do tamanho do material. Adaptado de (21). ...................................

    28

    Figura 2 - Representao esquemtica da estabilizao de partculas pelo efeito a)

    eletrosttico e b) estreo ............................................................................

    29

    Figura 3 - Estrutura molecular do dendrmero PAMAM G4 (38) .............................

    33

    Figura 4 - Representao esquemtica de uma nanopartcula teranstica.

    Nanopartculas multifuncionais so direcionadas at a membrana de

    clulas cancergenas usando um ligante especfico para um receptor na

    superfcie da clula (51) ............................................................................

    36

    Figura 5 - Estrutura tetramrica da Jacalina extrada do pdb (cdigo 1KU8). ............

    37

    Figura 6 - Imagem de Microscopia Eletrnica de Transmisso da protena BeCen1

    contrastada com acetato de uranila mostrando a formao de filamentos

    aps aquecimento (67). ...............................................................................

    39

    Figura 7 - Representao esquemtica da sntese de nanopartculas de ouro na

    presena do dendrmero PAMAM G mostrando a estabilizao das

    nanopartculas nas cavidades do dendrmero .............................................

    46

    Figura 8 - a) TEM da amostra de AuNPs-PAMAM G4 e b) Histograma de

    tamanho de partcula e distribuio Gaussiana ajustada aos dados

    indicando um dimetro mdio de 6,1 0,2 nm. .........................................

    61

    Figura 9 - a) Espectro de absoro das AuNPs-PAMAM G4 em diferentes

    concentraes e b) valores de absoro mxima na banda de ressonncia

    plasmonica de superfcie em funo da concentrao e ajuste linear dos

    dados. ..........................................................................................................

    63

    Figura 10 - Espectros de absoro no UV-VIS para AuNP-PAMAM G4, Jacalina e

    AuNP-PAMAM G4/Jacalina. .....................................................................

    65

    Figura 11 - Espectro de absoro para a Jacalina-FITC e AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina-FITC. ......................................................................................

    66

    Figura 12 - Histogramas obtidos a partir de medidas de DLS para as amostras de a)

    Jacalina, b) AuNP-PAMAM G4 e c) AuNP-PAMAM G4/Jacalina. .........

    68

    Figura 13 - Espectros de CD da Jacalina livre e do complexo AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina. ................................................................................................

    70

    Figura 14 - Espectro de fluorescncia da Jacalina e do complexo AuNP-PAMAM

  • G4/Jacalina. O inset do grfico mostra o espectro para o complexo

    AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC. excitao = 280 nm.. ...........................

    71

    Figura 15 - a) Supresso da fluorescncia da Jacalina na presena de vrias

    concentraes de AuNP-PAMAM G4. excitao = 280 nm; b) Grfico da

    intensidade da fluorescncia em 325 nm em funo da concentrao de

    AuNP-PAMAM G4; c) Grfico de F0/(F0-F) em funo de 1 / [AuNP-

    PAMAM G4], no inset grfico de F0/F contra [AuNP-PAMAM G4] e d)

    Grfico F0-F em funo de [AuNP-PAMAM G4].. ...................................

    74

    Figura 16 - Espectroscopia no Infravermelho a) AuNP-PAMAM G4; b) Jacalina e c)

    AuNP-PAMAM G4/Jacalina.. ...................................................................

    77

    Figura 17 - Calorimetria de Titulao Isotrmica das AuNP-PAMAM G4 com a

    Jacalina. O painel superior mostra os calores produzidos em cada

    titulao das nanopartculas na suspenso da protena. O painel inferior

    mostra a rea integrada de cada pico. Os dados foram ajustados segundo

    o modelo de um stio de ligao (One Sites). ............................................

    79

    Figura 18 - a) Imagens de Microscopia eletrnica das AuNP-PAMAM G4 antes

    (inset) e aps a conjugao com a Jacalina; b) Representao

    esquemtica do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina. ..........................

    82

    Figura 19 - Imagens obtidas com um aumento de 40 vezes das clulas HeLa e suas

    respectivas imagens de fluorescncia aps 24 horas de incubao e

    lavagem dos poos. a) e b) controle negativo; c) e d) AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina-FITC 1,0 mol L-1; e) e f) Jacalina-FITC 1,0 mol L-1. ......

    84

    Figura 20 - Imagens obtidas com um aumento de 40 vezes das clulas L929 e suas

    respectivas imagens de fluorescncia aps 24 horas de incubao e

    lavagem dos poos. a) e b) controle negativo; c) e d) AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina-FITC 1,0 mol L-1; e) e f) Jacalina-FITC 1,0 mol L-1. ......

    85

    Figura 21 - Viabilidade das clulas a) HeLa e b) L929 aps 24 de incubao com as

    amostras. Os valores correspondem a mdia e o desvio padro obtidos a

    partir de trs experimentos independentes e em triplicata para cada

    concentrao. *diferena significativa com relao ao controle (p

  • Figura 25 - Espectro de emisso para BeCen1 e o complexo AuNP-BeCen1 ..............

    92

    Figura 26 - Espectros de CD da protena BeCen1 livre e do complexo AuNP-

    BeCen1. ......................................................................................................

    93

    Figura 27 - Espectroscopia no Infravermelho a) BeCen1 e b) AuNP-BeCen1.. ...........

    95

    Figura 28 - Espalhamento da luz a 350 nm como funo do tempo aps rpida

    transferncia da soluo do gelo para uma dada temperatura em tampo

    Tris pH = 7,0: a) AuNP-BeCen1, b) BeCen1 livre e c) AuNP-PAMAM

    G4. ..............................................................................................................

    97

    Figura 29 - Espalhamento da luz a 350 nm como funo do tempo do complexo

    AuNP-BeCen1 aps ter sido submetido a elevadas temperaturas (Figura

    27a) e, posteriormente, passar diferentes tempos no gelo .........................

    98

    Figura 30 - Imagens de TEM do complexo AuNP-BeCen1 a) antes e b) aps o

    aquecimento ...............................................................................................

    99

    Figura 31 - Representao esquemtica do processo de agregao induzida pela

    temperatura do complexo AuNP-BeCen1. .................................................

    99

  • LISTA DE TABELAS

    Tabela 1 - Dimetro mdio obtido a partir dos histogramas de distribuio de

    tamanho. ..........................................................................................................

    68

    Tabela 2 - Porcentagens da estrutura da Jacalina livre e do complexo AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina. Estimativa realizada utilizando o programa CONTINLL

    (CD/Pro Package) (97) ....................................................................................

    70

    Tabela 3 - Potencial zeta obtido para amostras em pH = 7,4 ........................................... 75

    Tabela 4 - Bandas e atribuies encontradas no espectro de infravermelho para a

    AuNP-PAMAM G4, Jacalina e AuNP-PAMAM G4/Jacalina (30, 83). ........

    77

    Tabela 5 - Parmetros termodinmicos para a interao das AuNP-PAMAM G4 com a

    Jacalina obtido a partir do ajuste dos dados utilizando o modelo de um stio

    de ligao (One Sites). ....................................................................................

    79

    Tabela 6 - Porcentagens da estrutura da BeCen1 livre e do complexo AuNP-BeCen1.

    Estimativa realizada utilizando o programa CONTINLL (CD/Pro Package)

    (97) ..................................................................................................................

    93

    Tabela 7 - Bandas e atribuies encontradas no espectro de infravermelho para a

    BeCen1 livre e conjugada com as AuNPs (82). ..............................................

    95

  • LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

    A Absorbncia

    an Coeficiente de Mie

    ANOVA Anlise de varincia

    Antgeno T Antgeno Thomsen-Friedenreich

    AuNPs Nanopartculas de ouro

    bn Coeficiente de Mie

    BSA Albumina de soro bovino

    C Concentrao

    CD Dicrosmo Circular

    DLS Espalhamento de luz dinmico

    DMSO Dimetilsulfxido

    EDTA cido etilenodiamino tetra-actico

    F Intensidade de fluorescncia da protena na presena do supressor

    F0 Intensidade de fluorescncia da protena na ausncia do supressor

    F Intensidade de fluorescncia da protena saturada com o supressor

    fa Frao de stios de fluorforos acessveis ao ligante

    FITC Isoticianato de fluorescena

    FTIR Espectroscopia no Infravermelho com transformada de Fourier

    GFP Protena verde fluorescente

    HeLa Clulas epiteliais de carcinoma cervical humano

    HSA Albumina de soro humano

    IPTG Isopropil--D-tiogalactopiranosdeo

    ITC Calorimetria de Titulao Isotrmica

    Ka Constante de afinidade

    Kq Constante de supresso bimolecular

    KSV Constante de Stern-Volmer

    KSVa Constante de Stern-Vomer da frao acessvel

    Caminho tico

    L929 Fibroblastos de adipcitos de camundongo

    LB Meio de cultura Luria Bertani

    MTOCs Centros Organizadores de Microtbulos

  • MTT Brometo de 3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazlico

    PAMAM G4 Dendrmero poli(amidoamina) Gerao 4

    PDB Banco de Dados de Protenas (Protein Data Bank)

    PBS Tampo fosfato salino

    Potencial Potencial zeta

    QSE Efeitos Qunticos de tamanho

    SBF Soro bovino fetal

    SDS Dodecil sulfato de sdio

    SERS Espalhamento Raman intensificado por superfcie

    SPR Ressonncia de Plasmon de Superficie

    T Temperatura

    TEM Microscopia Eletrnica de Transmisso

    Tris Tris(hidroximetil)aminometano

    UV-VIS Espectroscopia no Ultravioleta-Visvel

    G Variao da energia molar de Gibbs

    H Variao da entalpia molar

    S Variao da entropia molar

    Coeficiente de absortividade molar

    m Funo dieltrica

    0 Tempo de vida

  • SUMRIO

    1. INTRODUO ............................................................................................................... 25

    2. REVISO BIBLIOGRFICA ....................................................................................... 27

    2.1 Nanocincia e Nanotecnologia ....................................................................................... 27

    2.1.1 Estabilidade de nanomateriais ................................................................................. 29

    2.2 Nanoparticulas de ouro ................................................................................................... 30

    2.3 Sntese de nanoparticulas de ouro ................................................................................... 32

    2.4 Nanobiotecnologia .......................................................................................................... 33

    2.5 Nanoparticulas teransticas: materiais multifuncionais para aplicao em

    nanomedicina ........................................................................................................................ 35

    2.5.1 Jacalina .................................................................................................................... 36

    2.6 Utilizao de biomolculas na auto-organizao de nanomateriais .............................. 38

    2.6.1 BeCen1 ..................................................................................................................... 39

    2.7 Citotoxicidade de nanomateriais ..................................................................................... 40

    4. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................... 45

    4.1 Materiais ......................................................................................................................... 45

    4.2 Estudos do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC ............................................. 45

    4.2.1 Sntese de Nanopartculas de ouro estabilizadas em PAMAM-G4 .......................... 45

    4.2.2 Obteno e purificao da Jacalina ........................................................................ 46

    4.2.3 Marcao da Jacalina com FITC ............................................................................ 47

    4.2.4 Conjugao da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4 .............................................. 48

    4.2.5 Estudos qualitativos da interao do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC

    com clulas tumorais e saudveis ..................................................................................... 49

    4.2.6 Ensaios de citotoxicidade in vitro ............................................................................ 50

    4.3 Estudos do complexo AuNP-BeCen1 ............................................................................. 51

    4.3.1 Expresso e purificao da centrina BeCen1 .......................................................... 51

    4.3.2 Sntese in situ das nanoparticulas de ouro com BeCen1 ......................................... 52

    4.3.3 Monitoramento da polimerizao controlada por temperatura por meio de medidas

    de espalhamento de luz ..................................................................................................... 53

    4.4 Tcnicas de Caracterizao ............................................................................................. 53

    4.4.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM) ...................................................... 53

  • 4.4.2 Espectroscopia no Ultravioleta-Visvel (UV-VIS) ................................................... 54

    4.4.3 Espectroscopia de Fluorescncia ............................................................................ 55

    4.4.4 Dicrosmo Circular (CD) ........................................................................................ 56

    4.4.5. Espectroscopia de Infravermelho (FTIR) ............................................................... 56

    4.4.6 Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC) ........................................................... 57

    4.4.7 Espalhamento de luz dinmico (DLS) ..................................................................... 59

    4.4.8 Potencial Zeta () ..................................................................................................... 59

    5. RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................... 61

    5.1 Sntese e caracterizao das AuNP-PAMAM G4 .......................................................... 61

    5.2 Sntese e caracterizao do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina ............................. 64

    5.2.1 Espalhamento de Luz Dinmico (DLS) ................................................................... 66

    5.2.2 Dicrosmo Circular (CD) ........................................................................................ 69

    5.2.3 Espectroscopia de Fluorescncia ............................................................................ 70

    5.2.4 Potencial Zeta () ..................................................................................................... 75

    5.2.5 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR) ................................................................ 75

    5.2.6 Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC) ........................................................... 78

    5.2.7 Microscopia Eletrnica de Transmisso ................................................................. 81

    5.2.8 Testes qualitativos in vitro ....................................................................................... 83

    5.2.9 Ensaios de citoxicidade ........................................................................................... 86

    5.3 Sntese e caracterizao do complexo AuNP-BeCen1 ................................................... 88

    5.3.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM) ..................................................... 90

    5.3.2 Espectroscopia de Fluorescncia ............................................................................ 91

    5.3.3 Dicrosmo Circular (CD) ........................................................................................ 92

    5.3.4 Espectroscopia vibracional (FTIR) ......................................................................... 93

    5.3.5 Anlise da propriedade termorresponsiva do complexo AuNP-BeCen1 ................ 95

    6. CONCLUSES ............................................................................................................. 101

    7. PERSPECTIVAS .......................................................................................................... 103

    REFERNCIAS ................................................................................................................... 105

  • 25

    Introduo

    1. INTRODUO

    O desenvolvimento de nanomateriais hbridos, que incorporam as propriedades de

    reconhecimento e catalticas de biomolculas com as propriedades eletrnicas, ticas e

    magnticas nicas exibidas pelas nanopartculas, tem resultado em nanobiocompsitos com

    elevado impacto em medicina. Suas aplicaes vo desde sistemas de liberao controlada de

    frmacos e marcadores biolgicos, at sistemas para deteco e diagnstico de doenas (1, 2,

    3). O crescente interesse na aplicao destes nanocompsitos em medicina tem levado ao

    surgimento de uma nova rea de pesquisa denominada nanomedicina (4).

    Em particular, nanopartculas de ouro so interessantes devido s suas propriedades

    ticas e eletrnicas diferenciadas (1), fazendo com que sejam teis para diversas aplicaes

    como deteco de analitos (5), biossensores (6), agentes de contraste em imagens de

    Microscopia Eletrnica de Transmisso (7) e raios X (8), veculo para a entrega de molculas

    dentro das clulas (1) e na teraputica do cncer (9). Para esta ltima, normalmente,

    requerido que as partculas se alojem especificamente na regio de interesse. Esta

    especificidade pode ser alcanada por meio da funcionalizao de sua superfcie com

    biomolculas como protenas (10), peptdeos (11), aptmeros (12) e anticorpos especficos

    (13). Assim, o desenvolvimento de nanobiocompsitos baseados em nanopartculas de ouro

    tem tido um importante impacto no diagnstico e tratamento de doenas.

    A interao entre nanopartculas e biomolculas , em muitos casos, facilitada pela

    compatibilidade de tamanhos, e pode ocorrer de maneira sinrgica, fazendo com que

    propriedades melhoradas ou totalmente novas sejam obtidas a partir da escolha e

    processamento adequado dos materiais. Esta conjugao proporciona, alm do aumento da

    estabilidade do sistema, a introduo de funcionalizaes biocompatveis e interaes

    biolgicas adicionais aos nanomateriais. Biomolculas possuem interaes de reconhecimento

    complementares fortes e especficas, que permitem levar nanoparticulas at clulas de

    interesse por meio do seu recobrimento com receptores adequados (2).

    Outra questo importante a organizao de nanopartculas para a obteno de

    estruturas bem definidas que possam ser integradas em dispositivos para aplicaes

    tecnolgicas (14). Para isto, nanoparticulas podem ser conjugadas com biomolculas que

  • 26

    Introduo

    possuem propriedades responsivas, permitindo a obteno de materiais com forma, tamanho,

    alinhamento e orientao controlados (15, 16).

    Apesar do desenvolvimento considervel nesta rea, reativamente pouco conhecido a

    respeito das interaes entre nanoparticulas e biomolculas, o que representa uma questo

    muito importante em reas emergentes como nanomedicina e nanotoxicologia. Para o

    eficiente desenvolvimento destes nanobiocompsitos so necessrios tanto o entendimento

    dos mecanismos de interao que ocorrem entre as biomolculas e os nanomateriais quanto o

    controle dos mtodos de manipulao utilizados para conjugao e posterior aplicao destes

    nanobiocompsitos.

    O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da sntese e caracterizao

    de nanoparticulas funcionalizadas com biomolculas. Em especial, visamos o entendimento e

    caracterizao das interaes entre nanoparticulas de ouro e protenas por meio do estudo de

    dois sistemas distintos: nanoparticulas de ouro funcionalizadas com Jacalina para a fabricao

    de nanocompsitos especficos para clulas tumorais, e nanoparticulas de ouro

    funcionalizadas com BeCen1 para a construo de nanobiocompsitos termorresponsivos e

    auto-organizados. Os novos nanobiocompsitos aqui desenvolvidos podem apresentar

    aplicaes relevantes em smart drug delivery e estudos de nanotoxicidade.

  • 27

    Reviso Bibliogrfica

    2. REVISO BIBLIOGRFICA

    2.1 Nanocincia e Nanotecnologia

    Materiais nanoestruturados tm adquirido cada vez mais importncia em diferentes

    reas da cincia e tecnologia, onde projetar e controlar propriedades de interesse no nvel

    atmico e molecular relevante para o desenvolvimento de novos materiais com propriedades

    e aplicaes fundamentalmente novas (3). Nanocincia pode ser definida como o estudo dos

    fenmenos e manipulao dos materiais nas escalas atmica e molecular, onde as

    propriedades diferem significativamente daquelas de uma escala maior, e nanotecnologia

    como o design, caracterizao, produo e aplicao de estruturas, dispositivos e sistemas por

    meio do controle de forma e tamanho na escala nanomtrica (17).

    Os fundamentos da nanocincia e nanotecnologia foram inicialmente propostos pelo

    fsico norte-americano Richard Feynman em uma conferncia proferida em 1959 com o ttulo

    Theres Plenty of Room at the Bottom. Nesta palestra, Feynman introduziu a discusso do

    tema mostrando as possibilidades de miniaturizao e terminou com uma explorao do que

    poderia ser obtido a partir do controle dos materiais, tomo por tomo (3).

    A nanocincia e a nanotecnologia tm como base dois conceitos para a obteno de

    sistemas nanoestruturados: top-down (de cima para baixo) e bottom-up (de baixo para cima)

    (18). A primeira abordagem consiste na miniaturizao dos materiais e das estruturas da

    escala microscpica para a escala nanoscpica. Este tipo de abordagem exige o domnio de

    toda tecnologia da microeletrnica, implicando no aprimoramento de um vasto arsenal de

    recursos. A segunda se baseia na construo de estruturas e nanomateriais a partir de tomos e

    molculas individuais por meio de processos que permitam o controle tridimensional, gerando

    sistemas cada vez mais complexos (18). Para tal finalidade, podem ser utilizadas estruturas

    orgnicas e inorgnicas menores, que serviriam como blocos de construo para as

    nanoestruturas.

    As propriedades diferenciadas ou melhoradas dos materiais quando estruturados na

    escala nanomtrica advm de dois fatores principais: efeitos de superfcie e qunticos de

    tamanhos (QSE, do ingls Quantum Size Effects) (19). O aumento da razo entre a rea

  • 28

    Reviso Bibliogrfica

    superficial e o volume resulta em um correspondente aumento na reatividade qumica (3),

    fazendo com que alguns nanomateriais sejam timos para aplicao em catalisadores,

    aumentando a eficincia em clulas a combustvel e sensores (20), por exemplo. Em tamanhos

    intermedirios entre o molecular e a matria estendida (bulk matter), chamado de nanoescala,

    estados de energia individuais das molculas e bandas continuas dos slidos estendidos se

    tornam discretos, e sua separao de energia mostra uma dependncia analtica com a

    dimenso espacial do material (19). Um esquema mostrado na Figura 1 e representa a

    transformao dos estados de densidade eletrnica das bandas de valncia e conduo, em

    metais e semicondutores, do contnuo para o discreto, conforme a matria passa de um estado

    estendido para o atmico (21). Estes efeitos qunticos possuem consequncias diretas nas

    propriedades eletrnicas, ticas e magnticas destes materiais.

    Portanto, no a estrutura e a composio do material que so novas, mas sim sua

    forma, tamanho, arranjo ou orientao. Isto o que produz materiais com novas funes e

    novas utilidades. Assim, o desafio no consiste somente em fabricar materiais com a

    composio adequada, mas tambm com tamanho e forma controlados. Igualmente

    importante que estes nanomateriais tenham a superfcie, carga e funcionalidade requerida,

    uma vez que as propriedades de superfcie controlam as interaes entre estes materiais e o

    ambiente, determinando suas propriedades.

    Figura 1 - Representao esquemtica da variao de densidade de estados em funo do tamanho do material

    Adaptado de (21).

  • 29

    Reviso Bibliogrfica

    2.1.1 Estabilidade de nanomateriais

    Uma fase coloidal termodinamicamente instvel quando comparada com uma fase

    contnua (22). Isto pode ser explicado pela relao entre a variao da energia livre de Gibbs

    (dG) e a variao na rea superficial de uma amostra (d), a temperatura e presso constantes,

    que dada por dG = d, onde a tenso superficial interfacial (22). G diminui quando h

    uma diminuio da rea superficial do sistema, o que indica uma tendncia natural de

    agregao. Desta maneira, agentes estabilizantes devem ser utilizados de modo a alterarem as

    propriedades de superfcie das nanoparticulas, assim como os parmetros cinticos de

    agregao, permitindo a estabilizao destes sistemas em suspenses.

    A estabilidade de nanomateriais em suspenso aquosa pode ser obtida por dois

    mecanismos: eletrosttico e/ou estreo. A estabilizao eletrosttica de uma disperso de

    nanoparticulas bem descrita pela teoria de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO),

    que prev que tal estabilidade determinada pelo balano entre as foras atrativas de van der

    Waals e repulsivas eletrostticas (1). Como resultado, as nanopartculas se mantm estveis,

    sem agregao, se a intensidade da fora eletrosttica repulsiva for maior que a intensidade da

    fora atrativa de van der Waals (Figura 2a). Em outras palavras, as nanoparticulas no

    apresentam agregao se contem uma densidade de carga suficiente na superfcie.

    Na estabilizao estrea (Figura 2b), camadas de molculas longas, como polmeros

    ou tensoativos no inicos, adsorvidos na superfcie da partcula, repelem uns aos outros por

    repulso estrea, impedindo a agregao das partculas. Um efeito combinado obtido por

    meio da utilizao de polieletrlitos, que estabilizam tanto por um mecanismo estreo quanto

    eletrosttico.

    Figura 2 - Representao esquemtica da estabilizao de partculas pelo efeito a) eletrosttico e b) estreo.

    a) b)

  • 30

    Reviso Bibliogrfica

    2.2 Nanoparticulas de ouro

    Nanopartculas de ouro (AuNPs) possuem propriedades ticas e eletrnicas

    diferenciadas, fazendo com que sejam interessantes para muitas aplicaes (1, 23). Apesar de

    algumas aplicaes similares poderem ser encontradas em diferentes materiais, como

    quantum dots, AuNPs so consideradas relativamente menos txicas, devido maior inrcia

    do ouro (1).

    Quando AuNPs absorvem a luz, seus eltrons so excitados. Excitao na frequncia

    de ressonncia plasmonica causa uma oscilao coletiva dos eltrons livres (23). Esta

    frequncia de ressonncia plasmonica uma importante caracterstica das AuNPs, e possui

    comprimentos de onda entre 510 e 530 nm para nanopartculas com dimetro entre 4 e 50 nm

    (24). A ligao e proximidade de molculas na superfcie das nanopartculas podem modificar

    o comprimento de onda de absoro. Este efeito de acoplamento de plasmon pode ser

    utilizado para a deteco colorimtrica de analitos (5), medidas de distncias e mudanas

    conformacionais das molculas (25, 26).

    Aps a absoro da energia proveniente da radiao, os eltrons relaxam e a energia

    transferida para a rede cristalina do cristal, gerando calor. O aquecimento das AuNPs

    dissipado para o meio circundante (23, 27). Clulas, e principalmente clulas anormais, so

    muito sensveis a um pequeno aumento da temperatura. Esta propriedade pode ser utilizada no

    tratamento de cncer em um conceito chamado hipertermia (23). A ideia que as

    nanopartculas se acumulem em clulas tumorais, e com isso, o aquecimento provocado pela

    radiao possa elimin-las (28). No entanto, como os tecidos absorvem a radiao no visvel,

    esta tcnica ainda limitada a tecidos prximos a pele (23). Neste caso, o aumento da

    temperatura em uma regio contendo AuNPs pode ser realizado utilizando radiofrequncia.

    Glazer e colaboradores (29) mostraram a destruio de clulas de adenocarcinoma pancretico

    tratadas com AuNPs por meio do aquecimento induzido por um campo de radiofrequncia.

    O espalhamento Raman (30) pode ser melhorado quando as molculas esto prximas

    de superfcies de ouro com elevada curvatura como, por exemplo, AuNPs. Este efeito

    conhecido como espalhamento Raman intensificado por superfcie (SERS, do ingls Surface-

    Enhanced Raman Scattering) (23). Devido ao significante aumento do campo, SERS pode ser

    usado como uma tcnica analtica extremamente sensvel, excedendo a sensibilidade das

  • 31

    Reviso Bibliogrfica

    tcnicas luminescentes de deteco. Alm disso, em experimentos de Ressonncia de Plasmon

    de Superfcie (SPR, do ingls Surface Plasmon Resonance), a sensibilidade pode ser

    aumentada cerca de 1000 vezes para a deteco de oligonucleotdeos complementares

    utilizando AuNPs (31).

    AuNPs tambm podem ser utilizadas para a transferncia de eltrons em reaes redox

    (1). Neste caso, o objetivo detectar analitos que so substratos de reaes enzimticas. O

    fluxo de eltrons desta reao detectado por alguma medida de corrente. Para este propsito,

    enzimas so imobilizadas em subtratos condutores e conectadas a um amplificador para a

    deteco da corrente. Uma camada de AuNPs aumenta a rugosidade da superfcie, levando ao

    aumento da corrente (6). Assim, devido ao seu tamanho reduzido e excelentes propriedades

    ticas e eltricas, sensores baseados em AuNPs tm tido um importante impacto em

    diagnsticos (26).

    Uma das aplicaes mais bem exploradas das AuNPs a sua utilizao como veculo

    para a entrega de molculas dentro das clulas (1, 23). Para estas aplicaes, as molculas

    normalmente so adsorvidas na superfcie das nanopartculas. Por exemplo, um gene de DNA

    pode ser introduzido na clula por adsoro em AuNPs e, consequentemente, provocar a

    expresso de protenas especficas (32). As clulas podem captar nanopartculas coloidais por

    meio de um mecanismo especfico, via receptor-ligante, ou no especifico. A incorporao

    especifica mais eficiente, pois, neste caso, as nanopartculas modificadas com os receptores

    so predominantemente incorporadas pelas clulas de interesse (23).

    AuNPs tambm so agentes de contraste muito atraentes, pois podem ser visualizadas

    com uma grande variedade de tcnicas. As principais tcnicas de deteco so baseadas na

    interao entre as AuNPs e a luz (23). Por exemplo, devido ao seu elevado peso atmico,

    AuNPs proporcionam um excelente contraste em imagens de Microscopia Eletrnica de

    Transmisso (7). AuNPs tambm espalham raios X eficientemente e, desta maneira,

    proporcionam contraste em imagens de raios X (8).

  • 32

    Reviso Bibliogrfica

    2.3 Sntese de nanopartculas de ouro

    Muitas estratgias tm sido utilizadas no preparo de nanoparticulas metlicas, entre

    elas AuNPs. Em uma sntese tpica, sais de ouro so reduzidos pela adio de um agente

    redutor que leva a nucleao e, consequente, crescimento das partculas. No entanto, como

    descrito anteriormente, um estabilizante sempre requerido e pode tanto ser adsorvido ou

    quimicamente ligado superfcie das nanopartculas (23). Na rota mais comum de sntese, as

    nanoparticulas so sintetizadas na presena de cido ctrico ou citrato de sdio, que atua no

    s como redutor, mas tambm fornece estabilidade s nanoparticulas devido a sua carga

    negativa (33).

    Rotas de sntese similares tambm tm sido realizadas em solventes orgnicos (34).

    Nanoparticulas podem ser sintetizadas utilizando reduo bifsica (35), onde um sal de metal

    nobre dissolvido em gua e extrado por transferncia de fase em um solvente orgnico

    seguido por reduo. A fabricao das nanoparticulas tambm tem sido realizada por mtodos

    de micela reversa, onde o tamanho e disperso de tamanho das nanoesferas podem ser

    controlados por meio da composio da micela (36). Aps a sntese, as molculas

    estabilizantes podem ser substitudas por outras molculas em uma reao de troca de ligante.

    Desta maneira, possvel ajustar as propriedades da superfcie das partculas escolhendo as

    molculas estabilizantes (23).

    Para aplicaes biomdicas, as nanoparticulas devem ser estveis em soluo aquosa.

    Dentre os diferentes tipos de molculas que podem ser utilizadas como estabilizantes,

    nanoparticulas funcionalizadas com polmeros tm emergido como materiais multifuncionais

    com grande potencial para aplicao em reas como biossensores, imageamento, dispositivos

    ticos, entre outros (23). Esta funcionalizao permite a obteno de nanomateriais hbridos

    orgnico/inorgnico, cujos parmetros como tamanho, forma, grupos funcionais na superfcie

    podem ser ajustados pela escolha adequada do polmero na superfcie (37).

    Dentre os polmeros, os dendrmeros, que so macromolculas com baixa

    polidispersividade e arquitetura tridimensional regular e altamente ramificada (38, 39), tem

    sido amplamente utilizados para encapsular ou estabilizar nanoparticulas metlicas (40, 41,

    42). Uma vez que possuem composio e estrutura bastante definidas, a utilizao de

    dendrmeros permite a reprodutibilidade na fabricao das nanopartculas (40, 41). Alm

  • 33

    Reviso Bibliogrfica

    disso, os grupos terminais dos dendrmeros podem ser adaptados para controlar a solubilidade

    do nanocompsito e usado para facilitar a ligao com superfcies ou outras molculas (43). A

    Figura 3 (38) mostra a estrutura do dendrmero poli(amidoamina) gerao 4 (PAMAM G4),

    utilizado no presente trabalho para a sntese das AuNPs. O nmero da gerao est

    diretamente relacionado quantidade de ramificaes e, consequentemente, de grupos

    funcionais na superfcie dos dendrmeros.

    Figura 3 - Estrutura molecular do dendrmero PAMAM G4 (38).

    2.4 Nanobiotecnologia

    A convergncia da biotecnologia e da nanotecnologia tem levado ao desenvolvimento

    de nanomateriais hbridos que incorporam as propriedades de reconhecimento e catalticas dos

    biomateriais, como protenas e enzimas, com as propriedades eletrnicas e ticas nicas das

    nanopartculas (2). A funcionalizao de nanopartculas com biomolculas resulta na

    mudana de suas propriedades e interaes com o meio. A solubilidade das nanopartculas em

    meio aquoso, por exemplo, pode ser melhorada por meio da funcionalizao de suas

    superfcies com biomolculas altamente hidroflicas. Desta maneira, modificaes da

    superfcie de nanoestruturas utilizando biomolculas no s fornecem interaes biolgicas

    adicionais como tambm melhoram sua solubilidade e biocompatibilidade (10). Estes novos

    nanobiocompsitos hbridos com propriedades e funes sinrgicas constituem uma nova rea

    de pesquisa, a nanobiotecnologia (2).

  • 34

    Reviso Bibliogrfica

    Diversas biomolculas tm sido conjugadas com nanoparticulas. Por exemplo,

    nanoparticulas de ouro conjugadas com oligonucleotdeos so de grande interesse, pois a

    complementaridade de pares de base do DNA faz com que esses complexos sejam altamente

    especficos. Esta propriedade pode ser utilizada em biossensores, na deteco de sequncias

    especficas do DNA associadas a anomalias ou doenas (44), bem como para a organizao de

    nanoestruturas supramoleculares (45). Protenas esto envolvidas em quase todos os

    processos biolgicos e so empregadas em uma ampla gama de formas devido sua

    especificidade funcional. Desta maneira, nanoestruturas baseadas em protenas podem ser a

    chave para o desenvolvimento de materiais multifuncionais e dispositivos para aplicaes

    biotecnolgicas (2).

    A conjugao de biomolculas e nanomateriais tem sido realizada por uma variedade

    de tcnicas que vo desde adsoro eletrosttica ou ligao covalente at reduo dos metais

    na presena de biomolculas (2). A conjugao qumica de nanopartculas com protenas

    envolve a complexao da protena com nanoparticulas modificadas em suspenso.

    Geralmente, molculas contendo grupamentos amina ou carboxlico so utilizadas para

    acoplar as nanoparticulas s protenas (1). Uma opo para a biofuncionalizao de AuNPs

    por meio da ligao direta da biomolcula na sua superfcie. Pequenos peptdeos ou protenas

    globulares, por exemplo, tm sido conjugados diretamente na superfcie de AuNPs, utilizando

    grupamentos tiis proveniente do resduo de aminocido cistena (46). DNA modificado com

    tiol tambm tem sido diretamente conjugado com AuNPs (32).

    possvel observar que a biofuncionalizao dos nanomateriais normalmente

    realizada por meio da ligao superficial aps a fabricao das nanoparticulas. Normalmente,

    vrias etapas adicionais de reaes e lavagens so requeridas, alm da utilizao de outros

    tipos de molculas funcionalizantes (47). A conjugao in situ das nanoparticulas tem sido

    uma tima alternativa para estes casos (47, 48). Nesta metodologia, o conjugado

    nanopartcula-protena sintetizado em uma nica etapa e nenhum outro estabilizante ou

    molcula de entrecruzamento so necessrios. A biomolcula funciona tambm como

    estabilizante, diminuindo a quantidade de interferentes no meio (48).

    Apesar do desenvolvimento de muitas estratgias de bioconjugao, a aplicao

    biomdica de nanobiocompsitos ainda apresenta muitos desafios, j que no apenas uma

    conjugao apropriada requerida, mas tambm outros importantes aspectos que dizem

    respeito a biocompatibilidade e especificidade (1). Estes aspectos incluem: preveno da

    agregao da nanopartcula no meio biolgico, preveno da adsoro no especifica de

  • 35

    Reviso Bibliogrfica

    biomolculas na superfcie da nanopartcula, especificidade e baixa toxicidade (1). Portanto, a

    aplicao biomdica de nanobiocompsitos depende tanto das propriedades fsico-qumicas

    das nanoparticulas quanto da atividade biolgica da biomolcula. Entender os processos de

    preparao e estabilidade destes nanoconjugados importante para obter sistemas com a

    reatividade desejada.

    2.5 Nanoparticulas teransticas: materiais multifuncionais para aplicao em

    nanomedicina

    O crescente interesse da aplicao da nanotecnologia em medicina tem levado ao

    surgimento de um novo campo chamado nanomedicina (4). Mais recentemente, o termo

    teranstico (do ingls theranostic, consiste na unio das palavras therapeutic e

    diagnostic) tem sido utilizado para descrever agentes multifuncionais que combinam

    capacidades teraputicas e de diagnstico (49). Esta lgica surgiu do fato de que algumas

    doenas, como cncer, so imensamente heterogneas e os tratamentos existentes so

    limitados e efetivos em apenas alguns estgios da doena. A ideia, portanto, consiste no

    desenvolvimento de complexos versteis a partir do casamento entre diagnstico e teraputica

    (9).

    Nanovetores multifuncionais especficos para clulas cancergenas tm se mostrado

    excelentes candidatos para o tratamento e diagnstico de cncer e, por isso, o termo

    teranstico tem sido amplamente aplicado a nanomateriais. No entanto, a utilizao

    eficiente de nanomateriais para o diagnstico e tratamento de cncer requer que estas

    partculas se alojem especificamente na regio de interesse. Esta especificidade pode ser

    alcanada por meio da funcionalizao de sua superfcie com biomolculas como protenas

    (10), peptdeos (11), aptmeros (12) e anticorpos especficos (13).

    Complexos formados por nanoparticulas funcionalizadas com molculas de

    reconhecimento melhoram a biodistribuio e o direcionamento das nanoparticulas at o

    tumor (1, 23, 49). As nanopartculas, alojadas na regio de interesse, podem, ento, ser

    utilizadas para a deteco precoce de cncer por meio de tcnicas de imageamento, alm de

    auxiliarem no tratamento, como por hipertermia (23). Ainda, nestes nanocomplexos pode ser

    adicionado um antitumoral que direcionado especificamente at a regio cancergena,

  • 36

    Reviso Bibliogrfica

    diminuindo, assim, os efeitos colaterais deste frmaco (50). A Figura 4 (51) mostra uma

    representao esquemtica de uma nanopartcula teranstica atuando no reconhecimento

    especifico, podendo ser utilizada, portanto, no diagnstico, e na liberao controlada de

    frmacos para o tratamento (51).

    Figura 4 - Representao esquemtica de uma nanopartcula teranstica. Nanopartculas multifuncionais so

    direcionadas at a membrana de clulas cancergenas usando um ligante especfico para um receptor

    na superfcie da clula (51).

    2.5.1 Jacalina

    Lectinas correspondem a uma classe de protenas que se ligam especificamente a

    carboidratos (52). Suas principais atividades biolgicas esto relacionadas ao

    reconhecimento celular, interaes patgeno-hospedeiro, sinalizao, diferenciao celular e

    resposta imune por meio da ligao a carboidratos especficos contidos na superfcie das

    clulas (52, 53).

    A Jacalina, uma lectina vegetal encontrada na semente da jaca, um ligante especifico

    para a galactose e para que esta interao ocorra no necessria a presena de ons metlicos

    (54). Na sua estrutura existem de 7 a 10% de carboidratos e no contm resduos de cistena.

    A Jacalina possui massa molar de 66000 g mol-1

    e ponto Isoeltrico (pI) em uma faixa ampla

    de pH, entre 4 e 8,5, sugerindo a presena de isoformas (54). Possui a forma de um

    homotetrmero em pH neutro com cada unidade tendo 16,5 kDa. Bourne e colaboradores (55)

    mostraram que os cristais obtidos a partir da Jacalina pertencem ao grupo espacial P21 com

    dimenses de cela unitria de 5,8 nm, 8,23 nm e 6,29 nm, contendo um tetrmero de Jacalina

    por unidade assimtrica. A Figura 5 ilustra sua estrutura tetramrica (PDB 1KU8).

  • 37

    Reviso Bibliogrfica

    Figura 5 - Estrutura tetramrica da Jacalina extrada do pdb (cdigo 1KU8).

    Como a Jacalina uma lectina tetramtrica e possui quatro stios de ligao, estabelece

    uma ponte ligante entre as clulas, ligando-se a carboidratos presentes na superfcie de

    diferentes clulas ao mesmo tempo, formando uma rede que se aglutina (54). Alm disso, a

    Jacalina pode ser um estimulante potente e seletivo de funes distintas das clulas T e

    apresenta a habilidade de reconhecer especificamente IgA de soro humano. Ela tambm

    interage com regies especficas do CD4 e inibe a infeco de HIV in vitro (54).

    A Jacalina tambm tem chamado ateno devido sua capacidade de reconhecer

    especificamente os resduos de galactose e acetilgalactosamina (GalNac) interligados nas

    posies 1-3 (Gal1-3GalNAc), dissacardeo associado a tumores de origem oncofetal e

    conhecido como antgeno Thomsen-Friedenreich (antgeno T) (53, 56, 57, 58). Este

    dissacardeo expresso em aproximadamente 90% dos tipos de cnceres humano, incluindo

    carcinomas humanos como de mama, bexiga, cavidade bucal, prstata, ovrio, fgado e

    estmago (53, 59). Na maioria destes casos, o aumento da expresso deste antgeno est

    relacionado com a progresso do cncer e processos de metstase (59).

    Desta maneira, o desenvolvimento de um complexo contendo Jacalina e

    nanoparticulas apresenta elevado potencial de aplicao em biotecnologia e medicina para

    atuao no diagnstico precoce e tratamento de cncer, onde nanopartculas funcionalizadas

    com esta lectina podem ser carreadas especificamente at clulas tumorais.

  • 38

    Reviso Bibliogrfica

    2.6 Utilizao de biomolculas na auto-organizao de nanomateriais

    A natureza, em um processo de engenharia evolutiva lenta, tem otimizado o

    planejamento e a sntese de materiais com estruturas impressionantes e cada vez mais

    versteis e resistentes. Segundo Geoffrey A. Ozin em seu livro Nanochemistry: a chemical

    approach to nanomaterials (19) razovel que pesquisadores interessados na fabricao de

    novos materiais aprendam como a natureza tem resolvido problemas que so frequentemente

    encontrados na cincia e tecnologia. Este sinergismo entre a natureza e a qumica de materiais

    tem inspirado o desenvolvimento de materiais com estruturas e propriedades

    fundamentalmente novas (19).

    A fabricao controlada de estruturas em escalas muito reduzidas que vo alm dos

    limites atuais das tcnicas de litografia uma meta tecnolgica de grande interesse prtico e

    fundamental (14). Mtodos para atingir este objetivo so baseados principalmente na

    estabilizao de nanoparticulas por polmeros que respondam a algum estimulo externo como

    pH (60), luz (61) ou temperatura (62). Estes materiais so chamados de materiais inteligentes

    (smart materials) (63) e possuem pelo menos uma de suas propriedades, como forma ou

    solubilidade, drasticamente modificada em resposta a algum destes estmulos.

    Outra estratgia incorpora o uso de biomolculas para organizar nanomateriais em

    padres predefinidos. A combinao destas molculas biolgicas com nanomateriais

    inorgnicos funcionais pode levar a muitas organizaes com forma, tamanho, alinhamento e

    orientao controlados (15, 16). Por exemplo, por meio da conjugao de fitas simples de

    DNA com nanoparticulas de ouro, Sharma e colaboralores (16) formaram nanoestruturas

    tubulares com vrias conformaes e quiralidades, semelhantes s dos nanotubos de carbono,

    o que, segundo os autores, pode representar um avano substancial para aplicaes de

    nanomateriais em dispositivos. O reconhecimento biolgico, como antgeno-anticorpo,

    protena-substrato, entre outros, tambm tem sido utilizado para induzir a agregao

    reversvel de nanoparticulas inorgnicas (64).

  • 39

    Reviso Bibliogrfica

    2.6.1 BeCen1

    Centrinas so protenas de aproximadamente 20000 g mol-1

    e que possuem quatro

    domnios EF-hand de ligao de clcio usualmente encontradas em Centros Organizadores de

    Microtubulos (MTOCs, do ingls Microtubule-organizing centers) (65). Inicialmente isolada

    de razes flageladas na alga verde unicelular Tetraselmis striata, homlogos de centrinas

    foram localizados tambm em organismos eucariotos como fungos, plantas e animais (65, 66).

    As centrinas parecem estar envolvidas em diversos processos que vo desde reparao por

    exciso de nucleotdeos e transduo de sinais em clulas fotorreceptoras at transporte de

    RNAm ncleo-citoplasma (65, 66). No entanto, suas funes mais bem caracterizadas so a

    contrao de fibras dependente de clcio de clulas flageladas e orientao, localizao e

    separao de corpos basais e duplicao de MTOCs, essencial para a mitose (66).

    A centrina utilizada no presente trabalho chamada de BeCen1 e foi inicialmente

    isolada do fungo Blastocladiella emersonii (66). Atualmente produzida heterologamente por

    E.coli. Esta centrina possui a habilidade de formar filamentos nanomtricos em funo da

    temperatura (67), podendo apresentar, portanto, um elevado potencial biotecnolgico. A

    Figura 6 (67) mostra uma imagem de Microscopia Eletrnica de Transmisso da protena

    BeCen1 utilizando acetato de uranila como agente de contraste, onde possvel identificar a

    formao dos filamentos aps o aquecimento da protena. Tourbez e colaboradores (65)

    tambm analisaram este processo reversvel de formao de filamentos na centrina humana

    HsCen2, que possui 70% de identidade com a BeCen1.

    Figura 6 Imagem de Microscopia Eletrnica de Transmisso da protena BeCen1 contrastada com acetato de

    uranila mostrando a formao de filamentos aps o aquecimento (67).

  • 40

    Reviso Bibliogrfica

    Devido a esta interessante propriedade, a conjugao de nanoparticulas com esta

    protena pode ser utilizada como uma estratgia para a produo de nanomateriais auto-

    organizados com potencial para vrias aplicaes tecnolgicas como a fabricao de

    nanodispositivos e processos bioanalticos (60).

    2.7 Citotoxicidade de nanomateriais

    Nanomateriais possuem elevado potencial para aplicaes mdicas que vo desde

    imageamento e diagnstico at liberao controlada de frmacos e teraputica (9). Por este

    motivo, a toxicidade e biocompatibilidade destes nanomateriais devem ser cuidadosamente

    avaliadas. Uma vez que nanomateriais no so caracterizados apenas pela sua composio

    qumica, mas tambm por suas dimenses fsicas especiais, estudos de toxicidade devem ser

    realizados com nfase no entendimento das propriedades fsico-qumicas que resultam nas

    respostas biolgicas adversas (68, 69). Isto significa que a toxicidade, a atividade e interao

    dos diferentes tipos de nanomateriais necessitam ser rigorosamente testados. Ensaios de

    citotoxicidade in vitro so uma maneira simples para avaliar a toxicidade bsica de um

    material (70).

    A citotoxicidade de AuNPs tem sido descrita na literatura como dependente do

    tamanho. Por exemplo, Pan e colaboradores (71) mostraram em estudos in vitro que

    nanoparticulas de ouro com 1,4 nm de dimetro provocam morte celular por meio da induo

    de estresse oxidativo e danos mitocondriais. Outros estudos apontam que nanoparticulas de

    ouro maiores, acima de 3,7 nm, praticamente no apresentam toxicidade (72, 73). Vale

    ressaltar, no entanto, que essa toxicidade tambm fortemente dependente da dose (72).

    A estabilidade e biocompatibilidade das AuNPs podem ser melhoradas por meio da

    funcionalizao de sua superfcie (69, 73). Esta cobertura das nanoparticulas determina suas

    propriedades fsico-qumicas, como tamanho total e carga da superfcie. Goodman e

    colaboradores (74) mostraram que a toxicidade de AuNPs dependente da carga superficial.

    Assim, a carga um fator extremamente importante no s na determinao da estabilidade

    do complexo, mas tambm na extenso das interaes entre a clula e as nanopartculas (69).

    Alm disso, etapas posteriores sntese, como lavagem dos nanomateriais para retirada de

  • 41

    Reviso Bibliogrfica

    compostos provenientes da sntese, controle da agregao no meio biolgico, e pH, podem ser

    determinantes para a toxicidade destes materiais (69).

    Torna-se claro que a toxidade de nanomateriais fortemente dependente de diversos

    fatores como tamanho, forma, concentrao e propriedades de superfcie. Desta maneira, o

    controle destes parmetros e a caracterizao detalhada destes materiais so de fundamental

    importncia para a determinao de suas propriedades no meio biolgico. Para cada tipo de

    nanomaterial, a citotoxicidade deve ser cuidadosamente avaliada e entendida com base nas

    suas caractersticas fsico-qumicas. Este conhecimento importante no s para entender os

    seus efeitos adversos, mas tambm para otimizao dos nanomateriais para futuras aplicaes

    biomdicas.

  • 42

  • 43

    Objetivos

    3. OBJETIVOS

    O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da sntese e caracterizao

    de AuNPs funcionalizadas com protenas. Em especial, visamos o entendimento e

    caracterizao das interaes entre nanoparticulas e biomolculas com vistas aplicao em

    medicina, por meio do estudo de dois sistemas distintos:

    AuNPs funcionalizadas com a protena Jacalina para a fabricao de nanopartculas

    teransticas especficas para clulas tumorais. Este sistema ser caracterizado por tcnicas

    microscpicas, espectroscpicas e calorimtricas.

    AuNPs funcionalizadas com a protena BeCen1 para a construo de nanocompsitos

    termorresponsivos e auto-organizados.

  • 44

  • 45

    Materiais e Mtodos

    4. MATERIAIS E MTODOS

    4.1 Materiais

    Todos os reagentes foram utilizados como adquiridos. Todas as solues foram

    preparadas utilizando gua Milli-Q (resistividade = 18,2 M cm). cido tetracloaurico

    HAuCl4, cido frmico e Isotiocianato de fluorescena (FITC, do ingls Fluorescein

    Isothiocyanate) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Dendrimero Poli(amidoamina) gerao

    4.0 (PAMAM G4) foi adquirido da Dendritech.

    Na preparao do tampo PBS (do ingls, Phosphate Buffer Saline) 0,1 mol L-1

    , NaCl

    0,15 mol L-1

    pH = 7,4 foram utilizados os seguintes reagentes: Fosfato de potssio

    monobsico e Fosfato de sdio dibsico 99% adquiridos da Sigma-Aldrich e Cloreto de sdio

    da J.T.Baker. No preparo do tampo fosfato 10 mmol L-1

    pH 7,4 tambm foram utilizados os

    Fosfato de potssio monobsico e Fosfato de sdio dibsico 99% da Sigma-Aldrich. No

    preparo do tampo Tris (Tris(hidroximetil)aminometano) 20 mmol L-1

    , NaCl 150 mmol L

    -1 e

    Tris 20 mmol L-1

    , NaCl 10 mmol L

    -1, ambos em pH = 7,0, utilizou-se TRIZMAR

    Base da

    Aldrich e Cloreto de sdio da J.T.Baker.

    4.2 Estudos do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC

    4.2.1 Sntese de Nanopartculas de ouro estabilizadas em PAMAM-G4

    Nanopartculas de ouro foram obtidas na presena do dendrmero PAMAM-G4

    (AuNP-PAMAM G4). A reduo de ons metlicos na presena de dendrmeros pode levar a

    obteno de nanopartculas encapsuladas nas cavidades do dendrmero, levando a formao

    de nanoparticulas muito pequenas (menores que 5 nm) e com elevado controle de forma e

    tamanho (40) como mostra o esquema da Figura 7. Neste caso, as nanopartculas

    normalmente so obtidas por meio da reduo rpida usando NaBH4. Por outro lado, a

  • 46

    Materiais e Mtodos

    utilizao de redutores mais fracos pode levar a obteno de nanopartculas maiores, que no

    so formadas nas cavidades e so estabilizadas por vrias molculas de dendrmeros (75).

    A sntese das nanopartculas consistiu basicamente em se adicionar volumes iguais de

    HAuCl4 1,0 mmol L-1

    e PAMAM G4 0,07 mmol L-1

    e, em seguida, de uma soluo de cido

    frmico 10% v/v (76). A gerao 4 (Figura 4) foi escolhida no presente trabalho, pois

    possibilita a obteno de partculas com tamanhos reduzidos e altamente estveis em meio

    aquoso (77). O sistema foi mantido em agitao a temperatura ambiente por 2 horas e, em

    seguida, permaneceu em repouso e protegido da luz. Quando todo o ouro foi reduzido, a

    colorao passou de amarelo claro a vermelho. Esta reao ocorreu durante um perodo total

    de 4 horas.

    Figura 7 - Representao esquemtica da sntese de nanopartculas de ouro na presena do dendrmero PAMAM

    G4 mostrando a estabilizao das nanopartculas nas cavidades do dendrmero.

    Antes de serem utilizadas, as nanoparticulas foram lavadas em tampo fosfato 10

    mmol L-1

    pH = 7,4. Este tampo foi escolhido, aps a realizao de vrios testes de

    estabilidade, inclusive na presena da protena Jacalina. Para isto, as AuNP-PAMAM G4

    foram centrifugadas a 13000 rpm e 20C por 15 minutos em uma Centrifuga Eppendorf 5415

    R. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido no tampo. Este ciclo de

    lavagem foi repetido at que as nanopartculas apresentassem um pH fisiolgico. No entanto,

    devido a instabilidade das AuNP-PAMAM G4 em pH = 7,4, estas lavagens eram realizadas

    pouco tempo antes de serem utilizadas.

    4.2.2 Obteno e purificao da Jacalina

    A lectina Jacalina foi obtida a partir do extrato bruto das sementes de Artocapus

    integriflia em colaborao com tcnicos do Grupo de Biofsica Molecular IFSC/USP. As

    HAuCl4Reduo

  • 47

    Materiais e Mtodos

    sementes foram lavadas com gua destilada, secas a temperatura ambiente e, ento, trituradas

    e ressuspendidas em tampo PBS pH = 7,4. Esta mistura permaneceu em agitao por 12

    horas a 4C e, ento, foi centrifugada a 4000 rpm em uma centrfuga refrigerada Eppendorf

    5804R a 4C. O sobrenadante, ou extrato bruto, foi separado e purificado por cromatografia

    de afinidade utilizando-se uma resina Sepharose contendo D-Galactose imobilizada (Pierce)

    equilibrada com o tampo PBS. Aps a passagem do extrato bruto, as protenas que no

    possuem afinidade por D-Galactose foram eludas com tampo PBS e coletadas em tubos de

    10 mL at que no se observou mais absoro em 280 nm. A Jacalina foi, ento, eluda com

    tampo PBS contendo 0,2 mol L-1

    de D-Galactose.

    O eluato proveniente da cromatografia de afinidade passou por uma etapa adicional de

    purificao utilizando cromatografia de excluso molecular. Volumes de 1 mL da protena

    foram aplicados em uma coluna Superdex75 3.2/30 (Pharmacia Biotech Smart System)

    acoplada a um sistema kta purifier (GE Healthcare), previamente equilibrada com tampo

    PBS pH 7,4. O fluxo utilizado foi de 0,5 mL min-1

    , monitorado pela absorbncia em 220 e

    280 nm. A concentrao da protena foi medida por meio da Lei de Beer-Lambert (Equao

    2), utilizando a absorbncia em 280 nm e o coeficiente de absortividade molar desta protena.

    4.2.3 Marcao da Jacalina com FITC

    A Jacalina foi marcada com o fluorforo FITC, cujos comprimentos de onda mximos

    de excitao e emisso so aproximadamente 495 e 521 nm, respectivamente. O FITC se liga

    aos grupamentos amino terminal ou aminas primrias das protenas e, portanto, no deve

    interferir na conjugao da protena com as AuNP-PAMAM G4, uma vez que estas ltimas

    so funcionalizadas com grupamentos amina e devem interagir com outros grupamentos da

    protena. Esta marcao permitiu o monitoramento por microscopia de fluorescncia da

    protena e da protena conjugada com as AuNP-PAMAM G4 nos testes posteriores realizados

    em cultura de clulas.

    Para a marcao, uma soluo de FITC 0,01 mol.L-1

    em tampo PBS pH = 7,4 foi

    adicionada a suspenso de Jacalina 1,0 mg mL-1

    . O sistema foi mantido em agitao e

    protegido da luz a temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, o excesso de FITC foi

    removido por dilise no mesmo tampo em uma membrana de 25 kDa (Spectra/Por). A

  • 48

    Materiais e Mtodos

    protena marcada Jacalina-FITC foi, ento, retirada do saco de dilise e conjugada com as

    AuNP-PAMAM G4.

    4.2.4 Conjugao da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4

    Vrias estratgias foram testadas para a conjugao da Jacalina com nanoparticulas de

    ouro. Na reduo in situ, por exemplo, a protena mostrou-se instvel, precipitando logo aps

    o trmino da sntese. A interao com nanoparticulas de ouro estabilizadas em citrato tambm

    no se mostrou eficiente, visto que a quantidade de protena junto com as nanoparticulas aps

    o processo de separao era muito baixa. Assim, a conjugao com as AuNP-PAMAM G4 foi

    a que apresentou os melhores resultados e escolhida para as caracterizaes posteriores.

    Desta maneira, 250 L de AuNP-PAMAM G4 dispersas em tampo fosfato pH = 7,4

    foram adicionados a 1,3 mL de uma soluo contendo 1,0 mg mL-1

    de Jacalina tambm em

    tampo PBS. O sistema foi mantido sob agitao a 4 C e protegido da luz por

    aproximadamente 12 horas. Tempos maiores de incubao testados no alteraram os

    resultados espectroscpicos e, portanto, este perodo foi adotado para todos os experimentos.

    A separao do excesso de Jacalina, ou seja, que no foi eficientemente conjugada

    com as AuNP-PAMAM G4, foi realizada por centrifugao. A amostra foi centrifugada a

    13000 rpm e 4 C por 15 minutos em uma Centrifuga Eppendorf 5415 R. O sobrenadante foi

    descartado e o precipitado ressuspendido em 500 L de tampo fosfato 10 mmol L-1

    pH = 7,4.

    Este ciclo de lavagem foi repetido por mais duas vezes, para garantir que todo o excesso de

    protena fosse eliminado. A separao do excesso de protena foi testada tambm por

    Cromatografia de Excluso Molecular. No entanto, como as colunas de excluso molecular

    eram compostas por agarose e dextran, a Jacalina interagiu fortemente com estas resinas,

    obtendo-se um baixo rendimento (resultados no mostrados).

  • 49

    Materiais e Mtodos

    4.2.5 Estudos qualitativos da interao do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC

    com clulas tumorais e saudveis

    Com o intuito de investigar a especificidade do complexo AuNP-PAMAM

    G4/Jacalina-FITC por clulas tumorais, anlises qualitativas acerca da interao do complexo

    AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC com clulas tumorais e saudveis foram realizados. Todos

    os reagentes utilizados na cultura de clulas foram previamente autoclavados ou filtrados em

    membrana para evitar a contaminao da cultura. Todos os procedimentos foram realizados

    em cmara de fluxo laminar com material estril. Duas linhagens celulares foram testadas:

    clulas epiteliais de carcinoma cervical humano (HeLa) e no tumorais de fibroblastos de

    adipcitos de camundongo (L929), ambas aderentes.

    As clulas (1x105 clulas mL

    -1) foram incubadas em meio de cultura DMEM (do

    ingls, Dulbeccos modified Eagles mdium), contendo 2% de L-glutamina, suplementado

    com 15% de soro bovino fetal (SBF), 0,06 g L-1

    de penicilina G e 0,10 g L-1

    de estreptomicina

    em estufa com atmosfera de aproximadamente 5% de CO2 e 37 C. O crescimento celular foi

    acompanhado utilizando-se o microscpio invertido Nikon Eclipse TS 100.

    As clulas foram semeadas em placas de cultura de 24 poos com volume final de 500

    L e, aps 24 horas, foram tratadas em triplicata com as concentraes de 0,5; 1,0 e

    1,5 mol L-1

    do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC em tampo fosfato

    10 mmol L-1

    pH = 7,4 e deixadas em estufa com atmosfera de 5% de CO2 e 37 C por,

    aproximadamente, 24 horas. Com o intuito de realizar uma anlise comparativa, as mesmas

    concentraes e condies foram utilizadas para Jacalina-FITC e AuNP-PAMAM G4. O

    controle negativo foi realizado por meio da adio de quantidades equivalentes do tampo.

    Para todas as amostras e cada uma das concentraes, os tratamentos foram realizados em

    triplicata.

    Aps o perodo de incubao, o meio de cultura foi retirado e as clulas aderidas

    foram lavadas trs vezes com tampo PBS pH = 7,4 estril. Em seguida, as imagens foram

    obtidas em um microscpio de fluorescncia Nikon Eclipse TS 100 acoplado a cmera digital

    Nikon DS-Ri1 com objetiva de 40x. Para cada regio fotografada por microscopia tica, sua

    respectiva imagem por microscopia de fluorescncia era obtida utilizando a excitao no azul

    correspondente ao comprimento de onda de absoro do FITC.

  • 50

    Materiais e Mtodos

    4.2.6 Ensaios de citotoxicidade in vitro

    O conhecimento da toxicidade de novos materiais de fundamental importncia para

    futuras aplicaes. Desta maneira, com intuito de avaliar a toxicidade do complexo AuNP-

    PAMAM G4/Jacalina-FITC, ensaios de citoxicidade in vitro foram realizados utilizando as

    mesmas linhagens celulares, HeLa e L929, e o mesmo procedimento para o cultivo das

    clulas. As clulas foram semeadas em placas de cultura de 96 poos com volume final de

    200 L e, aps 24 horas, foram tratadas em triplicata com as concentraes de 0,5; 1,0 e

    1,5 mol L-1

    do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FITC, da Jacalina-FITC e AuNP-

    PAMAM G4 em tampo fosfato 10 mmol L-1

    pH = 7,4 e deixadas em estufa com atmosfera

    de 5% de CO2 e 37 C por aproximadamente 24 horas. O controle negativo foi realizado por

    meio da adio de quantidades equivalentes do tampo.

    Tanto no experimento qualitativo descrito anteriormente (Tpico 4.2.5) como no teste

    de toxicidade, o clculo da concentrao do complexo foi baseado na concentrao da

    protena obtida pela absoro em 280 nm. No controle com a Jacalina-FITC, as mesmas

    concentraes de protena foram utilizadas. J para as AuNP-PAMAM G4, um procedimento

    anlogo ao utilizado para a sntese do complexo foi realizado, mas apenas em tampo, ou seja,

    na ausncia de protena, para garantir que a quantidade de nanoparticulas fosse a mesma.

    Ento, a mesma quantidade adicionada de complexo para cada concentrao, foi tambm

    adicionada de AuNP-PAMAM G4 em tampo fosfato 10 mmol L-1

    .

    A citotoxicidade foi analisada utilizando o ensaio MTT, um teste utilizado para avaliar

    a viabilidade celular baseado em uma reao colorimtrica. O sal brometo de 3-(4,5-

    dimetilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazlio (MTT, do ingls 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-

    diphenyl-2H tetrazolium bromide) entra na mitocndria de uma clula vivel e clivado pela

    enzima succinato desidrogenase, produzindo cristais formazan, de colorao roxa (78). A

    quantidade de cristais formada diretamente proporcional ao nmero de clulas viveis.

    Assim, quanto mais escura a colorao ao final da reao, maior a viabilidade celular.

    Desta maneira, aps o perodo de 24 horas de interao das clulas com as amostras,

    10 L da soluo MTT a 5 mg mL-1

    em tampo PBS pH = 7,4 foi adicionado a cada poo. As

    placas foram, ento, novamente incubadas na estufa com atmosfera de 5% de CO2 e 37 C por

    3 horas. Em seguida, as placas foram centrifugadas por 5 minutos a 3000 rpm em uma

  • 51

    Materiais e Mtodos

    centrifuga Eppendorf 5804R utilizando um rotor de placas. O sobrenadante foi descartado e

    100 L de DMSO (Dimetilsulfxido) adicionado em todos os poos para a solubilizao dos

    cristais. Aps 5 minutos de agitao em baixa velocidade, a absorbncia de cada poo foi

    determinada utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M3 (Molecular Devices) a 570

    nm.

    A porcentagem relativa de clulas sobreviventes foi calculada dividindo-se a

    absorbncia das clulas tratadas por aquela do controle de cada experimento. Para todas as

    amostras e cada uma das concentraes, os tratamentos das clulas foram realizados em

    triplicata e para cada tipo de clula os experimentos foram repetidos trs vezes, resultando em

    nove medidas para cada concentrao. Os resultados foram analisados de acordo com a mdia

    desvio padro resultante destas nove medidas, e foram estatisticamente comparados

    utilizando a anlise de varincia simples (ANOVA) e o teste de comparaes mltiplas Tukey

    no software GraphPad Prisma (p < 0,05).

    4.3 Estudos do complexo AuNP-BeCen1

    4.3.1 Expresso e purificao da centrina BeCen1

    A expresso e purificao da protena BeCen1 foram realizadas em colaborao com a

    Dra. Ana Isabel de Camargo. Brevemente, 5 mL de pr-inculo em meio LB (Meio de cultura

    Luria Bertani), contendo o antibitico canamicina 50 g mL-1

    para a construo em vetor

    pET28a desta protena, foi incubado a 37C e agitao de 250 rpm durante 16 horas. Aps

    este perodo, foi diludo em 500 mL de meio LB previamente autoclavado com 50 g mL-1

    de

    canamicina e permaneceu em agitao constante de 250 rpm por 2 horas a 37 C. A cultura foi

    induzida com 0,4 mmol L-1

    de IPTG (Isopropil--D-tiogalactopiranosdeo) a 37 C e agitao

    de 250 rpm por mais 4 horas.

    Em seguida, a cultura foi centrifugada por 15 minutos a 5000 rpm e o sobrenadante

    descartado. As clulas foram ressuspendidas em 10 mL do tampo Tris 20 mmol L-1

    , NaCl

    150 mmol L-1

    , pH = 7,0 e, ento, sonicadas por 10 minutos com intervalos de 30 segundos. Os

    lisados foram centrifugados por 30 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi purificado por

    cromatografia de afinidade, utilizando uma coluna de Ni-NTA super flow (Qiagen)

  • 52

    Materiais e Mtodos

    equilibrada com 10 volumes do tampo Tris 20 mmol L-1

    , NaCl 150 mmol L-1

    , pH = 7,0. O

    sobrenadante foi aplicado na coluna, que foi, ento, lavada com 10 volumes do tampo

    contendo quantidades crescentes de imidazol de 5 a 100 mmol L-1

    para retirar os

    contaminantes ligados a coluna com baixa afinidade. Finalmente, a BeCen1 foi eluda em 300

    mmol L-1

    de imidazol. Este ltimo eluato foi novamente purificado por Cromatografia de

    Excluso Molecular em uma coluna Superdex 75 10/300 GL com faixa de separao entre

    3000 e 70000 Da, utilizando um sistema AKTA purifier (Amersham, Pharmacia). A coluna

    foi equilibrada e eluda com tampo Tris 20 mmol L-1

    , NaCl 10 mmol L-1

    pH= 7,0 contendo 1

    mmol L-1

    de EDTA (cido etilenodiamino tetra-actico) para retirar o Ca2+

    . A velocidade de

    fluxo foi de 0,5 mL min-1

    , monitorada pela absorbncia em 220 e 280 nm e o eluato coletado

    em fraes de 1 mL. As fraes contendo a protena foram lavadas em um concentrador

    utilizando o tampo Tris 20 mmol L-1

    , NaCl 10 mmol L-1

    pH= 7,0 para retirar o EDTA.

    4.3.2 Sntese in situ das nanoparticulas de ouro com BeCen1

    Na conjugao da protena BeCen1 com AuNPs, a estratgia que apresentou os

    melhores resultados foi a sntese in situ das nanopartculas, ou seja, a reduo dos ons de

    ouro na presena da protena BeCen1. Em 700 L de uma soluo da protena a 0,8 mg mL-1

    em tampo Tris 20 mmol L-1

    , NaCl 10 mmol L-1

    pH= 7,0, adicionou-se 100 L de uma

    soluo de HAuCl4 3,0x10-4

    mol L-1

    . Este sistema foi mantido em agitao por alguns

    minutos e, ento, 30 L de cido frmico 10% v/v foram adicionados. O cido frmico atua

    como redutor e a protena como estabilizante, sendo determinante na forma e tamanho final

    das partculas. Aps a adio do agente redutor, o sistema foi mantido em agitao a

    temperatura ambiente por 15 minutos e, ento, armazenado a 4 C e protegido da luz por

    aproximadamente 24 horas. Aps este perodo, a suspenso apresentou uma colorao rosa.

    O excesso de protena foi removido utilizando-se a tcnica de Cromatografia de

    Excluso Molecular em uma coluna Superdex 75 10/300 GL, utilizando um sistema AKTA

    purifier (Amersham, Pharmacia). Esta tcnica tem sido muito utilizada no estudo e separao

    de nanopartculas conjugadas com biomolculas (79). A coluna foi equilibrada e eluda com

    tampo Tris 20 mmol L-1

    , NaCl 10 mmol L-1

    pH= 7,0. A velocidade de fluxo foi de 0,5 mL

    min-1

    , monitorada pela absorbncia em 280 e 520 nm, correspondentes a protena e as AuNPs,

  • 53

    Materiais e Mtodos

    respectivamente, e o eluato coletado em fraes de 1 mL. Apesar de o pH inicial da sntese ser

    cido, devido a diluio e troca de tampo na passagem pela coluna, a frao coletada

    contendo as AuNPs e a protena apresentaram um pH prximo ao fisiolgico.

    As fraes que apresentaram as bandas em 280 e/ou 520 nm foram submetidas a

    Eletroforese desnaturante em Gel de Poliacrilamida 15% contendo dodecil sulfato de sdio

    (SDS-PAGE), utilizando os seguintes marcadores de massa molecular: 12 kDa (citocromo C),

    20 KDa (inibidor de tripsina de soja), 29 kDa (anidrase carbnica bovina), 45 kDa

    (ovalbumina) e 66 kDa (albumina srica bovina).

    4.3.3 Monitoramento da polimerizao controlada por temperatura por meio de medidas de

    espalhamento de luz

    A mudana na turbidez induzida pelo rpido aumento da temperatura das suspenses

    contendo Becen1 e o complexo AuNP-BeCen1 foram monitoradas pela observao do

    espalhamento de luz a 90 utilizando o Espectrofluormetro K2 (ISS Illinois, USA)

    pertencente ao Grupo de Biofsica Molecular IFSC/USP acoplado a um controlador de

    temperatura NESLAB RET 111. Para isto, fixou-se o comprimento de onda de excitao e

    emisso em 350 nm e mediu-se o espalhamento por 1200 segundos em temperaturas fixas de

    25, 35, 45 e 55 C.

    4.4 Tcnicas de Caracterizao

    4.4.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM)

    Uma das maneiras mais eficientes e diretas de caracterizar a morfologia e tamanho de

    nanopartculas por meio de imagens obtidas por Microscopia Eletrnica de Transmisso

    (TEM, do ingls Transmission Electron Microscopy). As imagens foram obtidas em um

    microscpio eletrnico JEOL JEM-2100 operando a 200 kV, pertencente ao Laboratrio de

    Microscopia Eletrnica (Laboratrio Nacional de Nanotecnologia) em Campinas-SP. Em

    todos os casos, os sistemas foram preparados depositando uma gota da suspenso aquosa de

  • 54

    Materiais e Mtodos

    nanopartculas sobre uma grade de cobre recoberta por um filme fino de carbono 300 mesh

    (Ted Pella, Inc.). Aps a deposio da gota sobre o suporte, a gua foi lentamente evaporada a

    temperatura ambiente.

    Apenas para o caso em que a inteno era analisar a propriedade de polimerizao

    controlada por temperatura da protena no complexo AuNP-BeCen1, este sistema foi

    aquecido a aproximadamente 45 C durante 15 minutos e, ento, uma gota foi depositada

    sobre a grade de cobre e seca em estufa a 40 C.

    O dimetro mdio e o desvio-padro das nanopartculas foram determinados

    estatisticamente pela contagem de 100 a 150 partculas utilizando o software de domnio

    publico ImageJ desenvolvido pelo National Institute of Health, NIH, Estados Unidos.

    4.4.2 Espectroscopia no Ultravioleta-Visvel (UV-VIS)

    A espectroscopia no UV-VIS tem sido amplamente utilizada na caracterizao das

    propriedades ticas de nanopartculas metlicas. Segundo a teoria de Mie (80), a quantidade

    de luz que chega ao detector de um espectrofotmetro, aps passar atravs de uma suspenso

    diluda de n