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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
FLÁVIA WERNER DA ROCHA JESUINO
EFEITOS DO Synadenium grantii SOBRE AS
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS E NOCICEPTIVAS EM
CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE
DISMENORREIA
Itajaí (SC)
2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
FLÁVIA WERNER DA ROCHA JESUINO
EFEITOS DO Synadenium grantii SOBRE AS
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS E NOCICEPTIVAS EM
CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE
DISMENORREIA
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Prof.ª. Dr.ª Nara Lins Meira
Quintão
Itajaí (SC)
Março, 2017
FICHA CATALOGRÁFICA
Irene Albino – CRB 14ª/1114
J499e Jesuino, Flávia Werner da Rocha, 1980-
Efeitos do Synadenium grantii sobre as alterações inflamatórias e
nociceptivas em camundongos submetidos ao modelo de dismenorreia.
[manuscrito] / Flávia Werner da Rocha Jesuino. – Itajaí, 2017.
91 f. : il., color.
Inclui lista de figuras, gráficos, abreviaturas e siglas.
Referências: p. 83-91.
Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em produtos
naturais e substâncias sintéticas bioativas, 2017.
“Orientadora: Prof.ª Dr.ª Nara Lins Meira Quintão”.
1. Dismenorreia. 2. Plantas medicinais. 2. Ginecologia - Distúrbios
menstruais. 3. Soluções farmacêuticas. I. Quintão, Nara Lins Meira. II. Título.
CDU: 618.175
EFEITOS DO Synadenium grantii SOBRE AS
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS E NOCICEPTIVAS EM
CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE
DISMENORREIA
Flávia Werner da Rocha Jesuino
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e
aprovadas em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
______________________________________
Doutor Clóvis Antônio Rodrigues
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Doutora Nara Lins Meira Quintão (UNIVALI)
Presidente orientador
______________________________________
Doutora Edineia de Andrade (UFSC)
Membro
______________________________________
Doutora Fátima de Campos Buzzi (UNIVALI)
Membro Interno
____________________________________
Titulação Nome do Membro da Banca (Univali)
Membro Interno
Itajaí (SC), 17 de março de 2017.
Dedicatória
Ao meu marido Alexsandro e aos meus
pais, que sempre me apoiaram em
todos os momentos, ajudando-me a
chegar a este ponto do caminho. Ao
meu irmão Ricardo que teve uma
participação especial nesta pesquisa.
As minhas filhas, Alice e Helena, que
espero que tenham sempre muito
orgulho de sua mãe...
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus por me permitir aproveitar as oportunidades da vida
com saúde e disposição;
Agradeço à professora Nara Lins Meira Quintão, por sua dedicação,
preocupação e disponibilidade, pelo seu tempo e por todo o conhecimento
transmitido a mim;
Aos meus pais, meus maiores incentivadores neste projeto e no meu
desenvolvimento pessoal e profissional;
Ao meu marido, Alexsandro, por me apoiar em cada decisão e me
tranquilizar nos momentos mais difíceis, por todo o amor e carinho que
compartilhamos;
As minhas filhas, que estiveram e estão ao meu lado, me ajudando e
me fazendo uma pessoa mais feliz;
Aos técnicos do laboratório do Programa de Pós-Graduação, pela
inestimável colaboração no meu aprendizado;
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, participaram da
elaboração deste trabalho, contribuindo para a sua conclusão.
EPÍGRAFE
“Só se aprende aquilo
que faz sentido, o que
é significativo para a
nossa vida”
Paulo Freire
EFEITOS DO Synadenium grantii SOBRE AS
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS E NOCICEPTIVAS EM
CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE
DISMENORREIA
Flávia Werner da Rocha Jesuino Março/2017
Orientador: Dra. Nara Lins Meira Quintão.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 91.
A dismenorreia primária é a desordem ginecológica mais frequente nas mulheres jovens.
Sua fisiopatologia ainda não está totalmente elucidada e um modelo animal é crucial
para a determinação dos processos inflamatórios teciduais envolvidos. A Synadenium
grantii é conhecida no Brasil como “cola-nota”, “janaúba” e é usada no tratamento de
distúrbios gástricos, como úlcera péptica, gastrite, e doenças neoplásicas. O objetivo do
estudo foi avaliar os efeitos do extrato metanólico da S. grantii e seu composto isolado
(3,4,12,13- tetraacetilforbol-20-fenilacetato (1) sobre as alterações inflamatórias e
nociceptivas em camundongos submetidos ao modelo de dismenorreia. Foram utilizados
camundongos Swiss fêmeos entre 6 a 8 semanas de idade. Os mesmos foram
selecionados conforme o período do ciclo estral por método de análise microscópica do
lavado vaginal, e os animais que se encontravam no proestro foram tratados por 3 dias
consecutivos com benzoato de estradiol (0,01 mg/kg, intraperitoneal; i.p.). No quarto
dia, os animais foram divididos em quatro grupos: grupo controle negativo; grupo
tratado com o extrato da S. grantii nas doses de 1, 3, 10 30 e 100 mg/Kg; grupo tratado
com o composto isolado nas doses de 0,1, 1, 10 e 40 mg/Kg; grupos controle-positivo
tratamentos com dois fármacos de referência da prática clínica: Ibuprofeno (7,5 mg/kg)
ou Buscopan composto® (1,2 mg/kg). Todos receberam os tratamentos por via oral.
Todos os grupos foram submetidos ao tratamento prévio com benzoato de estradiol por
3 dias, no quarto dia receberam ocitocina (0,4 UI/animal, i.p.) 1 h após os respectivos
tratamentos e analisados individualmente quanto ao número de contorções abdominais
num intervalo de 45 min. O tecido uterino de cada animal foi pesado, fotografado e
fixado em parafina para posterior análise histológica. Todos os protocolos experimentais
foram previamente aprovados pelo CEUA da Univali, sob nº de protocolo 027/2015. O
tratamento prévio com o extrato foi capaz de causar uma inibição dose dependente do
número de contorções abdominais induzidas pela ocitocina, com inibição máxima de
77.7 ± 5.6% e DI50 de 25.8 (12.5 – 49.3) mg/kg. Resultados semelhantes foram obtidos
com o composto 1, com inibição máxima de 65.2 ± 4.6% e DI50 de 15,01 (8,58-26,29)
mg/kg. Os resultados obtidos com as maiores doses do extrato e do composto 1 foram
semelhantes aos obtidos com os fármacos controle-positivo Ibuprofeno e Buscopan
composto®, que apresentaram inibições de 69,13 ± 5,84% e 63,19 ± 10,90%,
respectivamente. Foram observadas alterações significativas quanto ao volume do útero
dos animais nos diferentes grupos, mas não quanto ao peso dos mesmos. Entretanto, a
análise histológica demonstrou diferença significativa quanto à presença de edema e
infiltrado leucocitário característico de processo inflamatório entre os grupos controle-
negativo e tratados com o extrato ou composto isolado. Diante do exposto, podemos
concluir que o extrato apresenta atividade promissora contra o principal sintoma da
dismenorreia (dor pélvica), indicando importante atividade anti-inflamatória. O
composto isolado 1 parece ser, ao menos em parte, responsável por este efeito.
Palavras-chave: Dor visceral. Dismenorreia primária. Plantas medicinais. Roedores.
Synadenium grantii.
EFFECTS OF Synadenium grantii ON INFLAMMATORY
AND NOCCEPTIVE CHANGES IN MICE SUBMITTED TO
THE MODEL OF DYSMENORRHEA
Flávia Werner da Rocha Jesuino
March 2017
Advisor: Drª. Nara Lins Meira Quintão.
Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances
Number of Pages: 91.
Primary dysmenorrhoea is the most common gynecological disorder in young women.
Its pathophysiology is not yet fully elucidated, and an animal model is crucial to
determine the inflammatory tissue processes involved. Synadenium grantii is known in
Brazil as "cola-nota" or "janaúba", and is used to treat gastric disorders, such as peptic
ulcer, gastritis, and neoplastic diseases. The aim of the study was to evaluate the effects
of the methanolic extract of S. grantii and its compound (3, 4, and 12, 13-
tetraacetylforbol-20-phenylacetate (1) on inflammatory and nociceptive changes in mice
submitted to the dysmenorrhoea model. Female Swiss mice between 6 and 8 weeks of
age were used. They were selected according to the period of the estrous cycle by
microscopic analysis of vaginal lavage, and the animals that were in proestrus were
treated for 3 consecutive days with estradiol (00.01 mg / kg, intraperitoneal; i.p.). The
animals were divided into four groups: negative control group, group treated with S.
grantii extract at doses of 1, 3, 10, 30 and 100 mg Kg/kg, group treated with the
compound isolated at the doses of 0.1, 1, 10 and 40 mg/kg, control-positive treatments
with two reference drugs of clinical practice, ibuprofen (7.5 mg/kg) or buscopan
compound (1.2 mg/kg). All received oral treatment. All groups were pretreated with
estradiol benzoate and oxytocin (0.4 IU / animal, i.p.) 1 h after the respective treatments
and individually analyzed for the number of abdominal writhes in a 45 min interval. The
uterine tissue of each animal was weighed, photographed and fixed in paraffin for later
histological analysis. All the experimental protocols were previously approved by the
Univali CEUA under protocol number 027/2015. Pretreatment with the extract was able
to cause dose - dependent inhibition of oxytocin - induced abdominal writhing, with
maximum inhibition of 77.7 ± 5.6% and DI 50 of 25.8 (12.5 - 49.3) mg/kg. Similar
results were obtained with compound 1, with inhibition 65.2 ± 4.6% and DI 50 of 15.01
(8.58-26.29) mg/kg. The results obtained with the highest doses of the extract and
compound were similar to those obtained with the control-positive drugs ibuprofen and
buscopan compound®, which presented inhibitions of 69.13 ± 5.84% and 63.19 ±
10.90%, respectively. Significant changes were obtained in the uterus volume of the
animals in the different groups, but not in their weight. However, histological analysis
showed a significant difference in the presence of edema and leukocyte infiltrate
characteristic of inflammatory process between the control-negative groups and those
treated with the extract or isolated compound. In view of the above, we can conclude
that the extract shows promising activity against the main symptom of dysmenorrhea
(pelvic pain), indicating an important anti-inflammatory activity. Isolated compound 1
appears to be, at least in part, responsible for this effect.
Key words: Visceral pain. Primary dysmenorrhea. Medicinal plants. Rodents.
Synadenium grantii.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Inervação dos órgãos pélvicos............................................................35
Figura 2 Representação dos níveis de estrógeno e progesterona durante o ciclo
menstrual...................................................................................... ......................39
Figura 3 Fisiopatologia da dismenorreia...........................................................40
Figura 4 Visão geral dos eventos associados à ativação dos mastócitos..........41
Figura 5 Mecanismo de transdução de sinal para o receptor de ocitocina no
miométrio...........................................................................................................43
Figura 6 Partes aéreas da S. grantii...................................................................50
Figura 7 Estrutura química do composto isolado 3,4,12,13- tetraacetilforbol-
20-fenilacetato (1) .............................................................................................52
Figura 8 Representação do peso dos animais do experimento.........................54
Figura 9 Demonstração do camundongo em contorção abdominal, patas
traseiras em extensão, rotação do quadril..........................................................55
Figura 10 Esfregaço vaginal de camundongos, representação de cada fase do
ciclo....................................................................................................................56
Figura 11 Efeito antinociceptivo do extrato de S. grantii.................................60
Figura 12 Efeito antinociceptiva do composto isolado de S. grantii................61
Figura 13 Efeito do extrato e do composto 1 de S. grantii sobre a área de
superfície do útero..............................................................................................62
Figura 14 Fotomicrografia dos tecidos uterinos dos animais do experimento
corados com H. E.......................................................................................... .....64
Figura 15 Número de mastócitos por campo....................................................65
Figura 16 Fotomicrografia dos tecidos uterinos dos animais do experimento
corados com azul de Toluidina..........................................................................66
Figura 17 Detalhe dos mastócitos em aumento de 1000x, no grupo controle.66
Figura 18 Representação do peso do útero dos animais nas diferentes doses do
extrato e do composto de S. grantii....................................................................67
Figura 19 Efeito do extrato de S. grantii sobre a atividade locomotora...........68
Figura 20 Relação do peso absoluto dos órgãos dos animais...........................69
Figura 21 Relação do peso relativo dos órgãos dos animais............................69
Figura 22 Estrutura química do composto isolado 3,4,12,13- tetraacetilforbol-
20-fenilacetato (1) .............................................................................................73
Figura 23 Estrutura química do butilbrometo de escopolamina.......................73
Figura S1 Representação da amplitude de contração de tiras de útero no
equipamento de órgão isolado............................................................................81
LISTA DE ABREVIATURAS
ACO – anticoncepcional oral.
AINES – anti-inflamatórios não esteroidais.
DP – dismenorreia primária.
GM-CSF – Fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos.
H & E – hematoxilina e eosina.
IMC – índice de massa corporal.
i.p. – intraperitoneal.
LT – leucotrienos.
MPO – migração de neutrófilos.
OTR – receptores de ocitocina.
PAF – fator ativador de plaquetas.
PGI2 – prostaciclina.
PGs – prostaglandinas.
Proteína quinase – PKC.
SCF – Fator de células tronco.
SNC – Sistema Nervoso Central.
TNF-α – Fator de necrose tumoral.
v.o. – via oral.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................29
2 OBJETIVOS..................................................................................................33
2.1 Objetivo Geral............................................................................................33
2.2 Objetivos Específicos.................................................................................33
3 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................35
3.1 Dor pélvica..................................................................................................35
3.2 Dismenorreia primária..............................................................................36
3.2.1 Fisiopatologia da dismenorreia primária................................................38
3.3 Papel da ocitocina na contração miometrial............................................42
3.4 Medicamentos em uso para dismenorreia primária...............................44
3.4.1 Antiinflamatórios não esteroidais............................................................44
3.4.2 antiespasmódicos......................................................................................46
3.4.3 anticoncepcionais hormonais orais.........................................................47
3.4.4 métodos alternativos.................................................................................47
3.5 Busca de novos medicamentos..................................................................48
3.5.1 Synadenium grantii..................................................................................48
4 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................53
4.1 Material vegetal..........................................................................................53
4.2 Animais.......................................................................................................53
4.3 Modelo de dismenorreia............................................................................54
4.3.1 Determinação do ciclo estral no grupo experimental.............................55
4.4 Avaliação da atividade inflamatória........................................................57
4.5 Avaliação do peso e área dos úteros.........................................................57
4.6 Avaliacao da atividade locomotora através do Modelo do Campo
Aberto (open field)............................................................................................57
4.7 Análise estatística.......................................................................................58
5 RESULTADOS..............................................................................................59
5.1 Efeito anti-nociceptivo do extrato e composto isolado............................59
5.2 Análise morfométrica do útero de animais submetidos ao modelo de
dismenorreia.....................................................................................................61
5.3 Avaliação da histológica do útero com coloração H & E.......................62
5.4 Avaliação histológica do útero com coloração de azul de toluidina......65
5.5 Relação do peso do útero dos animais .....................................................67
5.6 Efeito do extrato de S. grantii sobre a atividade locomotora.................67
5.7 Apresentação dos pesos dos órgãos dos animais tratados com S. grantii
comparados com controles..............................................................................68
6 DISCUSSÃO................................................................................................. .71
7 CONCLUSÃO...............................................................................................79
8 PERSPECTIVAS..........................................................................................81
10 REFERÊNCIAS..........................................................................................83
29
1 INTRODUÇÃO
A dor pélvica é uma das queixas mais desafiadoras que o profissional
de saúde enfrenta (RAPKIN; HOWE, 2008). Na área da Ginecologia, as dores
pélvicas mais prevalentes são: as vesicais provenientes de infecções do trato
urinário inferior, destacando-se a cistite intersticial na sua complexidade e,
portanto, de difícil terapêutica e as dores provenientes do útero com maior
destaque para a endometriose e a dismenorreia pela sua alta prevalência
(GUYTON; HALL, 2011).
Aproximadamente 80% das mulheres terão algum grau de
dismenorreia de acordo com a Autoridade Médica Britânica (PROCTOR;
FARQUHAR, 2006). Esta prevalência pode chegar até 95% segundo Osuga et
al. (2005) e até 90% de acordo com Chen e Kwekkeboom (2015). Percebe-se
que em 10 anos a prevalência permaneceu similar. É considerada a desordem
mais frequente na mulher jovem, possuindo grande correlação com desordens
como a depressão e a ansiedade (GAGUA et al., 2013; ZAHRADNIK et al.,
2010).
A dismenorreia é classificada em primária e secundária, sendo a última
dependente de outras desordens pélvicas. A primária é a mais frequente e
ocorre sem uma patologia pélvica evidente (PU et al., 2015). Apesar de não
estar associada a uma doença orgânica pélvica, certamente se relaciona a um
processo patogênico em nível bioquímico (BORGES; RAMOS et al, 2007). A
dismenorreia é caracterizada por intensa dor pélvica aguda durante o primeiro
ou segundo dia do ciclo menstrual (YANG et al., 2015).
Algumas vezes a dismenorreia pode vir associada à dor de cabeça,
náuseas e vômitos, desconforto digestivo, como diarréia ou constipação,
desmaios, mastalgia e edema abdominal que podem permanecer por todo o
período menstrual (GIRALDO et al., 2008). Sintomas como fadiga, dor lombar,
nervosismo, tonturas e cefaleia, os quais se manifestam algumas horas antes do
fluxo menstrual ou, mais frequentemente, nas primeiras 24 horas também são
descritos (FRARE; TOMADON; SILVA, 2014).
Há uma classificação quanto à intensidade da dor, em leve, moderada
ou severa, esta última representa 15% dos casos (CHEN et al., 2013). Desta
forma a dor causada pela dismenorreia, interfere nas atividades laborais e não
permite o desempenho normal no trabalho, nos estudos e no adequado
relacionamento familiar, sendo possível causa de alterações vasculares e
gastrointestinais (FRARE; TOMADON; SILVA, 2014).
30
Como uma forma de diminuir os sintomas citados acima e assim
melhorar a qualidade de vida de quem apresenta tais sintomas, os anti-
inflamatórios não esteroidais são os fármacos mais comumente utilizadas no
tratamento da dismenorreia (CHEN et al., 2013; PU et al., 2015). Possuem a
vantagem de alívio rápido dos sintomas, porém, apresentam efeitos colaterais
como o desconforto gastrointestinal e o impacto na função renal (CHEN et al.,
2014). Efeitos mais graves são observados com o uso crônico ou altas doses da
medicação (HAIDAR et al., 2012). Por estas razões, vários países preocupam-
se com a necessidade de novas terapias (CHEN et al., 2014).
Outras medicações também muito comercializadas na prática clínica
são os antiespasmódicos, sendo o principal representante deste grupo é o
"Buscopan composto", medicamento que contém dipirona sódica e brometo de
N-butilescopolamina. Um estudo analisou seus efeitos no alívio da dor
menstrual em pacientes, e os resultados foram baseados na escala numérica de
dor. Houve diferença importante no porcentual de melhora da dor nas pacientes
que receberam o comprimido ou a solução deste fármaco (KAARI et al., 2006).
A maioria dos estudos sobre o tema envolvem experimentos in vitro,
os quais se tornam restritos à análise dos efeitos uterinos locais e o
esclarecimento mais amplo do processo doloroso. O devido entendimento desta
patologia contribuirá para a formulação de novas terapias mais direcionadas
obtendo-se assim menos efeitos colaterais.
A Medicina Tradicional Chinesa, com compostos à base de plantas,
apresenta resultados positivos para o controle da dor da dismenorreia. Neste
contexto é importante ressaltar o Brasil como uma fonte rica destes compostos,
considerando sua altíssima biodiversidade, possuindo 22% das espécies de
plantas do planeta, e imensa variedade de animais e espécies de
microorganismos (BORGES et al., 2007).
A Synadenium grantii é conhecida popularmente no Brasil como
“cola-nota”, “janaúba”, “tiborna”, “leiterinha”, ou “cega-olho” e é utilizada sob
a forma de preparado do látex (diluído em água) para o tratamento de distúrbios
gástricos, como úlcera péptica, e gastrite, além de doenças neoplásicas
(MACHADO, 2008; VALADARES; CASTRO; CUNHA, 2007).
Na literatura não se encontrou estudos da atividade anti-nociceptiva
desta espécie, somente a planta S. umbellatum Pax, apresentou atividades
antinociceptiva (atuação no sistema opioide) e anti-inflamatória (redução de
edema e formação leucocitária), de acordo com o trabalho publicado por
Oliveira et al. (2013). Esta descoberta gera uma hipótese acerca da atividade
31
antinociceptiva e anti-inflamatória da S. grantii, já que pertence ao mesmo
gênero: Synadenium. Portanto este trabalho teve como objetivo analisar os
efeitos da S. grantii sobre as alterações inflamatórias e nociceptivas em
camundongos submetidos ao modelo de dismenorreia.
32
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Analisar os efeitos do extrato metanólico obtido das partes aéreas da
Synadenium grantii e do composto isolado 1 sobre as alterações inflamatórias e
nociceptivas em camundongos submetidos ao modelo de dismenorreia.
2.2 Objetivos Específicos:
Avaliar o efeito do tratamento oral com o extrato da S. grantii sobre as
contorções abdominais induzidas pela injeção de ocitocina em camundongos
fêmeos estrogenizados;
Avaliar o efeito do tratamento oral com o composto 3,4,12,13-
tetraacetilforbol-20-fenilacetato (1) isolado da S. grantii sobre as contorções
abdominais induzidas pela injeção de ocitocina em camundongos
estrogenizados;
Avaliar o efeito do extrato e do composto isolado sobre o volume e
peso do útero de animais submetidos ao modelo de dismenorreia.
Analisar o efeito do extrato e do composto isolado sobre achados
histológicos indicativos de processo inflamatório.
34
35
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Dor pélvica:
A Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), descreve
dor como uma experiência angustiante associada a uma lesão real ou potencial
dos tecidos com componentes sensoriais, emocionais, cognitivas e sociais
(WILLIAMS e CRAIG, 2016).
A patogênese da dor pélvica envolve estímulos nocivos ou
potencialmente nocivos para induzir o dano tecidual. Desta forma há a ativação
de nociceptores especializados localizados nas terminações nervosas das fibras
aferentes como demonstrado na figura 1 (ORIGONI et al., 2014). Modelos
animais de dor nociceptiva são usados desde o século 19 para o melhor
entendimento desse processo (GREGORY et al., 2013). Esses estudos
anteriores demostraram a ativação da fibra A delta (rápida, mielinizada) e fibras
C (lentas, não mielinizadas) em neurônios no gânglio da raiz dorsal da medula
espinhal, como sinapses dentro do cordão espinhal, principalmente via plexo
hipogástrico e nervo pudendo (ORIGONI et al., 2014).
Figura 1 - Inervação dos órgãos pélvicos.
Nervo pudendo
Nervo hipogástrico
GRD
GRD
Nervo pélvico
Sínfise púbica reto
bexiga
útero
36 Nota: Os nociceptores sensoriais que inervam a pelve estão em neurônios no gânglio da
raiz dorsal da medula espinhal, com sinapses dentro do cordão espinhal, principalmente
via plexo hipogástrico e nervo pudendo. A região em torno do colo do útero representa
uma zona de transição e é inervada por fibras em ambos os nervos.
GRD: gânglio da raiz dorsal.
Fonte: Adaptado de ORIGONI et al., 2014.
Vísceras localizadas na pelve são as responsáveis pela dor visceral
provenientes de estímulos transmitidos pelas fibras sensoriais destes órgãos
para os feixes nervosos autônomos, e as sensações são referidas para as áreas
da superfície do corpo longe do órgão doloroso (GUYTON; HALL, 2011). Este
tipo de sensação de dor pode ser aguda, cíclica ou crônica. A dor aguda tem
início abrupto, possui aumento de intensidade e é de curta duração, porém
muitas vezes está associada a respostas reflexas autônomas profundas como
náusea, vômito, diaforese bem como apreensão (RAPKIN; HOWE, 2008).
Estudos mais recentes utilizam a neuroimagem por ressonância
nuclear magnética para demonstrar as mudanças na morfologia cerebral
frequentemente acompanhada nos casos de dor pélvica crônica, especialmente
nas áreas de percepção e modulação de dor. Entretanto, os biomarcadores
sensíveis e específicos para a dor pélvica ainda não foram identificados
adequadamente (BAGARINAO et al., 2014). Muitas são as causas de dor
pélvica crônica, entre as condições descritas acima, a dismenorreia destaca-se
neste contexto pela sua elevada prevalência nas mulheres em idade reprodutiva
(ORIGONI et al., 2014).
3.2 Dismenorreia primária:
A dor é uma modalidade sensorial que, em muitos casos, representa o
único sintoma para o diagnóstico de várias doenças, portanto frequentemente
tem uma função protetora (ALMEIDA et al., 2012). No caso da dismenorreia
primária, há ausência de patologia pélvica associada (DAWOOD, 2006).
Dismenorreia, palavra derivada do grego, significa “menstruação
difícil” e caracteriza-se por uma dor na região abdominopélvica, crônica e
cíclica, associada à menstruação, comumente chamada de cólica menstrual
(FRARE; TOMADON; SILVA, 2013). Geralmente tem início após dois ou três
anos da menarca, quando os ciclos tornam-se ovulatórios
(DELIGEOROGLOU, 2006). A prevalência da dor diminui com a idade e a
37
paridade, sendo mais algumas particularidades para relacionar a um mecanismo
hormonal na patogênese da doença (OSUGA et al., 2005).
Outros fatores envolvidos são o tabagismo, a menarca precoce, o
fluxo menstrual intenso ou prolongado, os distúrbios psicológicos e a influência
genética (FRARE; TOMADON; SILVA, 2014). Outras doenças também
podem estar relacionadas, como a síndrome do intestino irritável e a
fibromialgia (CHEN; KWEKKBOOM, 2015). Além disso, deve-se citar o
nervosismo, a depressão, a irritabilidade e a insônia como sintomas associados
ao processo de dor. Essas queixas foram citadas por pacientes participantes de
estudos sobre a apresentação clínica da dismenorreia primária
(DELIGEOROGLOU, 2006).
As mulheres com dismenorreia têm a qualidade do sono, a qualidade
de vida, a atividade física reduzidas e mau humor quando estão com dor. Ao
longo de ciclos menstruais, essas mulheres, em um processo conhecido como
sensibilização à dor visceral, podem iniciar o reflexo da dor viscerossomática e
dor referida, resultando em dor somática crônica e hipersensibilidade de
nociceptores à inflamação (JARRELL; ARENDT-NIELSEN, 2016). Nas
regiões pélvicas ocorre um aumento da sensibilidade para estímulos dolorosos,
no entanto, é desconhecido se o aumento da sensibilidade à dor é a causa ou
efeito da dor menstrual recorrente, mas pode predispor outras condições
crônicas dolorosas a longo prazo (IACOVIDES et al., 2015).
Um estudo recente associou a presença de dismenorreia primária
(DP) em pacientes diagnosticadas com fibromialgia. A DP foi estabelecida em
41% dos pacientes com fibromialgia e em 28% no grupo controle. Uma
diferença significativa foi encontrada na DP entre os dois grupos, comprovando
que há uma maior frequência de dismenorreia nestes pacientes (TERZI;
TERZI; KALE, 2015).
Principalmente nas pacientes com nível mais severo de dismenorreia,
o número absoluto de dias de absenteísmo é maior, mas varia de meio dia a 3
dias por mês, e praticamente todas, independentemente do nível de sintomas,
relatam uma redução clara na produtividade. Evidentemente, o panorama da
dismenorreia com suas características menstruais afeta a capacidade das
mulheres (OMIDVAR; BAKOUEI et al., 2016). Em um estudo no Canadá,
51% das mulheres afetadas com dismenorreia relataram comprometimento nas
atividades e 17% referiram absenteísmo (DAWOOD, 2006). Esta é a principal
causa de absenteísmo ao trabalho e redução da qualidade de vida (ABADIAN
et al., 2016). Nos Estados Unidos estima-se perda de 1 a 3 dias no mês de
38
trabalho, com perda de 6 bilhões de horas por ano e perda econômica
aproximada de 200 milhões de dólares (HSU, YANG, YANG, 2004).
3.2.1 Fisiopatologia da dismenorreia primária:
A dor observada na dismenorreia primaria ocorre devido à atividade
uterina aumentada ou anormal caracterizada pela liberação de mediadores
químicos como prostaglandinas, demonstrado em estudos prévios (CHEN et al.,
2013). A dor é semelhante à contratilidade uterina induzida por prostaglandinas
ou seus análogos para o trabalho de parto ou aborto (DAWOOD, 2006). O
mecanismo da dismenorreia primaria é atribuído a este alto nível sérico de
prostaglandinas E₂ (PGE₂), PGF₂α e leucotrienos, levando não só à contração
miometrial severa, mas também à vasoconstrição com consequente isquemia
resultante da liberação de citocinas (CHEN et al., 2014; DELIGEOROGLOU,
2006). Este é um mecanismo para a dor visceral verdadeira, pois estas citocinas
estimulam diretamente as fibras nervosas nociceptivas uterinas (GUYTON;
HALL, 2011).
Mulheres com dismenorreia têm níveis mais elevados do que as não-
dismenorreicas de prostaglandinas endometriais (PGF₂α e PGE₂) e
leucotrienos, resultando em aumento do tônus do músculo liso uterino,
contrações uterinas mais fortes e mais frequentes, bem como modificações do
fluxo sanguíneo local, que, em conjunto, são responsáveis pelas cólicas
abdominais dolorosas (TJANDRAWINATA et al., 2011). Verificou-se um
número duas vezes superior dessas prostaglandinas em fluido menstrual de
mulheres com dismenorreia comparado com as sem dismenorreia (OMIDVAR;
BAKOUEI et al., 2016). Principalmente os leucotrienos C4 e o D4 possuem
níveis nos fluidos menstruais superiores demonstráveis nos locais de ligação
para leucotrieno C4 nas células miometriais, portanto é provável que os
leucotrienos contribuam para a hipercontratilidade uterina na DP (DAWOOD,
2006).
É o endométrio secretor pós ovulatório, quando não ocorre a
concepção, que produz grande quantidade de PGF₂α que atuam promovendo a
luteólise e consequentemente diminuição brusca da concentração de
progesterona (HAREL, 2006). Existe uma excelente correlação entre a
quantidade de prostaglandinas liberada e a intensidade da dor durante esse
período (HSU, YANG, YANG, 2006). O endométrio humano de fase lútea de
mulheres dismenorreicas mostrou, em experimentos in vitro, produzir sete
39
vezes mais PGF₂α do que o endométrio de fase lútea de mulheres sem a
patologia (DAWOOD, 2008). Este processo estimulado pelo metabólito do
ácido araquidônico, via cicloxigenase, leva à hipertonia, causando isquemia e
dor, e assim dificultando o fluxo menstrual (PARK; WATANUKI, 2005). A
hipertonia concentrada no istmo uterino provoca estenose do canal cervical,
provocando o acúmulo de sangue na cavidade uterina e assim aumento ainda
maior dos níveis de prostaglandinas, gerando um ciclo vicioso e causando mais
dor (BORGES; RAMOS et al., 2007).
Além disso, a queda da progesterona antes do início do ciclo menstrual
deflagra a liberação de ácido araquidônico (figura 2), potencializando a ação
das citocinas locais na contração miometrial (CHEN et al., 2014). Isto ocorre
pelo acúmulo de ácidos graxos nos fosfolipídios das membranas celulares
resultantes da alta ingestão dessas substâncias na dieta ocidental, e antes da
menstruação, estes ácidos graxos particularmente o ácido araquidônico, são
liberados, e uma cascata de prostaglandinas (PG) e leucotrienos (LT) é iniciada
no útero (HAREL, 2006). Este esquema é demonstrado conforme a figura 3.
Figura 2: Representação dos níveis de estrógeno e progesterona durante o ciclo
menstrual.
Nota: Observar a queda de progesterona no início do ciclo. Adaptado de Lee et al., 2015.
40 Figura 3: Fisiopatologia da dismenorreia.
Diminuição Progesterona
Fosfolipase A2
FosfolipídeosNa parede celular
ω3 ω6
Ácido aracdônicoω6
Leucotrieno A4Lipooxigenase 5
Edndoperóxidos cíclicos
ciclooxigenase
PGE2PGF2α
PGI2(prostaciclina)
TXA2(Tromboxano A2)
Contração miometrialVasocosntricção dor
DOR
LT-B4 LT-C4
LT-D4
LT-E4
Fonte: Harel: Dysmenorrhea in Adolescents and Young Adults, 2006.
Possível envolvimento desses potentesvasoconstrictores e mediadores inflamatóriosem mediar os sitomas de dismenorreia emadolescentes.
Fonte: Adaptação de Harel: Dysmenorrhea in Adolescents and Young Adults.
Os mastócitos também foram identificados no endométrio durante
todo o ciclo menstrual, mas sem flutuação durante o mesmo (LEE et al., 2015).
Estas células desempenham um papel primordial nas reações inflamatórias
agudas e um importante mediador pró-inflamatório é o fator de necrose tumoral
(TNF), encontrado dentro de mastócitos granulados e liberados na ativação
mastocitária (MENZIES et al., 2015). Outros mediadores pré-formados incluem
a histamina, serotonina, proteinases e proteoglicanos e mediadores lipídicos
neoformados, como o fator ativador de plaquetas (PAF) e derivados do ácido
araquidônico, como os leucotrienos e as prostaglandinas. Os mastócitos
também sintetizam uma série de interleucinas e fatores de crescimento, como
IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, fator de crescimento de
fibroblastos, TNF, Fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos
(GM-CSF) e Fator de células tronco (SCF), estes mediadores estão descritos na
figura 4 (MESQUITA JR et al., 2011).
41
Figura 4: Visão geral dos eventos associados à ativação dos mastócitos.
Nota: As consequências biológicas da ativação dos mastócitos variam conforme os
subtipos dos mastócitos, estímulo ativador e tecidos adjacentes FGF: fator do
crescimento de fibroblastos VEGF: fator de crescimento do endotélio vascular SCF:
fator de célula-tronco TGF-b: fator do crescimento transformador-b TNF-α: fator de
necrose tumoral a IL: interleucina LT: leucotrieno PAF: fator ativador de plaquetas PG:
prostaglandina MHC: complexo de histocompatibilidade principal GM-CSF: fator
estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos. Fonte MESQUITA et al., 2011.
O tipo e a intensidade dos sintomas mudam para cada mulher e de
ciclo para ciclo na mesma mulher. Os sintomas podem durar horas ou vários
dias, porém, na maioria das vezes o desaparecimento das cólicas ocorre após 48
horas do início da menstruação (FRARE; TOMADON; SILVA, 2014). Foi
observada uma associação significativamente positiva entre os níveis séricos de
marcadores inflamatórios e a severidade dos sintomas menstruais em mulheres
jovens, incluindo IL-12 e Interferon-γ (IFN-γ), e esta associação persistiu
depois de ajustes como: IMC, tabagismo, álcool utilizados com outros fatores
para inflamação crônica (BERTONE-JOHNSON et al., 2014).
Observa-se em mulheres dismenorreicas elevação significativa de
estradiol na fase lútea do ciclo menstrual, acarretando desbalanço entre os
42
hormônios ovarianos e níveis de PGF₂α endometrial até quatro vezes maior
(HAREL, 2006). Isto poderia também contribuir para o aumento da atividade
uterina e, consequentemente, dor menstrual. Esse predomínio estrogênico
poderia aumentar a secreção de PGs e hormônio antidiurético, que, por sua vez,
provocariam aumento de atividade uterina, isquemia e dor. Outro hormônio
recentemente relacionado com a dismenorreia é a ocitocina (IKEDA;
SALOMÃO; RAMOS, 2016).
3.3 Papel da ocitocina na contração miometrial:
O papel da ocitocina na contração do miométrio ocorre pela ativação
dos receptores de ocitocina (OTR) na presença do estrogênio. O estrogênio
apresenta tanto efeito estimulatório para a síntese de ocitocina como para o
aumento da concentração de OTR (MITCHELL et al., 1998). Relatos clínicos
sugerem que a expressão de OTR está aumentada em pacientes com DP, pois as
vias de sinalização do OTR também estão envolvidas nesse processo de dor
(SUN et al., 2016). A ativação do OTR (receptor acoplado a proteína G)
mediará a ação da ocitocina no miócito. A ligação da ocitocina ao OTR na
membrana plasmática dissocia a subunidade da proteína G, o que acaba por
liberar IP₃, que então mobiliza o cálcio armazenado no retículo endoplasmático
e também de locais extracelulares resultando numa resposta contrátil
(PHANEUF et al., 1993).
O receptor de ocitocina é um receptor de membrana clássico com sete
domínios transmembranares ligados através de um complexo de proteína G a
um sistema de transdução de sinal de fosfolipase C-proteína quinase C
(PHANEUF et al., 1993). As proteínas de acoplamento incluem subunidades αq
e α11. Em segundos de estimulação com ocitocina, há concentrações
intracelulares expressivamente mais elevadas de IP₃ e Ca²⁺. O aumento de Ca²⁺
e calmodulina aumenta a quinase de cadeia leve de miosina, que catalisa a
resposta de contração (MITCHELL et al., 1998).
Mudanças na sinalização do cálcio dentro do miométrio tem
importante consequência funcional para determinar a contratilidade. Agentes
bloqueadores do canal de cálcio diminuem a contratilidade miometrial (LIU et
al., 2011). Além disso, a ocitocina possui um importante efeito constritor nas
artérias uterinas, o que favorece isquemia e dor (CHEN et al., 2013).
A ocitocina pode também estimular células de endométrio a
produzirem prostaglandinas e elas próprias podem ser uterotônicas. Além disso,
43
as prostaglandinas são estimulantes importantes da síntese de receptores de
ocitocina, portanto, é possível que haja um sistema de feedback positivo entre
os receptores de ocitocina e as prostaglandinas (MITCHELL et al., 1998).
Soloff e colaboradores em 1975, demonstraram que o estrogênio
aumenta o número de receptores de ocitocina em úteros de rato. Assim, o
preparo anterior com estrogenioterapia nos animais submetidos ao modelo de
dismenorreia explica-se por esta ativação estrogênica e o número de OTR
eleva-se durante a fase folicular do ciclo, refletindo também o efeito positivo do
estrogênio.
Figura 5: Mecanismo de transdução de sinal para o receptor de ocitocina no miométrio.
Nota: Mecanismo de transdução de sinal para o receptor de ocitocina no miométrio.
Este receptor é um receptor com 7 domínios transmembranares clássico ligado através
de uma proteína G à fosfolipase C. Após a estimulação do receptor com ocitocina (OT),
a subunidade α da proteína G heterotrimérica hidrolisa GTP e libera a subunidade βy
para estimular a fosfolipase C. Esta enzima converte bisfosfato (PIP2) em diacilglicerol
(DAG) e trifosfato de inositol (IP3). O DAG estimula a atividade da proteína quinase C
(PKC) provocando a fosforilação de substratos que caracterizarão a resposta do tipo de
célula específica. O IP3 estimula o fluxo de Ca²⁺ no citoplasma através dos canais de
cálcio, principalmente a partir do retículo sarcoplasmático, mas também do espaço
Membrana celular
Fosfatidil inositol
Diacilglicerol
Proteína G
calmodulina
Retículo
endoplasmático
Proteína quinase C
Fosfolipase C
44 extracelular. O Ca²⁺ aumentado irá combinar com calmodulina para estimular a quinase
de cadeia leve da miosina (MLCK) a produzir contração miometrial.
Fonte: Adaptado de MITCHELL et al., 1998.
A ocitocina também é utilizada para indução de contrações em
modelos in vitro, por ser considerada uma forma rápida e estável, e adequada
para triagem de drogas de terapia para dismenorreia (HUA et al., 2008). Nesta
pesquisa também se testou o efeito da ocitocina em útero isolado através da
técnica de órgão/tecido isolado. Esses resultados ficaram como preliminares,
pois até o momento foi realizada apenas a padronização da técnica, ficando os
testes com o extrato e composto utilizados nesta pesquisa para uma continuação
da mesma.
3.4 Medicamentos em uso para dismenorreia primária:
A abordagem geral da dismenorreia inclui o manejo adequado dos
fatores psicológicos e comportamentais e da farmacoterapia específica. A
eficácia da farmacoterapia e outras formas de terapia podem ser reforçadas pela
psicoterapia simples que acompanha o diálogo médico-paciente os
medicamentos mais eficazes são os contraceptivos orais e os anti-inflamatórios
não esteroidais (AINES), que são, na sua maioria, inibidores da síntese de
prostaglandina. O fármaco de escolha para o alívio da DP é um AINE conforme
dados de literatura estrangeira. No Brasil não encontramos estudos sobre a
primeira medicação de escolha para esta condição, mas acredita-se ser o
buscopan® o fármaco mais utilizado. No entanto, a escolha da medicação
depende se a mulher prefere um contraceptivo oral para suas necessidades de
controle de natalidade e se há qualquer contraindicação para o uso do
contraceptivo oral combinado ou não com AINE (DAWOOD, 2008).
3.4.1 Anti-inflamatórios não esteroidais
Várias modalidades de tratamento vêm sendo utilizadas no tratamento
da DP. As medicações em uso na atualidade, como os (AINEs), além dos
efeitos colaterais já descritos, não promovem o controle adequado dos sintomas
(CHEN et al., 2014). Setenta e três triagens randomizadas controladas foram
incluídas em uma revisão para avaliar os efeitos dos AINES comparados com o
analgésico comum, como paracetamol. Concluiu-se que os AINEs são os mais
efetivos, porém indigestão, cefaleia e sonolência foram descritas pelas
45
participantes após o uso desta medicação (MARJORIBANKS; PROCTOR;
DERKS, 2010).
Os AINES inibem a via do ácido araquidônico, inibindo a COX e
bloqueando a síntese de PGs, reduzindo a atividade miometrial (HAIDAR;
DARDES; NAVARRO, 2012). Alguns fármacos inibem a enzima redutase,
permitindo a formação de endoperóxidos e evitando a síntese de PGs
(TJANDRAWINATA et al., 2011). Deve-se, no entanto, evitar o uso de tais
fármacos, uma vez que os endoperóxidos também têm ação uterotônica
(IKEDA; SALOMÃO; RAMOS, 2016). Além de inibir a síntese de
prostaglandina, reduzem a secreção de vasopressina (PARK et al., 2014), esta
possui ação contrátil uterina e reduz o fluxo sanguíneo durante o período
menstrual (LIEDMAN; HANSSON; HOWE, 2008).
O ibuprofeno também é um AINE largamente utilizado na prática
clínica para o controle da dor menstrual. Possui ação anti-inflamatória,
analgésica e antipirética. O comprometimento das atividades diárias durante o
ciclo menstrual foi minimizado com o uso de ibuprofeno, apresentando maior
eficácia com menos efeitos colaterais, sendo superior dentre os principais
AINEs utilizados rotineiramente (ACQUA; BENDLIN, 2015). Recomenda-se
seu uso antes do início do ciclo menstrual para melhor resposta terapêutica
(HAIDAR; DARDES; NAVARRO, 2012).
Os fármacos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) e
pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para dismenorreia
são: ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, ácido mefenâmico, naproxeno e
naproxeno sódico (IKEDA et al., 2016).
Dentre os AINEs, há relato de melhora em 17 a 95% das mulheres em
diferentes estudos, e 10 a 25% não respondem ao tratamento (PARK et al.,
2014) ou optam por não os usar em razão dos efeitos gastrintestinais, não sendo
indicados em mulheres com úlcera gástrica, com nível de evidência A. Não está
claro por que o restante 15% a 20% das pacientes não apresentam resposta
adequada (ACQUA; BENDLIN, 2015). Além dos efeitos gastrointestinais, há
relatos de comprometimento hepático e renal com o longo tempo de uso dessas
medicações (HSU, YANG, YANG, 2004).
Muitos fatores podem contribuir para isso, incluindo o diagnóstico
incorreto de DP e a presença de fatores bioquímicos que podem ter papel mais
dominante na patogênese da dor menstrual (IKEDA et al., 2016). Como
demonstrado na figura 1, sabe-se que algumas pacientes produzem mais
leucotrienos do que PGF₂α. Os leucotrienos, derivados do ácido araquidônico
46
pela via da lipoxigenase (LOX) também induzem contração uterina, produzindo
dismenorreia através de um mecanismo semelhante ao das PGs (SUN et al.,
2016). Como os agentes mais comumente usados bloqueiam somente a
conversão de ácido araquidônico em endoperóxidos cíclicos (via da COX),
estes fármacos são incapazes de inibir a produção excessiva de leucotrieno. O
papel da prostaciclina (PGI₂), outro derivado do ácido araquidônico, também
deve ser considerado (relaxa o útero e causa vasodilatação), já que os AINEs
que inibem a COX irão bloquear também a produção de PGL₂ (HAREL, 2006).
O uso de fármacos da classe dos salicilatos como anti-inflamatórios,
apesar de apresentarem melhora da dor, por sua atividade de diminuição dos
fatores de coagulação de origem hepática e inibição da agregação plaquetária,
aumentam o fluxo menstrual (HAIDAR; DARDES; NAVARRO, 2012).
3.4.2 Antiespasmódicos
Uma medicação muito utilizada é a associação do brometo de N-
butilescopolamina com dipirona sódica (Buscopan composto®), devido aos
seus efeitos anticolinérgicos sobre a musculatura lisa, além da analgesia.
Entretanto uma desvantagem do uso dos antiespasmódicos é a distensão
abdominal e a obstipação intestinal, razão pela qual algum serviço tem
preconizado o uso isolado de analgésicos, como a dipirona. A dipirona é a
droga não opioide mais popularmente usada para analgesia em vários países, à
exceção de alguns, como os Estados Unidos e a Inglaterra, que baniram o seu
uso em função do raro aparecimento de agranulocitose. (KORKES; GOMES;
HEILBERG, 2009).
O uso da dipirona, também considerado um AINE, associado a
antiespasmódico também é muito comum na clínica, pois ambas as substâncias
têm comprovada ação terapêutica. O brometo de butilescopolamina exerce uma
ação espasmolítica sobre a musculatura lisa, ou seja, relaxa a musculatura lisa
quando esta está contraída de forma não fisiológica (espasmo), resultando no
alívio da dor. E, a dipirona possui propriedades analgésicas que funcionam
como complemento dos efeitos do brometo de butilescopolamina. É um
medicamento indicado no alívio de dor ou desconforto abdominal associado a
espasmos transitórios e moderados do trato gastrointestinal e na DP. Admite-se
que o efeito analgésico da dipirona ocorra principalmente por supressão do
mecanismo de percepção da dor no sistema nervoso central, e ainda por uma
47
inibição da síntese de prostaglandinas, impedindo o aparecimento da
hiperalgesia (KAARI, 2006).
3.4.3 Anticoncepcionais hormonais orais
Os contraceptivos orais (ACOs) também são usados para o alívio da
dor, mas possuem efeitos indesejáveis como náuseas e retenção hídrica, os
quais não se podem ignorar (CHEN et al., 2014). As pacientes que não fazem
contracepção e têm vida sexual ativa são aconselhadas a iniciar o tratamento no
primeiro dia do fluxo menstrual, pois os efeitos dos AINEs sobre o embrião não
são bem conhecidos. Além disso, sabe-se que as PGs têm papel importante na
maturação folicular e na ovulação, o que sugere que prejuízos fetais podem
ocorrer no caso de uma gestação precoce (IKEDA; SALOMÃO; RAMOS,
2016).
Os ACOs inibem a ovulação, diminuindo a proliferação endometrial e,
consequentemente, a produção das prostaglandinas. Há também a diminuição
do fluxo menstrual, o que reduz a intensidade da dor (HAIDAR; DARDES;
NAVARRO, 2012). Houve maior beneficio com os ACOs de terceira geração,
(baixa dose de estrogênio, associado a progestagênio de terceira geração, como
desogestrel e gestodeno).
3.4.4 Métodos alternativos
A Medicina Tradicional Chinesa utilizando substâncias a base de
plantas, demonstra efeitos benéficos no tratamento da dismenorreia descrito em
vários estudos ao longo da história e é bem aceita (LIU et al., 2014; PU et al.,
2015). Na Coreia, muitas pacientes com falha na resposta aos tratamentos
convencionais, são direcionadas aos compostos à base de plantas (PARK et al.,
2014). Outras possibilidades terapêuticas têm sido empregadas, como a
prescrição de magnésio, vitaminas B6, B1 e E, ácidos graxos e ômega-3.
Acredita-se que estes tratamentos possam reduzir a produção de
prostaglandinas e leucotrienos, atenuando os sintomas menstruais observados
em adolescentes (HAREL, 2006). Além disso, há ainda métodos alternativos
como repouso, calor local, dieta leve, acupuntura e atividade física (ACQUA;
BENDLIN, 2015). Entretanto, não se verificou diferença significativa na
prevalência da DP entre as praticantes de atividade física quando comparadas
às não praticantes (OMIDVAR; BAKOUEI et al., 2016). Há dados que
apontam que a interrupção cirúrgica da inervação pélvica pode ser utilizada em
48
mulheres que não respondem ao tratamento medicamentoso, mas não há
evidências para suportar a eficácia a longo prazo deste método (PARK et al.,
2014).
3.5 Busca de novos medicamentos
Na China o modelo de dismenorreia com ocitocina é reconhecido
como padrão para testes pré-clínicos. Estudos comparativos de modelos in vivo
mimetizando as características clínicas possuem poucas publicações na
literatura. Embora os níveis anormais de prostanóides sejam os responsáveis
atualmente pela dor da dismenorreia, ainda faltam conhecimentos mais
específicos sobre sua fisiopatologia, os quais possivelmente propiciarão uma
terapêutica mais eficaz (YANG et al., 2015).
Para o tratamento de dores crônicas, cada vez mais a farmacologia
busca fontes naturais com o objetivo de obtenção de fármacos com menos
efeitos colaterais quando comparado com as terapias sintéticas tradicionais
(COSTA, 2011). Assim, as plantas medicinais apresentam um papel importante
na terapêutica, representando claramente uma janela de oportunidades na
indústria de medicamentos e hoje, são frequentemente utilizadas com o intuito
de substituir ou auxiliar as terapias convencionais no tratamento de várias
doenças (OLIVEIRA et al. 2008). A antiga medicina herbal chinesa citada na
literatura a 4.000 anos atrás, é hoje uma alternativa promissora muito
considerável (ALOTAIBI, 2016).
As plantas possuem uma abrangente diversidade de metabólitos
secundários com diferentes atividades biológicas (BORGES et al., 2012). Uma
revisão sobre produtos naturais como fontes de novas terapias aponta os
produtos naturais como representantes de um alto potencial no processo de
descoberta e desenvolvimento de fármacos. A área de oncologia é a que mais
contribui com pesquisas neste assunto, seguida da anti-infecciosa (NEWMAN;
CRAGG, 2014).
3.5.2 Synadenium grantii
Além das designações de “leitosinha” e “janaúba”, como descrito
anteriormente (COSTA et al., 2012), a S. grantii também é conhecida como
Euphorbia umbellata, e outros nomes populares são: "cola-nota", "avelós",
"milagrosa", "cancerola”, “tiborna”, “leiterinha”, ou “cega-olho”, é uma planta
49
medicinal que cresce em regiões tropicais da América e África e atinge de 3 a 5
metros (COSTA, 2011). O látex desta planta, diluído em água, tem sido
utilizado no tratamento de várias doenças, principalmente distúrbios gástricos,
como úlcera péptica, e gastrite, diabetes mellitus, hanseníase, tripanossomíases,
leucemia e vários tumores malignos (MELO-REIS et. al., 2010).
Este látex também é empiricamente recomendado para o tratamento de
várias outras enfermidades tais como alergia, câncer, doença de Chagas,
diabetes, gripe, hemorragias internas, impotência sexual, obesidade, úlcera de
estresse, cólicas menstruais e dores no corpo (BADGUJAR, 2014).
A S. grantii (Figura 6) pertence à família das Euphorbiaceae, a qual
possui cerca de 300 gêneros e 8.900 espécies identificadas (BITTNER et al.,
2001). Quando os ramos são removidos, a planta libera um látex branco
altamente irritante (COSTA et al., 2012). Causa toxicidade imediata ou
irritação tardia (queimadura, vermelhidão, bolhas, edema) da pele e dos olhos
após o contato com o látex; a ingestão causa a irritação dos lábios, da língua, e
da garganta sendo que o princípio ativo comumente encontrado são ésteres de
diterpenos (KINGHORN, 1980).
Em relação à nocicepção na dismenorreia primária, alguns estudos
demonstraram os mecanismos pelos quais os compostos a base de plantas
fornecem nocicepção, os mecanismos foram variados e incluíram: associação
com a redução nos níveis de PGs; supressão da COX₂; ativação de superóxido
dismutase; redução de óxido nítrico incluindo óxido nítrico sintetase e redução
do fator nuclear kappa B (NFĸB); estimulação de receptor de somatostatina;
redução de Ca²⁺ intracelular e o restabelecimento do metabolismo de
fosfolipídeos (PARK et al., 2014).
50 Figura 6: Partes aéreas da S. grantii.
A origem de seu nome significa: “syn” = úmido, “aden” = glândula,
referentes as glândulas que são vistas nas inflorescências. E “grantii” ao George
Barnard Grant (1849-1917), botânico e seu explorador (FRANCO, 2012).
Estudos prévios isolaram diterpenos, triterpenos, compostos
polifenólicos, ácidos orgânicos e ácidos graxos neste látex. Todos estes
compostos possuem propriedades medicinais: molucida, fibrinolíticas,
proteolíticas e hemoaglutinação (COSTA et al., 2012). No Brasil, a espécie S.
grantii apresentou atividade moluscicida promissora contra o caramujo
Biomphalaria glabrata Say, principal vetor hospedeiro intermediário do
helminto trematódeo Schistosoma mansoni (agente etiológico da
esquistossomose), sendo este o primeiro relato desta atividade para espécie
(HARTMANN; MARIM et al., 2011). Outras propriedades são mencionadas na
literatura, tais como antitumourais, anti-inflamatórias e para imunorregulação
(OLIVEIRA et al., 2013). Também foram observadas atividades
antiangiogênica, antiparasitária e antiasmática. Possivelmente estas atividades
biológicas da S. grantii estão associadas à presença de flavonoides e terpenos
(MUNHOZ; MINOZZO et al., 2014).
51
Estudos da atividade biológica da planta S. grantii foram realizados
em diversas partes do mundo. Porém, a formação dos metabólitos secundários e
ativos parece estar ligada ao ambiente em que se coleta a espécie vegetal,
ocorrendo uma variabilidade de constituintes químicos nas plantas
(OLIVEIRA, 2008). As plantas produzem metabólicos secundários de acordo
com a exigência ambiental onde vivem, resgatando assim, a conceituada teoria
da adaptação das espécies de Charles Darwin (CECHINEL-FILHO; YUNES,
1998). Esta variabilidade de constituintes químicos de plantas relaciona-se
com a sazonalidade, embora uma planta possa conter centenas de metabólitos
secundários, apenas os compostos presentes em maior concentração são
geralmente isolados e estudados pela fitoquímica clássica. A análise de
substâncias ativas é muito mais complexa e longa, já que geralmente os
compostos presentes em menor proporção na planta são os que apresentam
melhores efeitos biológicos (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998).
A utilização da S.grantii na medicina popular é evidente, em diferentes
tipos de patologias. Porém, existem poucos trabalhos científicos para a
comprovação dos efeitos bem como para a relação entre dosagens e respostas
biológicas.
Um dos princípios ativos desta planta foi identificado como um raro
éster diterpeno forbol, encontrado no caule, denominado como 3,4,12,13-
tetraacetilforbol-20-fenilacetato (figura 7).
52 Figura 7: Estrutura química do composto isolado 3,4,12,13- tetraacetilforbol-20-
fenilacetato (1).
53
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material vegetal:
Foram utilizadas o extrato metanólico de caules e folhas e o composto
do caule de S. grantii provenientes de plantas coletadas na cidade de Itajaí (SC-
Brasil) nos meses de agosto de 2013 e março de 2014. Após a coleta,
receberam identificação pelo Dr. Oscar B. Iza (Universidade do Vale do Itajaí).
Um comprovante da amostra foi depositado no Herbário Barbosa Rodrigues em
Itajaí, Santa Catarina sob o número de escicata VC Filho 118.
Os procedimentos de extração e isolamento do composto foram
realizados por Adriana Campos, sob supervisão do Prof. Valdir Cechinel Filho.
O material vegetal (caule e folhas) foi moído e submetido a um processo de
maceração com metanol a temperatura ambiente, por um período de uma
semana. Após, o solvente foi removido por destilação em rotaevaporador sob
pressão reduzida, para obtenção do extrato metanólico bruto, este extrato foi
solubilizado com os solventes de polaridade crescente: acetona e metanol
(CAMPOS et al., 2016).
Procedimentos cromatográficos usuais como cromatografia em
camada delgada, cromatografia em coluna e cromatografia líquida de alta
eficiência (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; MALHEIROS et al., 2010);
para isolar e purificar possíveis princípios ativos nesta espécie. O composto
isolado foi obtido da fração do caule (CAMPOS et al., 2016).
4.2 Animais:
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeos (pesando entre 20 e 30 g
e com 6 a 8 semanas de vida) criados no Biotério Central da Universidade do
Vale do Itajaí. Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura e
umidade controladas (22 ± 1 °C, 60 a 80% de umidade), em ciclo 12 h claro/12
h escuro, com água e ração fornecidos ad libitum. Os experimentos foram
conduzidos de acordo com as diretrizes atuais de cuidados com os animais de
laboratório e com as diretrizes éticas para investigações de dor experimental em
animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983). Os experimentos foram
realizados após a aprovação do Comitê de Ética da Univali (nº de protocolo
027/2015) e o processo de obtenção de material de estudo obedeceu a
protocolos que orientam os cuidados na investigação experimental em animais
54
submetidos ao estresse físico e mental de acordo com as recomendações do
CONCEA e Lei 11.974 que regulamenta o inciso VII do § 1º do art. 225 da
Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para uso científico de
animais. Os animais foram mantidos no biotério dos laboratórios de
Farmacologia por uma semana antes da realização dos experimentos.
Não houve diferença entre o peso dos animais incluídos nas amostras,
conforme demonstrado na figura 8. Em todos os grupos, os animais pesavam
entre 20 e 30 g. Isto já era esperado, já que todos foram retirados do biotério
obedecendo rigorosamente a data de nascimento, sempre selecionados animais
entre 6 a 8 semanas de vida.
Figura 8: Representação do peso dos animais do experimento.
C e1 e3 e10 e30 e100 co0,1 co1 co10 co40 bus ibu0
10
20
30
40
S. grantii (mg/kg, v.o.)
peso
do
an
imal
(g)
Nota: Entre o grupo controle negativo, nas diferentes doses do extrato e do composto de
S. grantii, e nos grupos controles positivos. C: controle, ext: extrato (1, 3, 10, 30 e 100
mg/kg), c: composto 1 0,1, 1, 10, 40 mg/kg) BUS: controle positivo: buscopan
composto® e IBUP: controle positivo com ibuprofeno. Ausência de significância, total
de 119 animais.
4.3 Modelo de dismenorreia:
Para a indução do modelo de dismenorreia em camundongos, os
mesmos foram selecionados quanto ao ciclo estral em que se apresentavam em
proestro foram tratados com benzoato de estradiol. Benzoato de estradiol (0,01
g/kg/dia) (Zoetis, gonadiol® uso veterinário, licenciado no Ministério
Agricultura sob o número 8821/04, 100mg/100ml), intraperitonealmente (i.p.),
por 3 dias consecutivos. Após o último tratamento, no quarto dia de
experimento, os animais foram desafiados com Ocitocina sintética (UCB Saúde
55
animal licenciada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e abastecimento sob
o número 0697, 0,4UI/animal) para indução do quadro dismenorreico
caracterizado por contorções abdominais. Os animais foram então observados
individualmente por 45 minutos, e o número de contorções abdominais foram
tomados como indicativo de nocicepção.
Os animais tratados após este preparo com estradiol, receberam o
extrato nas doses de 1, 3, 10 30 ou 100 mg/Kg; no grupo tratado com o
composto isolado, estes animais receberam doses de 0,1, 1, 10 ou 40 mg/Kg;
grupos controle-positivo tratados com o ibuprofeno na dose de 7,5 mg/kg ou
com o buscopan composto® na dose de 1,2 mg/kg. A escolha das doses para
cada dia foi aleatória, no mesmo dia foi testado diferentes doses e todos os dias
de teste com o desafio de ocitocina foram incluídos também animais controles,
sempre para ter a certeza da correta padronização do modelo.
Figura 9: (A –D) Demonstração do camundongo em contorção abdominal.
Nota: patas traseiras em extensão, rotação do quadril.
4.3.1 Determinação do ciclo estral no grupo experimental:
Às 08h00min da manhã do primeiro dia de experimento, após a
pesagem e identificação dos animais, ocorreu a coleta do muco vaginal com
auxílio de uma pipeta automática, onde 30 µL de solução salina 0,9% foi
instilado na vagina dos animais e imediatamente coletados para posterior
A B
C D
56
observação em microscópio para determinar o período do ciclo estral e seleção
dos que estavam em proestro para iniciar o tratamento com estradiol. Aqueles
que não estavam em proestro, no dia seguinte, o procedimento de análise do
muco vaginal foi repetido para seleção de novos animais para alocação no
experimento.
A escolha do proestro foi devido ao fato de que neste período ocorrer o
pico de estrogênio, com o desenvolvimento dos folículos ovarianos, ao final
desta fase ocorre a ovulação graças ao pico de LH e logo após o período
menstrual, portanto com a utilização de mais hormônios este período é
potencializado provocando a cólica menstrual. O ciclo estral completo nos
camundongos dura de 4-6 dias (SILVA; SANTOS; DIAS JÚNIOR, 2014).
A determinação do ciclo estral baseou-se na metodologia descrita por
VILELA; SANTOS JÚNIOR; CASTRO E SILVA (2007) e está representada
na figura 10.
Figura 10: Esfregaço vaginal de camundongos, representação de cada fase do
ciclo.
Fonte: Prof.ª. Dra. Cristina Maria Henrique Pinto, CFS/CCB.UFSC, set. /2007.
http://player.slideplayer.com.br/10/2697549/data/images/img3.jpg
57
4.4 Avaliação da atividade inflamatória:
Foi realizada a análise histológica do tecido uterino dos grupos
controles e tratados com extrato de S. grantii e composto 1 para a avaliação das
alterações inflamatórias induzidas pelo processo de dismenorreia. Esta etapa do
trabalho contou com o auxílio da Técnica Cláudia Fernanda da Silva do
laboratório de Histologia do Curso de Odontologia da Univali para o corte das
peças e da Prof.ª. Maria Verônica D`Ávila Pastor para análise das lâminas.
Inicialmente, os tecidos uterinos de animais selecionados de cada
grupo experimental foram isolados por dissecação logo após o experimento,
fixado em formalina tamponada (10%). Após 24 horas, trocou-se o banho para
álcool 70% v/v. Após alguns dias, os órgãos foram desidratados com etanol
graduado em série (100, 95 e 90%, nesta sequencia) e diafanizados em xilol e
então embebidos em parafina para confecção dos blocos para corte. Os tecidos
uterinos foram em seguida, seccionados em cortes não seriados de 5 mm de
espessura utilizando micrótomo, montados em lâminas e corados com
hematoxilina e eosina (H & E). Também realizam-se cortes para o corante de
azul de Toluidina com o intuito de verificar o número de mastócitos. A
avaliação dos tecidos corados foi realizada com um microscópio de luz
(Olympus CBA, Japão), nos aumentos de 100x, 200x e 400x.
Cada corte do tecido uterino cortado de forma transversal e fixado na
lâmina foi considerado um campo, realizaou-se a contagem de 10 cortes de
cada grupo de animais do estudo. No total realizou-se a observacação de 40
campos.
4.5 Avaliação do peso e área dos úteros
Animais escolhidos aleatoriamente, tendo representantes de todos os
tipos de grupos, tiveram os úteros retirados após o término do experimento in
vivo para aferição do peso do órgão em mg e análise da área em mm2. Para a
análise da área os úteros foram posicionados sobre papel milimetrado e
posteriormente fotografados. As imagens foram então analisadas utilizado o
programa Image J.
4.6 Avaliação da atividade locomotora através do Teste do Campo Aberto
(Open Field)
58
O teste de campo aberto, open field, visa investigar entre outras
coisas, a possível influência dos compostos sobre o Sistema Nervoso Central
(SNC) dos animais, especificamente efeitos depressores ou ansiolíticos. Na
prática experimental é utilizado para avaliar substâncias estimulantes ou
depressoras do SNC (DE SOUZA et al., 2003). Para excluir a possibilidade de
o extrato de S. grantii atuar sobre o sistema locomotor dos animais, este
modelo foi utilizado para avaliação. Para isto, foi utilizado um aparato de
acrílico transparente, com 60 cm de diâmetro e borda de 50 cm de altura, com a
parte inferior dividida em 12 quadrantes de igual área (CRUZ et al., 1997;
RODRIGUES et al., 2002; DE SOUZA et al., 2003). Para a realização do
experimento, um grupo de animais foi pré tratado com o extrato S. grantii
30mg/Kg v.o. (n:4) e comparado com controles (n:4). A dose de 30mg/Kg foi
escolhida por ser a dose de resposta eficaz na inibição das contorções no
animal. Após 1h da administração, os animais foram avaliados individualmente
durante 6 min, sendo o número de cruzamentos realizados com as quatro patas
entre as divisões, o parâmetro de análise.
Como um início de pesquisa de parâmetros tóxicos, realizou-se a
pesagem de alguns órgãos desses mesmos animais que participaram do estudo
do teste open Field.
4.7 Análise estatística
Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da
média (E.P.M., 95%), exceto os valores das DI50 (doses da substância que
produziram a resposta em 50% em relação ao grupo controle), que são
apresentadas como a média geométrica acompanhada de seus respectivos
limites de confiança, em nível de 95%. As porcentagens de inibição foram
citadas como a média ± o erro padrão da média da diferença (em porcentagem)
entre as áreas sob as curvas obtidas para cada experimento individual em
relação ao grupo controle correspondente. A análise estatística dos dados foi
realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelos
testes de Dunnett ou Newman-Keuls. Valores de p menores que 0,05 foram
considerados como indicativos de significância. Todas as análises citadas acima
representadas graficamente através do GraphPad Prism Instat® ou GraphPad
PRISM® version 7.0 program. Software, Inc., SanDiego, CA, USA.
59
5 RESULTADOS
5.1 Efeito anti-nociceptivo do extrato e composto isolado.
A resposta de contorção induzida pela ocitocina ocorreu com maior
frequência entre 5 e 30 min após a injeção de ocitocina nas fêmeas pré-tratadas
com estrogênio. As contorções abdominais consistiram principalmente em
contrações da parede abdominal, rotação pélvica, seguida por membros
posteriores em extensão. Observou-se também piloereção, ptose palpebral,
atitude de “freezing”, quando o animal fica em posição estática.
Como se pode observar na figura 7, o extrato metanólico de S. grantii
reduziu significativamente o número de contorções induzidas por ocitocina nos
animais previamente tratados com estrogênio comparado com o grupo controle
(p < 0,001). Este efeito foi dependente da dose, com porcentagens de inibição
de 34,85 ± 9,89 %, 27,29 ± 8,38 %, 62,07 ± 7,19 %, 70,87 ± 6,81 % e 77,71 ±
5,67 % para as doses de 1, 3, 10, 30 e 100 mg/Kg, respectivamente. A DI50 do
extrato calculada foi de 25.8 (12.5 – 49.3) mg/kg.
Os fármacos utilizados como controles-positivos, Buscopan
composto® e Ibuprofeno, utilizados na clínica para processos dolorosos
viscerais, reduziram o comportamento nociceptivo de maneira semelhante, com
inibições de 63,19 ± 10,90 % e 69,13 ± 5,84 %, respectivamente.
A figura 6 B demonstra a estratificação dos resultados das diferentes
doses de extrato comparadas ao grupo controle. Em cada dia de experimento,
escolhia-se diferentes doses a serem testadas, contendo de três a quatro animais
para cada dose escolhida e sempre incluia-se animais controle para a garantia
da correta execucação do modelo de dor.
60 Figura 11 – Efeito anti-nociceptivo do extrato de S. grantii.
C 1 3 10 30 100 BUS IBUP0
5
10
15
20
******
S. grantii (mg/kg, v.o.)
******
***
Nú
mero
de c
on
torç
ões
C 1 3 10 30 100 BUS IBUP0
10
20
30
S. grantii (mg/kg, v.o.)
******
**
***
***
Nú
mero
de c
on
torç
ões
A B
Nota: Em A: Efeito do extrato de S. grantii, administrado oralmente nas doses de 1
mg/Kg (n=10), 3 mg/Kg (n=14), 10 mg/Kg (n=15), 30 mg/Kg (n=12) e 100 mg/Kg
(n=13), sobre o número de contorções abdominais induzidas pela ocitocina. Comparação
desses efeitos com o grupo controle negativo (C) e com o efeito de buscopan
composto® (BUS) (1,2 mg/kg) e ibuprofeno (IBUP) (7,5 mg/kg), controles positivos.
(B) Representação dos valores individuais do resultado apresentado em (A). C: controle,
BUS: controle positivo buscopan, IBUP: controle positivo ibuprofeno. Valores são
média ± E.P.M. diferem significativamente do grupo controle `C` ** p < 0,01 e ***:
p<0,001 (ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de Dunnett).
O composto 1 reduziu significativamente o número de contorções
induzidas por ocitocina nos animais previamente tratados com estrogênio.
Efeito inibitório significativo foi observado em 49,42 ± 10,34%, 61,32 ±
6,64%, 62,19 ± 10% e 65,23 ± 4,59% nas doses de 0,1, 1, 10 e 40 mg/Kg,
respectivamente, administrados por via oral, conforme demonstrado na figura
12. O valor de DI50 foi de 15,01 (5,58-26,29) mg/kg.
A figura 12 B demonstra a estratificação dos resultados das diferentes
doses do composto administrados comparados aos controles, conforme
demonstrado em A.
61
Figura 12 – Efeito antinociceptivos do composto 1.
C 0,1 1 10 400
5
10
15
20
Composto 1 (mg/kg, v.o.)
******
*
**
Nú
mero
de c
on
torç
ões
C 0,1 1 10 400
10
20
30
Composto 1 (mg/kg, p.o.)
***
*****
*
Nú
mero
de c
on
torç
ões
A B
Nota: O composto 1 da planta foi administrado em doses diferentes de 0,1 mg/kg (n=4),
1 mg/kg (n=7), 10 mg/kg (n=5) ou 40 mg/Kg (n=5) 1h antes do desafio com ocitocina e
comparado com o grupo controle negativo (C). B: A estratificação dos resultados. Efeito
do composto de S. grantii em diminuir contorções em animais submetidos ao modelo de
dor tipo DP. Representação do número de contorções sofridas pelo animal após receber
o Estradiol e Ocitocina. C: controle. * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,01. (ANOVA de
uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).
5.2 Análise morfométrica do útero de animais submetidos ao modelo de
dismenorreia.
Demostrou-se que neste modelo de dor nos camundongos, a ocitocina
aumentou significativamente a espessura do miométrio e consequentemente
diminuiu a área do miométrio uterino, em resposta a contração. Esta redução de
tamanho demonstra que os não tratados com o extrato e composto isolado
contraíram mais e por isso tiveram suas áreas diminuídas e comprova que os
animais tratados tinham seus úteros mais relaxados. Como demonstrado na
figura 9, o extrato a partir da dose de 10mg/Kg e o composto 1 a partir já da
primeira dose de 0,1mg/Kg, aumentaram significativamente a área uterina dos
animais. Esta diferença também pode ser observada na macroscopia pelas fotos
dos órgãos uterinos (figura 9) capturadas imediatamente após a retirada desses
órgãos dos animais, para a fixação em formol e confecção das lâminas de
histologia.
62 Figura 13 – Efeito do extrato e do composto 1 de S. grantii sobre a área de superfície do
útero.
C 1 3 10 30 1000
50
100
150
S. grantii (mg/kg, v.o.)
**
***
Áre
a d
o ú
tero
(m
m2)
C 0,1 1 10 400
50
100
150
***
*****
Composto 1 (mg/kg, v.o.)
**
Áre
a d
o ú
tero
(m
m2)
A B
Nota: O extrato administrado oralmente nas doses de 1, 3, 10, 30 e 100 mg/Kg, após a
administração de ocitocina, causou aumento significativo de área de superfície do útero
após a dose de 10 mg/Kg. (B) Efeito do composto de S. grantii, administrado oralmente
nas doses de 0,1, 1, 10 e 40 mg/Kg, sobre a área de superfície do útero após a
administração de ocitocina, este causou aumento significativo a partir da dose de 0,1
mg/Kg. C: controle. Valores são média ± E.P.M. diferem significativamente do grupo
controle `C` ** p < 0,01 e ***: p < 0,001 (ANOVA de uma via seguida do teste post-
hoc de Dunnett). Em anexo estão representadas as fotos dos órgãos uterinos para análise
de área macroscópica em papel milimetrado. Um total de noventa e nove animais
tiveram seus úteros pesados e calculados conforme a área.
5.3 Avaliação histológica do útero com coloração H & E:
Como mostrado na figura 10, o estudo da histomorfologia do útero de
grupos de naïve apresenta a anatomia microscópica normal do tecido uterino de
camundongos, enquanto o grupo controle negativo apresentou edema moderado
a pronunciado na lâmina própria do endométrio, desorganização importante da
arquitetura tecidual com perda de definição da junção das camadas de
endométrio e miométrio, desarranjo de distribuição das glândulas endometriais,
63
até diminuição destas. Observou-se também a presença de células inflamatórias
e mastócitos.
A contração anormal e processo inflamatório uterino também foram
corfirmados pela histopatologia. Houve presença de mastócitos que
posteriormente foi confirmada com a coloração de azul de toluidina das
mesmas peças.
Nos animais tratados com o extrato de S. grantii e nos tratados com o
composto da mesma planta, houve melhora no aspecto celular, observa-se o
endométrio revestido por epitélio cilíndrico simples bem definido nos dois
casos. Estroma preservado, apresenta células com núcleos heterocromáticos
com pouca substância intercelular no asterisco, as glândulas endometriais são
corretamente revestidas por epitélio cilíndrico. Nota-se a definição das camadas
miometriais nestes grupos controles. O endométrio revestido por epitelio
cilíndrico simples está desconfigurado no grupo controle negativo e o estroma
normal apresenta células com núcleos heterocromáticas com pouca substância
intercelular, as glândulas endometriais sao revestridas por epitélio cilíndrico.
64 Figura 14: Fotomicrografia dos tecidos uterinos dos animais do experimento corados
com H.E.
Nota: Nos animais naïve observa-se ausência de edema na lâmina própria,
arquitetura celular preservada com ausência de células inflamatórias. Nos animais
estrogenizados, desafiados com ocitocina e não tratados (grupo controle negativo),
observa-se o edema na lâmina própria, arquitetura celular comprometida com
desarranjo das camadas celulares, perda no número de camadas de células epiteliais,
perda da definição da camada epitelial e entre as camadas endometrial e miometrial,
presença de células inflamatórias e mastócitos. Nos animais tratados com o extrato
de S. grantii e nos tratados com o composto da mesma planta, houve melhora no
aspecto celular, na seta preta observa-se o endométrio revestido por epitélio
cilíndrico simples bem definido nos dois casos. Estroma preservado, apresenta
células com núcleos heterocromáticos com pouca substância intercelular no
asterisco, as glândulas endometriais são corretamente revestidas por epitélio
cilíndrico seta vasada. O miométrio está identificado com M e nota-se a definição
desta camada nestes grupos controles. Na seta preta, observa-se o endométrio
revestido por epitelio cilindrico simples, este está desconfigurado no grupo controle
negativo. Estroma normal, apresenta células com núcleos heterocromáticas com
65
pouca substância intercelular no asterisco, as glândulas endometriais sao revestridas
por epitélio cilíndrico, seta vasada. Aumento de 100x e 400x, este último mostra o
detalhe do edema lâmina própria e mastócitos.
5.4 Avaliação histológica do útero com coloração de azul de Toluidina:
Para a confirmação da existência do processo inflamatório, realizou-se
a contagem de mastócitos por campo nos grupos controle, naive e entre os
grupos tratados com o extrato de S. grantii na dose de 30 mg/kg ou
composto 1 na dose de 1 mg/kg, como estratificado na figura 15 e ilustrado
na figura 16. Realizou-se a contagem dos 10 cortes por grupo de animais,
portanto contou-se 40 cortes no total. Para o realce dos mastócitos no tecido
utilizou-se a coloração de azul de Toluidina.
Figura 15: Número de mastócitos por campo.
0
5
10
15
20
C S. grantii C1 Naïve
***
***Nú
mero
de m
astó
cit
os
Nota: nos cortes dos úteros de animais controle, naive e tratados com o extrato de S.
grantii na dose de 30mg/Kg, v.o. e os tratados com o composto 1 na dose de 1mg/Kg,
v.o. Os asteriscos representam: ***: p<0,001 (ANOVA de uma via seguida do teste
post-hoc de Dunnett).
66 Figura 16: Fotomicrografia dos tecidos uterinos dos animais do experimento corados
com azul de Toluidina.
Nota: A região da lâmina própria apresenta intenso infiltrado inflamatório no grupo
controle, maior ampliacão coradas com azul de toluidina apresentam numerosos
mastócitos ativos, setas (400X).
Figura 17: Detalhe dos mastócitos em aumento de 1000x, no grupo controle.
Nota: Setas indicam os mastócitos.
67
5.5 Relação do peso do útero dos animais
Não houve diferença significativa entre o peso do útero de noventa e
nove animais incluídos nas amostras, conforme demonstrado no Figura 18.
Figura 18: Representação do peso do útero dos animais nas diferentes doses do extrato
e do composto de S. grantii.
C e1 e3 e10 e30 e100 co0,1 co1 co10 co40 bus ibu0
40
80
120
160
S. grantii (mg/kg, v.o.)
peso
do
úte
ro (
mg
)
Nota: C: controle negativo (n=11). Extrato S. grantii: e1 (1mg/Kg, n=10), e3 (3mg/Kg,
n=14), e10 (10mg/Kg, n=14), e30 (30mg/Kg, n=8), e100 (100mg/Kg, n=13). Composto
1: co 0,1 (0,1mg/Kg, n=4), co1 (1mg/Kg, n=7), co10 (10mg/Kg, n=5), co40 (40mg/Kg,
n=5), bus (buscopan, n=3) e ibu (ibuprofeno, n=3). Sem diferença significativa, total de
97 animais com seus órgãos pesados (ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de
Dunnett).
5.6 Efeito do extrato de S. grantii sobre a atividade locomotora
Quando avaliados no teste do campo aberto, o tratamento oral dos
animais com o extrato (30 mg/Kg) comparado com os controles, não foi capaz
de afetar de maneira significativa a atividade locomotora dos animais quando
avaliados 1h após o tratamento como demonstrado na figura 19.
68 Figura 19: Efeito do extrato de S. grantii sobre a atividade locomotora.
0
50
100
150
0
50
100
150
C CS. grantii S. grantii
Controle
S. grantii (30 mg/kg, v.o.)
Nú
mero
de e
levaçõ
es
Nú
mero
de c
ruzam
en
tos
Nota: Observa-se ausência de diferença no comportamento dos animais tanto em
número de elevações do corpo, quanto em número de vezes que estes atravessaram os
campos durante o período determinado.
5.7 Apresentação dos pesos dos órgãos dos animais tratados com S. grantii
comparado com controles
Os órgãos: coração, útero, pulmão, rins, fígado e baço foram
pesados de forma absoluta e relativa. Esses resultados estão representados nas
figuras 20 e 21. Não houve diferença entre os pesos relativos e absolutos,
exceto com relação ao peso do fígado tanto na forma absoluta ou relativa
apresentou-se menor no grupo controle, por ser uma pesquisa preliminar com
pequeno número de animais na amostra, não se pode afirmar que isto seja
conclusivo.
69
Figura 20: Relação do peso absoluto dos órgãos dos animais.
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle
S. grantii (30 mg/kg, v.o.)
*
Coração Útero Pulmões Rins Fígado Baço
Peso
ab
so
luto
(g
)
Nota: Efeito do extrato de S. grantii na dose de 30 mg/Kg, v. o., sobre o peso absoluto
dos órgãos dos animais. Cada coluna representa a média estatística de oito animais. As
barras verticais indicam os erros padrões. Efeito * p < 0,05 (ANOVA de uma via
seguida do teste post-hoc de Dunnett).
Figura 21: Relação do peso relativo dos órgãos dos
animais
0.00
0.02
0.04
0.06
Controle
S. grantii (30 mg/kg, v.o.)
*
Coração Útero Pulmões Rins Fígado Baço
Peso
rela
tivo
(g
)
Nota: Efeito do extrato de S. grantii na dose de 30 mg/Kg, v. o., sobre o peso relativo
dos órgãos dos animais. Cada coluna representa a média estatística de oito animais. As
70 barras verticais indicam os erros padrões. Observar o peso do fígado com * p < 0,05
(ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de Dunnett).
71
6 DISCUSSÃO
A DP é uma condição de elevada prevalência, com incidência maior
nas mulheres mais jovens e surpreendentemente pouca atenção científica foi
dada à dismenorreia primária na comunidade da dor (IACOVIDES et al.,
2015). Sendo assim, é importante causa de perda da produtividade e
absenteísmo escolar, interferindo na vida cotidiana, principalmente nos
primeiros dias da menstruação (OMIDVAR et al., 2016).
O modelo de dismenorreia, utilizado neste estudo, foi proposto
incialmente por Yang et al. (2015) e consiste na estrogenização prévia de
camundongos fêmeos e posterior administração de ocitocina para indução de
contorções abdominais. Neste estudo de Yang; Cao, e colaboradores, 2015,
demonstraram que a dor induzida pela ocitocina em camundongos fêmeos com
estrogenização prévia promoveu um modelo experimental para o estudo da dor
da dismenorreia. Os níveis de Ca²⁺ e NO no útero, bem como a contratilidade
do útero in vitro e os tempos de contorção in vivo são usualmente utilizados
para a avaliação de eficácia de substâncias, sendo o estradiol comumente
utilizado como agente sensibilizador e ocitocina como agente indutor de
contração (LIU et al., 2011). Entretanto, no mesmo estudo de padronização do
modelo de Yang et al., estes compreendem ser impossível observar
características farmacocinéticas em testes com fármacos por este modelo, por
ser um modelo agudo, observando a resposta nociceptiva somente por 30
minutos.
Contrações uterinas induzidas por ocitocina em camundongos
estrogenizados são um modelo comum em estudos in vivo para avaliação de
resposta nociceptiva (SUN et al., 2016). O modelo animal é o ideal para
reproduzir de forma sistêmica as características da dor. Assim a
reprodutibilidade clínica do método é alcançada de forma mais direta quando
comparado com modelos de órgão isolado ou análises in vitro. Estas últimas
são importantes para o complemento do modelo in vivo.
Na China, o modelo de contorção induzida pela ocitocina é um modelo
de dor frequentemente utilizado em camundongos. Este foi usado para avaliar
os efeitos anti-dismenorreia da fitoterapia chinesa, utilizada para prevenir e
tratar a DP desde os tempos antigos (YANG et al, 2015). Este é o primeiro
estudo a avaliar a atividade antinociceptiva de S. grantii em um modelo de dor
visceral. Mesmo amplamente utilizada na medicina popular brasileira, nenhum
relato sobre a atividade antinociceptiva visceral desta planta está registrada na
72
literatura. O estudo de plantas e espécies tradicionalmente utilizadas para o
alívio de dor ainda deve ser visto como uma estratégia de pesquisa lógica na
busca de novos fármacos analgésicos. Em 2006, Hsu, Yang e Yang, analisaram
o mecanismo fisiológico de compostos ativos in vivo e in vitro usualmente
utilizados na medicina Chinesa, e demonstraram possuir efeito antagônico para
a prostaglandina F₂α e acetilcolina. Esta é uma demonstração da comprovação
da eficácia de compostos derivados de plantas para a contrações induzidas em
animais com seu respectivo mecanismo de ação.
O presente estudo demonstrou, pela primeira vez, que S. grantii possui
propriedades anti-nociceptivas. Esses resultados foram comparados com duas
das medicações de uso de referência, o buscopan composto® e o ibuprofeno, e
os resultados foram similares. Estes resultados foram favoráveis para
considerar o extrato metanólico bruto de caules e folhas de S. grantii como uma
importante ferramenta no controle de dor de dismenorreia.
Diante desse resultado pode-se considerar a hipótese de que o extrato
metanólico de S. grantii pode atuar inibindo a síntese de prostaglandinas, uma
vez que este parecer ser o principal mecanismo pelo qual se dá a DP induzida
por ocitocina. O fato da S. grantii ser usada na medicina popular para o
tratamento de doenças inflamatórias corrobora para esta hipótese. Ademais,
estudos demonstram que o extrato bruto da casca apresentou elevada atividade
antioxidante sobre vários sistemas, bem como redução in vitro da atividade da
mieloperoxidase (MPO) humana e um sistema de hemólise ex vivo (MUNHOZ
et al., 2014). Além disso, a administração oral do extrato bruto de casca foi
capaz de reduzir o edema da pata de rato induzido por carragenina de forma
semelhante ao ibuprofeno. Estas atividades biológicas podem estar associadas
com a presença de flavonóides e terpenos. As investigações fitoquímicas
resultaram no isolamento da friedelina e 3β-friedelinol pela primeira vez,
enquanto eufol e lanosterol também foram isolados (MUNHOZ et al., 2014).
O mesmo extrato metanólico de caule e folhas de S. grantii
demonstrou atividade antiproliferativa, com efeito citostático promissor contra
várias linhagens de células tumorais humanas (glioma, mama, rim e pulmão).
Um dos princípios ativos desta planta foi identificado como um éster de
diterpeno de forbol raro, designado por 3,4,12,13-tetraacetil forbol-20-
fenilacetato (1). Resultados demonstraram que as hastes de S. grantii produzem
princípios ativos com potencial ação antiproliferativa (CAMPOS et al., 2016).
O raro éster diterpeno forbol, encontrado no caule, um dos princípios
ativos desta planta identificado e denominado como 3,4,12,13-tetraacetilforbol-
73
20-fenilacetato (figura 22), possui uma porção farmacofórica similar ao
butilbrometo de escopalamina, antiespasmódico utilizado na terapêutica para
dismenorreia (figura 23).
Figura 22: Estrutura química do composto isolado 3,4,12,13- tetraacetilforbol-20-
fenilacetato (1), em destaque a porção similar presente também no butilbrometo de
escopolamina.
Figura 23: Estrutura química do butilbrometo de escopolamina, em destaque a porção
similar presente também no composto 1.
74
Mesmo diante deste dados, as informações biológicas a respeito de
atividade antinociceptiva da planta são escassas. Há relatos sobre algumas
espécies do genêro Synadenium como potentes inibidores da síntese de
prostaglandinas, como a S. cupularis, utilizada como agente antiinflamatório e
como analgésico. Muitas outras plantas pertencentes à família Euphorbiaceae
mostraram atividades farmacológicas, como a Euphorbia kansu, com
propriedades analgésicas e antitumorais, e Euphorbia splendens, que
apresentaram potente atividade anti-inflamatória (OLIVEIRA et al., 2012).
S. grantii Hook é uma planta popularmente conhecida no sudeste do
Brasil. Na medicina popular, seu látex é utilizado para o tratamento de
neoplasias e desordens gástricas como úlceras pépticas (COSTA et al., 2012).
Este látex apresenta potente efeito antiulceroso, além do extrato das folhas ter
demonstrado atividade citotóxica e antiparasitária (CAMPOS, et al., 2016).
Da família Euphorbiaceae são isolados ésteres de forbol, os quais são
membros da família dos diterpenos de tigliane. Estes são compostos
policíclicos nos quais dois grupos hidroxila em átomos de carbono vizinhos são
esterificados em ácido graxos, algumas vezes empregados em pesquisas
biomédicas para ativar a transdução de sinal da enzima proteína quinase C
(PKC) (OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD 2012). A PKC desempenha
um papel central na transdução de sinais gerados através do aumento do
turnover de fosfatidilinositol ou de outras vias que produzem níveis elevados de
1,2-diacilglicerol. Estes sinais desempenham um papel importante na regulação
fisiológica de quase todas as células e estão intimamente envolvidos no
processo de câncer. O papel central da PKC na transdução de sinal e na
regulação da diferenciação e proliferação celular aumenta a possibilidade de
que ativadores ou inibidores seletivos de PKC possam ter como potenciais
agentes terapêuticos na terapia do câncer (SZALLASI; KRAUSZ;
BLUMBERG, 1992). A ligação de esteres de forbol é o primeiro passo na
ativação de PKC. Esta ligação é saturada e ocorre através de interações
específicas dentro do domínio C1 na região reguladora da proteína. As
atividades biológicas dos esteres de forbol são estritamente dependentes da
estrutura, com base nos grupos funcionais presentes. Deste modo, ésteres de
forbol diferentes podem ativar diferentes isoenzimas de PKC nas células e
assim desencadear caminhos diferentes conduzindo a várias respostas incluindo
a formação de tumores, inflamação, diferenciação e apoptose nos tecidos
animais (OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD 2012).
75
Os resultados de Munhoz, Minozzo e colaboradores em 2014 mostram
que a casca do caule de S. grantii tem atividade inibitória sobre a enzima MPO
e ação contra oxidantes graves, tais como O²⁻ e HCl, estes associados à
patogênese de diversas doenças e também à dismenorreia, estudos sugerem que
a oxidação de lipídeos e o estresse oxidativo participa da sua patogênese
(CHEN, 2010). Isto sugere que as propriedades medicinais relatadas por
utilização tradicional pode ser associada aos compostos presentes na S. grantii
e o fato de que estes compostos poderem atuar como reguladores de várias
espécies reativas de oxigênio e também pariciparem da regulação negativa da
resposta inflamatória (BERTONE-JOHNSON et al., 2014). O envolvimento da
inflamação na promoção do tumor tem sido sugerido por vários artigos. Sabe-se
há muito tempo que a aplicação de agentes anti-inflamatórios reduz
significativamente o número de papilomas e carcinomas no modelo clássico de
carcinogênese de pele em camadas múltiplas. Várias linhas de evidência
sugerem que os leucócitos polimorfonucleares podem desempenhar um papel
importante na promoção tumoral (OSKOUEIAN, ABDULLAH, AHMAD,
2012).
Os resultados de exames histopatológicos deste estudo mostraram a
grande diminuição do edema e do processo inflamatório relacionado ao
processo de dismenorreia nos grupos tratados com a S. grantii e a contagem de
mastócitos acrescentou dados mais palpáveis em relação a este aspecto de
proteção anti-inflamatória. Pesquisas relacionadas com mastócitos criam fontes
adicionais de conhecimento que permitem entender a patogenia das doenças
onde essas células são detectadas (RECH; GRAÇA, 2006).
Os mastócitos foram descritos pela primeira vez por de Paul Ehrlich
no século XIX e participam da indução da inflamação aguda e da reparação
tecidual na fase crônica do processo (MENZIES, et al., 2011). Os mastócitos
além de mediarem o processo inflamatório, também podem contribuir com a
dor, isso já foi observado na dor neuropática da endometriose. Acredita-se ser o
resultado de comunicações cruzadas entre mastócitos e neurônios. Assim, seus
mediadores, incluindo a histamina, fator de necrose tumoral (TNF), triptase,
PGs, serotonina, IL-1 e fator de crescimento neuronal (NGF) podem
sensibilizar ou ativar neurônios nociceptivos primários, enquanto que os
neurotransmissores, tais como a substância P ou NGF, podem desencadear a
degranulação de mastócitos. A ativação de mastócitos pode também levar ao
desenvolvimento da dor pelo recrutamento de neutrófilos e macrófagos, que
também liberam mediadores álgicos (MENZIES et al., 2011).
76
O processo completo da fisiopatologia da dismenorreia não é
totalmente compreendido, e consequentemente, a dismenorreia primária
permanece uma desordem mal compreendida e muitas mulheres simplesmente
aceitam como uma parte normal de seu ciclo menstrual (IACOVIDES et al.,
2015; CHEN, 2010). Porém, já está bem estabelecido ser o resultado da
isquemia tecidual causada pela contração do músculo uterino. E todo este
processo é resultante da resposta inflamatória gerada pela liberação de ácido
araquidônico, metabólito da via da cicloxigenase (HAREL, 2006).
O ácido araquidônico é liberado após a queda de progesterona no fim
do ciclo ovulatório, antes da menstruação, e com isto, uma cascata de
prostaglandinas e leucotrienos é iniciada, ocasionando uma elevada produção
de prostaglandinas E₂ e F₂α no útero que, por sua vez, causam vasoconstrição e
contração muscular (GIRALDO; ELEUTERIO JUNIOR; LINHARES, 2008).
Quadros de dismenorreia mais severos têm sido associados a maior quantidade
de níveis de prostaglandinas, principalmente nos primeiros dois dias de
menstruação (PROCTOR; FARQUHAR, 2006).
O uso de plantas medicinais tem sido muito significativo em várias
populações, especialmente no Nordeste do Brasil. Evidência descrevem que
hoje, de todos os fármacos prescritos no mundo, 25% são direta ou
indiretamente obtidos de plantas, e aproximadamente, 49% dos fármacos
desenvolvidos entre os anos 1981 e 2002 foram obtidos de produtos naturais
(BORGES et al., 2012). No entanto, o uso popular ou utilizações tradicionais
não são suficientes para validar medicamentos à base de plantas de forma
eficaz e segura. Por isto é necessário a realização de estudos toxicológicos para
avaliar os parâmetros de segurança.
Em 1976 Roger Short, observou que na sociedade contemporânea, as
mulheres terão muito mais ciclos menstruais do que nas populações ancestrais.
Isso poderia ser pela precocidade da idade na menarca graças à dieta moderna
com maior oferecimento de gorduras, pelo aumento da expectativa de vida e
também pelo menor número de gestações. Uma visão evolutiva aponta este fato
como um importante papel no desenvolvimento da dor pélvica visceral crônica
e deve-se lembrar que a dismenorreia grave é comum na população com dor
pélvica crônica, particularmente entre aquelas com sensibilização a dor
(JARRELL; ARENDT-NIELSEN, 2016). Esta relação explica-se pela
prevalência da dismenorreia primária diminuir de acordo com a paridade de
forma inversa. O mecanismo para tal fato permanece incerto, uma possibilidade
seria pelos nervos adrenérgicos que inervam a musculatura miometrial
77
desaparecerem quase completamente durante a gestação, e pós gestação
somente parte deles regeneram-se (OSUGA et al., 2005).
Esses resultados podem reduzir o prejuízo econômico decorrente do
absenteísmo incapacitante da dismenorreia, bem como fornecer informações
sobre a fisiologia do processo de dor e no futuro melhorar a qualidade da vida
humana.
78
79
7 CONCLUSÃO
O modelo in vivo de dismenorreia em camundongos obtido através da
indução com ocitocina em animais pré-tratados com estrogênio recapitula a
fisiopatologia e características clínicas da DP, fornecendo um modelo
experimental para estudar a dor abdominal dismenorreica.
Os parâmetros nociceptivos dos animais submetidos ao modelo
puderam ser avaliados e houve diferença significativa entre os grupos tratados e
controles.
Quanto aos parâmetros inflamatórios teciduais entre camundongos
com ou sem o desenvolvimento da dismenorreia, não houve diferença
estatística no infiltrado leucocitário quanto a mieloperoxidase. Isto pode ser
pelo modelo agudo do processo de tratamento e sacrificação dos animais
imediata.
As características morfológicas do útero de camundongos submetidos
ao modelo de dismenorreia através de análise histológica, demonstrou grande
diferença na análise microscópica, principalmente em relação ao edema e
processo inflamatório caracterizado de forma mais pronunciada no grupo não
tratado com o extrato. A contagem de mastócitos por campo comprovou a
diminuição do processo inflamatório obtido com o tratamento de S. grantii.
Com estes dados demonstrou-se que houve diferença no padrão deste
importante marcador inflamatório.
Estes resultados, apontam a S. grantii como uma promissora planta
para o alívio da dismenorreia. Porém, novos estudos são necessários para
entender melhor seu mecanismo de ação.
No entanto, os modelos experimentais de doença têm pontos fracos e o
de DP não é exceção. O modelo experimental usado é um modelo animal agudo
e a resposta de contorção apenas permanece por cerca de 40 min. É impossível
observar as características farmacocinéticas dos fármacos no teste por este
modelo. Portanto, existem limitações para este estudo e no futuro estas poderão
ser solucionadas com o uso de métodos complementares.
Com a conclusão dos testes de orgão isolado, onde serão testados as
doses do extrato e composto em questão, poderemos fornecer mais respostas
sobre o efeito famacológico.
80
81
8 PERSPECTIVAS
Como dados preliminares, demonstrou-se a contratilidade uterina
através do estímulo com ocitocina em animais estrogenizados. Este estímulo foi
repetido após a lavagem das preparações de útero isolado e no segundo
momento também se obteve a mesma resposta de contratilidade uterina. A
ocitocina foi capaz de aumentar as contrações tanto em amplitude como em
frequência, conforme demonstrado na figura S1.
0
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
Am
pli
tud
e d
e o
nd
a (
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LB
Co
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Ocit
. 1
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B
Lav.
Co
nt.
Ocit
. 1
Ocit
. L
B
Ocitocina 1 Lavagem
Ocitocina 2
82
Figura S1: Representação da resposta contrátil de preparações de útero no equipamento
de órgão isolado. Início em repouso, primeiro aumento de linha de base (LB), primeira
administração de ocitocina (Ocito 1) no banho de órgão isolado, amplitude máxima de
contração está representado em Ocito 2. Após 15 min. da administração de ocitocina as
preparações foram lavadas (Lav.), as amplitudes de ondas diminuíram e após 15min. as
preparações foram reexpostas à ocitocina administração de ocitocina foi adicionada ao
banho e novamente o miométrio respondeu aumentando a amplitude de onda
representando contração.
83
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