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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
Impacto da antibioticoterapia materna intraparto sobre as populações
de Bifidobacterium spp. em diferentes fases do leite humano
Julia de Melo Iaucci
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade de
São Paulo.
Orientador(a):
Prof. Dra. Susana Marta Isay Saad
Colaboradora: doutoranda Marina Padilha
(bolsista FAPESP)
São Paulo
2017
SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... 1
RESUMO ....................................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 3
1.1 Antibioticoterapia materna intraparto (ATI) ..................................................... 3
1.2 A interação entre micro-organismos e o ser humano e o processo de colonização do
recém-nascido. ............................................................................................ 5
1.3 A importância do gênero Bifidobacterium na saúde do recém-nascido e o papel do leite
materno no processo de colonização intestinal. ..................................................... 7
2. OBJETIVO ................................................................................................ 10
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 10
3.1 Delineamento do estudo e coleta de leite humano ........................................... 10
3.2 Características clínicas maternas e do recém-nascido. ...................................... 11
3.3 Extração de DNA a partir do leite humano. .................................................... 12
3.4 Quantificação de Bifidobacterium spp e bactérias totais. ................................... 13
3.5 Análises dos resultados ............................................................................ 14
4. RESULTADOS ............................................................................................. 14
5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 20
6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 23
7. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................... 24
8. ANEXOS ................................................................................................... 32
8.1 ANEXO 1 ............................................................................................. 32
1
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATI Antibioticoterapia materna intraparto
CATI Com antibioticoterapia materna intraparto
CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças
HU Hospital Universitário
IMC Índice de Massa Corporal
OLH Oligossacarídeos presentes no leite humano
qPCR quantitative Polymerase Chain Reaction
SATI Sem antibioticoterapia materna intraparto
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
2
RESUMO IAUCCI, J.M. Impacto da antibioticoterapia materna intraparto sobre as populações de Bifidobacterium spp. em diferentes fases do leite humano. 2017. no. 29. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.
Palavras-chave: Antibioticoterapia intraparto; Bifidobacterium; Leite humano.
INTRODUÇÃO: O leite humano consiste em uma importante fonte de micro-organismos para a colonização intestinal do recém-nascido. Embora a antibioticoterapia materna durante o parto vaginal seja uma importante profilaxia na sepse neonatal, é necessário elucidar seu impacto sobre a microbiota do leite humano, especialmente sobre o gênero Bifidobacterium, o qual tem sido associado a efeitos benéficos à saúde. OBJETIVOS: Investigar o impacto da antibioticoterapia materna intraparto (ATI) nas quantidades de Bifidobacterium spp. presente no leite humano na primeira semana (curto prazo) e no primeiro mês (médio prazo) após o parto, por meio da técnica de PCR em tempo real (qPCR). Paralelamente, foram quantificadas bactérias totais, com a finalidade de monitorar a carga bacteriana do leite materno nos dias analisados. MATERIAIS E MÉTODOS: Amostras de leite humano foram coletadas a partir de 55 lactantes atendidas no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, aos 7 ± 3 dias após o parto e, posteriormente, aos 30 ± 4 dias após o parto. As amostras coletadas foram aliquotadas e armazenadas a -80 ºC para posterior extração de DNA. A amplificação do DNA bacteriano foi realizada, utilizando-se primers e probes selecionados da literatura. As análises de quantificação de Bifidobacterium spp. e de bactérias totais foram conduzidas por qPCR. RESULTADOS: Dentre as participantes do estudo, 34 não receberam ATI (Grupo SATI) e 21 receberam ATI (Grupo CATI). Foram observadas menores quantidades de Bifidobacterium no grupo CATI, na primeira semana após o parto [medianas = 2,1 (1,7 – 2,3) vs 2,4 (2,1 – 2,8) log de células equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente; p = 0,01)], embora as quantidades de bactérias totais não tenham apresentado diferenças estatísticas [medianas = 5,0 (4,5 – 5,7) vs 5,0 (4,5 – 5,4) log de células equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente; p = 0,69]. Observou-se uma redução nas quantidades de bactérias totais em ambos os grupos entre 7 ± 3 e 30 ± 4 dias após o parto e não foram observadas diferenças entre os grupos aos 30 ± 4 dias [medianas = 4,7 (4,5 – 5,0) vs 4,6 (4,2 – 5,0) log de células equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente; p = 0,71]. Aos 30 ± 4 dias após o parto, não foram observadas diferenças nas quantidades de Bifidobacterium entre os grupos [medianas = 2,5 (2,1 – 2,7) vs 2,2 (1,9 – 2,3) log de células equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente; p = 0,50]. No entanto, houve um aumento nas quantidades de Bifidobacterium entre os dias 7 ± 3 [mediana = 2,1 (1,7 – 2,3) log de células equivalentes/mL] e 30 ± 4 [2,5 (2,1 – 2,7) log de células equivalentes/mL] dias após o parto (p = 0,03) no grupo CATI. CONCLUSÃO: Os resultados do presente estudo sugerem que ATI apresenta influência significativa sobre as quantidades de Bifidobacterium na primeira semana após o parto. Porém, estas quantidades tendem a se recuperar, ao longo do primeiro mês após o parto, alcançando quantidades similares às encontradas no grupo SATI aos 30 ± 4 dias.
3
1. INTRODUÇÃO
1.1 Antibioticoterapia materna intraparto (ATI) A utilização materna de antibióticos durante o parto vaginal consiste em uma prática
profilática mundialmente disseminada, com a finalidade de prevenção da infecção
neonatal pelo Streptococcus agalactiae ou Estreptococo grupo B (EGB), através da
transmissão vertical durante o parto.
A espécie Streptococcus agalactiae é Gram-positiva, usualmente encontrada no trato
gastrointestinal e genito-urinário (BERARDI et al., 2013) e estima-se que entre 10 e 30%
das gestantes são colonizadas por EGB (CDC, 2010). Apesar de ser comumente
identificada como parte da comunidade microbiana comensal de indivíduos adultos, na
década de 70 a espécie foi identificada como a principal causa de morbidade e
mortalidade neonatal causada por infecções (VERANI; SCHRAG, 2010; PINTYE et al.,
2015).
A infecção neonatal por EGB é responsável por doenças como osteomielite,
pneumonia e meningite, sendo que as manifestações mais frequentes ocorrem nos
primeiros 7 dias de vida (início precoce), ou podem ocorrer entre o 7º e 89º dia (início
tardio), embora menos frequente (BERARDI et al., 2013).
Dentre as estratégias para a prevenção da doença perinatal pelo EGB, até o
momento, a antibioticoterapia parece ser a prática mais eficiente para a erradicação do
estado de portadora em gestantes colonizadas e deve ser feita durante o trabalho de
parto. Estudos mostram que a administração de antibióticos durante o pré-natal não foi
eficiente em prevenir a infecção neonatal. Grande parte das gestantes que receberam o
tratamento apresentavam-se re-colonizadas no momento do parto (CDC, 2010).
O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Centers for Disease Control and
Prevention, CDC, 2010) e a Sociedade Brasileira de Pediatria baseiam-se em duas
abordagens para identificar a indicação para a profilaxia com antibióticos intraparto: a
abordagem baseada no risco ou a triagem baseada em cultura.
Os critérios para a abordagem baseada no risco consistem na presença de qualquer
um dos seguintes critérios: parto com menos de 37 semanas de gestação; temperatura
corporal igual ou superior a 38 ºC no momento do parto ou ruptura de membranas por
tempo igual ou superior a 18 horas. Para a triagem baseada em cultura, são indicações
4
para a ATI quando há resultado positivo para a colonização vaginal ou retal de EGB,
realizada entre 35 e 37 semanas de gestação.
Além das abordagens mencionadas, a ATI é indicada para mulheres com bacteriúria
por EGB em qualquer momento da gestação atual ou para mulheres que tiveram recém-
nascido anterior com doença invasiva por EGB.
Conceitualmente, a quimioprofilaxia intraparto é a administração de antibiótico logo
após o início do trabalho de parto ou ruptura das membranas, sendo necessárias pelo
menos duas doses de antibióticos com intervalo de 4 horas antes da resolução do parto
para que uma menor percentagem de recém-nascidos esteja colonizada pelo EGB ao
nascimento (CDC, 2010).
A profilaxia com antibióticos intraparto consiste na recomendação do uso de penicilina
(5.000.000 U inicialmente e, posteriormente, 2.500.000 U a cada 4 horas até o
nascimento), preferencialmente, ou ampicilina (2g inicialmente e, posteriormente, 1g a
cada 4 horas até o nascimento). Recomenda-se a penicilina G como o antibiótico de
escolha, porque este tem espectro estreito e provavelmente leva à menor resistência
antimicrobiana. Em caso de alergia à penicilina, sem risco de anafilaxia, recomenda-se o
uso de cefazolina 2 g inicialmente, seguidas de 1g a cada 8 horas até o parto. Em casos
de risco de anafilaxia, indica-se a clindamicina 900 mg a cada 8 horas, eritromicina 500
g a cada 6 horas até o nascimento ou a vancomicina, em casos mais raros em que o
EGB for resistente aos antibióticos citados (CDC, 2010).
Embora a prática mencionada seja uma importante estratégia na redução do risco de
sepse neonatal, é necessário elucidar seus efeitos no que se refere à microbiota do corpo
humano, ou seja, a comunidade de micro-organismos que estão naturalmente presentes
no corpo humano.
Diversos estudos têm evidenciado o impacto de antibióticos sobre a microbiota do
corpo humano. Nesse sentido, BRANDT et al. (2012) observaram uma redução de
bactérias anaeróbicas e Escherichia e um aumento de Klebsiella em recém-nascido que
recebeu antibiótico por 10 dias, em comparação com o grupo de recém-nascidos que não
receberam o tratamento. Interessantemente, Aloisio et al. (2014) observaram diferenças significativas entre a
microbiota intestinal de bebês de mulheres que receberam ATI, quando comparada à de
5
bebês de mulheres que não receberem ATI, embora o antibiótico tenha sido administrado
na gestante em trabalho de parto,
Ainda que estudos tenham mostrado que a comunidade de micro-organismos
aparentemente se re-estabeleça após a utilização de antibióticos, e possível que algumas
alterações sejam permanentes, com possíveis repercussões na saúde (TANAKA et al.,
2009; AZAD et al., 2015). Tais estudos destacam a importância de pesquisas acerca dos
efeitos a curto, médio e longo prazo, principalmente nos primeiros dias de vida em que
se desenvolve o processo de colonização microbiana.
1.2 A interação entre micro-organismos e o ser humano e o processo de colonização do recém-nascido.
Desde tempos remotos, as bactérias têm sido consideradas agentes patogênicos,
causadores de doenças ao hospedeiro. No entanto, nas últimas décadas, estudos tem
evidenciado complexas interações entre bactérias e o ser humano, dentre as quais,
funções importantes relacionadas à saúde humana têm sido atribuídas a algumas
bactérias e metabólitos bacterianos (RAUTAVA, 2016).
Estima-se que exista uma comunidade de micro-organismos composta por 1014
células bacterianas no corpo humano, número que supera em dez vezes o número de
células humanas (JIA et al., 2008).
A microbiota do corpo humano apresenta funções específicas, dentre as quais
destacam-se o metabolismo de nutrientes, produção de vitaminas, produção de ácidos
graxos de cadeia curta, participação no desenvolvimento do sistema imunológico do
hospedeiro e, mais recentemente, tem-se sugerido que alguns compostos produzidos
pela microbiota intestinal apresentem funções sistêmicas, atuando no eixo entero-
cerebral. Tais funções variam de acordo com o habitat de residência dos micro-
organismos no corpo humano e de acordo com a composição de micro-organismos
(CONLON; BIRD, 2014).
Nesse sentido, diversos fatores contribuem para as variações na composição da
microbiota humana, dentre os quais incluem-se fatores intrínsecos, como o sítio de
residência (pele, cavidade oral, intestino, etc.), características genéticas, sistema
6
imunológico do hospedeiro, idade, e fatores extrínsecos, como o ambiente, tipo de dieta
e uso de medicamentos (CABRERA-RUBIO et al. 2012).
A maior concentração de micro-organismos no corpo humano reside no intestino
grosso. Além de apresentar elevada concentração de nutrientes, o pH do lúmen intestinal
é próximo a 7, o que favorece a permanência de micro-organismos (FALLINGBORG,
1999).
O processo de colonização por micro-organismos no intestino tem sido sugerido por
alguns autores iniciar-se antes mesmo do nascimento, através do contato com micro-
organismos na placenta, durante o desenvolvimento intrauterino. As evidências baseiam-
se na identificação de micro-organismos no cordão umbilical (JIMENEZ et al., 2005),
mecônio (JIMENEZ et al., 2008; GOSALBES et al., 2013) e líquido amniótico
(BEARFIELD, 2002; RAUTAVA et al., 2012), mesmo sem a ocorrência de infecção
durante a gestação.
Embora os mecanismos pelos quais os micro-organismos alcancem a cavidade
uterina e a placenta estejam elucidados, acredita-se que decorram de células dendríticas
capazes de captar bactérias no lúmen intestinal e transportá-las pelo sistema circulatório,
alcançando diversas partes do corpo humano, enquanto migram para órgãos linfoides.
Outra hipótese consiste na transferência de micro-organismos da cavidade bucal para a
corrente sanguínea via infecções periodontais. As hipóteses têm sido sugeridas, uma vez
que foram observadas similaridades entre a microbiota da placenta e da cavidade bucal
e intestinal (FUNKHOUSER; BORDENSTEIN, 2011; RAUTAVA, 2016).
No entanto, o processo de colonização intestinal do recém-nascido parece ser
principalmente influenciado pelo tipo de nascimento (parto normal vs cesárea) e o tipo de
alimentação (MARQUES et al., 2010) nos primeiros dias de vida e continua a
desenvolver-se ao longo dos primeiros anos.
O estudo de Dominguez-Bello et al. (2010) sugere que durante o parto normal os
micro-organismos do trato genito-urinário e intestinal materno entram em contato com o
bebê, no momento da sua passagem pelo canal vaginal, uma vez que ao analisar a
microbiota da pele do recém-nascido e da mucosa oral do bebê nascido de parto normal,
estas compartilham gêneros bacterianos identificados na microbiota vaginal e intestinal
materna. Por outro lado, a microbiota identificada na pele e na mucosa oral de recém-
7
nascidos de parto cesárea apresenta maior similaridade micro-organismos da pele da
mãe.
A influência do tipo de parto na microbiota intestinal e, consequentemente, na saúde
do recém-nascido, tem associado o parto cesárea com um maior risco de desenvolver
rinite alérgica, asma (RENZ-POLSTER et al., 2005), doença celíaca (DECKER et al.,
2010), diabetes tipo 1 (CARDWELL et al., 2008) e doença inflamatória intestinal (BAGER
et al., 2012). De acordo com os autores, a maior taxa de doenças imunomediadas em
crianças nascidas de parto cesárea pode indicar que os micro-organismos vaginais e
fecais transferidos durante o parto (vaginal) pela mãe são únicos em sua capacidade de
promover a maturação do sistema imune no recém-nascido.
Do mesmo modo, o tipo de alimentação apresenta relevante influência no processo
de colonização intestinal. Diversos estudos identificaram diferenças significativas entre a
microbiota de fezes de recém-nascidos alimentados exclusivamente por leite materno ou
alimentados exclusivamente por fórmulas infantis (MARQUES et al., 2010).
Paralelamente, a microbiota intestinal nos primeiros meses de vida tem sido associada
ao risco de desenvolvimento de doenças crônicas, tais como Diabetes melittus (HU;
WONG; WEN, 2017) e obesidade (KAPPLAN; WALKER, 2012).
Portanto, a colonização intestinal que se inicia logo após o nascimento apresenta uma
grande importância, uma vez que os primeiros dias e semanas de vida representam uma
janela crucial na formação e desenvolvimento do trato gastrintestinal e sistema
imunológico, bem como da microbiota do adulto (HOUGHTELING; WALKER, 2015;
RAUTAVA, 2016). Nesse sentido, além das repercussões imediatas, o perfil da
microbiota formado na infância parece estar associado a repercussões na vida adulta
(PENDERS et al., 2007; KAPPLAN; WALKER, 2012; GENSOLLEN et al., 2016).
1.3 A importância do gênero Bifidobacterium na saúde do recém-nascido e o
papel do leite materno no processo de colonização intestinal. Dentre as bactérias identificadas na microbiota intestinal de lactentes, o gênero
Bifidobacterium consiste em um dos mais importantes e tem sido amplamente
contemplado pela literatura científica, por estar relacionado a diversos efeitos benéficos
8
à saúde e a redução do risco de doenças (BISGAARD et al., 2011; RINGEL-KULKA et
al., 2013).
As principais funções associadas ao gênero Bifidobacterium no intestino incluem a
produção de ácidos graxos de cadeia curta, os quais estão relacionados à potencial
proteção contra patógenos, redução de diarreia, maior absorção de nutrientes e estímulo
do sistema imunológico (MORO et al., 2006; LAVANDA et al., 2011; WHELAN, 2013).
De acordo com Rutayisire et al. (2016), os gêneros Bifidobacterium e Bacteroides
parecem ser significativamente mais frequentes em lactentes nascidos por parto vaginal,
comparados com cesárea, os quais apresentam maiores proporções dos gêneros
Clostridium e Lactobacillus.
Além disso, diversos estudos observaram que lactentes que receberam aleitamento
materno exclusivo apresentam tendência a uma microbiota mais benéfica, com
predominância de grupos de Bifidobacterium e Lactobacillus e menores populações de
Bacteroides, Clostridium difficile, Clostridium coccoides, Staphylococcus,
Enterobacteriaceae e Escherichia coli (HARMSEN et al., 2000; PENDERS et al., 2007;
SOLÍS et al., 2010). Por outro lado, lactentes alimentados exclusivamente por fórmula
infantil apresentaram maior frequência de E. coli, C. difficile, Bacteroides e Lactobacillus
em fezes (PENDERS et al., 2007; MARQUES et al., 2010).
Nesse sentido, os principais fatores relacionados às maiores proporções de
Bifidobacterium na microbiota intestinal de lactentes alimentados exclusivamente por leite
materno deve-se a presença de oligossacarídeos do leite humano, que atuam como
substrato para obtenção de energia para estes micro-organismos, além da própria
presença de Bifidobacterium no leite (MUSILOVA et al., 2017).
Os oligossacarídeos compreendem o terceiro maior composto sólido do leite humano,
presentes em mais de 200 diferentes estruturas, as quais podem diferir em tamanho,
carga e quantidade (GRABARICS et al., 2017). A sialilação e fucosilação nas posições
terminais da molécula conferem aos oligossacarídeos do leite a propriedade de ser
acessível somente às bactérias que possuem as enzimas necessárias (glicosil
hidrolases) para hidrolisar e utilizar os monossacarídeos.
Sela e Mills (2010) identificaram que Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium
bifidum, duas espécies tipicamente presentes na microbiota intestinal de recém-nascidos
9
em aleitamento materno, apresentam maiores concentrações na presença de
oligossacarídeos do leite humano, comparados com Bifidobacterium breve e
Bifidobacterium longum. Além disso, Marcobal et al. (2010) relataram que cepas de
Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bacteroides fragilis e Bacteroides vulgatus foram
capazes de metabolizar oligossacarídeos do leite humano com elevada eficiência,
enquanto que Enterococcus, Streptococcus, Veilonella, Eubacterium, Clostridium e
Escherichia coli apresentaram menor ou nenhuma capacidade de utilização destes
oligossacarídeos. Tais resultados sugerem que oligossacarídeos do leite humano podem
promover o crescimento seletivo de espécies, influenciando o processo de colonização
intestinal.
Além dos oligossacarídeos, diversos estudos identificaram a presença de micro-
organismos no leite humano, os quais representam um inóculo contínuo para o lactente.
Dentre os micro-organismos frequentemente identificados no leite humano estão os
gêneros Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Enterococcus, Propionibacterium
e Bifidobacterium (FITZSTEVENS et al., 2017). Entretanto, diferenças metodológicas
entre os estudos para a identificação de micro-organismos resultam em diferentes
padrões de microbiota do leite humano (FITZSTEVENS et al., 2017).
Em termos de espécies de Bifidobacterium já isoladas de leite humano, incluem-se B.
breve, B. adolescentis, B. bifidum, B. longum e B. dentium (MARTÍN et al. 2007, 2009;
MARQUES et al., 2010). A partir da técnica de PCR quantitativo, COLLADO et al. (2009)
identificaram quantidades de Bifidobacterium entre 102 e 104 genoma equivalente/ mL de
leite.
Nesse sentido, a relevância de Bifidobacterium encontrados no leite humano pode ser
mensurada ao estimar que a ingestão pelo lactente de aproximadamente 500 mL de leite
materno por dia, nos primeiros meses após o nascimento, resultaria no consumo de 104
a 106 unidades do micro-organismo.
Diversos fatores parecem influenciar a composição de micro-organismos do leite
humano, o que poderia, indiretamente, influenciar na composição da microbiota intestinal
do lactente em aleitamento materno. A idade gestacional, o tipo de parto, o Índice de
Massa Corporal (IMC) pré-gestacional, as fases do leite (colostro, leite de transição e leite
10
maduro) e a dieta materna (CABRERA-RUBIO et al.; 2012, WILLIAMS et al., 2017) estão
entre os fatores já descritos na literatura.
Adicionalmente, um estudo prévio sugeriu que a ATI poderia influenciar na
composição de Bifidobacterium e Lactobacillus do leite humano, uma vez que a
frequência de isolamento destes micro-organismos em meio de cultura foi menor em
amostras de mulheres que receberam ATI (SOTO et al., 2014).
No entanto, ao que parece, o presente estudo é o primeiro a avaliar o efeito da ATI
sobre as quantidades do gênero Bibifobacterium presentes no leite materno ao longo do
primeiro mês após o parto, por técnicas moleculares de quantificação, o que corrobora
para a relevância do presente estudo.
2. OBJETIVO Investigar o impacto da antibioticoterapia materna intraparto (ATI) nas quantidades
de Bifidobacterium spp. presente no leite humano na primeira semana (curto prazo) e no
primeiro mês (médio prazo) após o parto, por meio da técnica de PCR em tempo real
(qPCR). Paralelamente, foram quantificadas bactérias totais, com a finalidade de
monitorar a carga bacteriana do leite materno nos dias analisados.
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Delineamento do estudo e coleta de leite humano O presente estudo está vinculado ao estudo “Impacto da dieta materna e da
intervenção com fruto-oligossacarídeo sobre a microbiota do leite humano”, coordenado
pela professora Susana Marta Isay Saad e conduzido pela doutoranda Marina Padilha,
que tem como objetivo avaliar se a alimentação da mãe pode apresentar efeitos na
composição de micro-organismos presentes no leite materno.
Foram incluídas 55 puérperas atendidas no Hospital Universitário (HU) da
Universidade de São Paulo, na cidade de São Paulo - SP - Brasil. A realização da
pesquisa foi aprovada pelos Comitês de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências
11
Farmacêuticas e do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (CAAE:
27247614.6.0000.0067; ANEXO 1).
Os critérios de inclusão foram: mulheres saudáveis, com idade entre 19 e 35 anos,
com ganho de peso adequado durante a gestação, que tiveram parto normal e a termo
(entre 37 e 42 semanas de gestação), com recém-nascidos de peso adequado para idade
gestacional ao nascimento, sem intercorrências maternas ou do recém-nascido durante
a gravidez, parto e lactação, em prática de aleitamento materno, ter concordado em
participar do estudo e assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
Foram critérios de exclusão: apresentar doenças de base como diabetes,
cardiopatias, nefropatias, imunodeficiências, doenças inflamatórias, doenças genéticas
ou hipertensão arterial, ter apresentado diabetes gestacional, eclâmpsia ou pré-
eclâmpsia, durante o período de gestação, apresentar inflamação das glândulas
mamárias (mastite), ser usuária de drogas ilícitas ou qualquer outro tipo de tóxico-
dependência, ter utilizado antibióticos no último trimestre de gestação ou ter
utilizado/estar em uso de antibióticos após o parto.
As participantes foram categorizadas em dois grupos: grupo que recebeu
antibioticoterapia intraparto (CATI) e grupo que não recebeu antibioticoterapia intraparto
(SATI).
As amostras de leite humano foram coletadas aos 7 ± 3 dias após o parto e,
posteriormente, aos 30 ± 4 dias após o parto, de acordo com as metodologias descritas
por MARTÍN et al. (2009) e JOST et al. (2013). Para essa finalidade, aproximadamente 5
ml de leite foram coletados manualmente em tubos estéreis, com o auxílio de luvas
estéreis. Para minimizar a contaminação da amostra com os micro-organismos
residentes da pele, mamilos e aréola foram previamente higienizados com clorexidina
1%. O primeiro fluxo de leite foi desprezado.
Os tubos contendo as amostras foram aliquotados e armazenados a -80ºC para
posterior extração de DNA.
3.2 Características clínicas maternas e do recém-nascido. Informações sobre histórico das participantes, como o histórico de doenças, uso de
fármacos, assim como idade gestacional no parto, tipo de parto, uso de anestesia no
12
parto, dados antropométricos maternos (peso e altura), ganho de peso na gestação,
prática do aleitamento materno foram obtidas por meio de questionário estruturado ou
em registros de prontuário médico.
Os critérios do Institute of Medicine (INSTITUTE OF MEDICINE, 2009) foram
utilizados para a avaliação da adequação de ganho de peso gestacional.
Informação e dados antropométricos do lactente, como peso e comprimento ao
nascer, foram obtidos do cartão da criança ou questionados à mãe. Para avaliação da
adequação de peso para idade gestacional ao nascer foi utilizada a curva de
ALEXANDER et al. (1996) e foi considerado adequado para idade gestacional peso ao
nascer entre os percentis 10 e 90 da curva.
3.3 Extração de DNA a partir do leite humano. As extrações de DNA foram realizadas utilizando-se QIAamp DNA Mini kit® (QIAGEN,
Hilden, Alemanha), conforme o protocolo sugerido pelo fabricante para bactérias Gram-
positivas, com adaptações necessárias para otimizar a lise celular. Para esta finalidade,
amostras de 1,5 mL de leite foram centrifugadas a 15700 x g, a 4 ºC, por 15 minutos. O
sobrenadante foi descartado e, com o auxílio de hastes de algodão estéreis (SWAB), foi
removida a gordura da parede do tubo. Em seguida, foi adicionado 1 mL de solução
tampão (pH 7,5) Tris-EDTA (TE) a cada amostra, seguido de centrifugação a 15700 x g,
a 4 ºC, por 15 minutos.
O pellet celular foi ressuspendido em 200 µl de tampão de lise enzimático contendo
20 mg/ml de Lisozima [1 M de Tris-HCl (pH 7,5) 0,5 M de EDTA (pH 8,0), 20% de
sacarose], e incubado a 37 °C, por 1 hora. Foram adicionados 25 µl de proteinase K e
200 µl de tampão (AL), seguido de homogeneização em vórtex. A suspensão foi incubada
a 56 °C, por 30 minutos e 95 °C, por 15 minutos. Foram adicionados 500 µl de etanol
(100%) e a suspensão foi carregada na coluna de purificação, fornecida pelo kit de
extração de DNA utilizado.
Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 6000 x g por 1 min. O DNA ligado na
membrana foi lavado em 2 passos de centrifugação com dois tampões de lavagem (AW1
e AW2). O DNA retido na coluna foi eluído em 200 µl de tampão de eluição (AE). A
13
qualidade e concentração do DNA extraído foi verificada usando o Nanodrop ND-2000®
(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).
3.4 Quantificação de Bifidobacterium spp e bactérias totais. Para as análises de quantificação de Bifidobacterium spp., foi empregada a técnica
de PCR em tempo real (qPCR), utilizando Taqman (ThermoFisher Scientific). A
amplificação do DNA bacteriano foi realizada, utilizando-se primers e probes gênero-
específico (para Bifidobacterium spp.) ou universais (para bactérias totais), selecionados
da literatura científica (FURET et al., 2009). A sequência dos primers e probes utilizados
estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Lista de primers e probes utilizados para quantificação de Bifidobacterium spp. e bactérias
totais (FURET et al., 2009).
Primers e probes Sequência (5´- 3´)
Bifidobacterium spp.
F_Bifid 09c CGG GTG AGT AAT GCG TGA CC
R_Bifid 06 TGA TAG GAC GCG ACC CCA
P_Bifid 6FAM-CTC CTG GAA ACG GGT G
Bactérias totais
F_Bact 1369 CGG TGA ATA CGT TCC CGG
R_Prok1492 TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T
P_TM1389F 6FAM-CTT GTA CAC ACC GCC CGT C
Para cada reação, foram adicionados 12,5 µL de TaqMan® Universal PCR 2X Master
Mix (ThermoFisher Scientific), primers e sondas nas concentrações de 200 nM e 250 nM,
respectivamente, além de 5 µL de DNA da amostra, sem diluição prévia. A fim de
melhorar a eficiência da reação, utilizou-se Albumina Sérica Bovina (BSA, ThermoFisher
Scientific) em concentração 0,1 μg/μl em todas as reações. Foi adicionada água
14
suficiente para 25 µL em cada reação. As condições para as reações foram 1 ciclo de 95
ºC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ºC por 30 segundos e 60 ºC por 1 minuto.
Os coeficientes de eficiência das reações, calculados como 10(-1/slope) -1, foram entre
98 e 102% e os coeficientes de correlação R2 obtidos para a curva padrão estiveram
entre 0,98 e 0,99. Controles negativos foram incluídos em todas as corridas de PCR.
Todas as reações de amplificação foram realizadas em triplicata.
Para a quantificação, utilizou-se o método de quantificação absoluta, com curva
padrão de 5 pontos (105 – 101, para Bifidobacterium spp. ou 105 – 101 para bactérias
totais), elaborada a partir de quantidades conhecidas de DNA genômico de cultura pura
de Bifidobacterium longum BB-46 (Christian Hansen, Hoersholm, Dinamarca) ou
Escherichia coli ATCC 8739. Para a determinação das quantidades o Ct (do inglês Cycle
Threshold) obtido de cada amostra foi comparado aos Ct obtidos na curva padrão, para
obtenção do número de cópias do gene 16S RNAr nas amostras. O limite mínimo de
detecção da técnica de qPCR foi de 1,4 log células equivalentes/mL de leite humano.
Quantidades inferiores foram consideradas não detectadas.
3.5 Análises dos resultados Os dados foram submetidos aos testes de Shapiro-Wilk, a fim de verificar os
pressupostos de normalidade. Para a análise das características clínicas das
participantes, foram utilizados os testes de Mann Whitney para variáveis contínuas e Qui-
quadrado para variáveis categóricas. Para a quantidade de micro-organismos entre os
grupos, utilizou-se o teste t ou teste de Mann-Whitney, para amostras independentes, de
acordo com a distribuição dos dados. Para a análise entre os dias avaliados, utilizou-se
o teste de Wilcoxon para amostras pareadas. O nível de confiança utilizado nas análises
foi de 95%. O programa RStudio versão 3.3.2 (Boston, MA, EUA) foi utilizado para as
análises mencionadas.
4. RESULTADOS
Participaram do presente estudo 55 lactantes, das quais 34 não receberam ATI
(grupo SATI) e 21 receberam ATI (grupo CATI). As coletas das amostras foram realizadas
aos 7 ± 3 e aos 30 ± 4 dias após o parto. As variações entre os dias de coleta decorreram
15
da disponibilidade das participantes em comparecer ao local onde seria realizada a coleta
(HU/USP).
No grupo CATI, 17 receberam cefazolina, 3 participantes receberam penicilina e 1
recebeu clindamicina como antibiótico intraparto. As características clínicas das
participantes estão descritas na Tabela 2, de acordo com os grupos.
Tabela 2: Características clínicas da população estudada, de acordo com os grupos.
Variáveis CATI SATI valor de
p (n = 21) (n = 34) Idade (anos) 27 (23 - 28) 24,5 (21 - 28) 0,4445 Idade gestacional (semanas) 39 (38 - 39) 39 (39 - 40) 0,2376 Antibiótico durante o parto Clindamicina 1 (4,8) - Cefazolina 17 (80,9) - Penicilina 3 (14,3) - IMC pré-gestacional (kg/m2) 23,0 (20,7 – 25,2) 23,9 (21,7 – 25,4) 0,6244 Ganho de peso durante a gestação (kg) 11,1 ( 8,3 – 13,0) 10,8 (8,2 – 13,3) 0,9854 Anestesia Não 12 (57,1) 25 (73,5) 0,1900 Sim Boqueio de pudendo 1 (4,8) 1 (2,9) Peridural 2 (9,5) 2 (5,9) Raquidiana 6 (28,6) 6 (17,6) Gênero do bebê Masculino 12 (57.1) 19 (55,9) 0,5085 Feminino 9 (42.9) 15 (44,1) Peso do bebê ao nascer (g) 3130 (2835 – 3365) 3282,5 ( 3092,5 – 3445) 0,1631 Comprimento do bebê ao nascer (cm) 49 (48 – 49) 49.5 (48 – 50) 0,2814
Peso do bebê aos 7 ± 3 dias após o parto 3045 (2788,75 – 3585) 3420 (3063,75 – 3700) 0,092
Alimentação do bebê aos 7 ± 3 dias após o parto
Aleitamento materno exclusivo 21 (100) 34 (100) 1,000
16
Aleitamento materno + fórmula infantil* 0 0
Peso do bebê aos 30 ± 4 dias após o parto 4265 (3920 – 4480) 4465 (4010 – 4796,25) 0,1145 Alimentação do bebê aos 30 ± 4 dias após o parto
Aleitamento materno exclusivo 17 (80,9) 29 (85,3) 0,5137 Aleitamento materno + fórmula
infantil* 4 (19,1) 5 (14,7)
Dados apresentados em mediana (intervalo interquartil) ou número (frequência em %). Os valores de p foram calculados para comparar os grupos do estudo, utilizando o teste de Mann Whitney para variáveis contínuas e Qui-quadrado para variáveis categóricas. IMC: Índice de Massa Corporal (kg/m2) CATI: grupo de participantes que receberam antibioticoterapia intraparto. SATI: grupo de participantes que não receberam antibioticoterapia intraparto. * Frequência da fórmula infantil foi menor ou igual a 3x/dia
Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas para as
características clínicas avaliadas entre os grupos CATI e SATI (p > 0,05).
Menores quantidades de Bifidobacterium foram observadas no grupo CATI, na
primeira semana após o parto [medianas = 2,1 (1,7 – 2,3) vs 2,4 (2,1 – 2,8) log de células
equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente; p =
0,01)] (Figura 1), embora as quantidades de bactérias totais não tenham apresentado
diferenças estatísticas [medianas = 5,0 (4,5 – 5,7) vs 5,0 (4,5 – 5,4) log de células
equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente; p =
0,69] (Figura 2). Além disso, foi observada uma grande variabilidade na quantidade de
Bifidobacterium entre as amostras de leite humano, sendo os intervalos entre o menor e
o maior valor foram de 1.5 a 4.4 log de células equivalentes/mL de leite humano no grupo
SATI e de “não detectado” a 3.4 log de células equivalentes/mL de leite humano no grupo
CATI aos 7 ± 3 dias após o parto. A frequência de amostras com valores inferiores ao
limite de detecção (não detectado) foi de 4 amostras no grupo CATI e 0 no grupo SATI
para este mesmo período.
Aos 30 ± 4 dias após o parto, não foram observadas diferenças nas quantidades de
Bifidobacterium entre os grupos [medianas = 2,5 (2,1 – 2,7) vs 2,2 (1,9 – 2,3) log de
células equivalentes/mL de leite humano, para os grupos CATI e SATI, respectivamente;
p = 0,50]. No entanto, observou-se um aumento nas quantidades de Bifidobacterium entre
os dias 7 ± 3 [mediana = 2,1 (1,7 – 2,3) log de células equivalentes/mL] e 30 ± 4 [2,5 (2,1
17
– 2,7) log de células equivalentes/mL] dias após o parto (p = 0,03) somente no grupo
CATI (Figura 1).
Não foram observadas diferenças entre os dois grupos nas quantidades de bactérias
totais aos 30 ± 4 dias (p = 0,71). No entanto, observou-se uma redução nas quantidades
de bactérias totais em ambos os grupos entre os dias 7 ± 3 e 30 ± 4 após o parto. A
mediana das quantidades foram de 5,0 (4,5 – 5,7) para 4,7 (4,5 – 5,0) log de células
equivalentes/mL de leite humano no grupo CATI e de 5,0 (4,5 – 5,4) para 4,6 (4,2 – 5,0)
log de células equivalentes/mL de leite humano no grupo SATI (Figura 2).
18
Figura 1. Box plot da distribuição dos valores obtidos para as quantidades de
Bifidobacterium spp. em amostras de leite humano coletadas entre 7 ± 3 dias (1ª semana)
e entre 30 ± 4 dias (1º mês) após o parto, de lactantes que receberam (CATI ) ou que
não receberam (SATI ) antibioticoterapia intraparto. Os valores de mediana estão
indicados dentro de cada box plot. O box estende-se do 25º ao 75º percentil e os whiskers
indicam os valores mínimo e máximo obtidos. * Indicam diferenças significativas entre os grupos para cada dia (análises por teste t ou Mann Whitney, de
acordo com a distribuição dos dados) ou diferenças significativas entre os dias para cada grupo (análises
por teste de Wilcoxon para amostras pareadas).
SATI (n = 34)
CATI (n=21)
/
19
Figura 2. Box plot da distribuição dos valores obtidos para as quantidades de bactérias
totais em amostras de leite humano coletadas entre 7 ± 3 dias (1ª semana) e entre 30 ±
4 dias (1º mês) após o parto, de lactantes que receberam (CATI ) ou que não
receberam (SATI ) antibioticoterapia intraparto. Os valores de mediana estão
indicados dentro de cada box plot. O box estende-se do 25º ao 75º percentil e os whiskers
indicam os valores mínimo e máximo obtidos. * Indicam diferenças significativas entre os grupos para cada dia (análises por teste t ou Mann Whitney, de
acordo com a distribuição dos dados) ou diferenças significativas entre os dias para cada grupo (análises
por teste de Wilcoxon para amostras pareadas).
SATI (n = 34)
CATI (n=21)
/
20
5. DISCUSSÃO Ainda que a antibioticoterapia materna intraparto tenha se mostrado uma importante
estratégia na redução do risco de sepse neonatal, nos últimos anos, diversos estudos
tem destacado o impacto da administração de antibióticos na microbiota do indivíduo,
principalmente na microbiota intestinal (BRANDT et al., 2012; GILLINGS et al., 2015;
VANGAY et al., 2015). Entretanto, poucos abordaram o impacto da antibioticoterapia
materna intraparto sobre a microbiota do leite humano. Considerando a importância do
leite humano no processo de colonização intestinal, particularmente como um recurso
contínuo de bactérias potencialmente probióticas para o intestino do lactente, torna-se
essencial o estudo dos fatores que poderiam influenciar a composição bacteriana do leite
humano.
O presente estudo investigou como a utilização profilática de antibióticos intraparto
poderia influenciar a quantidade de Bifidobacterium spp. presente no leite humano em
dois períodos distintos, a curto prazo (7 ± 3 dias) e a médio prazo (30 ± 4 dias) após o
parto. Paralelamente, foram quantificadas bactérias totais, com a finalidade de monitorar
a carga bacteriana do leite materno nos dias analisados.
Em geral, as quantidades de bactérias totais entre 4 e 5 log células equivalentes/mL
de leite humano foram inferiores às quantidades relatadas em estudos prévios, com cerca
de 6 log células equivalentes/mL de leite humano (CABRERA-RUBIO et al.,2012; BOIX-
AMOROS et al. 2016).
Similarmente, as quantidades de Bifidobacterium spp. identificadas nas amostras de
leite humano do presente estudo, com medianas entre 2,1 (dia 7) a 2,5 (dia 30) log células
equivalentes/mL no grupo CATI e 2,4 (dia 7) – 2,2 (dia 30) log células equivalentes/mL
no grupo SATI foram inferiores aos encontrados por estudos prévios. Embora não tenham
sido identificados os períodos em que foram realizadas as coletas das amostras, Collado
et al. (2009) observaram médias de 3,6 log células equivalentes/mL de leite humano,
enquanto que Cabrera-Rubio et al. (2012) observaram medianas superiores a 5 log
células equivalentes/mL em amostras de leite coletadas aos 2 e 30 dias após o parto.
De acordo com Gomez-Gallego et al. (2016), as diferenças em termos de quantidades
encontradas em amostras de leite humano entre os estudos podem decorrer de fatores
genéticos, ambientais e regionais.
21
Como esperado, menores quantidades do gênero Bifidobacterium foram encontradas
no leite humano de mulheres que receberam ATI aos 7 ± 3 dias após o parto, quando
comparadas ao grupo que não recebeu ATI. Além disso, a frequência de amostras com
quantidades não detectadas foi maior no grupo CATI.
De fato, Soto et al. (2014) observaram que a utilização de antibioticoterapia durante
algum período da gestação, parto ou lactação poderiam reduzir significativamente a
frequência de amostras positivas para o gênero Bifidobacterium spp. no leite humano,
embora o estudo não informe o período em que foram coletadas as amostras para as
análises. Além disso, as amostras foram coletadas de uma população heterogênea que
apresentaram diferenças entre o tipo de parto, provenientes de áreas rural e urbana e
sem informações acerca da idade gestacional.
Interessantemente, o estudo de Aloisio et al. (2014), ao investigarem o impacto da
ATI (ampicilina) nas populações de Bifidobacterium em amostras de fezes de recém-
nascidos em aleitamento materno exclusivo, entre 6 e 7 dias de vida, observaram
reduções deste gênero microbiano em recém-nascidos de mulheres que receberam ATI
(7.3 vs 5.8 log células equivalentes/g de fezes). Ainda que o estudo de Aloisio et al. tenha
investigado o impacto da ATI sobre populações de micro-organismos no intestino do
recém-nascido, os resultados obtidos pelos autores alinhados ao observado no presente
estudo, uma vez que reduções de Bifidobacterium no leite humano poderiam reduzir as
quantidades de Bifidobacterium transferidas ao lactente. Por outro lado, o estudo não
observou influência da ATI sobre populações de Lactobacillus spp, Clostridium difficile e
Bacteroides fragilis, sugerindo que a ATI parece influenciar grupos bacterianos de formas
distintas.
Em termos da quantificação de bactérias totais, era igualmente esperado uma
redução nas populações de bactérias totais no grupo CATI, uma vez que a administração
de antibiótico sugere uma redução da carga bacteriana total no organismo. No entanto,
as quantidades de bactérias totais foram similares entre os grupos.
Ao que parece, é possível que a administração de ATI tenha proporcionado uma
modificação inicial na microbiota do leite humano, e aos 7 dias após o parto diferentes
populações bacterianas tenham se multiplicado, em detrimento de Bifidobacterium spp.
22
Nesse sentido, estudos sugerem que o impacto do tratamento com antibióticos advém
das alterações na composição e da redução da diversidade microbiana intestinal
(JAKOBSSON et al., 2010; BRANDT et al., 2012; GILLINGS et al., 2015). Tais alterações
na microbiota intestinal são susceptíveis a persistir, mesmo em curtos períodos de
administração do antibiótico (JERNBERG et al., 2007).
Embora tenham sido observadas menores quantidades de Bifidobacterium no grupo
CATI na primeira semana após o parto, observou-se uma recuperação das quantidades
de Bifidobacterium aos 30 dias após o parto, alcançando valores similares ao grupo SATI.
Uma hipótese para a recuperação das quantidades de Bifidobacterium no grupo CATI
consiste na re-colonização do leite humano por Bifidobacterium provenientes do intestino
materno. Nesse sentido, as bactérias alcançariam a glândula mamária através de uma
via endógena, entero-mamária, envolvendo células dendríticas. Neste caso, dendritos
atravessariam o epitélio intestinal e capturariam bactérias comensais, diretamente do
lúmen intestinal materno (JEURINK et al., 2013). Uma vez dentro das células dendríticas,
as bactérias do intestino podem alcançar sítios distintos através do sistema circulatório,
a partir do tecido linfoide associado ao trato gastrintestinal (FERNANDÉZ et al., 2012).
Outra hipótese inclui a contribuição de oligossacarídeos presentes no leite humano
(OLH), uma vez que algumas espécies de Bifidobacterium são capazes de utilizar OLHs
como substrato para seu metabolismo, promovendo a sua multiplicação
(CHARBONNEAU et al. 2016)
Ainda que as quantidades de Bifidobacterium aos 30 dias após o parto tenham
alcançado valores similares ao grupo SATI, é possível que o perfil de Bifidobacterium
seja diferente. De acordo com Aloisio et al. (2014), análises sobre o perfil de
Bifidobacterium em amostras de fezes de recém-nascidos de mulheres que receberam
ATI evidenciaram uma menor diversidade, quando comparado ao grupo controle, sem
administração de ATI.
Em relação às quantidades de bactérias totais, observou-se uma redução
estatisticamente significativa ao longo do primeiro mês após o parto, independentemente
da utilização da ATI. Embora estudos prévios tenham identificado certa estabilidade na
quantidade de bactérias totais ao longo do primeiro mês após o parto (CABRERA-RUBIO
et al., 2012; BOIX-AMOROS et al., 2016), as menores quantidades de bactérias
23
identificadas no presente estudo possivelmente derivam da maior produção de leite aos
30 dias, quando comparada à produção de leite aos 7 dias. Consequentemente, haveria
uma diluição da carga bacteriana naturalmente presente no leite humano.
6. CONCLUSÕES De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, a ATI apresenta influência
significativa sobre as quantidades do gênero Bifidobacterium na primeira semana após o
parto. Ainda que as quantidades de Bifidobacterium tenham se recuperado aos 30 dias
após o parto, é essencial que estudos futuros investiguem o impacto da ATI sobre o perfil
de espécies de Bifidobacterium no leite humano, com a finalidade de monitorar se a
recuperação em termos de quantidade ocorre, igualmente, em termos de qualidade.
Além disso, os resultados obtidos destacam a importância de estudos clínicos de
suplementação com prebióticos/probióticos na dieta materna no período pré-natal ou pós-
natal imediato, a fim de investigar se a suplementação poderia reverter os efeitos da ATI
sobre a população de Bifidobacterium no leite humano na primeira semana após o parto.
24
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8. ANEXOS 8.1 ANEXO 1
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