FFI0776�FFI0776��� Modelagem�e�Modelagem�e�ggEngenharia�de�ProteínasEngenharia�de�Proteínas

Prof. Rafael V. C. GuidoProf. Rafael V. C. GuidoProf.�Rafael�V.�C.�GuidoProf.�Rafael�V.�C.�Guidorvcguido@ifsc.usp.brrvcguido@ifsc.usp.br

Aula�02Aula�02Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�Biomoleculares

Instituto�de�Física�de�São�Carlos�Instituto�de�Física�de�São�Carlos��� USPUSP

ObjetivosObjetivos

• Obtenção�e�determinação�estrutural�de�proteínas– Cristalografia�de�raios�X�(Xtal)g ( )– Ressonância�Magnética�Nuclear�(RMN)– Crio microscopia Eletrônica (Cryo EM)– Crio�microscopia�Eletrônica�(Cryo EM)

Ob ã d i ãOb ã d i ãObtenção�e�determinação�Obtenção�e�determinação�estrutural de proteínasestrutural de proteínasestrutural�de�proteínasestrutural�de�proteínas

Biologia�Molecular�Biologia�Molecular�–– Obtenção�de�proteínasObtenção�de�proteínas

A�Biologia�Molecular�é�o�estudo�da�Biologia�em�nível�molecular,�com�especial�foco�no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressãono�estudo�da�estrutura�e�função�do�material�genético�e�seus�produtos�de�expressão�(proteínas).

Estratégias:l– clonagem

– expressão

Purificação�de�proteínasPurificação�de�proteínasA�purificação�de�proteínas�é�uma�série�de�processos�que�têm�em�vista�o�isolamento�de�um único tipo de proteínas de uma mistura complexa A purificação de proteínas éum�único�tipo�de�proteínas�de�uma�mistura�complexa.�A�purificação�de�proteínas�é�vital�para�a�caracterização�da�função,�estrutura�e�interações�da�proteínas�de�interesse.�O�material�inicial�é�normalmente�um�tecido�biológico�ou�uma�cultura�microbiana�(nativa�ou�recombinante).�

Os passos de separação exploram as diferenças no Estratégias:�(pureza�>�97%)Os�passos�de�separação�exploram�as�diferenças�no�tamanho�da�proteína,�as�propriedades�físico�químicas�(hidrofobicidade,�estado�de�

g (p )– Ensaios�Enzimáticos;– Determinação�Estrutural

protonação)�e�afinidade�de�ligação.ç

Cinética�EnzimáticaCinética�Enzimática

A�cinética�enzimática�estuda�as�reações�químicas�catalisadas�pelas�enzimas,�em�ti l l id d d ã O t d d i éti d i itparticular,�a�velocidade�de�reação.�O�estudo�da�cinética�de�uma�enzima�permite�

elucidar�os�detalhes�do�mecanismo�catalítico,�função�no�metabolismo,�modulação�da�atividade�na�célula.�Além�disso,�fornece�as�bases�para�os�estudos�de�inibição�por��, p ç pmoléculas�bioativas�(e.g.,�fármacos�e�agroquímicos).

E�+�S� E•S E�+�P�

Exemplo�de�determinação�de�Exemplo�de�determinação�de�KKMM Estratégias�para�resolução�estruturalEstratégias�para�resolução�estrutural

Expressão�e�ifi ã d

Expressão�e�purificação�da proteína marcadapurificação�do�

produto�gênicoda�proteína�marcada�(e.g.,�C13,�N15)

Cristalização�e�difração�de�raios�X

Aquisição�de�dados�de RMNde�RMN

Cl dClonagem�do�gene

Determinação�estrutural�e�refinamento�do�modelo

refinamento�do�modelo�por�restrições�espaciais.

Cristalografia�de�ProteínasCristalografia�de�ProteínasCristalizaçãoCristalização

Experimentos�de�triagem�de�cristalização�empregam tipicamente uma buscaempregam�tipicamente�uma�busca�convencional�de�múltiplos�parâmetros�de�protocolos�nas�técnicas�de�gota�suspensa�(difusão�de�vapor),�com�otimização�via�utilização�de�aditivos�que�são�rotineiramente realizados em umarotineiramente�realizados�em�uma�câmara�termoestável��a�4�ou�18ºC

Estratégias:T i ( l ã f i l)– Triagem�(solução�fatorial)

– Otimização�da�condição

CristalCristalUm�cristal�é�um�sólido�no�qual�os�constituintes�(e.g.,�átomos,�moléculas�ou�íons) estão organizados num padrão tridimensional bem definido que se repete

Características

íons)�estão�organizados�num�padrão�tridimensional�bem�definido,�que�se�repete�no�espaço,�formando�uma�estrutura�com�uma�geometria�específica

• Estrutura�altamente�ordenada;• Alta�resolução;ç• Precisão�da�posição

dos�átomos;

Difração�da�luzDifração�da�luz

3° álbum�mais�vendido�de�todos�os�tempos�no�mundo�inteiro(~�40�milhões cópias)

Os�mais�vendidos�do�mundoOs�mais�vendidos�do�mundo

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Cristalografia�de�raios�XCristalografia�de�raios�X

A�cristalografia�é�o�ramo�da�ciência�que�estuda�as�propriedade�dos�cristais,�a�sua�

R t ã áti d dif ã

formação�e�interação�com�os�fatores�físicos,�químicos�e�ambientais.

Representação�esquemática�da�difração�de�raios�X

feixe�de�raio�X

Moléculas�no�cristalcristal

Padrão�de�difraçãoPadrão�de�difração

• raios�X difratados pela densidade eletrônica dosraios X�difratados�pela�densidade�eletrônica�dos�átomos�da�amostra.

Cristalografia�de�Proteínas�Cristalografia�de�Proteínas�–– EtapasEtapas

1 Análise dos Dados Experimentais1. Análise�dos�Dados�Experimentais– Verificar�a�qualidade�dos�dados�experimentais�

(e.g.,�grupo�espacial,�resolução,�I/�I,�Rfactor,�( g g p p ç factorredundância,�No.�de�reflexões,)

2. Determinação�das�Fases�Experimentais– Substituição�Isomórfica�

(átomos�pesados�� e.g.,�Se,�I,�Zn)– Substituição MolecularSubstituição�Molecular�

(e.g.,�proteínas�homólogas)3. Interpretação�do�Mapa�de�Densidade�e�Refinamento– Refinamento�no�Espaço�Real/Recíproco

4. Validação�da�Estrutura5. Depósito�no�Banco�de�Dados�de�Proteínas�(PDB)

Cristalografia�de�Proteínas�Cristalografia�de�Proteínas��� ExemploExemplo Mapa�de�densidade�eletrônicaMapa�de�densidade�eletrônica

Mapa�de�densidade�eletrônicaMapa�de�densidade�eletrônica ResoluçãoResolução dada EstruturaEstrutura

• Qualidade do cristal;• Qualidade do�cristal;• Certeza�da�localização�de�um�grupo�químico�no�espaço;

• Menor�o�valor�em�Å�maior�a�resolução�da�estrutura

Coleta�de�Dados�Coleta�de�Dados�–– “In�“In�househouse”” Laboratório�Nacional�de�Luz�Síncrotron�Laboratório�Nacional�de�Luz�Síncrotron��� LNLSLNLS

• A�única�fonte�de�luz�síncrotron�do�Hemisfério�Sul;• Brasil�é�um�dos�14�países�que�dominam�este�tipo�de�

tecnologia;g ;• Investimento�de�US$70�milhões�financiado�pelo�

CNPq�e�MCT;• Inaugurado em 2 de julho de 1997;• Inaugurado�em�2�de�julho�de�1997;

Campinas�� SP

No LNLS, cientistas fazem pesquisaspara ampliar o conhecimento sobre

á lé los átomos e as moléculas.

LNLS�LNLS�–– MX1�e�MX2MX1�e�MX2 Cristalografia�de�ProteínasCristalografia�de�Proteínas

RMN�de�ProteínasRMN�de�ProteínasRessonância��Magnética�Nuclear�(RMN)Ressonância��Magnética�Nuclear�(RMN)

Ressonância�magnética�nuclear�é�uma�gtécnica�que�permite�determinar�propriedades�de�uma�substância�através�da�correlação�entre�a�energia�absorvida�contra�a�frequência,�na�faixa�d h t (MH )de�megahertz�(MHz)�

Características:Determinação de proteínas em– Determinação�de�proteínas�em�solução

– Indicação da dinâmica da proteínaIndicação�da�dinâmica�da�proteína�(e.g.,�mudanças�conformacionais,�enovelamento,�interações)

Ressonância��Magnética�Nuclear�(RMN)Ressonância��Magnética�Nuclear�(RMN)

• Proteína marcada com isótopos• Proteína�marcada�com isótopos• Aumento da�sensibilidade�e�resolução

• Diminuição da�complexidade�ç pdo�espectro�de�RMN

• Isótopos estáveis mais utilizados:Isótopos estáveis�mais�utilizados:• 13C

15N• 15N�• 2H�(deutério)

RMN�RMN�–– EtapasEtapas

1. Produção da Proteína Marcada com Isótopos1. Produção�da�Proteína�Marcada�com�Isótopos2. Coleta�de�Dados�

Assinalamento dos valores de ressonância– Assinalamento�dos�valores�de�ressonância�(e.g.,�1H,�13C,�15N)Informação espacial sobre os átomos próximos (< 5 Å)– Informação�espacial�sobre�os�átomos�próximos�(<�5�Å)�(e.g.,�1H–1H�NOE;�1H–15N�HSQC,�TROSY)

– Assinalamento de sequências específicas– Assinalamento�de�sequências�específicas3. Refinamento�das�soluções

Cál l d E– Cálculo�das�Estruturas– Obtenção�de�Modelos�Múltiplos

4. Validação�da�Estrutura5. Depósito�no�Banco�de�Dados�p

de�Proteínas�(PDB)

RMN�RMN�–– Assinalamento�(1D)Assinalamento�(1D)

UbiquitinaUbiquitina (8,5�(8,5�KdaKda –– 76�resíduos)76�resíduos)qq ( ,( , ))

RMN�RMN�–– Assinalamento�(2D)Assinalamento�(2D)

Integração�de�RMN�e�Integração�de�RMN�e�XtalXtal

P t íP t í��Solubilidade

Proteína�(Solubilidade�>�1�mM)

Proteína�(Solubilidade�>�1�mM)

��Estabilidade

< 60 Kda< 60 Kda > 60 KDa> 60 KDa�60�KdaMarcação�15N�60�Kda

Marcação�15N>�60�KDa>�60�KDa

Det.�do�Estado�de�Agregação

Det.�do�Estado�de�Agregação

Det.�do�Estado�de�Enovelamento

Det.�do�Estado�de�Enovelamento XtalXtalAgregaçãoAgregação EnovelamentoEnovelamento

<�20KDaDupla��Marcação�(15N,�13C)

<�20KDaDupla��Marcação�(15N,�13C)

>�20�KDaTripla�Marcação�(15N,�13C,�1H)

>�20�KDaTripla�Marcação�(15N,�13C,�1H)

RMN�de�ProteínasRMN�de�Proteínas XtalXtal x�RMNx�RMN

Estrutura�da�Enzima�Tioredoxina Humana�resolvida�por�Xtal e�RMN

Xtal1ert.pdb

RMN3trx.pdb1ert.pdb 3trx.pdb

XtalXtal x�RMNx�RMN

Xtal RMN

Resolução atômica Boa razoávelRaramente FrequentementeHidrogênios Raramente

determinadosFrequentemente

determinadosTamanho da Molécula Sem restrição < 40 KDaç

Dinâmica Um estado conformacional

Múltiplos estadosconformacionais

Proteínas de Membrana Problemático Problemático

P di L LProcedimento Longo Longo

Banco�de�Dados�de�ProteínasBanco�de�Dados�de�Proteínas

Estruturas�de�proteínas�no�PDBEstruturas�de�proteínas�no�PDB08/2010

08/2011 8.28508/2011

08/2012 8.381

No.�Proteínas�e�Métodos�Experimentais�No.�Proteínas�e�Métodos�Experimentais�

í í íMétodo Experimental No. de Proteínas08/2010

No. de Proteínas08/2011

No. de Proteínas08/2012

Raio X 54 099 61 365 68 559Raio X 54.099 61.365 68.559RMN 7.412 7.882 8.347Microscopia Eletrônica 203 254 305Microscopia Eletrônica 203 254 305Hibrido 21 40 44Outros 125 133 141Outros 125 133 141Total 61.860 69.674 77.396

7.814 7.722

Estruturas�no�PDBEstruturas�no�PDB PerspectivaPerspectivaPerspectivaPerspectivaMicroscopia EletrônicaMicroscopia EletrônicaMicroscopia�EletrônicaMicroscopia�Eletrônica

Microscopia�EletrônicaMicroscopia�Eletrônica CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica

Criomicroscopia eletrônicaCriomicroscopia eletrônica• Visualização�de�complexo�

macromoleculares�( ã í í(e.g.,�interação�proteína�proteína,�prteína�DNA,�proteína�RNA,�síntese de prteína);síntese�de�prteína);

• Estruturas�cristalinas�são�úteis,�mas�não�necessárias;

• Não�existe�limite�de�tamanho�molecular�(e.g.,�ribossoma,�vírus);Q id d d• Quantidade�pequena�de�amostra�necessária�para�análise;

• Análise de moléculas em seu ambiente• Análise�de�moléculas�em�seu�ambiente�natural�(e.g.,�condições�fisiológicas);

• Baixa�resolução�(30–3�Å)

CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica

Amostra

Projeção�das�imagens�orientadasorientadas

Média�das�imagens�2D

Transformada�de�FourierFourier

Transformada deTransformada�de�Fourier�3D

Reconstrução�do�modelo 3Dmodelo�3D

CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica

PNAS,�2011,�108,�4817–4821

CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica

NSMB, 2011, 18,���715�721

PNAS,�2007,�105,�1494–1498

Journal of Virology,�1999,�73,�3210�3218

PNAS 2011 108 1355 60PNAS,�2011,�108,�1355�60.

Unidade�assimétrica