Manual de Microbiologia de Alimentos

7/29/2019 Manual de Microbiologia de Alimentos

1/24

UNIVERSIDADE ESTADUAL DEFEIRADE SANTANA

ENGENHARIA DE ALIMENTOS BACHARELADO EMCINCIAS BIOLGICAS

Manual da DisciplinaMICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Professora:

Elinalva Maciel Paulo

Carga Horria:Terica 30 hPrtica 30 h

Feira de Santana Bahia2005.1


2/24

2. PLANO DE DISCIPLINA

2.1 EMENTAIntroduo microbiologia dos alimentos. Crescimento bacteriano. Tcnicas

microbiolgicas aplicadas microbiologia dos alimentos. Ecologia microbiana dos alimentos.Contaminao e deteriorao dos alimentos. Toxinfeces alimentares. Conservao dosalimentos. Controle microbiolgico de alimentos. Padres microbiolgicos e APPCC.

2.2.1. Objetivo GeralAo final do curso os alunos devero conhecer os fatores intrnsecos e extrnsecos que

controlam o desenvolvimento microbiano dos alimentos, os principais microrganismosdeteriorantes dos alimentos e a sua influncia na sade do consumidor,bem como osmtodos de anlises.

2.2.2. Objetivos Especficos

Fornecer aos alunos conhecimentos sobre os tipos de microrganismos de interesseem alimentos;

Mostrar os diferentes fatores que contribuem para a colonizao dos microrganismosnos alimentos,

Conhecer os principais microrganismos deteriorantes e patognicos encontrados nosalimentos, Ressaltar a importncia da escolha do mtodo do controle do crescimento

microbiano no alimento.

2.3. CONTEDO PROGRAMTICO

PROGRAMA TERICO

I UNIDADE01- Importncia dos microrganismos nos alimentos02- Fatores extrnsecos que controlam o crescimento bacteriano03- Fatores intrnsecos que controlam o crescimento bacteriano

04- Bactrias patognicas transmitidos prelos alimentos: Enterobactrias (Salmonella, ShigellaeEscherichia), Vbrios, Yersnia,Campylobacter

05- Bactrias patognicas transmiotidas pelos alimentos: Listria, Staphylococcus aureus,Clostridios, Bacillus

06- Protozorios transmitidos pelos alimento:07- helmintos transmitidos pelos alimentos ,08-vrus transmitidos pelos alimentos,09- Micotoxinas

II UNIDADE01- Microrganismo indicador- Amostragem, padres microbiolgicos02.Deteriorao de carne, frango, ovos e pescados

03- Deteriorao microbiana de cereais, farinhas, produtos lcteos e doces04- Conservao dos alimentos mtodos fsicos05- Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos06- Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos07- GMP, PPHO, HACCP


3/24

PROGRAMA PRTICO

I UNIDADE01- Montagem de materiais para esterilizao / Preparo de Meios de cultura02- Reaes tintoriais: colorao de Gram,03- Reaes tintoriais: colorao de esporos: Wirtz Conklin04- Tcnicas de semeadura05- Prepara de amostras de alimentos para anlises: diluio e plaqueamento06- Contagem de Bactrias mesfilas, psicrotfilas e termfilas,07- Esterilidade comercial08- Contagem de bolor e levedura, Esterilidade comercial

II UNIDADE01- Avaliao da qualidade do leite - (teste da fervura, teste do lcool teste do azul de

metileno)02-Contagem de coliformes a 37 C e a 45 C03- Contagem de Staphylococcus coagulase positiva04- Contagem de Bacillus cereus05- Contagem de Clostridios sulfito redutor06- Deteco de Salmonella

07- Deteco de vibrios08- Microrganismos presentes em produtos comerciais

2.4. MTODOAulas expositivas induzindo os alunos a discusso, pesquisas em artigos cientficos,realizao de seminrios e realizao de prticas relacionadas com os assuntos tericos.

2.5.RECURSOS DIDTICOSPara as aulas expositivas: quadro, transparncias e multimdia.Para as aulas prticas: vidrarias, meios de cultura, corantes , reagentes e microrganismosteste.

2.6. AVALIAO

Provas escritas com questes objetivas e subjetivas acerca do contedo tericoRelatrios das aulas prticasSeminrio

2.7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

BSICAFRANCO, B. G. M. Microbiologia dos Alimentos. So Paulo, ed. Atheneu, 1999JAMES, M. J. Microbiologia moderna de los alimentos. Zaragoza(Espana): Acribia, 4 ed.1994SIQUEIRA, R.S. Manual de microbiologia de Alimentos, EMBRAPA. Centro Nacional sePesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos (Rio de Janeiro). Braslia: EMBRAPA.SPI, Rio de Janeiro EMBRAPA_CTTA, 1995.

SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A. ;SILVEIRA, N. F. A. Manual de mtodos de anlisemicrobiolgica de alimentos, So Paulo, Varela, 1997

COMPLEMENTARAMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for themicrobiological examination of foods3 ed. New York: Vanderzant, 1992.FRAZIER, W. C.WESTHOF, D. C. Food Microbiology, 4o ed McGraW-Holl, p. 17-58, 1988.BOURGEOIS, C. M E LARPENT, J. P. Microbiologia alimentaria. Zaragoza: acribia, 1995.ICMSF. Mtodos de muestra para analisis microbiolgicas: principio e aplicaesespecficas. Zaragoza: Acrbia, 1995


4/24

3. PLANO DE AULA

N.AULA/DIA CONTEDO RECURSOS UTILIZ

01/02

11/10

11-15/10

T Microrganismos de interesse em alimentos: prions, vrus, bactrias,

fungos, protozorios e helmintos

P Montagem de materiais para esterilizao / Preparo de Meios decultura

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.

Materiais: materiais de labo

03/0418/10

18-22/10

T- Fatores extrnsecos que controlam o crescimento bacteriano

P Reaes tintoriais: colorao de Gram,

Materiais: Quadro branco,piloto,retroprojetor.

Materiais: materiais de labo05/0625/10

25-29/10

T Fatores intrnsecos que controlam o crescimento bacteriano

P Reaes tintoriais: colorao de esporos: Wirtz Conklin

Materiais: Quadro branco,piloto,retroprojetor.

Materiais: materiais de labo07/08

01/11

01-05/11

T- Toxinfeco alimentar: Enterobactrias (Salmonella, ShigellaeEscherichia), Vbrios, Yersnia, Campylobacter

P- Tcnicas de semeadura

Materiais: Quadro branco,piloto,retroprojetor, Data sho


09/10

08/11

08-12/11

T - Toxinfeco alimentar: Listria, Staphylococcus aureus, Clostridios,

Bacillus

P Prepara de amostras de alimentos para anlises: diluio eplaqueamento

Materiais: Quadro branco, pretroprojetor. Data show.


11/12

22/11

T- Protozorios transmitidos pelos alimentos: helmintos transmitidos

pelos alimentos , vrus transmitidos pelos alimentos, Micotoxinas

P- Contagem de Bactrias mesfilas, psicrotfilas e termfilas,

Materiais: Quadro branco,piloto,retroprojetor. Data sho


13/14

29/11

T I AVALIAO ESCRITA

P- Contagem de bolor e levedura, Esterilidade comercial

Materiais: Prova impressaMateriais: materiais de labo

15/16

06/12

T Microrganismo indicador- Amostragem, portaria RCD no 12-

01/02/2001- (ANVISA)

Materiais: Quadro branco,piloto,retroprojetor.Materiais: materiais de labo


5/24

P Avaliao da qualidade do leite - (teste da fervura, teste do lcool

teste do azul de metileno)

- Esterilidade comercial

17/18

13/12

T Deteriorao de carne, frango, ovos e pescados

P anlise microbiolgica de pratos prontos base de pescados crus

(sushi, sashmi, etc.): Coliformes a 45 , Estaf. Coag.positiva, Vbrio

parahaemolyticus, Salmonella

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.Materiais: materiais de labo

19/20

20/12

T Deteriorao microbiana dos vegetais

P- nlise microbiolgica de hortalias: Coliformes a 45 C, Salmonella

sp., contagem de mesfilos


21/22

07/02/06

T Deteriorao microbiana de cereais, farinhas, produtos lcteos e

doces

P nlise microbiolgica da granola: B. cereus, coliformes a 45 C,estaf. Coagulase positiva, Salmonella

Materiais: prova impressaMateriais: materiais de labo

23/24

14/02/06

T Conservao dos alimentos mtodos fsicos

P Anlise microbiolgica da lingia: Coliformes a 45 C, Salmonella,Clostrdio sulfito redutor


25/26

21/02/06

T Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicosP- Anlise microbiolgica do queijo de coalho: Coliformes a 45 C,Salmonella, Staphylococcus aureus


27/28

08/03

T GMP, PPHO, HACCPP Microrganismos presentes em produtos comerciais


29/30

15/03

II AVALIAO ESCRITA Materiais: Prova impressaMateriais: materiais de labo


6/24

4. INSTRUES GERAIS DA DISCIPLINA E DO LABORATRIO

1. Estudar previamente a aula prtica a ser realizada;2. Ser pontual no horrio previsto para incio das aulas;3. Trabalhar com ATENO, CALMA e seguir sempre o roteiro de aula;4. Solicitar aos professores esclarecimentos sobre todas as dvidas;

5. Usar somente os materiais de sua prpria bancada;6. Cuidado para no contaminar reagentes e solues;7. Ter o mximo de cuidado para evitar acidentes consigo e com os colegas. Caso

ocorra, avise imediatamente o professor. O laboratrio no lugar parabrincadeiras;

8. obrigatrio o uso do jaleco (avental) em todas aulas prticas.

NORMAS DE BIOSSEGURANA APLICADAS DISCIPLINAO fundamento bsico da biossegurana assegurar o avano dos processos tecnolgicos eproteger a sade humana, animal e o meio ambiente (Ministrio do meio Ambiente).

O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejada previne a exposio

indevida a agentes considerados de risco sade e sem dvida evita acidentes. A esseprocedimento denominamos boas prticas de laboratrio. As prticas de biosseguranabaseiam-se na necessidade de proteo ao operador, seus auxiliares e a comunidade localcontra riscos que possam prejudicar a sade, assim como proteger o local de trabalho, osinstrumentos de manipulao e o meio ambiente.

Manipular com biossegurana, os organismos considerados contaminantes, so regidos porleis federais, estaduais e municipais.

1-A permanncia dos alunos no laboratrio de aula prtica de microbiologia ser apenaspermitida mediante o uso de avental ou jaleco. O avental dever estar sempre devidamenteabotoado;2-No trabalhar com calados abertos;

3-

A entrada dos alunos no laboratrio ser apenas permitida aps a autorizao dosprofessores responsveis;4-No se alimentar, beber ou fumar no laboratrio;5-Trabalhar com seriedade, evitando brincadeiras;6-Nunca pipetar com a boca. Usar, sempre que possvel, pipetadores automticos ou prasde borracha;7-Evitar conversar durante a manipulao de cultura de microrganismos;8-No usar microscpio, caso esteja com conjuntivite;9- Comunicar imediatamente ao responsvel pela aula prtica, caso ocorra algum acidentecomo derramamento de cultura bacteriana ou quebra de vidraria;10-Observar os locais corretos para o descarte do material;11-Lavar as mos ao termino da aula, mesmo que no tenha trabalhado com cultura demicrorganismos;

12- Em caso de dvida, em qualquer situao, solicitar orientao ao professor.

LABORATRIO E INSTRUMENTAL

1- IntroduoTodo laboratrio bacteriolgico, seja qual for a sua finalidade, deve obedecer a um conjunto denormas gerais, as quais so sempre comuns.Deve possuir amplitude suficiente para abrigar comodamente os mveis, aparelhos einstrumental necessrio. Paredes e pisos devem ser recobertos de material impermevel, defcil limpeza e as mesas devem ser resistentes a ao de substncias qumicas. A iluminaonatural ou artificial tem que ser abundante e difusa. As correntes de ar devem ser evitadas e aventilao tem que ser controlada, a fim de que possa ser totalmente eliminada, quando

necessrio.


7/24

UEFS

7

2 - Instrumental indispensvel o conhecimento do instrumental especializado exigido no trabalhobacteriolgico, sendo a maioria de vidro e de outros materiais diversos.

2.1 - Tubos de ensaioExistem tubos de ensaio de diversos tamanhos e formatos: Tubos grossos (20 x 200 mm), tubosfinos (12 x 180 mm), tubos de hemlise (10 x 90 mm), Tubo de Durham (5 x 30 mm).

2.3 Pipetas (graduadas , de Pasteur e micropipetas)

2.4 FrascosBales, Erlenmeyer, Kitasato, frascos tipo conta gotas, provetas, clice (vasos cnicos), Becker(copo graduado), garrafa de Roux

2.5 Vidrarias DiversasPlacas de Petri, ala de Drigalsky, Funil, Gral e pistilo, lmina de vidro, lmina escavada,lamnula, cristalizadores, basto de vidro, lmpada a lcool, etc.

2.6 InstrumentalAla de platina, Fio ou agulha de platina, estantes para tubos de ensaio, galerias ou placa deMalassez, swab, esptulas, pinas, etc.

2.7 AparelhosBalana simples, balana de preciso ou analtica, estufa bacteriolgica, estufa de esterilizao,autoclave, banho Maria, microscpio, centrifuga, potencimetro, contador de colnias, filtroSeitz, bico de Bunsen, micro - incinerador, destilador. indispensvel no laboratrio: capela de fluxo laminar, gua corrente, caneta vidrogrfica, guadestilada, papel kraft, cordo, fita adesiva, algodo hidrfilo e hidrfobo.


8/24

UEFS

8

ROTEIRO 1

PREPARO DE MATERIAIS PARA USO NOS TRABALHOS DE MICROBIOLOGIA

Os materiais utilizados nos trabalhos do laboratrio de microbiologia, devem estar devidamentelimpos e esterilizados. Para tanto, faz-se necessrio o uso rigoroso de tratamentos que

possibilitem a perfeita esterilizao dos materiais, que vo desde sua lavagem at aesterilizao propriamente dita.

LAVAGEM DE VIDRARIAS

As pipetas, frascos, placas de Petri, erlenmyers, etc. devem ser imersos em soluosulfocrmica concentrada, a qual capaz de dissolver qualquer sujeira, e depois lavadas comsabo neutro ( a fim de no formar resduos que podero interferir no crescimento dosmicrorganismos) e enxaguados com gua destilada ( para que no fixe os minerais presentesna gua comum).

Lavagem de lminas e lamnulas

Ferver as lminas e as lamnulas com uma soluo de bicromato de potssio a 5% durantecerca de 1/2 hora. Adicionando a cada 10 min. Um pouco de cido sulfrico concentrado. Lavarabundantemente em gua destilada e conservar em lcool 95o at o momento do uso.

PREPARO DAS VIDRARIAS PARA ESTERILIZAO

As vidrarias depois de lavadas de maneira adequada, devem se esterilizadas, obedecendo osseguintes procedimentos: os tubos, bales e outros devem ser embuchados com rolhas dealgodo hidrfobo (no absorve gua). A rolha de algodo deve ser suficientemente, porm nomuito apertada. Sobre os tampes de algodo coloca-se cartuchos de papel.As tampas das placas de Petri devem ser munidas de um disco de papel de filtro. Traar com atampa da placa um crculo sobre o papel de filtro, corta-lo, aplica-lo contra a face interna datampa e ajusta-la bem. A funo deste papel de filtro, de absorver as gotculas de gua que se

evaporam da superfcie do meio de cultura. As placas de Petri devero ser envolvidas em papelou acondicionadas em recipientes apropriados. As pipetas devem ser providas de algodo naextremidade destinada aspirao e enroladas em papel ou guardadas em recipientesapropriados. Os outros objetos ( ala de Drigalsky, pina, bisturi, tesoura, basto de vidro,etc.)devem ser mergulhados em uma soluo de lcool iodado e flambados no momento do uso,repetindo este processo trs vezes.

ESTERILIZAO DE VIDRARIAS

As vidrarias sero esterilizadas no forno a 160o C , durante 2 horas ou 180/ 1 h. Deixar o fornoesfriar antes de abrir, pois o contrrio poder haver quebra de materiais devido a mudanabrusca de temperatura. Vidrarias especiais que no puderem ser esterilizadas pelo calor (balestarados e pipetas de preciso) sero tratadas por processos qumicos (sublimados a 1 o /00 ousoluo de formalina a 5% e depois lavadas em gua estril.As vidrarias com o meio de cultura, devero ser esterilizadas na autoclave sob presso (121 o /15 min) ou em vapor fluente (100o C / 1 h , trs dias sucessivos.


9/24

UEFS

9

ROTEIRO 2

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

1 DEFINIO: So substncias ou complexos de substncias capazes de dar aosmicrorganismos os elementos nutritivos necessrios ao seu desenvolvimento. Considerandoque as exigncias nutritivas das bactrias variam muito, existe um grande nmero de meio decultura.

2 CLASSIFICAO:

2.1 - Quanto ao estado fsico Lquidos, Slidos, Semi- slidos

2.2 Quanto aos componentes nutricionais- Bsicos Permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazerem especialmente nenhuma

exigncia caractersticas.- Especiais Cumprem as exigncias vitais de determinados microrganismos. Geralmenteso adicionados sangue, soro ou com outros nutrientes. Ex: gar sangue

2.3 - Quanto a procedncia Naturais Sintticos e Semi-sintticos

2.4 - Quanto a finalidade bacteriolgica:Diferenciais Possuem substncias que evidenciam a utilizao de determinados substratos.Estabelecem diferenas entre microrganismos de caractersticas parecidas. Ex: Mac Conkey eTeague.Seletivos permitem o crescimento de um tipo particular de microrganismos ou suprimem ocrescimento de outros tipos de microrganismos. Ex: gar SS e gar verde brilhanteEnriquecimento favorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento dasoutras espcies presentes em uma populao mista.

Estoque - meio pobre em nutrientes, utilizado para manter as culturas armazenadas por umdeterminado perodo de tempo.

3 COMPOSIO DE MEIOS BSICOSCaldo Simples: Agar Sabouraud ( para fungos )Extrato de carne........................0,3% Glicose ...........................................40gPeptona.....................................1,0% Peptona ..........................................10gCloreto de sdio.......................0,5% gar gar ......................................15ggua destilada......................100ml gua destilada ............................1000 ml

3.1 - Etapas na preparao do meio Pesar as substncias, juntar a gua, deixar dissolver, filtrar, ajustar se necessrio o pH para7,2 a 7,4 usando cido lctico ou hidrxido de sdio com pipeta de 1ml, gotejando aos poucos,

antes da adio da gar gar. Distribuir em tubos se o meio for caldo simples. Para tornar omeio slido acrescentar gar - gar e colocar o meio para fundir. O meio para o cultivo defungos o pH tem que ser ligeiramente cido (5.4)

4 FUNO DAS SUBSTNCIAS:Extrato de carne: Contm substncias que estimulam a atividade bacteriana (fatores decrescimento) e alimento plstico, pois vai integrar o protoplasma bacteriano. Fonte deCarbono.Peptona: fonte de nitrognioCloreto de sdio aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio.garagar: uma substncia mucilaginosa extrada de vrias espcies de Gelidiume outrasalgas afins. Tem somente funo de solidificar os meios, no sendo metabolizado pelasbactrias.


10/24

UEFS

10

5 ESTERILIZAO feita a 121C durante 15 minutos a 1 atmosfera de presso (autoclave). Deixar esfriar a 50c edistribuir assepticamente em placas de Petri.

6 PROVA DE ESTERILIDADEOs meios aps a esterilizao sero colocados na estufa de crescimento a 37c, durante 24h,para comprovao da esterilidade.

7 PROVA DE FERTILIDADEInocular a cultura no meio esterilizado e incubar a 37 C por 24 - 48horas.

NOTA: Partindo-se dos meios bsicos podemos preparar meios com acares. Os meioscontendo aucares e protenas naturais no sero esterilizados pelo calor sobre presso e simpela tindalizao ou pela filtrao. Em se tratando de meios contendo aucares, podemos aindapreparar solues concentradas destes, esteriliz-las por filtrao, na proporo de 1% ou 5%

ROTEIRO 3

COLORAO PELO MTODO DE GRAM

1 INTRODUOA colorao um dos passos mais importantes para a identificao bacteriana. A finalidade facilitar a observao microscpica das bactrias e diferenci-las quanto s suas caractersticasmorfotintoriais.

2 PREPARO DO ESFREGAOColoca-se no centro da lmina, com a ala de platina estril uma alada do material a serexaminado e com movimentos circulares espalhamos cuidadosamente. Se o material estiver emmeio slido, colocamos previamente uma gota de soluo salina estril com a ala de platina no

centro da lmina e sobre esta uma alada do material, misturamos e espalhamos. O esfregaodeve ser fixado pelo calor, passando a lmina trs a quatro vezes pela chama do bico deBunsen. O aquecimento fixa e mata as bactrias do esfregao. Deixar a lmina esfriar.

3 COLORAO PELO MTODO DE GRAMA colorao de Gram uma das mais importantes e rotineiras em Microbiologia, umacolorao composta e diferencial, pois permite a diferenciao de bactrias em Gram positivas eGram negativas.

TcnicaCobrir o esfregao com cristal violeta durante 1 minuto, escorrer o corante e lavar rapidamente.Cobrir a preparao com lugol, durante 1 minuto. Lavar em gua corrente.

Diferenciar com lcool etlico a 95% at que no se desprenda mais corante (cerca de 30segundos). Lavar e escorrer o excesso de gua.Cobrir a lmina com fucsina diluda durante 30 segundos, Lavar em gua corrente, escorrer,secar com papel de filtro e passar rapidamente na chama do bico de Bunsen para terminar asecagem.Examinar em microscpio tico utilizando objetiva de imerso (100x), com o condensador alto eo diafragma aberto


11/24

UEFS

11

ROTEIRO 4

TCNICA DE COLORAO DE ESPOROS (Endosporos)MTODO DE WIRTZ-CONKLIN

1 INTRODUOEsta colorao baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao corante,comparada com o resto da clula bacteriana, tornando possvel a sua diferenciao.O esporo bacteriano uma parede espessa formada no interior de algumas clulas bacterianas. muito resistente ao calor e a outros agentes fsicos e qumicos; capaz de permanecer emestado latente por longos perodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova clulavegetativa.

2 FINALIDADEEvidenciar a presena de esporos no interior do Bacillussp.

3 MATERIALCultura em agar de Bacillussp.

Solues: Verde malaquita a 5% em guaSafranina a 1% em guaSoluo fisiolgica

Lmina de microscopia e ala de platina

4 ESFREGAOEspalha-se sobre uma lmina, com o auxlio da ala de platina, uma gota do material a sercorado. Fixar pelo calor, passando-se a lmina (a superfcie sobre a qual foi feito o esfregaovoltada para cima) sobre a chama por 3 vezes.

5 PROCEDIMENTO TCNICO:Preparar esfregao, secar a temperatura ambiente.Cobrir com soluo de verde malaquita. Aquecer at o desprendimento de vapores por 6

minutos. (aquecer at a emisso de vapores e a partir da iniciar a marcao do tempo) Nodeixar ferver ou secar.Lavar em gua corrente, suavemente.Cobrir com soluo de safranina durante 30 segundos.Lavar em gua corrente e secar ao ar.Examinar no microscpio com objetiva de imerso.

5 RESULTADOO esporo se cora na de verde, porm o resto da clula ou a clula que no possui esporo setinge de vermelho ou rseo.

6 INTERPRETAOCom a ao drstica do calor sobre a clula esporulada h penetrao do verde malaquita nocerne do esporo e no h descoramento com a lavagem de gua; quando se coloca a safranina,ela cora as estruturas da clula vegetativa que no conseguiram reter o verde malaquita.


12/24

UEFS

12

ROTEIRO 5

TCNICAS GERAIS DE SEMEADURA

1 DEFINIO

Semear um microrganismo coloc-lo em um ambiente adequado, em meio de culturaapropriado ao seu desenvolvimento e reproduo. Ao semear um germe, preciso levar emconta as tcnicas de assepsia nas manipulaes, esterilidade do instrumento e dos meios decultura empregados.

2 FINALIDADEIsolar do material uma ou mais espcies microbianas, transplantar (repicar) uma cepa pura,visando conserv-la ou estudar as suas caractersticas morfolgicas, culturais e bioqumicas.A semeadura, plantio ou inoculao de bactrias em meios de cultura pode ser feita mediantediversos procedimentos.

3 NATUREZA DO INCULOSecreo, fluidos orgnicos, produtos patolgicos, fragmentos de tecidos, raspado de pele,

amostras retiradas de alimentos, etc.Suspenso de bactrias provenientes de crescimento em meio de cultura slido.Bactrias desenvolvidas em meio liquido.Definir inculo

4 MEIOS DE CULTURASlido- em tubo ( em coluna e inclinado ), em placa e em garrafa de RouxLquido em balo, em tuboSemi - slido em tubo

5 - TIPOS DE SEMEADURA E FINALIDADES

5.1 PLACA

Estrias simples e estrias compostas (Agar semeado com ala de platina) no crescemcolnias isoladasEsgotamento por Estrias ( gar semeado com ala de platina ) Isolamento de colnias.Disseminao ( gar semeado com ala de Drigalsky ou Swab ) Teste de sensibilidade Obteno de AntgenoPour- plate ( gar fundido resfriado a 45c 50c semeado com pipeta, - Contagem decolnias.

5.2 - TUBOSPunctura ou picada (gar semi - slido, slido em coluna, semeado com agulha de platina) Teste de Motilidade Conservao de bactriasShake tube (Agar fundido e resfriado a 45C- 50C, semeado com pipeta, ala de platina)Estrias (Agar inclinado semeado com ala ou agulha de platina) Realizao de determinadas

provas bioqumicas, ativao das culturas, conservao dos microrganismos.Meio Lquido (com ala ou pipeta) Testes Bioqumicos, ativao da cultura

6 LEITURA E INTERPRETAO DAS SEMEADURASCaractersticas do crescimento em meios lquidos - turvao, depsito, pelcula, pigmento.Caractersticas do crescimento em meio semi-slido (tubo) - Observar se o crescimento ficourestrito linha de inoculao (microrganismo imvel). Observar se o crescimento difundiu-se aolongo da linha de inoculao (microrganismo mvel). Usualmente todo o meio encontra-se turvo.Caractersticas do crescimento em meios slidosEm tubo inclinado - Observar a quantidade de crescimento: abundante, escasso, nulo, presenade pigmentos (cor) difusvel ou no.Em placas - semeado por estrias: verificar o isolamento das colnias, estudar as caractersticasem relao ao tamanho, forma, bordos, pigmentos, caracteres pticos, dentre outros; semeados

por disseminao - Crescimento confluente; semeados por "pour - plate" - contagem decolnias.


13/24

UEFS

13

ROTEIRO 6

AVALIAO DA QUALIDADE DO LEITE

O Leite um excelente meio de cultura para vrios microrganismos. Ao ser produzido nosalvolos, ele estril, mas medida que se desloca pelos canais da glndula, em direo cisterna, pode contaminar-se com microrganismos da microbiota normal. Algumas vezes oleite pode conter microrganismos patognicos (Salmonella, Coxiela burnetti, Mycpbacteriumbovis, M. tuberculosis, Brucella abotrus).A contaminao do leite pode continuar durante aordenha, o transporte e o armazenamento. Pessoas portadoras de infeces que participam damanipulao do produto tambm podem representar fonte de contaminao. As condies detransporte e?ou armazenamentos tambm contribuem para a multiplicao dos microrganismospresentes no leite. Assim grandes populaoes de microrganismos degradadores(Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus) podem estarpresentes no leite. A qualidade do leite pode ser avaliada em funo de sua microbiota,

fornecendo informaoes que refletem as condies sob as quais o alimento foi produzido,beneficiado e/ou mantido (refrigerao e armazenamento inadequado).

PROCEDIMENTOS UTILIZADOS

1. Teste de fervuraBaseia-se no fato de que o aquecimento reduz o pH. Se um leite apresenta-se bastante

alterado(pH baixo), embora com aspecto fsico normal, ele coagular ao ser aquecido, poiso pH baixa ainda mais.

colocar 5 mL de leite num tubo de ensaio- Ferver- Observar se h ou no coagulao (leite alterado ou normal respectivamente)

2. Teste do lcoolEste mtodo particularmente til na identificao de animais portadores de infeces

(Streptococcus) sem manifestaes clnicas. Animais infectados levam coagulao doleite, neste teste, que pode aparecer rapidamente ou demorar de quatro a seis horas,quando as alteraes so pequenas.

- Colocar 5 mL de leite num tubo de ensaio- Adicionar 5 mL de lcool 70%- Observar se h ou no coagulao (leite alterado ou normal, respectivamente)

3. Teste do azul de metilenoO crescimento de microrganismo no leite provoca o consumo do oxignio presente nomeio. Esse fenmeno leva produo de substncias redutoras, diminuindo o potencialxido-redutor (O/R). Atravs de uma substncia indicadora, possvel acompanhar oumedir essa diminuio do potencial O/R.O corante azul de metileno um exemplo de substncia indicadora. Em sua formaoxidada ele apresenta de cor azul, e, em sua forma reduzida, ele incolor (leuco azulde metileno).Quando introduzido numa cultura bacteriana,ou em qualquer meiocontendo bactrias, o azul de metileno age como aceptor de eltrons, ou seja, sofrereduo, tornando-se incolor. A velocidade dessa transformao diretamenteproporcional concentrao bacteriana no meio. possvel, dessa forma,avaliar aconcentrao bacteriana no meio pela adio desse corante e pela determinao dotempo de descoramento.


14/24

UEFS

14

Tabela 3 Relao entre o tempo de descoramento do leite e o nmero de bactriasaps a adio de azul de metileno

Tempo de descoramento UFC/mL Qualidade< 20 minutos > 2,0 x 107 pssima20 minutos 2 horas 4 x 106 2,0x 207 m2 horas 5,5 horas 5 x 105 4 x 106 regular> 5,5 horas < 5 x 105 boa

- Pipetar para um tubo de ensaio 10 mL do leite a ser testado- Juntar 1 mL de azul de metileno (0,02%)- Misturar e colocar na estufa a 37 C. Anotar o horrio de incio.- Fazer a primeira leitura aps 20 minutos e as seguintes a cada 30 minutos.Considera-se um teste positivo quando a cor do fundo do tubo estiver branca

4. Contagem de bactrias aerbias mesfilas (pour plate)No aspecto quantitativo procura-se avaliar a populao de um modo geral

- Preparar uma diluio decimal em srie at 105.- Inocular as placas em duas repeties com 1 mL das diluies de 10 3 a 105.- Verter nas placas o meio Agar padro para contagem (PCA) a 45 C- Homogeneizar, deixar solidificar, inverter e incubar por 48h a 37 C.- Proceder a contagem

Tabela 2 Limite de tolerncia para os diferentes tipos de leite. * Excludo na RDC 12

Tipo de leite Salmonella sp Coliformestotais*

Coliformes fecais Contagem padro emplacas*

Ausncia em NMP/mL NMP/mL UFC/mLABB

25 mL25/mL25/mL

1410

Ausncia12

2 x 103/mL8 x 104/mL3 x 105/mL

ROTEIRO 7

PREPARA DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS PARA ANLISES: DILUIO EPLAQUEAMENTO

AMOSTRAS LQUIDAS1- Amostras lquidas em frascos com espao suficiente para agitao devem ser

misturadas antes da retirada da unidade analtica, invertendo-se a embalagem 25 vezes2- Antes de abrir a embalagem, limpar a rea externa com etanol 75%, para remoo dos

contaminantes presentes3- Amostra direta transferir assepticamente 1,0 mL ou 10 mL das amostras para o meioem questo

4- Amostra diluda - diluies seriadas: 10-1 transferir assepticamente uma poro de1,0mL da amostra para 9,0 mL de diluente ( gua salina peptonada 0,1% ou tampofosfato pH 7,2), para a preparao da segunda diluio (10-2) , transferirassepticamente 1,0 mL da diluio 10-1 para 9,0mL de diluente. As diluiessubseqente(10-3, 10-4 etc.) so obtidas de maneira similar, transferindo-se 1,0 mL dadiluio anterior para 9,0 mL de diluente. Antes de retirar o volume a ser transferido,agitar o tubo no agitador tipo vortex ou inverter o tubo 25 vezes. Usar sempre umapipeta diferente para cada diluio

AMOSTRAS SLIDAS1- Antes de abrir a embalagem, limpar a rea externa com etanol 75%, para remoodos contaminantes presentes


15/24

UEFS

15

2- A unidade analtica utilizada na maioria dos alimentos slidos 25g. Retirarassepticamente a amostra e transferir para um triturador (liquidioficador), contendo225 mL do diluente. Triturar e homogeneizar por 60 segundos. Transferir o materialdiludo (!0-1) para um erlenmayer de 500mL e proceder as diluies subseqentes(10-2, 10-3 etc ) utilizando tubos com 9,0mL do diluente.

OBS: O nmero de diluies requeridas depender do nvel de contaminao esperado.

Caso no haja possibilidade de se estimar o nvel de contaminao da amostra, deve-sepreparar e inocular amostra direta (100 em caso de amostra lquida ) seguindo a diluio10-1 at a diluio 10-7

TCNICA DO PAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE POUR PLATE

1- Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular 1,0mL de cada diluioem placas de Petri estreis. (realizar este procedimento em duplicatas)

2- Verter nas placas inoculadas 20 mL do agar requerido para a anlise, previamentefundido e resfriado a 45 C. Misturar o inoculo com o meio de cultura movimentandosuavemente as placas, numa superfcie plana e seca, em movimentos circulares (4vezes no sentido horrio, 4 vezes no sentido anti-horrio e 4 vezes na forma de oito).

3- Esperar solidificar o meio. Inverter as placas e incubar nas temperaturas requeridas

ROTEIRO 8

CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERBIOS

1. Preparar diluies de 10-1 ate 10-7 da amostra (No caso da amostra lquidacomear

com a amostra direta 100 )

2. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis. (realizar esteprocedimento em duplicatas)

3. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar Padro para Contagem (PCA),previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizar. Esperar solidificar

Contagem total de aerbios mesfilos1. Incubar as placas invertidas a 35 C/48h. Contar todas as colnias

Contagem total de aerbios psicrotfilos2. Incubar as placas invertidas a 7 C/10 dias . Contar todas as colnias

Contagem total de aerbios termfilos3. Incubar as placas invertidas a 55 C/24 h . Contar todas as colnias

Contagem das colnias: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colnias.Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ou grama ,multiplicar pelo inverso da diluio inoculada .

Ex: 100 colnias na diluio 10-2 = 100 x 102 = 10 000 = 1,0 x 104 UFC/g ou mL

Contagem de bolor e levedura

1. Preparar diluies de 10-1 ate 10-6 da amostra (No caso da amostra lquidacomear com a amostra direta 100 )

2. Inocular 0,1 mL de cada diluio nas placas contendo o meio solidificado Agarbatata dextrosado (PDA)


16/24

UEFS

16

3. Incubar as placas no invertidas a 25 C ou temperatura ambiente por 5 dias(contar primeiro com 3 dias).

4. Contagem das colnias: Selecionar as placas que tenha entre 15 a 150colnias. Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ougrama , multiplicar pelo inverso da diluio inoculada e depois por 10 (j que foiinoculado 0,1 ml e no 1 ml)

Ex: 100 colnias na diluio 10-2 = 100 x 102 = 10 000 x 10 = 1,0 x 105 UFC/g ou mL

ROTEIRO 9

CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimentode fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento.

- PROCEDIMENTOS

- Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose 2%acidificado com cido tartrico a pH 3,5.

Com o auxlio de ala de Drigalski , espalhar o inculo cuidadosamente por toda asuperfcie do meio, at sua completa absoro.

Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuirem duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtoslquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1.- Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 C por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D.- Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

ROTEIRO 10

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS (37 C)E COLIFORMES FECAIS (45 C ou termotolerante)

A contagem de coliformes) baseada nas caractersticas do grupo: bastonete Gram-negativo, que produzem cido e gs a partir de lactose.Coliformes Totais: Habitat intestinal e ambiental: Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter,KlebsiellaColiformes Fecais: Habitat excluisivamente intestinal: Escherichia coli

Procedimento:Mtodo: tubos mltiplos (Nmero mais provvel NMP)

1. Teste presuntivoPresume-se que os microrganismos que crescem e produzem gs a partir da lactose sejamcoliformesMeio de enriquecimento: caldo lauryl sulfato triptose

- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldolauryl sulfato triptose (dupla concentrao) com 10 mL da amostra .

- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldolauryl sulfato tripose (concentrao normal) com 1m L da amostra.


17/24

UEFS

17

- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10mL de caldolauryl sulfato triptose (concentrao normal) com 0,1 mL da amostra

- Incubar a bateria com as sries te tubos a 37 C/48h- Fazer a leitura, considerando positivos os tubos com presena de gs no interior dos tubosde Durham

3- Teste confirmativo

Coliformes TotaisMeio seletivo caldo lactosado bile verde brilhante. Neste meio, os sais de bile tm afuno de inibir o crescimento de bactrias no entricas e o verde brilhante de inibir asbactrias Gram-positivas,selecionando desta forma os coliformes.

- Imediatamente aps a leitura do teste presuntivo,transferir com uma ala de platina umaalquota de cada tubo positivo para tubos ( tubos de Durham invertidos no seu interior)contendo caldo lactosado bile verde brilhante.

- Incubar a 35 C por 48h- Fazer a leitura identificando como positivos os tubos com gs.- Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de coliformes totais

por grama ou mL.

Coliformes FecaisOs coliformes fecais tm em seu ambiente natural (trato intestinal) temperaturas maiselevadas. Eles so capazes de crescer a 44,5 C, possibilitando, assim,de uma formaprtica, serem avaliados separadamente.

- Imediatamente aps a leitura do teste presuntivo, transferir com a ala de platina umaporo de cada tubo positivo para tubos contendo caldo EC (Escherichia coli) (tubosde Durham invertido no seu interior).

- Incubar a 44,5 (pescado) ou 45 C por 24h. Utilizar o banho-maria

Fazer leitura identificando como positivo os tubos com gsUsar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de coliformes fecais/g

ou mL

ROTEIRO 11

PESQUISA de Salmonella sp

Todas as salmonelas so consideradas potencialmente patognicas para o homem.A nica viade entrada destes microrganismos no corpo humano a oral, por isso de suma importncia aanlise dos alimentos para detectar sua presena.A metodologia recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo dealimentos

Pr- enriquecimento em caldo no seletivo; objetiva a recuperao de clulas injuriadas- Adicionar 25g ou mL da amostra em 225 mL do caldo de pr- enriquecimento (diluio 10 -1).Homogeneizar no liquidificador por 60 seg. Verter todo material em erlenmyer estril e incubar a35 C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o caldo lactosado ou a gua peptonada 0,1%tamponada e para produtos lcteos gua destilada verde brilhante.

Enriquecimento Seletivo: estimula a multiplicao de salmonelas e reduz ou inibe ocrescimento dos organismos competitivos, tais como coliformes, Proteuse Pseudomonas- Transferir 1,0 mL para 10mL de caldo Tetrationato (TT) .Incubar a 35 C/24h.


18/24

UEFS

18

Plaqueamento seletivo diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial decolnias de Salmonella, com caractersticas tpicas que as distingam dos competidores, paraposterior confirmao sorolgica e bioqumica.- Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alada do caldo tetrationato em placasde Agar entrico de Hectoen (HE) e gar xilose lisina descarboxilado (XLD). Incubar as placasinvertidas a 35 C/24h. Verificar se h desenvolvimento de colnias tpicas de Salmonella:Agar HE: colnias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto.

Agar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro,com ou sem centro preto.

Confirmao Preliminar das colnias tpicas de SalmonellaCom o auxlio de uma agulha de inoculao, remover uma poro da massa de clulas, docentro da colnia tpica (no mnimo 2 colnia) e semear em tubos inclinados de Agar LisinaFerro (LIA) e gar Trplice Acar.. A semeadura deve ser feita por picada e estrias na rampa.Incubar os tubos a 35 C/24h. Observar reao tpica:TSI- rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo),com ou sem produo de H2S(escurecimento do agar). Reao atpica que no deve ser descartada se as demais reaoesem LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos (amarelos), com ou sem produo deH2S.

LIA fundo e rampa alcalinos(prpura, sem alterao da cor do meio), com ou sem produo de

H2S. Reao atpica, que no devem ser descartada se as demais reaoes em TSI seapresentarem tpicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.

Teste bioqumico. Meio SIM Transferir com uma agulha atravs de picada a cultura de colcia tpicado TSI parao meio. Incubar 35 C/24h.. Produo de H2S: escurecimento do agar. Salmonela pode produzir ou no H2S. Motilidade : crescimento na regio da picada imvel

crescimento em todo agar ou ao redor da regio da picada: mvel. Salmonela mvelAps a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou Kovacs no tubo.Aparecimento de cor rsea: indol positivo.Aparecimento de cor amarelado: indol negativo. Salmonela indol negativo

Teste do vermelho de metila (VM) 3 Voges-Proskauer (VP): Transferir uma alada com inoculoda cultura em TSI, para dois tubo com caldo 3mL VM-VP e incubar a 35 C/48h para VP e 96hVM. Aps o perodo de incubao , no tubo VP adicionar 1,8 mL de soluo de alfa naftol 5% eagitar. Adicionar em seguida 0,6 mL de soluo KOH 40%, agitar. Observar at 1 hora.Desenvolvimento de cor vermelha ou rosea teste positivoPermanncia do meio na cor do reagente(amarelado ou ligeiramente esverdeado) testenegativo. A maioria das Salmonelas so VP negativasNo tubo VM adicionar 5 gotas de soluo vermelho metila e observar imediatamente se o meioadquire uma colorao vermelha teste positivo ou amarela _ teste negativo. A maioria dascepas de Salmonela so VM positivas.

Teste do citrato:Com uma agulha de inoculao, transferir um inoculo da cultura para um tubo de agar citrato deSimmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a 35 C/ 96h. Observar ocrescimento:Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de Salmonelas so citrato positivoCor do meio inalterado: citrato negativo

Teste de urease:transferir uma alada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uria de Chistensen.Incubar 35 C/24h. Observar crescimentoCor do meio original (pssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas so ureasesnegativaCor do meio rosa escuro: teste positivo

Teste da descarboxilao da lisina em caldoTransferir uma alada da cultura em TSI para um tubo com caldo lisina ( previamentedesaerado). Cobrir a superfcie do caldo com 2 q 3 ml de parafina ou leo mineral estril.Incubar


19/24

UEFS

19

a 35 C /48h h. Observar:Alterao do meio de esverdeado para prpura azulado : teste positivo- As cepas deSalmonelas so lisinas positivas. alterao do meio par cor amarela (cida): tesete negativo.

Reao sorolgica frente ao anti-soro polivalente ORessuspender o cultivo obtido em gar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em

aproximadamente 2 mL de soluo salina 0,85%.Em lmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gotade soluo salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonellapolivalente "O", diretamente do frasco.Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspenso em teste.Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminao sobre fundo escuro em 1 a 2minutos.Classificar a reao do seguinte modo:

Positiva: presena de aglutinao somente na mistura cultivo + anti-soro;Negativa: ausncia de aglutinao em ambas as misturas;No especfica: presena de aglutinao em ambas as misturas (formas rugosas).

ROTEIRO 12

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

A contagem de S. aureusem alimentos pode ser feita com dois objetivos, um relacionado com asade pblica, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicao alimentar, e outrorelacionado com o controle de qualidade higinico-sanitria dos processos de produo dealimentos, condio em que S. aureusserve como indicador de contaminao ps-processo oudas condies de sanificao das superfcies destinadas ao contato com alimentos.

Mtodo: Contagem direta em placaProcedimento:

- Inocular 0,1 mL de cada diluio na superfcie de placas de agar Baird-Parker(BP). Espalhar oinculo com uma ala de Drigalski, at que todo o excesso de lquido seja absorvido. Se ascontagens estimadas de S. aureus na amostra forem menores do que 100/g ou mL, inocular 1,0mL da primeira diluio, distribuindo o volume por quatro placas , 3 com 0,3 e uma com 0,1 mL.- Incubar invertidas a 37 C por 48h.- Contar as colnias tpicas de S. aureusselecionando as placas que tenha entre 25 a 250colnias.Colnias tpicas: colnias circulares,pretas, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas,massa de clulas esbranquiadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halotransparente se estendendo para alm da zona opaca.Colnias atpicas: cinzentas, sem um ou ambos os halos tpicos.

Confirmao das colnias- Selecionar no mnimo cinco colnias tpicas, para teste de coagulase, e havendo menos doque cinco tomar todas. Se a placa apresentar colnias suspeitas de mais de um tipo, tpicas eatpicas, selecionar pelo menos cinco de cada tipo.Transferir cada colnia para um tubo decaldo infuso crebro corao (BHI), emulsionar bem a massa de clulas com o caldo, transferiruma alada para um tubo com agar tripticase de soja (TSA) inclinado e incubar ambos os tubosa 35 C/24h.Teste da coagulase:Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL deplasma de coelho.

Incubar a 36 1C por 6 horas.Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:Reao negativa: no formao de cogulo;Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado;Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado;Reao 3+ : cogulo grande e organizado;Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender quando o


20/24

UEFS

20

tubo for invertido;Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva paraStaphylococcus aureus;Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcusaureus.Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubocontendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, para a

realizao dos testes complementares:

Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintesprovas confirmativas:Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram.A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. Apresena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testescomplementares.Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes com cerca de 2 mm de dimetro nogar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamentepreparadas.Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15minutos.

Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado.Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas.O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halode clarificao no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reaopositiva para termonuclease.Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. OStaphylococcus aureus termonuclease positiva.

Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou Pipetade Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para umalmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.A no formao de borbulhas indica prova negativa para

catalase.. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.O Staphylococcus aureus catalase positiva.

RESULTADOSQuando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias

selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se emconsiderao a diluio utilizada.

ROTEIRO 13

CONTAGEM DE Bacillus cereus

O Bacillus cereus aerbico formador de esporos e se encontra normalmente presente no solo,poeira e gua e alimentos com baixo aw. Os alimentos envolvidos so pratos a base de cereaise hortalias.

. PROCEDIMENTOSInoculao

- Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP (Polimixina gema de ovo) ,0,1 mL de cadadiluio selecionada.Com auxilio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente portoda a superfcie do meio at completa absoro.Nos casos em que for necessria a obtenode resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluio 10 -1 em 3 placas (0,4 mL,0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente daamostra.- Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 por 30 a 48 horas.- Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias


21/24

UEFS

21

rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar MYP.- Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar nutriente inclinado.- Incubar a 35C por 24 horas.- De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena debastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Osesporos so centrais ou sub-terminais.- Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as

seguintes provas:

Identificao Bioqumica- Motilidade e reduo de nitratoInocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 35 C por 18 a 24 horas.Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente.Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as mveiscrescem de forma difusa.O Bacillus cereusem 50 a 90% dos casos mostra-se mvel.

Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade parareduo de nitrato.O Bacillus cereusreduz o nitrato a nitrito.- -hemlise em gar sangue de carneiro.Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro.

- Incubar a 35 C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do Bacilluscereus.Bacillus cereus produtor de -hemlise.- Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente, depositandoo inculo no ponto central da placa.- Incubar a 35 por 48 a 72 horas.- Aps incubao verificar o tipo de crescimento: Crescimento rizide se caracteriza peloaparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios, tpicas deBacillus mycoides. O Bacillus cereusno apresenta crescimento rizide, porm algumas cepaspodem apresentar colnias rugosas em forma de galxia.

- RESULTADOSCalcular o nmero de Bacillus cereusmultiplicando o nmero de colnias confirmadas,

nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado.

ROTEIRO 14

CONTAGEM DE ClostridiumSULFITO REDUTORES EDE Clostridium perfringens

A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 mL em placas estreis e adicionar cercade 15 mL de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C.

Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana.Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio.Deixar solidificar em superfcie plana.

Incubao: Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), emjarra de anaerobiose a 35C por 18 a 24 horas.

Seleo e Isolamento: As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e detamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC.Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias tpicas.Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado.Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridiumsulfitoredutores presentes por grama da amostra em anlise.

RESULTADOSCalcular o nmero de Clostridiumsulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negrascontadas no gar TSC pelo fator de diluio usado


22/24

UEFS

22

ROTEIRO 15

NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus

PROCEDIMENTOSProvas presuntivasInoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10 -1), efetuar asdemais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies).Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendoGSTB . Incubar os tubos a 35 C por 18 horas a 24 horas.Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrioparahaemolyticus.Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao.Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS)Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB que apresentar turvao, sem agit-lo e com auxliode uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do

crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citrato sacarosesais biliares (TCBS). Incubar as placas em posio invertida a 35C por 24 horas.Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada,com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus.Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem.Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticusDe cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para tuboscontendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.Incubar a 35C por 18 a 24horas.Colorao de Gram: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder coloraode Gram . O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gramnegativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal

3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma aladapara um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%.Incubar os tubos a 35C por 18 a 24 horas.Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia decrescimento. O Vibrio parahaemolyticusno cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8%de sal.Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos demadeira, de plstico descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova deoxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobretiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis.Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas.O aparecimento de cor azul (quando usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina)ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado o oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva.OBS: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, poistraos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva.O Vibrio parahaemolyticus oxidase positivaCaldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal3%, inocular, com auxlio de ala de nquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenolsacarose sal 3%.Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estreis.Incubar a 35C por 18 a 24 horas.Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho paraamarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido.O Vibrio parahaemolyticus no altera a colorao do meio pois no capaz de fermentar asacarose.

gar Kligler ferro sal 3%A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina


23/24

UEFS

23

ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e estriandoa superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas.O Vibrio parahaemolyticusapresenta base cida (amarela), sem gs, sem produo de H2S ebisel alcalino (vermelho)..Provas adicionais para identificao de Vibrio parahaemolyticusAs colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticusnas provas

preliminares, devero ser submetidas s provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9.Teste do crescimento a 42C: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, comauxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldopeptonado sal 3%. Incubar a 42 1C por 24 horas.Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos meios.O vbrio parahaemolyticuscresce temperatura de 42C.gar gelatina sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio deala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gargelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculadono centro de cada setor). Incubar as placas a 35C por 18 a 24 horas.Colocar as placas em refrigerao por alguns minutos antes e realizar a leitura, o que facilita avizualizao do halo.O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase.

O Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva.Teste da motilidade: A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxliode agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular umtubo contendo gar motilidade sal 3%.Incubar a 36 1C por 24 horas.Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva.O Vibrio parahaemolyticusapresenta motilidade positiva.Prova de Hugh-Leifson glicose (OF): A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3% ,inocular, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tuboscontendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%.Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida,estril.Incubar a 35C/24hAps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e apresena de bolhas de gs nos meios.A cor amarela nos dois tubos significa fermentao da glicose.

A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa daglicose.O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubosdevem apresentar colorao amarela.Descarboxilao da lisina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxliode ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldovermelho de fenol lisina sal 3%.Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir decontrole.Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril.Incubar a 35C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenollisina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo.Examinar os tubos todos os dias.Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao daglicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono.O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.O Vibrio parahaemolyticusdescarboxila a lisina.Hidrlise da arginina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio deala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo argininasal 3%.Inocular tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir decontrole.Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril.Incubar a 35C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% noinoculado, que servir de controle negativo.Examinar os tubos todos os dias.Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao daglicose, e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de


24/24

UEFS

aminas primrias e dixido de carbono.O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.O Vibrio parahaemolyticusno hidrolisa a arginina.Prova da fermentao do manitol e arabinose: A partir do cultivo mantido em caldopeptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocularum tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelhode fenol arabinose sal 3%.

Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 35C por 24 hAps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho paraamarelo, devido fermentao dos acares e conseqente produo de cido.

99% das cepas de Vibrio parahaemolyticusfermenta o manitol.50% das cepas de Vibrio parahaemolyticusfermenta a arabinose.

Teste do halofilismo: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio deala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular tubos contendo caldo peptonadosal 6% e 10%.Incubar a 35C por 24 horas.Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios.O Vibrio parahaemolyticuscresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento discreto,a 10% de sal.RESULTADOSSero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus

as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao:Motilidade - positivaHugh Leifson (OF) - glicose fermentativoDescarboxilao da lisina - positivoHidrlise da arginina - negativoCrescimento a 42C - positivoFermentao do manitol - positivoFermentao da arabinose - positivogar gelatina sal 3% - crescimento com formao de haloHalofilismo (6% sal) - positivoHalofilismo (8% sal) - positivoHalofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto

A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero Mais

Provvel.Expressar o valor obtido em NMP/g.

Documents

Manual de Microbiologia de Alimentos